Summary
Ce protocole décrit plusieurs procédures pour la préparation d’échantillons de tissus congelés de haute qualité au moment de l’autopsie pour une utilisation dans l’essai de la comète pour évaluer les dommages à l’ADN : 1) tissu haché, 2) cellules épithéliales grattées du tractus gastro-intestinal, et 3) tissu en cubes d’échantillons, nécessitant l’homogénéisation à l’aide d’un dispositif de mincing tissulaire.
Abstract
L’essai de comète gagne en popularité comme moyen d’évaluer les dommages à l’ADN dans les cellules et les tissus cultivés, en particulier après l’exposition à des produits chimiques ou à d’autres facteurs de stress environnementaux. L’utilisation de l’analyse de la comète dans les essais réglementaires pour le potentiel génotoxique chez les rongeurs a été motivée par l’adoption d’une ligne directrice d’essai de l’Organisation de coopération et de développement économiques (OCDE) en 2014. Les diapositives d’analyse de comète sont généralement préparées à partir de tissus frais au moment de l’autopsie; cependant, la congélation d’échantillons de tissus peut éviter les problèmes logistiques associés à la préparation simultanée de diapositives à partir de plusieurs organes par animal et de nombreux animaux par étude. La congélation permet également d’expédier des échantillons de l’installation d’exposition à un autre laboratoire pour analyse, et le stockage des tissus congelés facilite le report d’une décision de générer des données sur les dommages à l’ADN pour un organe donné. L’essai de comète alcalin est utile pour détecter les ruptures d’ADN à double brin et à brin liés à l’exposition, les lésions alkali-labile, et les ruptures de brin associées à la réparation incomplète d’excision d’ADN. Cependant, les dommages à l’ADN peuvent également résulter de la tonte mécanique ou des procédures de traitement inadéquates de l’échantillon, confondant les résultats de l’essai. La reproductibilité dans la collecte et le traitement des échantillons de tissus pendant les nécropsies peut être difficile à contrôler en raison de la fluctuation du personnel de laboratoire avec des niveaux variables d’expérience dans la récolte des tissus pour l’essai de la comète. Il est coûteux d’améliorer la cohérence grâce à une formation de recyclage ou au déploiement d’unités mobiles dotées d’un personnel de laboratoire expérimenté et n’est pas toujours possible. Pour optimiser la génération constante d’échantillons de haute qualité pour l’analyse d’analyse d’analyse d’analyse d’analyse d’essai de comète, une méthode pour homogénéiser des cubes de tissu congelés flash à l’aide d’un dispositif de mincing tissulaire personnalisé a été évaluée. Des échantillons préparés pour l’analyse de la comète par cette méthode ont comparé favorablement en qualité aux échantillons de tissus frais et congelés préparés en mâmant pendant l’autopsie. En outre, de faibles dommages à l’ADN de base ont été mesurés dans les cellules des cubes congelés de tissu après stockage prolongé.
Introduction
L’essai de comète est de plus en plus utilisé comme un moyen d’évaluer les dommages à l’ADN dans les cellules cultivées et les tissus exposés à des produits chimiques ou d’autres facteurs de stress environnementaux1. L’essai peut détecter des ruptures d’ADN à deux brins et à un brin, des lésions alkali-labile, et des ruptures à brin unique associées à la réparation incomplète de l’ADN. Le Conseil international pour l’harmonisation des exigences techniques pour les produits pharmaceutiques à usage humain (ICH) recommande un analyse de rupture de brin d’ADN tel que l’analyse de la comète comme un deuxième test pour compléter l’essai de micronuclée érythrocyte rongeur pour évaluer la génototoxicité in vivo et comme un test de suivi pour évaluer le mode d’action dans les organes cibles de l’induction tumorale2. L’Autorité européenne de sécurité des aliments (EFSA) recommande l’analyse de la comète in vivo comme un test de suivi approprié pour étudier la pertinence d’un résultat positif dans un test de génototoxicité in vitro3. En 2014, une ligne directrice d’essai de l’OCDE a été approuvée pour l’essai de la comète rongeur, augmentant ainsi l’acceptabilité de l’essai pour l’utilisation dans les essais réglementaires du potentiel génotoxique. L’essai est basé sur la séparation électrophorétique des boucles d’ADN détendues et des fragments qui migrent des nucléoïdes des cellules lysed. Fondamentalement, les cellules simples sont incorporées dans l’agarose qui a été superposée sur des lames de microscope. Les diapositives sont ensuite immergées dans un tampon de lyse suivi d’une solution alcalin (pH et 13), qui permet à l’ADN nucléaire étroitement enroulé de se détendre et de se détendre. Les diapositives sont ensuite placées dans un champ électrique, ce qui stimule la migration de l’ADN chargé négativement vers l’anode, créant des images qui ressemblent à des comètes; la quantité relative d’ADN dans la queue de la comète par rapport à la tête de la comète est directement proportionnelle à la quantité de dommages à l’ADN; Le contenu de l’ADN dans la queue est généralement quantifié à l’aide d’un logiciel d’imagerie numérique.
