Summary
פרוטוקול זה מתאר מספר הליכים להכנת דגימות רקמה באיכות גבוהה קפואה בזמן נקרוזה לשימוש במערכת שביט להעריך נזק DNA: 1) רקמות טחון, 2) מגורד תאים אפיתל ממערכת העיכול, ו 3) לקוביות רקמה דגימות, הדורשות הומוגון באמצעות מכשיר משתמש ברקמה.
Abstract
הטיפול שביט הוא צובר פופולריות כאמצעי להערכת נזק DNA בתאים מתורבתים ורקמות, במיוחד בעקבות חשיפה כימיקלים או שלחצים סביבתיים אחרים. השימוש שיטת שביט בבדיקת הרגולציה של פוטנציאל גנומיק של מכרסמים כבר מונע על ידי אימוץ של ארגון לשיתוף פעולה כלכלי ופיתוח (ה-OECD) בדיקת מנחה ב 2014. שקופיות של שביט מכינים בדרך כלל מרקמה טרייה בזמן נקרופסי; עם זאת, דוגמאות לרקמות מקפיא יכולות להימנע מאתגרים לוגיסטיים הקשורים להכנה בו של שקופיות מאיברים מרובים לכל בעל חיים ומבעלי חיים רבים ללימוד. ההקפאה גם מאפשרת דגימות משלוח ממתקן החשיפה למעבדה שונה לניתוח, ואחסון של רקמה קפואה מאפשר מאוד החלטה ליצור נתונים נזק DNA עבור איבר נתון. שיטת השביט האלקליין היא שימושית לזיהוי חשיפה של דנ א כפול ומעברי-גדיל בודדים, נגעים אלקלי-לבנה, והפסקות שלמות הקשורות לתיקון כריתה DNA לא מלאה. עם זאת, נזק לדנ א יכול לנבוע גם מהטיה מכנית או הליכי עיבוד לדוגמה פסולים, הקמת תוצאות הטיפול. שינוי באוסף ועיבוד של דגימות רקמות במהלך נקרוזים עלול להיות קשה לשלוט בשל העובדים מעבדה ברמות שונות של ניסיון בקצירת רקמות עבור שביט השביט. שיפור עקביות באמצעות הדרכה מרענן או הפריסה של יחידות ניידות מאויש עם אנשי מעבדה מנוסים הוא יקר ולא תמיד יכול להיות אפשרי. כדי לייעל את הדור העקבי של דגימות באיכות גבוהה עבור ניתוח שביט כוכב, שיטה עבור הומוגניזציה קוביות פלאש קפוא של רקמות באמצעות מכשיר מותאם אישית רקמת העור הוערך. דגימות שהוכנו לצורך שביט בשיטת השביט על ידי שיטה זו בהשוואה לטובה באיכות לדוגמיות של רקמות טריות וקפואות שהוכנו על-ידי מינויה במהלך נקרופסי. יתר על כן, נזק DNA בסיסית נמוכה נמדד בתאים מקוביות קפואות של רקמות לאחר אחסון ממושך.
Introduction
שיטת השביט משמשת יותר ויותר כאמצעי להערכת נזקי DNA בתאים מתורבתים ורקמות חשופים לכימיקלים או לחצים סביבתיים אחרים1. האפשרות הניתנת לזיהוי הפסקות דנ א כפולות ויחיד, נגעים אלקלי-לבנה, ומעברי-גדיל בודדים הקשורים לתיקון DNA לא שלם. המועצה הבינלאומית להרמוניה של דרישות טכניות עבור תרופות לשימוש האדם (העליונה) מנחה עבור בדיקות התרופות ממליץ על הצירוף DNA שבירה כגון שיטת השביט כמבחן השני כדי להשלים את הטיפול מכרסם מיקרוקליאוס מיקרו להערכת vivo גנורעילות וכמבחן מעקב להערכת מצב של פעולה באברי היעדשל אינדוקציה גידול הרשות האירופית לבטיחות מזון (EFSA) ממליצה על שיטת שביט vivo כמבחן המשך המעקב המתאים לחקירת הרלוונטיות של תוצאה חיובית במבחן הרעילות של מבחנה3. ב-2014 אושרה מבחן ה-OECD לצורך הבחינה של כוכב השביט המכרסמים, ובכך הגבירה את יכולת ההתמדה לשימוש בבדיקות רגולטוריות של פוטנציאל הגנוטוקסיס. המנה מבוססת על הפרדה אלקטרופיניטית של לולאות DNA רגוע ושברי העוברים מתוך נוקלאונואידים של תאים ליטיים. ביסודו של דבר, תאים בודדים מוטבעים agarose כי כבר שכבתית על שקופיות מיקרוסקופ. שקופיות לאחר מכן שקוע במאגר הליזה ואחריו בסיסי (pH > 13) פתרון, אשר מאפשר את ה-DNA הגרעינית היטב מתפתל להירגע ולהירגע. שקופיות ממוקמות לאחר מכן בשדה חשמלי, אשר מעורר הגירה של דנ א טעונה שלילית לקראת האנדה, יצירת תמונות הדומות לשביט; הכמות היחסית של ה-DNA בזנב השביט בהשוואה לראש כוכב השביט הוא פרופורציונלי באופן ישיר כמות של נזק DNA; תוכן ה-DNA בזנב הוא בדרך כלל בכמת באמצעות תוכנת דימות דיגיטלי.
