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Genetics

डीएनए क्षति के मूल्यांकन के लिए धूमकेतु परख में जमे हुए ऊतक का उपयोग

Published: March 24, 2020 doi: 10.3791/59955
Automatic Translation
*1, 1, 1, 2
1Toxicology Program, ILS, Inc., 2Division of the National Toxicology Program, National Institute of Environmental Health Sciences
* These authors contributed equally

Summary

यह प्रोटोकॉल डीएनए क्षति का आकलन करने के लिए धूमकेतु परख में उपयोग के लिए नेक्रॉप्सी के समय उच्च गुणवत्ता वाले जमे हुए ऊतक नमूनों को तैयार करने के लिए कई प्रक्रियाओं का वर्णन करता है: 1) कीमा बनाया हुआ ऊतक, 2) गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ट्रैक्ट से एपिथेलियल कोशिकाओं को स्क्रैप किया गया है, और 3) क्यूबड ऊतक नमूने, एक ऊतक कीमा बनाने वाले उपकरण का उपयोग कर समरूपता की आवश्यकता होती है।

Abstract

धूमकेतु परख सुसंस्कृत कोशिकाओं और ऊतकों में डीएनए क्षति का आकलन करने के लिए एक साधन के रूप में लोकप्रियता प्राप्त कर रहा है, विशेष रूप से रसायनों या अंय पर्यावरणीय तनाव के लिए जोखिम के बाद । कृंतकमें जीनोटॉक्सिक क्षमता के लिए नियामक परीक्षण में धूमकेतु परख का उपयोग २०१४ में आर्थिक सहयोग और विकास संगठन (ओईसीडी) परीक्षण दिशानिर्देश को अपनाने से प्रेरित किया गया है । धूमकेतु परख स्लाइड आम तौर पर necropsy के समय ताजा ऊतक से तैयार कर रहे हैं; हालांकि, ठंड ऊतक के नमूने प्रति पशु कई अंगों और अध्ययन के अनुसार कई जानवरों से स्लाइड की एक साथ तैयारी के साथ जुड़े साजो-सामान की चुनौतियों से बच सकते हैं । ठंड भी विश्लेषण के लिए एक अलग प्रयोगशाला के लिए जोखिम सुविधा से शिपिंग नमूनों को सक्षम बनाता है, और जमे हुए ऊतक के भंडारण के लिए एक दिए गए अंग के लिए डीएनए क्षति डेटा उत्पन्न करने का निर्णय आस्थगित की सुविधा । क्षारीय धूमकेतु परख जोखिम से संबंधित डीएनए डबल और एकल कतरा टूटता है, क्षार-labile घावों, और स्ट्रैंड अधूरा डीएनए उत्तेजना की मरंमत के साथ जुड़े टूट का पता लगाने के लिए उपयोगी है । हालांकि, डीएनए क्षति यांत्रिक बाल काटना या अनुचित नमूना प्रसंस्करण प्रक्रियाओं से भी परिणाम हो सकता है, परख के परिणामों को भ्रमित कर सकता है। नेक्रॉप्सी के दौरान ऊतक के नमूनों के संग्रह और प्रसंस्करण में प्रजनन क्षमता धूमकेतु परख के लिए ऊतकों की कटाई में अनुभव के विभिन्न स्तरों के साथ अस्थिर प्रयोगशाला कर्मियों के कारण नियंत्रण करने के लिए मुश्किल हो सकती है। रिफ्रेशर प्रशिक्षण या अनुभवी प्रयोगशाला कर्मियों के साथ कर्मचारियों की तैनाती के माध्यम से स्थिरता बढ़ाना महंगा है और हमेशा संभव नहीं हो सकता है । धूमकेतु परख विश्लेषण के लिए उच्च गुणवत्ता वाले नमूनों की लगातार पीढ़ी को अनुकूलित करने के लिए, एक अनुकूलित ऊतक कीमा बनाने वाले उपकरण का उपयोग करके ऊतक के फ्लैश फ्रोजन क्यूब्स को समरूप करने के लिए एक विधि का मूल्यांकन किया गया था। इस विधि द्वारा धूमकेतु परख के लिए तैयार नमूने ताजा और जमे हुए ऊतक necropsy के दौरान कीमा द्वारा तैयार नमूनों के लिए गुणवत्ता में कृपापूर्वक तुलना की । इसके अलावा, लंबे समय तक भंडारण के बाद ऊतक के जमे हुए क्यूब्स से कोशिकाओं में कम बेसलाइन डीएनए क्षति मापा गया था ।