Étant donné que l’analyse de la comète détecte l’ADN fragmenté, la quantification précise des dommages causés par l’ADN induit par l’exposition peut être confondue par la fragmentation de la chromatine associée à la nécrose ou à l’apoptose résultant d’une cytotoxicité ou d’un stress induit par le traitement. En outre, des dommages à l’ADN peuvent se produire à la suite d’une tonte mécanique ou d’un traitement inadéquat de l’échantillon4. L’importance de maintenir le tissu récolté réfrigéré avant la préparation de la diapositive pour minimiser le niveau de base des dommages à l’ADN a été démontrée précédemment5,6. De nombreux laboratoires préparent des glissades d’essai de comètes à partir de tissus frais; cependant, cela peut être difficile sur le plan logistique lors de la préparation de diapositives de plusieurs types de tissus par animal dans une étude avec un grand nombre d’animaux. De plus, cela pose un problème lorsque la préparation et l’analyse des diapositives doivent se produire dans un laboratoire éloigné, ce qui nécessite l’expédition d’échantillons. Par exemple, le Programme national de toxicologie des États-Unis comprend l’analyse de la comète comme élément de son programme de tests toxicologiques génétiques (https://ntp.niehs.nih.gov/testing/types/genetic/index.html) et intègre parfois l’essai dans des études de toxicité de 28 ou 90 jours de dose de répétition; cela nécessite la collecte de tissus par le laboratoire de la vie et le transfert d’échantillons à un autre laboratoire pour analyse. Pour ce faire, les morceaux de tissus sont hachés, et / ou les cellules épithéliales du tractus gastro-intestinal sont grattés et les suspensions cellulaires sont flash congelés et stockés dans un congélateur pour l’expédition ultérieure et le stockage par le laboratoire de réception jusqu’à l’analyse7. Une bonne manipulation des échantillons est cruciale pour obtenir des données de haute qualité à l’aide de tissus congelés; cependant, la manipulation reproductible des échantillons de tissus pendant les autopsies exécutées par le personnel en constante évolution est difficile à contrôler, particulièrement dans les laboratoires dans la vie qui ne récoltent pas systématiquement des tissus pour l’essai de comète. La formation de recyclage du personnel de autopsie ou l’utilisation d’une unité mobile composée de personnel de laboratoire expérimenté pour recueillir des échantillons de tissus frais ou congelés est souvent trop coûteuse, pas faisable, ou tout simplement sous-évaluée.
Pour mieux assurer une génération constante d’échantillons de tissus de haute qualité pour le transfert vers un site éloigné pour l’analyse des analyses d’analyses d’analyses d’analyses de comètes, l’utilité d’une méthode publiée6 de préservation des tissus à partir de cubes de tissu congelés flash a été explorée. Dans cette méthode, des cubes de tissu congelés sont chargés dans un dispositif de mâchage des tissus en acier inoxydable(figure 1) qui est placé dans un tube de microcentrifuge contenant un tampon froid. Le cube de tissu est ensuite poussé à travers un petit maillage de jauge à l’extrémité de l’appareil. Forcer à plusieurs reprises la suspension de tissu par le tamis de maille dans les deux directions résultats plusieurs fois dans une suspension relativement uniforme de cellule simple. Les échantillons préparés par cette méthode comparaient favorablement en qualité aux échantillons de tissus frais et congelés préparés par le mincing. Comme avantage supplémentaire, contrairement aux échantillons hachés, les cubes de tissu peuvent être stockés congelés pendant de longues périodes de temps et donnent encore des résultats de haute qualité dans l’essai de la comète.
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Protocol
Les tissus ont été récoltés lors de la conduite d’études effectuées dans des installations accréditées par l’AAALAC dans les laboratoires contractuels du PNP conformément aux règlements sur les bonnes pratiques de laboratoire (21 CFR Partie 58) et aux protocoles d’utilisation des animaux approuvés par l’Animal institutionnel Comité de soins et d’utilisation (IACUC) dans chaque laboratoire.