בגלל שיטת השביט מזהה דנ א מפוצל, כימות מדויק של הנזק לחשיפה DNA המושרה יכול להיות מבולבל על ידי פיצול כרומטין הקשורים נמק או אפופטוזיס הנובע הטיפול המושרה ציטוזה או מתח. יתר על כן, נזק DNA יכול להתרחש כתוצאה של הטיה מכני או עיבוד לדוגמה לא תקין4. החשיבות של שמירה על רקמות שנקטפו מקורר לפני הכנת שקופית כדי למזער את רמת בסיסית של נזק DNA הפגינו בעבר5,6. מעבדות רבות מכינות שביט מתוך רקמה טרייה; עם זאת, הדבר יכול להיות מאתגר לוגיאני כאשר מכינים שקופיות מסוגי רקמות מרובים לכל בעל חיים במחקר עם מספר רב של בעלי חיים. כמו-כן, מדובר בבעיה כאשר ההכנה והניתוח של השקופיות מתרחשות במעבדה מרוחקת, הדורשת משלוח של דגימות. לדוגמה, תוכנית הטוקסיקולוגיה הלאומית של ארצות הברית כוללת את שיטת השביט כרכיב של תוכנית הרעלים הגנטית שלה בדיקה (https://ntp.niehs.nih.gov/testing/types/genetic/index.html) ולפעמים משלבת את הערך לתוך 28 או 90 יום לימודי הרעילות במינון; זה מחייבת אוסף של רקמות על ידי המעבדה בחיים והעברת דגימות למעבדה אחרת לניתוח. כדי להשיג את זה, חתיכות רקמה הם כתוש, ו/או תאים אפיתל של מערכת העיכול הם מגורד ושתלים סלולריים הם פלאש קפואים ומאוחסנים במקפיא עבור המשלוח הבאים ואחסון על ידי המעבדה המקבלת עד ניתוח7. טיפול נאות של דגימות חיוני להשגת נתונים באיכות גבוהה באמצעות רקמה קפואה; עם זאת, מניפולציה בלתי משתנה של דגימות רקמה במהלך נקרוזים שבוצעו על ידי אנשים שמשתנים אי פעם קשה לשלוט, במיוחד במעבדות בחיים כי לא באופן שגרתי הקציר רקמות עבור שביט השביט. רענון האימון של צוות נמק או שימוש ביחידה ניידת מאויש על ידי אנשי מעבדה מנוסים כדי לאסוף דגימות רקמות טריות או קפואות הוא לעתים קרובות יקר מדי, לא ריאלי, או פשוט חסר ערך.
כדי להבטיח בצורה טובה יותר את הדור העקבי של דגימות רקמה באיכות גבוהה עבור העברה לאתר מרוחק עבור ניתוח שביט כוכב, השירות של שיטה שפורסמה6 של שימור רקמות מפני קוביות פלאש קפוא של רקמות נחקרו. בשיטה זו, קוביות קפוא של רקמות נטענים לתוך מכשיר מיקרו של רקמת נירוסטה (איור 1) הממוקם לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה המכיל מאגר קר. הקוביה של רקמות הוא דחף לאחר מכן דרך מד קטן שינוי בסוף המכשיר. שוב ושוב השעיית רקמות דרך מסננת שינוי בשני הכיוונים מספר פעמים גורמת השעיית תא אחיד בודד יחסית. דגימות שהוכנו על ידי שיטה זו בהשוואה לטובה באיכות לדגימות רקמות טריות וקפואות שהוכנו על ידי מינויה. כתוספת תועלת, בניגוד דגימות בשר טחון, קוביות רקמה ניתן לאחסן קפוא לפרקי זמן ממושך ועדיין להניב תוצאות באיכות גבוהה בתוך שביט השביט.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
רקמות נקצרו במהלך התנהלות המחקרים שבוצעו במתקני AAALAC-מוסמך במעבדות החוזה NTP בהתאם לתקנות המעבדה הטובה לתרגול (21 CFR Part 58) ולהשתמש בפרוטוקולים בעלי חיים שאושרו על ידי החיה המוסדית הוועדה טיפול ושימוש (IACUC) בכל מעבדה.
1. הקציר ועיבוד רקמות
הערה: זה שימושי להכין צינורות לדוגמה כפולים (למשל, כבד) או להעביר כמחצית של מדגם לצינור אחסון אחר (למשל, התריסריון, הבטן) כדי לאפשר ניתוח מחדש, במידת הצורך. כדי למזער את השונות הפוטנציאלית לדוגמה לדוגמאות לרקמות מערכת העיכול, מומלץ לקחת טיפול כדי לדגום את אותו אזור של רקמה ביחס לקיבה עבור כל חיה, ומדגם להיות מחולק ליצירת דגימות כפולות. מלקחיים פלסטיק מומלצים להעברת רקמות דביקות כגון מוח. כאופציה, בשר טחון, שפשוף או מולגניים ההכנות רקמות ניתן לסנן כדי להשיג הומוגנית תא יחיד השעיות באמצעות מסננת תא 40 יקרומטר המצורפת צינור חרוט.
- הסר את כל הרקמה, האיברים והפסולת המחוברים מאברים מעניינים. מיד לאחר ההסרה, מוהים את האיבר במרץ בסירה שוקלים בגודל בינוני המכיל ~ 7 מ ל של הצטננות קר++ טרי מוכן פתרון מלח, 10% v/v dmso, ו20 מ"מ edta pH 7.5) כדי להסיר דם שיורית פסולת.