Introduction

धूमकेतु परख का उपयोग सुसंस्कृत कोशिकाओं और रसायनों या अन्य पर्यावरणीयतनावोंके संपर्क में आने वाले ऊतकों में डीएनए क्षति का मूल्यांकन करने के साधन के रूप में किया जाता है । परख डीएनए डबल और एकल कतरा टूटता है, क्षार-labile घावों, और एक ही कतरा अधूरा डीएनए मरम्मत के साथ जुड़े टूट का पता लगा सकते हैं । दवा परीक्षण के लिए फार्मास्यूटिकल्स फॉर ह्यूमन यूज (आईसीएच) दिशानिर्देश के लिए तकनीकी आवश्यकताओं के सामंजस्य के लिए अंतर्राष्ट्रीय परिषद ने वीवो जीनोमिकिटी में आकलन करने के लिए कृंतक एरिथ्रोसाइट माइक्रोन्यूकलस परख को पूरक करने के लिए एक दूसरे परीक्षण के रूप में धूमकेतु परख के रूप में डीएनए स्ट्रैंड टूटना परख की सिफारिश की है और ट्यूमर इंडक्शन2के लक्षित अंगों में कार्रवाई के तरीके का आकलन करने के लिए अनुवर्ती परीक्षण के रूप में । यूरोपीय खाद्य सुरक्षा प्राधिकरण (EFSA) एक इन विट्रो जीनोटॉक्सिकिटी टेस्ट3में एक सकारात्मक परिणाम की प्रासंगिकता की जांच के लिए एक उपयुक्त अनुवर्ती परीक्षण के रूप में वीवो धूमकेतु परख में सिफारिश की । २०१४ में, कृंतक धूमकेतु परख के लिए एक ओईसीडी परीक्षण दिशानिर्देश को मंजूरी दी गई थी, इस प्रकार जीनोटॉक्सिक क्षमता के नियामक परीक्षण में उपयोग के लिए परख की स्वीकार्यता में वृद्धि हुई । यह परख आराम से डीएनए छोरों और टुकड़ों के इलेक्ट्रोफोरेटिक पृथक्करण पर आधारित है जो lysed कोशिकाओं के नाभिक से स्थानांतरित होते हैं । असल में, एकल कोशिकाएं अगारोज में एम्बेडेड हैं जिन्हें माइक्रोस्कोप स्लाइड पर स्तरित किया गया है। स्लाइड्स में इसके बाद लिसिस बफर में डूब जाता है और उसके बाद क्षारीय (पीएच एंड जीटी;13) समाधान होता है, जो कसकर कुंडलित परमाणु डीएनए को आराम और खोलना की अनुमति देता है । स्लाइड तो एक बिजली के क्षेत्र में रखा जाता है, जो एनोड की ओर नकारात्मक आरोप लगाया डीएनए के प्रवास को उत्तेजित करता है, छवियों है कि धूमकेतु के समान बनाने; धूमकेतु सिर की तुलना में धूमकेतु पूंछ में डीएनए की सापेक्ष राशि सीधे डीएनए क्षति की मात्रा के आनुपातिक है; पूंछ में डीएनए सामग्री आम तौर पर डिजिटल इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर निर्धारित है।