1. Récolte et transformation des tissus
REMARQUE: Il est utile de préparer des tubes d’échantillon en double (p. ex., foie) ou de transférer environ la moitié d’un échantillon dans un autre tube de stockage (p. ex., du duodénum, estomac) pour permettre une réanalyse, si nécessaire. Afin de réduire au minimum la variabilité potentielle de l’échantillon à l’échantillon pour les tissus des voies intestinales, il est recommandé de prendre soin de goûter la même région de tissu par rapport à l’estomac pour chaque animal, et un échantillon soit divisé pour générer des échantillons en double. Des forceps en plastique sont recommandés pour le transfert de tissus collants tels que le cerveau. En option, les préparations de tissus hachées, grattées ou homogénéisées peuvent être filtrées pour obtenir des suspensions homogènes à cellule unique à l’aide d’une passoire cellulaire de 40 m fixée à un tube conique.
- Retirez tout tissu, organe et débris raccordés attachés de l’organe.s) d’intérêt. Immédiatement après l’enlèvement, tamponner l’organe vigoureusement dans un bateau de poids de taille moyenne contenant 7 ml de solution froide de mouchoir fraîchement préparé(Mg,Ca et phénol rouge-libre Hank’s Balanced Salt Solution, 10% v /v DMSO, et 20 mM EDTA pH 7.5) pour enlever le sang résiduel et les débris.
- Transférer chaque organe dans un autre bateau à poids propre contenant une solution de mincing froide suffisante (7 ml) pour maintenir le tissu immergé, sur la glace, jusqu’à nouvel examen.
- Retirez une section de chaque organe d’intérêt et placez-la dans une cassette d’intégration. Fixer dans 10% neutre formaline tampon, garniture, et paraffine incorporé selon les procédures standard du laboratoire pour l’évaluation histopathologique future possible.
- Pour le foie, couper une section longitudinale de 5 mm du lobe gauche et balayez doucement dans la solution de mincing froide de 7 ml. Placer la bande de tissu dans un bateau à poids moyen propre contenant 7 ml de solution de mincing froid et maintenir sur la glace jusqu’à ce qu’il soit prêt à traiter davantage (étape 1.8 ou 1.11).
- Pour le duodénum, couper une portion de 10 mm du duodénum proximal à l’estomac. À l’aide d’une aiguille de 21 à 25 G, rincer pour enlever les débris et les bactéries.
- Insérer l’aiguille dans une extrémité du duodénum et rincer avec 1 ml de solution de mincing froid.
- Rincer l’autre direction en renversant le duodénum et en répétant avec une autre solution de 1 ml de mincing. Jetez l’aiguille.
- Trancher le duodénum ouvert et le rincer dans une solution de mincing de 7 ml avant de le mettre dans un bateau de poids de taille moyenne contenant 7 ml de solution de mincing propre; maintenir sur la glace jusqu’à ce qu’il soit prêt à traiter davantage (étape 1.8 ou 1.11).
- Pour le cerveau, il peut être utile de diviser d’abord le cerveau en deux hémisphères; un hémisphère peut être sauvé pour une histopathologie possible (voir étape 1.2).
- Disséquer la région du cerveau (s) d’intérêt et doucement swish dans 7 ml de solution de mincing froid.
- Transférer les tissus(s) dans un bateau à poids moyen propre contenant 7 ml de solution de mincing froid et maintenir sur la glace jusqu’à ce qu’il soit prêt à traiter davantage (étape 1.8 ou 1.11; notez que les petites régions comme le cervelet et l’hippocampe peuvent ne pas nécessiter d’autre rognage).
- Pour l’estomac
- Retirer et jeter le forestomach. Ouvrez l’estomac glandulaire et lavez-vous des aliments à l’aide d’un tampon de mâche froide de 7 ml dans un bateau de poids de taille moyenne.
- Retirez une bande de 5 mm de l’estomac glandulaire proximal au duodénum pour la fixation pour l’évaluation possible de l’histopathologie (voir étape 1.2).
- Placer le reste de l’estomac dans un tampon de mincing froid de 7 ml dans un bateau de poids de taille moyenne et incuber sur la glace pendant 15 à 30 minutes.
REMARQUE: Cette étape d’incubation peut ne pas être nécessaire; cette étape a été incluse dans le protocole de validation jaCVAM, mais n’est pas mentionnée dans la directive de l’OCDE sur les tests8,9. - Transférer l’estomac à un morceau propre de paraffine (ou plat Petri ou peser le bateau) et gratter doucement l’épithélium de surface deux fois ou plus à l’aide d’une lame de scalpel ou d’un grattoir en polytetrafluoroethene (PTFE) pour enlever les débris. Ramassez la muqueuse gastrique avec des forceps et rincez avec 1 ml de tampon de mincing froid à l’aide d’un tuyauterie. Transférer le tissu gastrique sur une surface ou un plat propre.