- העבר כל איבר לסירת שקילה נקייה אחרת המכילה מספיק (~ 7 mL) פתרון מינורי קר כדי לשמור על הרקמה שקוע, על קרח, עד לעיבוד נוסף.
- הסר מקטע של כל אחד מאברי העניין והציבו אותו בקלטת הטבעה. תקן בתוך 10% פורמאלין מאגור נייטרלי, לקצץ, ו פרפין להטביע על פי הנהלים הסטנדרטיים של המעבדה להערכת העתיד העתידי האפשרי.
- עבור הכבד, לחתוך קטע האורך 5 מ"מ של האונה השמאלית ומסושת בעדינות ב-~ 7 מ ל של פתרון מינוב קר. מניחים את רצועת הרקמה לתוך הסירה נקי בגודל בינוני שוקל המכיל ~ 7 מ ל של פתרון קריר קר ולשמור על הקרח עד מוכן לעבד עוד (שלב 1.8 או 1.11).
- עבור התריסריון, לחתוך חלק 10 מ"מ של התריסריון האבובית לבטן. שימוש a 21 – 25 גרם מחט, סומק להסיר פסולת וחיידקים.
- הכנס את המחט לקצה אחד של התריסריון ואת הסומק עם 1 מ ל של פתרון מינוב קר.
- ריקון הכיוון השני על-ידי היפוך התריסריון שוב ושוב עם 1 מ ל של פתרון מחדש. להיפטר המחט.
- פורסים את התריסריון פתוח ולשטוף אותו ב ~ 7 מ ל של פתרון לפני לשים אותו לתוך סירת שקילה בינונית בגודל המכיל ~ 7 מ ל של פתרון נקי מיותר; לשמור על הקרח עד מוכנים לעבד עוד (שלב 1.8 או 1.11).
- עבור המוח, זה עשוי להיות שימושי לחלק תחילה את המוח לשתי אונות; כמחצית אחת ניתן לשמור עבור histopathology אפשרי (ראה שלב 1.2).
- לנתח את אזור המוח (עם) של עניין ומסושת בעדינות ב-~ 7 מ ל של פתרון מינוב קר.
- העברת רקמות (s) לסירה נקיה בגודל בינוני המכיל ~ 7 מ ל של פתרון מועט קר ולשמור על הקרח עד מוכן לתהליך נוסף (שלב 1.8 או 1.11; שים לב כי אזורים קטנים כגון המוח הקטן וההיפוקמפוס עשויים לא לדרוש קיצוץ נוסף).
- לבטן
- להסיר ולמחוק את היער. לחתוך לפתוח את הבטן בלוטות ולשטוף חינם מהאוכל באמצעות ~ 7 מ ל של מאגר מינורי קר בסירה שקילה בינונית.
- הסר רצועה של 5 מ"מ של בטן הבלוטות האבובית לתריסריון עבור קיבעון אפשרי הערכה histopathology (ראה שלב 1.2).
- מניחים את הבטן הנותרת ל ~ 7 מ ל של מאגר מינורי קר בסירת שקילה בינונית בגודל ומודטה על הקרח במשך 15 – 30 דקות.
הערה: ייתכן ששלב הדגירה הזה אינו הכרחי; שלב זה נכלל בפרוטוקול האימות של הג, אך אינו מוזכר במבחן ה-OECD מנחה8,9. - העבר את הקיבה לחתיכת מנקה של פרפין (או צלחת פטרי או סירה שוקלת) ובעדינות לגרד את האפיתל פני השטח פעמיים או יותר באמצעות להב אזמל או המגרד polyארבאואפן (מצופה) להסיר פסולת. להרים את רירית הקיבה עם מלקחיים ולשטוף עם 1 מ ל של מאגר מינורי קר באמצעות pipet. להעביר את רקמת הקיבה למשטח נקי או צלחת.
- בזהירות לגרד את האפיתל הקיבה 4 – 5 פעמים (יותר, אם יש צורך) בפתרון מינורי (בדרך כלל 250 μL/עכבר או 500-1000 μL/עכברוש) עם הגב של להב אזמל או מגרד לשחרר את התאים. באופן אופציונלי, לשטוף את הרקמה עם נפח שווה בקירוב של פתרון מינורי כדי לשחזר תאים נוספים. לאסוף את הפתרון הכולל המכיל תאים שפורסמו באמצעות pipet ולהעביר לצינור מיקרוצנטריפוגה על הקרח.
- לקבלת דגימות רקמה מבית הקירור, חותכים סעיף 3 – 4 מ"מ של רקמת הכבד או המוח או ~ 5 מ"מ של התריסריון והעברת תווית 1.5 או 2.0 mL מיקרוצנטריפוגה שפופרת המכיל 1 מ ל של פתרון מינוגה קר. המאדות במהירות (≤ 30 s) עם מספריים מינ, עד דק התפזרו, תוך שמירה על המדגם קר. המדגם צריך להיראות מעט מעונן; עם זאת, מקובל שחלק מהחלקים יישארו מתפשרים בתחתית הצינורית.
- כדי להשתמש ברקמה טרי, לשמור על צינורות המכילים רקמה טחון או תאים אפיתל שפשוף על הקרח; השתמשו ברקמה כדי להכין שקופיות של שביט בתוך כ 1 h של קציר (המתואר בסעיף 2).