क्योंकि धूमकेतु परख खंडित डीएनए का पता लगाता है, जोखिम प्रेरित डीएनए क्षति के सटीक मात्राकरण उपचार प्रेरित साइटोटॉक्सिकिसिटी या तनाव के परिणामस्वरूप नेक्रोसिस या एपोप्टोसिस से जुड़े क्रोमेटिन विखंडन से चकित किया जा सकता है । इसके अलावा, डीएनए क्षति यांत्रिक बाल काटना या अनुचित नमूना प्रसंस्करण4के परिणामस्वरूप हो सकता है । डीएनए क्षति के आधारभूत स्तर को कम करने के लिए तैयारी करने से पहले काटे गए ऊतकों को ठंडा बनाए रखने का महत्व पहले5,6का प्रदर्शन किया गया है । कई प्रयोगशालाओं ताजा ऊतक से धूमकेतु परख स्लाइड तैयार; हालांकि, बड़ी संख्या में जानवरों के साथ अध्ययन में प्रति जानवर कई ऊतक प्रकार ों से स्लाइड तैयार करते समय यह रसद चुनौतीपूर्ण हो सकता है। इसके अलावा, यह एक समस्या प्रस्तुत करता है जब स्लाइड तैयारी और विश्लेषण के लिए एक दूरदराज के प्रयोगशाला में होते हैं, नमूनों की शिपमेंट की आवश्यकता है । उदाहरण के लिए, अमेरिका के राष्ट्रीय विष विज्ञान कार्यक्रम अपने आनुवंशिक विष विज्ञान परीक्षण कार्यक्रम (https://ntp.niehs.nih.gov/testing/types/genetic/index.html) के एक घटक के रूप में धूमकेतु परख भी शामिल है और कई बार 28 या ९० दिन दोहराने खुराक विषाक्तता अध्ययन में परख शामिल; इसके लिए इन-लाइफ प्रयोगशाला द्वारा ऊतकों का संग्रह और विश्लेषण के लिए नमूनों को दूसरी प्रयोगशाला में स्थानांतरित करने की आवश्यकता होती है। इसे पूरा करने के लिए, ऊतक के टुकड़े कीमा बनाए जाते हैं, और/या गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ट्रैक्ट की एपिथेलियल कोशिकाओं को स्क्रैप किया जाता है और सेलुलर निलंबन को फ्लैश फ्रीज कर दिया जाता है और विश्लेषण7तक प्राप्त प्रयोगशाला द्वारा बाद में शिपमेंट और भंडारण के लिए फ्रीजर में संग्रहीत किया जाता है । जमे हुए ऊतकों का उपयोग करउच्च गुणवत्ता वाले डेटा प्राप्त करने के लिए नमूनों की उचित हैंडलिंग महत्वपूर्ण है; हालांकि, कभी बदलते कर्मियों द्वारा किए गए नेक्रॉप्स के दौरान ऊतक नमूनों के प्रजनन योग्य हेरफेर को नियंत्रित करना मुश्किल है, विशेष रूप से इन-लाइफ प्रयोगशालाओं में जो नियमित रूप से धूमकेतु परख के लिए ऊतकों को फसल नहीं करते हैं। नेक्रॉप्सी कर्मचारियों का रिफ्रेशर प्रशिक्षण या अनुभवी प्रयोगशाला कर्मियों द्वारा ताजा या जमे हुए ऊतक नमूनों को एकत्र करने के लिए कर्मचारियों की एक मोबाइल इकाई का उपयोग अक्सर बहुत महंगा होता है, संभव नहीं होता है, या बस इसका सही मूल्यांकन नहीं होता है।

बेहतर धूमकेतु परख विश्लेषण के लिए एक दूरदराज के स्थल पर स्थानांतरित करने के लिए उच्च गुणवत्ता वाले ऊतक नमूनों की लगातार पीढ़ी सुनिश्चित करने के लिए, ऊतक के फ्लैश जमे हुए क्यूब्स से ऊतक संरक्षण के एक प्रकाशित विधि6 की उपयोगिता का पता लगाया गया था । इस विधि में, ऊतक के जमे हुए क्यूब्स को स्टेनलेस स्टील टिश्यू कीमा बनाने वाले उपकरण(चित्रा 1)में लोड किया जाता है जिसे ठंडे बफर युक्त माइक्रोसेंटरिफ्यूज ट्यूब में रखा जाता है। ऊतक के घन तो डिवाइस के अंत में एक छोटे से गेज जाल के माध्यम से धक्का दिया है । बार-बार दोनों दिशाओं में जाल छलनी के माध्यम से ऊतक निलंबन को मजबूर करना कई बार अपेक्षाकृत समान एकल सेल निलंबन में परिणाम देता है। इस विधि द्वारा तैयार नमूने गुणवत्ता में कृपापूर्वक दोनों ताजा और जमे हुए ऊतक कीमा द्वारा तैयार नमूनों की तुलना में । एक अतिरिक्त लाभ के रूप में, कीमा बनाया हुआ नमूनों के विपरीत, ऊतक क्यूब्स समय की लंबी अवधि के लिए जमे हुए संग्रहीत किया जा सकता है और अभी भी धूमकेतु परख में उच्च गुणवत्ता के परिणाम उपज ।