- Gratter soigneusement l’épithélium de l’estomac 4 à 5 fois (plus, si nécessaire) dans la solution de mincing (généralement 250 L/souris ou 500-1,000 L /rat) avec le dos d’une lame de scalpel ou un grattoir PTFE pour libérer les cellules. Optionnellement, rincez le tissu avec un volume environ égal de solution de mincing pour récupérer plus de cellules. Recueillir la solution de mincing contenant des cellules libérées à l’aide d’un tuyauterie et transférer dans un tube de microcentrifuge sur la glace.
- Pour les échantillons de tissus de 1,5 ou 2,4 mm, couper une section de 3 à 4 mm de tissu hépatique ou de tissu cérébral ou 5 mm de dudodenum et transférer à un tube de microcentrifuge étiqueté de 1,5 ou 2,0 ml contenant 1 ml de solution de mincing froid. Hacher rapidement (30 s) avec des ciseaux de hache jusqu’à ce qu’ils soient finement dispersés, tout en gardant l’échantillon froid. L’échantillon doit sembler légèrement nuageux; cependant, il est courant que certaines pièces restent qui se déposeront au fond du tube.
- Pour utiliser le tissu frais, maintenir les tubes contenant du tissu haché ou des cellules épithéliales grattées sur la glace; utiliser le tissu pour préparer les glissements de comètes à moins d’environ 1 h de la récolte (décrite à la section 2).
- Pour la congélation des échantillons de tissus, immédiatement après le mincing ou la collecte de cellules épithéliales grattées
- Fixer le couvercle du tube et déposer le tube dans un flacon Dewar contenant de l’azote liquide; les tubes peuvent être maintenus dans l’azote liquide pendant la durée de l’autopsie (3 h).
- Récupérez les tubes à l’aide d’une louche et placez-les sur de la glace sèche pour les trier. Transférer les tubes dans une boîte de congélation sur de la glace sèche et entreposer la boîte dans un congélateur à -80 oC.
- Pour la préparation de cubes de tissu congelés, couper plusieurs petits morceaux de tissu (4 mm de diamètre et 6 mm de longueur; Figure 1).
- Déposez-les directement dans un bateau de poids de taille moyenne ou tout autre navire approprié contenant de l’azote liquide.
- Attendez quelques secondes que les morceaux congelent complètement et transfèrent des cubes de tissus congelés individuels dans un tube de microcentrifuge étiqueté ou un cryotube maintenu sur de la glace sèche; ne laissez pas les morceaux s’agglutiner pendant le processus de congélation.
- Transférer les tubes dans une boîte de congélation sur de la glace sèche et entreposer la boîte dans un congélateur à -80 oC.
2. Préparation de la diapositive
-
Pour les tissus hachés/grattés
- Maintenir les tubes contenant des tissus frais sur la glace humide.
- Placez les tubes de tissu congelé dans un bain d’eau à température ambiante jusqu’à ce que les échantillons soient complètement décongelés, tout en s’assurant qu’ils sont gardés froids. Transférer immédiatement les tubes sur la glace.
- Immédiatement avant de retirer les cellules pour le transfert à l’agarose (étape 2.3), mélanger délicatement chaque suspension cellulaire; pour les échantillons non filtrés, laissez les gros morceaux se déposer au fond du tube. Maintenir tous les tubes sur la glace jusqu’à ce que des toboggans aient été préparés pour tous les échantillons.
-
Pour le tissu en cubes
- Récupérez les tubes contenant des cubes de tissus du congélateur de 80 oC et maintenez-le sur la glace sèche jusqu’à la préparation de la glissière.
- Aliquot 1 mL de Medium Merchant (0,14 M NaCl, 1,47 mM KH2PO4, 2,7 mM KCl, 8,1 mM Na2HPO4, 10 mM NaEDTA, pH 7,4) ou solution de mincing dans un tube de microcentruge étiqueté de 1,7 mL pour chaque échantillon et maintenir la glace.
- Travailler rapidement pour éviter le dégel des tissus, placer un cube de tissu dans l’extrémité ouverte d’un dispositif de mincing de tissu de température ambiante(figure 1). Plusieurs morceaux de tissu peuvent être utilisés; si nécessaire, le tissu congelé peut être coupé ou fissuré en petits morceaux à l’aide d’un mortier froid et d’un pilon pour réduire la taille du cube pour s’insérer dans l’appareil.
- Insérez rapidement un piston de seringue assorti à la taille dans l’appareil pour pousser le tissu à l’extrémité de maille qui devrait alors être placée dans le tube de microcentrifuge contenant la solution de mincing froid ; éviter de forcer le liquide à déborder le tube. Immerger l’extrémité de maille de l’appareil pour environ 5-10 s dans la solution de mincing froid pour permettre au tissu de décongeler complètement.