- על הקפאת דגימות הרקמה, מיד לאחר מקור או אוסף של תאים אפיתל מגורד
- אבטחו את מכסה הצינור והצינור הנפתח לתוך בקבוקון מלחמתי המכיל חנקן נוזלי; צינורות עשויים להישמר חנקן נוזלי למשך נקרופסי (≤ 3 h).
- לאחזר צינורות באמצעות מצקת ומקום על קרח יבש למיין. העברת צינורות לתוך המקפיא על קרח יבש ותיבת החנות במקפיא-80 ° c.
- להכנת קוביות קפואות של רקמה, חותכים כמה חתיכות קטנות של רקמה (≤ 4 מ"מ בקוטר ~ 6 מ"מ באורך; איור 1).
- שחרר אותם בנפרד ישירות לתוך סירת שקילה בינונית או כלי מתאים אחרים המכילים חנקן נוזלי.
- המתן כמה שניות לחתיכות כדי להקפיא לחלוטין ולהעביר קוביות רקמה קפואה בודדים לצינור מיקרוצנטריפוגה בתווית או קריוצינור מתוחזק על קרח יבש; אל תאפשר לחלקים להתאחד במהלך תהליך ההקפאה.
- העברת צינורות לתוך המקפיא על קרח יבש ותיבת החנות במקפיא-80 ° c.
2. הכנת שקופיות
-
לרקמת בשר טחון
- שמרו על צינורות המכילים רקמות טריות על קרח רטוב.
- מניחים צינורות של רקמה קפואה לתוך הטמפרטורה בחדר אמבט מים עד הדגימות מופשרים לחלוטין, תוך הקפדה שהם נשמרים קר. מיד להעביר את הצינורות על הקרח.
- מיד לפני הנסיגה תאים עבור העברה agarose (שלב 2.3), לערבב כל תא השעיה בעדינות; עבור דגימות שאינן מסוננות, אפשר לגושים גדולים להתיישב בתחתית הצינורית. לשמור על כל הצינורות על הקרח עד שקופיות הוכנו עבור כל הדגימות.
-
לקוביות רקמה
- לאחזר צינורות המכילים קוביות רקמה ממקפיא 80 ° c ולשמור על קרח יבש עד הכנת השקופיות.
- מחלק 1 mL של בינונית של הסוחר (0.14 M היאl, 1.47 mM KH2PO4, 2.7 mm Kcl, 8.1 mm Na2Hpo4, 10 מ"מ naedta, pH 7.4) או מיניגה פתרון לתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה המסומנים בשנת mL עבור כל מדגם ולשמור על קרח.
- עובד במהירות כדי למנוע את הרקמה הרקמות, למקם קוביית של רקמה לתוך הקצה הפתוח של מכשיר מהפך רקמת טמפרטורת חדר (איור 1). ניתן להשתמש בחלקים מרובים ברקמות; במידת הצורך, ניתן לגזור את הרקמה הקפואה או לחדור לחלקים קטנים יותר באמצעות מרגמה קרה ומכתש כדי להקטין את גודל הקוביה כדי להשתלב במכשיר.
- במהירות להוסיף מזרק גודל בהתאמה לתוך המכשיר כדי לדחוף את הרקמה לקצה שינוי שצריך להציב לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה המכיל פתרון מהיר קר; להימנע מאלץ את הנוזל לגלוש בשפופרת. לטבול את קצה הרשת של המכשיר עבור כ 5-10 בפתרון קריר קר כדי לאפשר את הרקמה להפשיר לחלוטין.
- לדכא לחלוטין את הבוכנה עד התאים נראים הבלטת ממד דרך נקבוביות רשת. לאחר מכן משוך את הבוכנה למעלה כ 2.5 ס מ ולחץ שוב לחלוטין; חזור על התהליך מספר פעמים עד שהפתרון הזמני הופך להיות מבולבל.
- במקרה הצורך, המדגם עשוי להיות מרוכז כדי להגדיל את צפיפות התא על ידי צנטריפוגה בקירור עבור 5 דקות ב 1100 סל ד והסרה של חלק supernatant.
- חזור על התהליך עבור כל הדגימות באמצעות מכשיר ניקוי רקמות נקי עבור כל דוגמה.
- העבר 50 μL של השעיית התא לצינור המכיל 450 μL של 0.5% נקודת התכה נמוכה agarose ב-37 ° c.