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Protocol

टीएनपी अनुबंध प्रयोगशालाओं में एएएलएसी-मान्यता प्राप्त सुविधाओं में अच्छे प्रयोगशाला अभ्यास विनियमों (21 सीएफआर भाग 58) और संस्थागत पशु द्वारा अनुमोदित पशु उपयोग प्रोटोकॉल के अनुसार एएएलएसी-मान्यता प्राप्त सुविधाओं में किए गए अध्ययनों के संचालन के दौरान ऊतकों की कटाई की गई थी। प्रत्येक प्रयोगशाला में देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी)।

1. टिश्यू हार्वेस्ट एंड प्रोसेसिंग

नोट: यदि आवश्यक हो तो पुनर्विश्लेषण को सक्षम करने के लिए डुप्लिकेट नमूना ट्यूब (जैसे, जिगर) तैयार करना या नमूने का लगभग आधा हिस्सा किसी अन्य भंडारण ट्यूब (जैसे, डुडेनम, पेट) में स्थानांतरित करना उपयोगी है। आंतों के पथ ऊतकों के लिए संभावित नमूना-से-नमूना परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए, यह सिफारिश की जाती है कि प्रत्येक जानवर के लिए पेट के सापेक्ष ऊतक के समान क्षेत्र का नमूना लेने के लिए देखभाल की जाए, और डुप्लिकेट नमूने उत्पन्न करने के लिए एक नमूना विभाजित किया जाए। मस्तिष्क जैसे चिपचिपा ऊतकों को स्थानांतरित करने के लिए प्लास्टिक संदंश की सिफारिश की जाती है। एक विकल्प के रूप में, एक शंकुई ट्यूब से जुड़ी 40 माइक्रोन सेल छलनी का उपयोग करके सजातीय एकल कोशिका निलंबन प्राप्त करने के लिए कीमा बनाया हुआ, स्क्रैप या समरूप ऊतक तैयारी फ़िल्टर की जा सकती है।