- Déprimez complètement le piston jusqu’à ce que les cellules soient vues extrudant à travers les pores de maille. Tirez ensuite le piston vers le haut d’environ 2,5 cm et appuyez à nouveau complètement; répéter le processus plusieurs fois jusqu’à ce que la solution de mincing devienne turbide.
- Si nécessaire, l’échantillon peut être concentré pour augmenter la densité cellulaire par centrifugation réfrigérée pendant 5 min à 1100 tr/min et l’ablation d’une partie du supernatant.
- Répétez le processus pour tous les échantillons à l’aide d’un dispositif de mincing tissulaire propre pour chaque échantillon.
- Transférer 50 l de suspension cellulaire dans un tube contenant 450 L de 0,5 % de point de fusion bas à 37 oC.
REMARQUE: Les volumes peuvent être ajustés, mais la quantité d’agarose doit être de 1 %. - Préparer et marquer des diapositives comme décrit précédemment10,11.
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Representative Results
Étude 1
Le foie a été récolté à partir de deux cohortes de rats mâles Sprague Dawley administré de l’huile de maïs pendant 4 jours, décalé par une semaine. Des diapositives ont été préparées à partir de tissus fraîchement hachés, de tissus hachés congelés et de tissus en cubes congelés traités dans la solution moyenne ou de mincing de Merchant à l’aide du dispositif de mincing tissulaire. Les tissus congelés obtenus auprès d’animaux de la première cohorte ont été évalués après l’entreposage du congélateur pendant 3,5 mois. Les tissus congelés obtenus auprès d’animaux de la deuxième cohorte ont été évalués après stockage pendant 6 mois. Les comètes présentant la morphologie caractéristique du « hérisson », indicatif des cellules fortement endommagées (d’étiologie incertaine qui peut inclure la cytotoxicité ou le stress mécanique), n’ont pas été incluses dans la notation de l’ADN de queue de % ; le pourcentage de hérissons, identifiés uniquement lors d’une inspection visuelle de la morphologie, a été calculé séparément selon le TG 4899de l’OCDE . Les résultats d’ADN moyen de la queue pour les animaux des deux cohortes (basés sur la notation de 100 cellules/animaux) sont résumés à la figure 2A. Toutes les méthodes utilisant le tissu congelé ont produit des valeurs plus élevées, bien que pas toujours statistiquement différentes, que les tissus frais. Considérant que la limite supérieure recommandée pour l’ADN de queue % dans le foie de rat frais est de 6%9, ces résultats démontrent que l’une de ces méthodes peut bien fonctionner pour évaluer le tissu congelé. La solution de mincing a fonctionné au moins aussi bien que le médium de Marchand ; puisque ce dernier prend plus de temps à préparer, la solution de mincing a été choisie pour des études ultérieures. Il n’y avait aucune différence statistiquement significative dans les dommages dans les tissus de la deuxième cohorte animale qui avait été stockée congelée pendant 6 mois avant le traitement par rapport aux tissus de la première cohorte traitées après 3,5 mois d’entreposage. Dans l’ensemble, le % hérissons était parallèle à l’ADN de la queue en % bien que le % de hérissons dans les tissus congelés par rapport aux tissus frais soit plus variable que pour % d’ADN de queue(figure 2B). Les valeurs de ces critères d’évaluation dans le tissu frais fournissent une base de base par rapport laquelle les dommages d’ADN introduits de façon artéfactualement par les méthodes de congélation peuvent être mesurés.
Étude 2
Les souris femelles B6C3F1 ont été administrées saline normale ou le mélinome, le méthane d’éthyle (SMU) à 200 mg/kg/jour dans la saline normale pendant trois jours. Le tissu a été récolté 3 h après l’administration finale de dose et traité frais dans l’essai de comète. Le tissu additionnel a été congelé de flash après avoir été haché dans la solution de mincing ou recueilli comme cubes. Des échantillons en cubes ont ensuite été traités en solution de cirage à l’aide du dispositif de tamis immédiatement avant la préparation des glissières de comète. Partant du principe que les cellules présentant la morphologie des hérissons représentent des cellules à l’extrémité supérieure du continuum des dommages causés par l’ADN induits par les produits chimiques, les hérissons scorables par le logiciel d’imagerie ont été inclus dans la notation automatisée de l’ADN de queue en %. Les résultats de l’ADN de la queue en % (basés sur la notation de 150 cellules/animaux) sont résumés à la figure 3. Le tissu de foie congelé comme cubes et par la suite traité utilisant le dispositif de mincing de tissu a donné des résultats très semblables à ceux obtenus pour le tissu fraîchement haché. Les valeurs d’ADN de queue en % étaient un peu plus élevées pour le tissu haché congelé, mais les valeurs de base pour le tissu haché congelé étaient inférieures à 6 %, comme recommandé pour le foie de rat frais dans la ligne directrice d’essai de l’OCDE pour l’essai de comète9. Une augmentation statistiquement significative des dommages causés par l’ADN induit par le SME a été mesurée dans des échantillons de tissus traités par les trois méthodes.