הערה: ניתן לכוונן אמצעי אחסון, אך כמות האגבה צריכה להיות ≤ 1%. - להכין ולהבקיע שקופיות כמתואר בעבר10,11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מחקר 1
הכבד נקצרו משני גדודים של עכברושים גבריים מנוהלים בשמן תירס במשך 4 ימים, התנודדו בשבוע אחד. השקופיות היו מוכנות מרקמות טריות, מרקמות קפואות ומוקפאות, ורקמת העור הקפואה המעובדת בתמיסה המדיום של הסוחר או בשימוש במכשיר הרקמות. רקמות קפואות שהתקבלו מבעלי חיים מן הקבוצה הראשונה הוערכו לאחר אחסון המקפיא עבור ~ 3.5 חודשים. רקמות קפואות שהתקבלו מבעלי חיים מן הקבוצה השנייה הוערכו לאחר האחסון עבור ~ 6 חודשים. כוכבי שביט מציג את המאפיין "קיפוד" המבנה, מעיד על תאים פגומים בכבדות (של אטיולוגיה בלתי ודאות שעשויים לכלול הרעלת ציטוזה או מתח מכני), לא נכללו בניקוד של% הזנב DNA; אחוז הקיפודים, המזוהים באופן בלעדי על בדיקה חזותית של מורפולוגיה, הוחודש בנפרד כ-OECD TG 4899. ממוצע% הזנב התוצאות של החיות בשני הגדודים (מבוסס על הבקיע 100 תאים/בעלי חיים) מסוכמים באיור 2א. כל השיטות באמצעות רקמה קפואה הפיק ערכים גבוה יותר, אם כי לא תמיד שונה סטטיסטית, מאשר רקמה טרייה. בהתחשב כי המגבלה העליונה המומלצת עבור% הזנב DNA בכבד עכברוש טרי הוא 6%9, תוצאות אלה מוכיחים כי כל השיטות האלה יכול לעבוד היטב להערכת רקמות קפואות. פתרון מינוב התבצע לפחות באופן שווה כמו גם במדיום של הסוחר; מאחר והאחרון הוא זמן רב יותר להכנה, פתרון מאוחר יותר נבחר ללימודים הבאים. לא היו הבדלים משמעותיים מבחינה סטטיסטית נזק ברקמות מתוך הקבוצה השנייה בעלי חיים שאוחסנו קפוא במשך ~ 6 חודשים לפני עיבוד לעומת רקמות מן הקבוצה הראשונה שעובדו לאחר ~ 3.5 חודשים של אחסון. בסך הכל,% קיפודים וקרב ה-DNA% הזנב למרות% קיפודים ברקמות הקפואות ביחס לרקמה טרייה היה יותר משתנה מאשר עבור% ה-DNA של הזנב (איור 2B). הערכים עבור נקודות קצה אלה ברקמה הטרייה מספקים בסיס שנגדו נגרם נזק ל-DNA שניתן להציג על ידי שיטות ההקפאה.
מחקר 2
עכברים B6C3F1 נשים מנוהל תמיסת מלח רגיל או המוטגן, אתיל מתיונין (EMS) ב 200 מ"ג/ק"ג/יום בתמיסת מלח רגילה במשך שלושה ימים. הרקמה נאספה 3 שעות לאחר מינון המינון הסופי ומעובד טרי בתוך הבחינה שביט. רקמות נוספות היה הבזק קפוא לאחר להיות טחון בפתרון מינורי או נאסף כמו קוביות. דגימות הקוביות עובדו לאחר מכן בפתרון מיידי באמצעות מכשיר המיסננת מיד לפני הכנת שקופיות השביט. על ההנחה כי תאים המציגות את מורפולוגיה הקיפוד מייצגים תאים בקצה הגבוה של הרצף של נזק DNA כימי המושרה, קיפודים scorable על ידי תוכנת הדימות נכללו הבקיע אוטומטי של% הזנב DNA. את ה-DNA הזנב תוצאות (מבוסס על הבקיע 150 תאים/בעלי חיים) מסוכמים באיור 3. רקמת הכבד הקפואים כמו קוביות ולאחר מכן מעובד באמצעות המכשיר מיני, הרקמה הניבה תוצאות דומה מאוד לאלה שהתקבלו עבור רקמות טרי טחון. הערכים של ה-DNA% הזנב היו גבוהים במקצת עבור הרקמה הקצוצה הקפואה, אך ערכי הבסיס עבור הרקמה הקצוצה הקפואה היו מתחת ל -6%, כמומלץ לכבד עכברוש טרי במבחן ה-OECD מנחה לצורך שביט השביט9. גידול משמעותי מבחינה סטטיסטית בנזקי ה-DNA בהשפעת EMS נמדד בדגימות רקמות שעובדו על ידי שלוש השיטות.
מחקר 3
חלקים של רקמת הכבד שנאספו מעכברים B6C3F1 נקבה במחקר רעילות היום 90 של כימיה מבחן שנערך על ידי מעבדה מרוחקת היו מוכי או חתכו קוביות, פלאש קפוא, ונשלח לילה על קרח יבש למעבדה זו לניתוח. רקמת בשר טחון נותחו בעקבות ~ 2 חודשים של אחסון המקפיא (איור 4). תאים שהופיעו על בדיקה חזותית להיות קיפודים אבל היו מסוגלים על ידי תוכנת ההדמיה נכללו% הזנב DNA מדידות (150 תאים הבקיע/בעלי חיים). מספר הקיפודים (בין אם הם מסוגלים או לא מאפשרים) זוהו אך ורק על ידי בדיקה חזותית של מורפולוגיה בסכום כולל של 150 תאים/בעלי חיים היתה באמצעות טאבוניה בנפרד כדי לספק מידע על התדירות של תאים אלה פגומים מאוד. באופן כללי, נזק DNA (נמדד כ-DNA% זנב) ברקמת טחון קפוא היה גבוה על פני כל קבוצות מינון עם בעל חיים משמעותי לשונות בעלי חיים, כולל בקבוצת בקרת הרכב. The% הזנב התוצאות DNA בקורלציה עם% קיפודים (מזוהה אך ורק על בסיס של מורפולוגיה), המציין כי קיפודים תרמו באופן משמעותי לרמה גבוהה של נזק DNA כי נצפתה דגימות אלה. מבוסס על רמת הרקע הגבוה של נזק לדנ א נמדד ברקמה הקצוצה, קפוא לקוביות רקמות שלאחר מכן שנותחו לאחר ~ 22 חודשים של אחסון (איור 4). שני נזק DNA ו% קיפודים היו נמוכים מאוד ב פלאש קפוא לקוביות הרקמה כי היה מוכן במקביל עם דגימות הרקמה הקצוצה. כך, התאים פגום מאוד המשתקף על ידי מורפולוגיה הקיפוד בדגימות הרקמה הקצוצה היו בבירור לא תוצאה של תהליך ביולוגי, אבל הוצגו ככל הנראה על ידי שיבוש מכני ו/או התחממות רקמות במהלך ההליך מוקדם לפני היותו פלאש קפוא; נתונים אלה נחשבו להיות לא אמינים. למרבה המזל, ניתוח של רקמה קפואה לקוביות בתנאי תוצאה ברורה, כלומר חוסר בתגובה נזק לדנ א בכבד של עכברים נקבה בעקבות שלושה חודשים של חשיפה הכימי במבחן. התוצאות שסופקו על-ידי מחקר זה מקרה להדגים את הסיכון הקשור להכנת רקמות טחון על ידי מעבדה מנוסה יחסית ולהדגים את השירות של השיטה הקפואה לקוביות הרקמה כדי לעקוף את הבעיה.