  1. किसी भी संलग्न कनेक्टिंग ऊतक, अंगों, और ब्याज के अंग (ओं) से मलबे को हटा दें । हटाने के तुरंत बाद, एक मध्यम आकार के वजन वाली नाव में ऑर्गन को सख्ती से बेंत की मार देना जिसमें ठंड े-बद्ध तैयार कीमा समाधान (एमजी++,सीए+ + + और फिनॉल लाल मुक्त हांक का संतुलित नमक समाधान, 10% v/v DMSO, और 20 m EDTA पीएच 7.5) अवशिष्ट रक्त और मलबे को हटाने के लिए।
  2. एक और साफ वजन नाव पर्याप्त (~ 7 mL) ठंड कीमा बनाने के समाधान के लिए पर्याप्त (~ 7 mL) ठंड े हुए कीमा समाधान युक्त करने के लिए एक और अंग हस्तांतरण के लिए ऊतक जलमग्न बनाए रखने के लिए, बर्फ पर, आगे प्रसंस्करण तक ।
  3. ब्याज के प्रत्येक अंग का एक वर्ग निकालें और इसे एम्बेडिंग कैसेट में रखें। संभावित भविष्य हिस्टोपैथोलॉजी मूल्यांकन के लिए प्रयोगशाला की मानक प्रक्रियाओं के अनुसार 10% तटस्थ बफरफॉर्मिन, ट्रिम और पैराफिन में फिक्स करें।
  4. जिगर के लिए, बाईं पालि के 5 मिमी देशांश अनुभाग में कटौती और ठंड कीमा बनाने के समाधान के ~ 7 मिलील में धीरे बेंत की मार । ऊतक की पट्टी को एक साफ मध्यम आकार की वजन वाली नाव में रखें जिसमें ठंडे कीमा घोल का ~ 7 मिलीग्राम होता है और आगे की प्रक्रिया के लिए तैयार होने तक बर्फ पर बनाए रखें (चरण 1.8 या 1.11)।
  5. डुओडेनम के लिए, पेट में डुओडेनम समीपस्थ का 10 मिमी हिस्सा काट लें। एक 21-25 जी सुई का उपयोग करना, मलबे और बैक्टीरिया को दूर करने के लिए फ्लश ।
    1. डुओडेनम के एक छोर में सुई डालें और ठंडे कीमा समाधान के 1 मिलील के साथ फ्लश करें।
    2. पर duodenum फ्लिपिंग और कीमा समाधान के एक और 1 मिलील के साथ दोहरा द्वारा दूसरी दिशा फ्लश । सुई को त्याग दें।
    3. डुओडेनम को खुला काटें और इसे मध्यम आकार की वजन वाली नाव में डालने से पहले कीमा समाधान के ~ 7 mL में कुल्ला करें जिसमें स्वच्छ कीमा समाधान का ~ 7 mL हो; आगे की प्रक्रिया के लिए तैयार होने तक बर्फ पर बनाए रखें (चरण 1.8 या 1.11)।
  6. मस्तिष्क के लिए, मस्तिष्क को दो गोलार्द्धों में विभाजित करना पहले उपयोगी हो सकता है; एक गोलार्द्ध को संभावित हिस्टोपैथोलॉजी के लिए बचाया जा सकता है (चरण 1.2 देखें)।
    1. मस्तिष्क क्षेत्र (एस) ब्याज के विच्छेदन और धीरे ठंड कीमा बनाने की माँग समाधान के ~ 7 मिलील में बेंत की मार।
    2. ऊतक (एस) को एक स्वच्छ मध्यम आकार की वजन वाली नाव में स्थानांतरित करें जिसमें ठंड कीमा बनाने वाले समाधान का ~ 7 मिलीग्राम होता है और आगे की प्रक्रिया के लिए तैयार होने तक बर्फ पर बनाए रखें (चरण 1.8 या 1.11; ध्यान दें कि सेरिबैलम और हिप्पोकैम्पस जैसे छोटे क्षेत्रों को आगे ट्रिमिंग की आवश्यकता नहीं हो सकती है)।
  7. पेट के लिए
    1. फोरपेट निकालें और त्यागें। ग्रंथि पेट खोलें और मध्यम आकार की वजन वाली नाव में ठंडे कीमा बफर के ~ 7 मिलीग्राम का उपयोग करके भोजन से मुक्त धोएं।
    2. संभव हिस्टोपैथोलॉजी मूल्यांकन के लिए निर्धारण के लिए डुओडेनम के लिए ग्रंथि पेट समीपस्थ की 5 मिमी पट्टी निकालें (चरण 1.2 देखें)।
    3. शेष पेट को मध्यम आकार की वजन वाली नाव में ठंडे कीमा बनाने वाले बफर के ~ 7 मिलीग्राम में रखें और 15-30 मिन के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें।