Étude 3
Des parties de tissu hépatique prélevées sur des souris femelles B6C3F1 dans le cours d’une étude de toxicité de 90 jours sur un produit chimique d’essai menée par un laboratoire éloigné ont été hachées ou coupées en cubes, congelées par flash et expédiées toute la nuit sur de la glace sèche à ce laboratoire pour analyse. Le tissu haché a été analysé à la suite de 2 mois d’entreposage du congélateur(figure 4). Les cellules qui sont apparues lors d’une inspection visuelle étaient des hérissons mais qui étaient décorables par le logiciel d’imagerie ont été incluses dans les mesures de l’ADN de queue en % (150 cellules notées/animaux). Le nombre de hérissons (qu’ils soient scorables ou non) identifiés uniquement lors d’une inspection visuelle de la morphologie dans un total de 150 cellules/animaux a été compilé séparément pour fournir des informations sur la fréquence de ces cellules fortement endommagées. Dans l’ensemble, les dommages causés par l’ADN (mesurés sous forme d’ADN de queue en %) dans les tissus hachés congelés étaient élevés dans tous les groupes de dose ayant une variabilité importante d’animaux à animaux, y compris dans le groupe témoin du véhicule. Les résultats de l’ADN de queue en % se sont corrélés avec % de hérissons (identifiés uniquement sur la base de la morphologie), ce qui indique que les hérissons ont contribué de manière substantielle au niveau élevé de dommages à l’ADN observés dans ces échantillons. Sur la base du niveau élevé de dommages à l’ADN mesuré dans le tissu haché, le tissu en cubes congelé a ensuite été analysé après 22 mois de stockage(figure 4). Les dommages d’ADN et % hérissons étaient très bas dans le tissu en cubes congelé flash qui avait été préparé en parallèle avec les échantillons de tissu haché. Ainsi, les cellules fortement endommagées reflétées par la morphologie des hérissons dans les échantillons de tissus hachés n’étaient manifestement pas le résultat d’un processus biologique, mais ont probablement été introduites par une perturbation mécanique et/ou un réchauffement tissulaire pendant la procédure de mincing avant d’être congelés par flash; ces données ont été jugées peu fiables. Heureusement, l’analyse du tissu en cubes congelé a fourni un résultat clair, à savoir l’absence d’une réponse de dommages d’ADN dans le foie des souris femelles après trois mois d’exposition au produit chimique d’essai. Les résultats fournis par cette étude de cas illustrent le risque associé à la préparation des tissus hachés par un laboratoire relativement inexpérimenté et démontrent l’utilité de la méthode congelée de tissu en cubes pour contourner ce problème.
Figure 1 : Dispositif de mouchoir et piston utilisé pour préparer une suspension à cellule unique à partir de tissus congelés. Le prototype (4,5 mm de diamètre intérieur, 0,4 mm de taille en maille) a été gentiment fourni par le Dr Gunnar Brunborg (NorGenotech, Oslo, Norvège). Le panneau de droite fournit un exemple d’un cube de tissu de taille appropriée pour une utilisation avec l’appareil. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Comparaison des dommages causés par l’ADN mesurés dans des échantillons de foie de souris hachés et homogénéisés frais et congelés. Le foie a été récolté à partir de deux cohortes décalées (n - 5/groupe/cohorte) de rats Sprague Dawley mâles administré de l’huile de maïs pendant 4 jours. Des diapositives ont été préparées à partir de tissus fraîchement hachés, de tissus hachés congelés et de tissus en cubes congelés traités dans la solution moyenne ou de mincing de Merchant à l’aide du dispositif de mincing tissulaire. Les tissus congelés ont été analysés 3,5 et 6 mois suivant l’autopsie pour les cohortes 1 et 2, respectivement. Les comètes classées comme hérissons en fonction de la morphologie n’ont pas été incluses dans la notation de l’ADN de queue en %. (A) Cohorte moyenne % résultats d’ADN de queue. (B) Cohorte moyenne % des résultats hérissons. Les barres d’erreur reflètent l’écart standard. Des analyses statistiques ont été effectuées pour comparer les tissus congelés avec les tissus frais pour chaque cohorte et pour comparer les résultats entre les deux cohortes pour chaque méthode de préparation des tissus. - Statistiquementp différent (p’lt; 0,05) à partir de tissus hachés frais au sein de la même cohorte à l’aide du t-test de l’étudiant; #statistically différentes(p-lt; 0,05) à partir de tissus hachés frais au sein d’une même cohorte à l’aide du test Mann-Whitney pour des données non normalement distribuées; différence statistique(p-lt; 0,05) entre les cohortes utilisant le t-test de l’étudiant. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Comparaison des dommages causés par l’ADN induits par le SMU dans le tissu hépatique traité par différentes procédures. Moyenne % d’ADN de queue pour les souris B6C3F1 administrées par des souris ou 200 mg/kg/jour de SME pendant trois jours (n - 5/groupe). Les foies ont été récoltés 3 h après l’administration de la dose finale et traités frais dans l’essai de la comète. Le tissu hépatique additionnel a été congelé de flash après avoir été haché dans la solution de mincing ou recueilli comme cubes ; des échantillons en cubes ont été homogénéisés à l’aide du dispositif de mincing tissulaire immédiatement avant la préparation des lames de comète. Pour s’assurer que les cellules à l’extrémité supérieure du continuum des dommages causés par l’ADN induit par le SME n’étaient pas exclues de l’analyse, les comètes qui, après inspection visuelle, semblaient répondre à la description morphologique des hérissons, mais se sont avérées scorables par le logiciel d’imagerie. Les barres d’erreur reflètent l’écart standard. Le t-test d’un élève a été utilisé pour comparer la quantité de dommages à l’ADN chez les animaux exposés au SMU par rapport à celle des animaux témoins du véhicule pour chaque méthode de préparation de l’échantillon. Augmentation statistiquement significative p à p’lt; 0,05. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4. Étude de cas démontrant l’utilité de la méthode de cube congelé et des données de haute qualité obtenues après stockage prolongé. Des portions de tissu hépatique prélevées sur des souris femelles B6C3F1 exposées à diverses concentrations d’un produit chimique d’essai pendant 90 jours (n - 5/groupe) ont été hachées ou coupées en cubes et flash congelés au laboratoire de la vie et ensuite expédiés à ce laboratoire pour analyse. Le tissu haché a été analysé après 2 mois de stockage; en raison de la mauvaise qualité des données, le tissu en cubes congelé a ensuite été analysé après 22 mois de stockage. Pour s’assurer que les cellules à l’extrémité supérieure du continuum des dommages causés par l’ADN chimique n’étaient pas exclues de l’analyse, les données des cellules scorables qui, après inspection visuelle semblaient être des hérissons, ont été incluses. (A) Groupe signifie % résultats d’ADN de queue. Comparé au tissu haché, des résultats de haute qualité ont été obtenus à partir du tissu en cubes congelé, même après stockage prolongé. (B) Groupe signifie % des résultats hérissons. Une mauvaise technique de mincing est évidente à partir des dommages étendus non biologiques d’ADN observés comme comètes hérisson dans les échantillons de tissu haché. Les barres d’erreur reflètent l’écart standard. Un ANOVA avec le test de Dunnett a été utilisé pour évaluer une réponse positive au produit chimique d’essai pour chaque méthode de préparation d’échantillon. Il n’y avaitp aucun groupe de dose statistiquement significatif (p-lt; 0,05) détecté pour l’une ou l’autre méthode. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Dommages de base de l’ADN mesurés dans les tissus congelés du cerveau de rat. Les résultats de l’analyse des comètes sont fournis pour les tissus hachés ou en cubes congelés représentant plusieurs régions différentes du cerveau des rats Sprague Dawley mâles et femelles. Les données (générées par l’inclusion de comètes hérissons scorables) ont été rassemblées au cours de plusieurs études; n - nombre total de tissus cérébraux évalués pour chaque méthode de préparation de l’échantillon. Les barres d’erreur reflètent l’écart standard. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Comme démontré précédemment7,12,13, correctement manipulé flash congelé tissu haché fournit de bons résultats dans l’essai de la comète. En fait, les valeurs d’ADN de queue de base pour les rats hachés congelés et le foie de souris préparés dans notre laboratoire sont généralement de 6 %, comme le recommande la ligne directricede l’OCDE pour les échantillons de foie de rat fraîchement hachés. De bons résultats ont été obtenus par plusieurs laboratoires à l’aide d’une variété de types de tissus qui ont été hachés et stockés congelés; De même, les cellules épithéliales congelées flash grattées à partir d’organes dans le tractus gastro-intestinal ont été utilisés avec succès dans l’essai de la comète7,12,13,14. Le tissu haché/gratté congelé semble relativement stable pendant au moins plusieurs mois. La méthode utilisant l’homogénéisation de cubes de foie surgelés flash à l’aide d’un dispositif de mâche tissulaire initialement décrit par Jackson et al.6, donne des résultats dans l’essai de la comète au moins comparable et généralement mieux (c.