איור 1: מכשיר מקפיא רקמות ו בוכנה המשמש להכנת השעיית תא יחיד מרקמות קפואות. התקן אב-טיפוס (4.5 מ"מ בקוטר פנימי, 0.4 מ"מ גודל של רשת שינוי) הסופק באדיבות ד ר גונאר ברובורג (נורג'נוטק, אוסלו, נורבגיה). הפאנל בצד ימין מספק דוגמה של קוביית בגודל כראוי של רקמה לשימוש עם המכשיר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: השוואה של נזק לדנ א נמדד בדגימות כבד טרי וקפוא הומוגניים של העכבר. הכבד נקצרו משני הגדודים המוטים (n = 5/קבוצה/קוהורנים) של עכברי הגברים מנוהלים שמן תירס במשך 4 ימים. השקופיות היו מוכנות מרקמות טריות, מרקמות קפואות ומוקפאות, ורקמת העור הקפואה המעובדת בתמיסה המדיום של הסוחר או בשימוש במכשיר הרקמות. רקמות קפואות נותחו ~ 3.5 ו 6 חודשים לאחר נקרופסי עבור הגדודים 1 ו-2, בהתאמה. שביטים מסווגים כקיפודים המבוססים על מורפולוגיה לא נכללו בניקוד של% DNA הזנב. (A) קוהורטה פירושו% הזנב תוצאות DNA. (ב) קוהורטה מתכוון% קיפוד התוצאות. קווי שגיאה משקפים סטיית תקן. ניתוחים סטטיסטיים נערכו כדי להשוות את הרקמות קפוא נגד רקמות טריות עבור כל קבוצה ולהשוות את התוצאות בין שתי הגדודים עבור כל שיטת הכנת רקמות. * מבחינה סטטיסטית שונה (p < 0.05) מ רקמה טחון טרי בתוך אותה מפרק באמצעות מבחן t של הסטודנט; #statistically שונה (p < 0.05) מרקמות בשר טחון טרי בתוך אותה קבוצה באמצעות מבחן מאן-ויטני עבור נתונים שאינם מבוזרים בדרך כלל; ¥ הפרש סטטיסטי (p < 0.05) בין הגדודים באמצעות מבחן ה-t של הסטודנט. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: השוואה של נזק DNA הנגרמת על ידי EMS ברקמת הכבד מעובד על ידי הליכים שונים. מתכוון% זנב DNA עבור נשים B6C3F1 עכברים מנוהל רכב או 200 mg/ק"ג/יום EMS במשך שלושה ימים (n = 5/קבוצה). כבדים נקצרו 3 שעות לאחר מינהל המינון הסופי ועיבד טרי בתוך הבחינה שביט. רקמת הכבד נוסף היה פלאש קפוא לאחר להיות טחון בפתרון מינורי או נאסף כמו קוביות; באמצעות המכשיר הממתן של הרקמה מיד לפני הכנת שקופיות השביט. כדי להבטיח תאים בקצה הגבוה של הרצף של נזק ל-DNA המושרה לא נשלל מהניתוח, שביטים כי על בדיקה חזותית הופיעו לפגוש את התיאור מורפולוגית של קיפודים אבל נמצאו להיות scorable על ידי תוכנת ההדמיה נכללו. קווי שגיאה משקפים סטיית תקן. מבחן t של סטודנט שימש כדי להשוות את כמות הנזק DNA בבעלי חיים חשופים ל-EMS נגד זה בעלי בקרת הרכב בעלי חיים עבור כל שיטת הכנה לדוגמה. * עלייה משמעותית מבחינה סטטיסטית ב p < 0.05. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4. מקרה לימוד הוכחת השירות של שיטת קוביה קפואה ונתונים באיכות גבוהה שהתקבלו לאחר אחסון ממושך. חלקים של רקמת הכבד שנאספו מעכברים B6C3F1 נקבה נחשף ריכוזים שונים של כימיה מבחן עבור ~ 90 ימים (n = 5/קבוצה) היו כהים או חתכו לקוביות פלאש קפוא במעבדה בחיים ולאחר מכן נשלח למעבדה זו לניתוח. רקמה קצוצה נותחו בעקבות ~ 2 חודשים של אחסון; בשל האיכות הירודה של הנתונים, הרקמה