      नोट: यह ऊष्मायन कदम आवश्यक नहीं हो सकता है; इस कदम को JaCVAM सत्यापन प्रोटोकॉल में शामिल किया गया था, लेकिन ओईसीडी परीक्षण दिशानिर्देश8,9में उल्लेख नहीं है ।
    4. पेट को पैराफिन (या पेट्री डिश या वजन नाव) के एक साफ टुकड़े में स्थानांतरित करें और मलबे को हटाने के लिए स्केलपेल ब्लेड या पॉलीटेट्राफ्लोरोथेन (पीटीएफई) स्क्रैपर का उपयोग करके सतह एपिथेलियम को दो या अधिक बार धीरे से कुरेदें। संदंश के साथ गैस्ट्रिक म्यूकोसा उठाओ और एक पाइप का उपयोग कर ठंड कीमा बनाने बफर के 1 मिलीएम के साथ कुल्ला। पेट के ऊतकों को एक साफ सतह या पकवान में स्थानांतरित करें।
    5. कोशिकाओं को छोड़ने के लिए स्केलपेल ब्लेड या पीटीएफई स्क्रैपर के पीछे से कीमा समाधान (आमतौर पर 250 μL/माउस या 500-1,000 μL/चूहा) में पेट एपिथेलियम 4-5 बार (अधिक, यदि आवश्यक हो) को सावधानीपूर्वक कुरेदलें। वैकल्पिक रूप से, अधिक कोशिकाओं को ठीक करने के लिए कीमा बनाने वाले समाधान की लगभग समान मात्रा के साथ ऊतक को कुल्ला करें। एक पाइप का उपयोग कर जारी कोशिकाओं युक्त कीमा समाधान ले लीजिए और बर्फ पर एक माइक्रोसेंटरिफ्यूज ट्यूब के लिए हस्तांतरण ।
  8. ऊतक के नमूनों की माँग ने, यकृत या मस्तिष्क के ऊतकों के 3-4 मिमी खंड या डुओडेनम के ~ 5 मिमी को काट दें और एक लेबल वाले 1.5 या 2.0 एमएल माइक्रोसेंरिफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें 1 मिलीएम ठंडा कीमा समाधान होता है। नमूना ठंडा रखते हुए, जब तक बारीक तितर-बितर होने तक कीमा कैंची के साथ तेजी से कीमा (30 एस) । नमूना थोड़ा बादल दिखना चाहिए; हालांकि, कुछ टुकड़ों के लिए यह आम है कि ट्यूब के नीचे तक बस जाएगा।
  9. ऊतक ताजा का उपयोग करने के लिए, बर्फ पर कीमा बनाया हुआ ऊतक या स्क्रैप एपिथेलियल कोशिकाओं युक्त ट्यूबों को बनाए रखें; लगभग 1 घंटे की फसल (धारा 2 में उल्लिखित) के भीतर धूमकेतु स्लाइड तैयार करने के लिए ऊतक का उपयोग करें।
  10. ऊतक के नमूनों को ठंडा करने के लिए, स्क्रैप एपिथेलियल कोशिकाओं के कीमा या संग्रह के तुरंत बाद
    1. ट्यूब के ढक्कन को सुरक्षित करें और ट्यूब को तरल नाइट्रोजन युक्त देवर फ्लास्क में छोड़ दें; ट्यूब ों को नेक्रॉप्सी (3 एच) की अवधि के लिए तरल नाइट्रोजन में बनाए रखा जा सकता है।
    2. एक लाडल का उपयोग कर ट्यूबों को पुनः प्राप्त करें और सॉर्ट करने के लिए सूखी बर्फ पर रखें। एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में सूखी बर्फ और स्टोर बॉक्स पर एक फ्रीजर बॉक्स में ट्यूब ों को स्थानांतरित करें।
  11. ऊतक के जमे हुए क्यूब्स तैयार करने के लिए, ऊतक के कई छोटे टुकड़ों को काटें (व्यास में 4 मिमी और लंबाई में ~ 6 मिमी; चित्रा 1)।
    1. व्यक्तिगत रूप से उन्हें सीधे मध्यम आकार की वजन वाली नाव या तरल नाइट्रोजन वाले अन्य उपयुक्त पोत में छोड़ दें।
    2. टुकड़ों के लिए कुछ सेकंड के लिए पूरी तरह से फ्रीज और एक लेबल माइक्रोसेंटरिफ्यूज ट्यूब या शुष्क बर्फ पर बनाए रखा क्रायोट्यूब के लिए व्यक्तिगत जमे हुए ऊतक क्यूब्स हस्तांतरण; ठंड प्रक्रिया के दौरान टुकड़ों को एक साथ झुरमुट न होने दें।
    3. एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में सूखी बर्फ और स्टोर बॉक्स पर एक फ्रीजर बॉक्स में ट्यूब ों को स्थानांतरित करें।