-à-d., des niveaux de base inférieurs de dommages à l’ADN) que ceux obtenus pour le foie haché congelé. Cette méthodologie s’applique également aux autres types de tissus6; d’après notre expérience, d’excellents résultats ont également été obtenus à l’aide de duodenum en cubes congelés (données non montrées) et de tissus cérébraux(figure 5). Cependant, le dispositif de tamis peut ne pas être favorable à l’homogénéisation de tous les types de tissus. Dans une étude pilote, nous avons constaté que le tissu cardiaque musculaire ne pouvait pas facilement être forcé par le dispositif de tamis, ayant pour résultat la récupération pauvre de cellules ; au lieu de cela, hacher le tissu immédiatement après la décongélation des suspensions cellulaires cédées avec des valeurs d’ADN de queue de base % comparables à celles hachées avant le gel flash (données non montrées). Notamment, lorsqu’il est manipulé correctement pendant l’autopsie (c.-à-d. gardé froid et humide; flash congelé comme des morceaux individuels et ne pas autorisé à décongeler partiellement), le tissu en cubes congelé flash a produit des dommages à l’ADN de base très faibles, même après environ deux ans de stockage du congélateur(figure 4).
L’utilisation de suspensions de cellules congelées ou de tissu en cubes dans l’essai de comète offre plusieurs avantages par rapport aux tissus frais, y compris : 1) la facilitation de la collecte simultanée de plusieurs types de tissus pour l’analyse de comète ; 2) la facilitation de la collecte des tissus dans un laboratoire de la vie et le transfert d’échantillons à un autre laboratoire aux fins d’analyse; 3) la commodité de reporter une décision d’analyser un tissu donné pendant des mois. Bien que l’homogénéisation des tissus congelés au moment de la préparation de la glissière soit plus lourde que le tissu frais au moment de la récolte, l’utilisation de tissus en cubes congelés offre plusieurs avantages supplémentaires qui comprennent : 1) aucune exigence pour le personnel formé dans l’analyse de la comète (p. ex., unité mobile) ou les fournitures/réactifs spécialisés à l’autopsie; 2) moins de possibilités d’erreurs techniques (p. ex., réchauffement de l’échantillon; libération insuffisante de cellules; taille d’échantillon de tissu sous-optimale) pendant l’autopsie; 3) possibilité minimale d’introduire des dommages mécaniques à l’ADN pendant le traitement de l’échantillon (p. ex., cisaillement de mincing); et 4) dommages à l’ADN de base bas, même après stockage prolongé.
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Disclosures
Ces travaux ont été soutenus par le Programme de recherche intra-muros des NIH, National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) sous contrat HHSN273201300009C; toutefois, les déclarations, les opinions ou les conclusions qui y sont contenues ne représentent pas nécessairement les déclarations, les opinions ou les conclusions du NIEHS, des NIH ou du gouvernement des États-Unis.
Acknowledgments
Les auteurs sont redevables à Lincoln Martin et Kelley Owens pour une assistance technique experte préparant et marquant des diapositives de comète et le Dr Carol Swartz pour avoir effectué des analyses statistiques. Les auteurs reconnaissent également les contributions de soutien des membres des programmes de toxicologie génétique, de toxicologie d’enquête et d’autopsie à l’ILS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryovials | Corning Costar | 430488 | |
| Dental Wax Sheets | Electron Microscopy Sciences | 72670 | |
| Dissecting (Mincing) Micro Scissors | Fisher Scientific | 08-953-1B | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Gibco | 14175-079 | |
| KCl | Teknova | P0315-10 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Low Melting Point Agarose | Lonza | 50081 | |
| Microfuge Tubes (1.7 mL) | Corning | 3207 | |
| Na2EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | |
| Neutral Buffered Formalin | Leica | 600 | |
| Scalpel Blades | Miltex | 4-110 | |
| Syringe Plunger (1 mL) | Fisher Scientific or Vitality Medical | 14-826-88; 8881901014 | Becton Dickinson or Monoject tuberculin syringe |
| Tissue Mincing Device | NorGenoTech (Oslo, Norway) | None | Small variability in diameter observed which can affect snuggness of plunger. |
| Tweezers, plastic | Trade Winds Direct | DF8088N | Reinforced nylon, nonsterile, blunt tip, autoclavable; tradewindsdirect.com |
| Weigh Boats | Krackler Scientific/Heathrow Scientific | 6290-14251B |
References
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