הקפואה בקוביות נותחו לאחר מכן בעקבות ~ 22 חודשים של אחסון. כדי להבטיח תאים בקצה הגבוה של הרצף של נזק כימי DNA המושרה לא נשלל מהניתוח, נתונים מתאים scorable כי, על בדיקה חזותית נראה קיפודים, נכללו. (A) קבוצה ממוצע% תוצאות ה-DNA של הזנב. בהשוואה לרקמת בשר טחון, תוצאות באיכות גבוהה התקבלו מרקמת לקוביות קפוא, גם לאחר אחסון ממושך. (ב) קבוצה מתכוונת% קיפוד תוצאות. טכניקה המסכנה מאוד ניכרת הנזק הנרחב שאינם ביולוגיים DNA שנצפו כמו קיפוד שביטים בדגימות רקמות טחון. קווי שגיאה משקפים סטיית תקן. ב-ANOVA עם המבחן של דנטו שימש להערכת תגובה חיובית לבחינה כימית עבור כל שיטת הכנה לדוגמה. לא היו משמעותיים מבחינה סטטיסטית (p < 0.05) קבוצות מינון שזוהו עבור כל אחת מהשיטות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: הנזק DNA בסיסית הנמדד ברקמות המוח הקפוא עכברוש. התוצאות שיטת שביט מסופקות עבור קפואים מוקפאים או לקוביות הרקמות המייצגים מספר אזורים שונים של המוח של הזכר והנקבה מג דאוליי. נתונים (שנוצרו על ידי כולל קיפוד scorable) נאספו על פני מספר מחקרים; n = המספר הכולל של רקמות המוח שוערכו עבור כל שיטת ההכנה לדוגמה. קווי שגיאה משקפים סטיית תקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כפי שמתואר בעבר7,12,13, מטופלים כראוי פלאש קפוא ברקמות בשר טחון מספק תוצאות טובות שיטת שביט. למעשה, בסיסית% הזנב ערכי ה-DNA עבור עכברוש קצוץ וכבד העכבר המוכן במעבדה שלנו הם בדרך כלל ≤ 6%, כפי שמומלץ על-ידי מבחן ה-OECD מנחה9 עבור טרי דגימות הכבד עכברוש טחון. תוצאות טובות הושגו על ידי מעבדות מרובות באמצעות מגוון סוגי רקמות כי כבר כתוש ואוחסנו קפוא; באופן דומה, פלאש קפוא תאים אפיתל מגורד מאיברים במערכת העיכול שימשו בהצלחה בתוך שביט במערכת השביט7,12,13,14. רקמת כתוש/שפשוף קפוא נראה יציב יחסית למשך מספר חודשים לפחות. השיטה המשתמשת המגון של קוביות פלאש קפוא של הכבד באמצעות מכשיר מיניט רקמות תיאר במקור על ידי ג ' קסון ואח '6, תשואות תוצאות בדיקת שביט לפחות דומה ובדרך כלל טוב יותר (כלומר, רמות הבסיסית נמוכה יותר של נזק DNA) מאשר אלה שהתקבלו על הכבד קפוא טחון. מתודולוגיה זו ישימה גם על סוגי רקמות אחרים6; בניסיון שלנו, תוצאות מצוינות באופן דומה התקבלו באמצעות קפוא לקוביות התריסריון (הנתונים לא מוצגים) ואת רקמת המוח (איור 5). עם זאת, את המכשיר מסננת לא יכול להיות מקלה הומוקות של כל סוגי הרקמה. במחקר פיילוט, מצאנו כי רקמת לב שרירי לא יכול בקלות להיות מאולץ דרך המכשיר מסננת, וכתוצאה מכך התאוששות תא עני; במקום זאת, הכניסה את הרקמה מיד לאחר שהטביעה הניבה את השעיות התאים עם התוכנית הבסיסית% DNA לעקוב אחר אלה לפני הקפאת פלאש (נתונים לא מוצגים). בעיקר, כאשר מטופלים כראוי במהלך נקרופסי (כלומר, שמרו קר ולח; פלאש קפוא כמו חתיכות בודדות ולא מותר להפשיר באופן חלקי), פלאש קפוא לקוביות הרקמה הניב נזק מאוד נמוך DNA הבסיסית גם לאחר כ שנתיים של אחסון המקפיא (איור 4).
שימוש בשעיות תא קפואות או ברקמה בתוך שיטת השביט מציעה מספר יתרונות על פני רקמה טרייה כולל: 1) הנחיה של אוסף סימולטני של סוגי רקמה מרובים לניתוח שביט; 2) הנחיה באיסוף רקמות במעבדת החיים והעברת דגימות למעבדה אחרת לניתוח; 3) נוחיות לעכב החלטה לנתח רקמה נתונה במשך חודשים. למרות המיגון של רקמות קפואות בזמן הכנת השקופיות הוא מסורבל יותר מאשר רקמה טרייה מחדש בזמן הקציר, שימוש ברקמת לקוביות קפוא מציעה מספר יתרונות נוספים הכוללים: 1) אין דרישה עבור כוח אדם מאומן בתוך שביט השביט (g., יחידה ניידת) או ציוד מיוחדות/ריאגנטים ב נקרופסי; 2) פחות הזדמנות לשגיאות טכניות (לדוגמה, התחממות מדגם; שחרור מספיק של תאים; גודל מדגם הרקמה האופטימלי) במהלך נקרופסי; 3) הזדמנות מינימלית כדי להחדיר נזק DNA מכני במהלך עיבוד לדוגמה (למשל, להטות את ההטיה); ו 4) נזק DNA בסיסית נמוכה, גם לאחר אחסון ממושך.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
עבודה זו נתמכת על ידי תוכנית מחקר הפנים של NIH, המכון הלאומי למדעי הסביבה בריאות (בע) תחת חוזה HHSN273201300009C; עם זאת, ההצהרות, הדעות או המסקנות הכלולות בו אינן מייצגות בהכרח את ההצהרות, הדעות או המסקנות של המדינות המאוחדות, או של הממשלה.
Acknowledgments
המחברים אסירי תודה ללינקולן מרטין וקלי אוונס לסיוע טכני מומחה בהכנת שקופיות שביט והבקיע ד ר קרול שוורץ לביצוע ניתוחים סטטיסטיים. המחברים מכירים גם את התרומות התומכות של חברי הטוקסיקולוגיה הגנטית, החקירתית ותוכניות הנקרופסי ב-ILS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryovials | Corning Costar | 430488 | |
| Dental Wax Sheets | Electron Microscopy Sciences | 72670 | |
| Dissecting (Mincing) Micro Scissors | Fisher Scientific | 08-953-1B | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Gibco | 14175-079 | |
| KCl | Teknova | P0315-10 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Low Melting Point Agarose | Lonza | 50081 | |
| Microfuge Tubes (1.7 mL) | Corning | 3207 | |
| Na2EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | |
| Neutral Buffered Formalin | Leica | 600 | |
| Scalpel Blades | Miltex | 4-110 | |
| Syringe Plunger (1 mL) | Fisher Scientific or Vitality Medical | 14-826-88; 8881901014 | Becton Dickinson or Monoject tuberculin syringe |
| Tissue Mincing Device | NorGenoTech (Oslo, Norway) | None | Small variability in diameter observed which can affect snuggness of plunger. |
| Tweezers, plastic | Trade Winds Direct | DF8088N | Reinforced nylon, nonsterile, blunt tip, autoclavable; tradewindsdirect.com |
| Weigh Boats | Krackler Scientific/Heathrow Scientific | 6290-14251B |
References
- van der Leede, B. J., et al. Performance and data interpretation of the in vivo comet assay in pharmaceutical industry: EFPIA survey results. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 775-776, 81-88 (2014).
- ICH. International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH) S2(R1): Guidance on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended for Human Use. ICH. , (2012).
- EFSA. Scientific opinion on genotoxicity testing strategies applicable to food and feed safety assessment. EFSA Journal. 9 (9), 2379 (2011).
- Lorenzo, Y., Costa, S., Collins, A. R., Azqueta, A. The comet assay, DNA damage, DNA repair and cytotoxicity: hedgehogs are not always dead. Mutagenesis. 28 (4), 427-432 (2013).
- Guerard, M., Marchand, C., Plappert-Helbig, U. Influence of experimental conditions on data variability in the liver comet assay. Environmental and Molecular Mutagenesis. 55 (2), 114-121 (2014).
- Jackson, P., et al. Validation of freezing tissues and cells for analysis of DNA strand break levels by comet assay. Mutagenesis. 28 (6), 699-707 (2013).
- Recio, L., Kissling, G. E., Hobbs, C. A., Witt, K. L. Comparison of Comet assay dose-response for ethyl methanesulfonate using freshly prepared versus cryopreserved tissues. Environmental and Molecular Mutagenesis. 53 (2), 101-113 (2012).
- Uno, Y., et al. JaCVAM-organized international validation study of the in vivo rodent alkaline comet assay for detection of genotoxic carcinogens: II. Summary of definitive validation study results. Mutation Research/Genetetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 786-788, 45-76 (2015).
- OECD. OECD Guideline for the Testing of Chemicals: In Vivo Mammalian Alkaline Comet Assay. OECD. 489, (2016).
- Hobbs, C. A., et al. Comet assay evaluation of six chemicals of known genotoxic potential in rats. Mutation Research/Genetetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 786-788, 172-181 (2015).
- Ding, W., Bishop, M. E., Lyn-Cook, L. E., Davis, K. J., Manjanatha, M. G. In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver. Journal of Visualized Experiments. (111), 53833 (2016).
- Hobbs, C. A., Chhabra, R. S., Recio, L., Streicker, M., Witt, K. L. Genotoxicity of styrene-acrylonitrile trimer in brain, liver, and blood cells of weanling F344 rats. Environmental and Molecular Mutagenesis. 53 (3), 227-238 (2012).
- Hobbs, C. A., et al. Comprehensive evaluation of the flavonol anti-oxidants, alpha-glycosyl isoquercitrin and isoquercitrin, for genotoxic potential. Food and Chemical Toxicology. 113, 218-227 (2018).
- Pant, K., et al. Vehicle and positive control values from the in vivo rodent comet assay and biomonitoring studies using human lymphocytes: historical database and influence of technical aspects. Environmental and Molecular Mutagenesis. 55 (8), 633-642 (2014).