2. स्लाइड तैयारी

  1. कीमा बनाया हुआ/स्क्रैप ऊतक के लिए
    1. गीली बर्फ पर ताजा ऊतकों युक्त ट्यूबों को बनाए रखें।
    2. एक कमरे के तापमान पानी स्नान में जमे हुए ऊतक की ट्यूब ों को तब तक रखें जब तक कि नमूने पूरी तरह से गल न जाएं, जबकि यह सुनिश्चित करते हुए कि उन्हें ठंडा रखा जाता है। ट्यूबों को तुरंत बर्फ पर स्थानांतरित करें।
    3. आगारोज (चरण 2.3) में स्थानांतरित करने के लिए कोशिकाओं को वापस लेने से तुरंत पहले, प्रत्येक सेल निलंबन को धीरे-धीरे मिलाएं; गैर-फ़िल्टर किए गए नमूनों के लिए, बड़े हिस्से को ट्यूब के नीचे बसने की अनुमति दें। बर्फ पर सभी ट्यूबों को बनाए रखें जब तक स्लाइड सभी नमूनों के लिए तैयार किया गया है।
  2. क्यूब किए गए ऊतकों के लिए
    1. 80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से ऊतक क्यूब्स युक्त ट्यूबों को पुनः प्राप्त करें और तैयारी की तैयारी तक सूखी बर्फ पर बनाए रखें।
    2. मर्चेंट मीडियम का एलिकोट 1 मिलीएम (0.14 एम एनसीएल, 1.47 एमएम एम एचएएच2पीओ4,2.7 एमएम केसीएल, 8.1 एमएम एनए2एचपीओ4,10 एमएम नाएट्टा, पीएच 7.4) या प्रत्येक नमूने के लिए लेबल वाले 1.7 एमएल माइक्रोसेंटरिफ्यूज ट्यूब में कीमा समाधान और बर्फ पर बनाए रखें।
    3. ऊतक विगलन से बचने के लिए तेजी से काम करना, ऊतक के एक घन को कमरे के तापमान ऊतक कीमा बनाने वाले उपकरण(चित्रा 1)के खुले अंत में रखें। कई ऊतक टुकड़ों का उपयोग किया जा सकता है; यदि आवश्यक हो, जमे हुए ऊतक को काट दिया जा सकता है या एक ठंडा मोर्टार और मूसल का उपयोग कर छोटे टुकड़ों में फटा जा सकता है ताकि डिवाइस में फिट करने के लिए घन आकार को कम किया जा सके।
    4. जल्दी से डिवाइस में एक आकार मिलान सिरिंज प्लंजर डालने के लिए जाल अंत है जो तो ठंड कीमा में ख़बर समाधान युक्त माइक्रोसेंड्रिफ्यूज ट्यूब में रखा जाना चाहिए करने के लिए ऊतक धक्का; तरल को ट्यूब को ओवरफ्लो करने के लिए मजबूर करने से बचें। ऊतक को पूरी तरह से गल ने की अनुमति देने के लिए ठंडे कीमा समाधान में लगभग 5-10 एस के लिए डिवाइस के जाल अंत को विसर्जित कर दें।
    5. जब तक कोशिकाओं को जाल के छिद्रों के माध्यम से बाहर निकलते हुए नहीं देखा जाता है तब तक प्लंजर को पूरी तरह से दबाना। फिर प्लंजर को लगभग 2.5 सेमी ऊपर खींचें और फिर से पूरी तरह से दबाएं; प्रक्रिया को कई बार दोहराएं जब तक कि कीमा समाधान टर्बिड न हो जाए।
    6. यदि आवश्यक हो, तो नमूना 1100 आरपीएम पर 5 मिन के लिए रेफ्रिजरेटेड सेंट्रलिफायरेशन और सुपरनेटेंट के एक हिस्से को हटाने के द्वारा सेल घनत्व बढ़ाने के लिए केंद्रित हो सकता है।
    7. प्रत्येक नमूने के लिए एक साफ ऊतक कीमा बनाने वाले उपकरण का उपयोग करके सभी नमूनों के लिए प्रक्रिया दोहराएं।
  3. सेल निलंबन के 50 माइक्रोन को 37 डिग्री सेल्सियस पर 0.5% कम पिघलने वाले बिंदु अगारोज के 450 माइक्रोन युक्त ट्यूब पर स्थानांतरित करें।
    नोट: वॉल्यूम को समायोजित किया जा सकता है, लेकिन अगारोज की मात्रा ‧1% होनी चाहिए।
  4. तैयार करें और स्कोर स्लाइड के रूप में पहले10,11वर्णित है ।

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Representative Results

अध्ययन 1
जिगर पुरुष Sprague Dawley चूहों के दो साथियों से काटा गया था 4 दिनों के लिए मकई का तेल प्रशासित, एक सप्ताह से कंपित । स्लाइड हौसले से कीमा बनाया हुआ ऊतक, जमे हुए कीमा बनाया ऊतक से तैयार किए गए थे, और जमे हुए क्यूब ऊतक ऊतक कीमा डिवाइस का उपयोग करके मर्चेंट के माध्यम या कीमा बनाने वाले समाधान में संसाधित किए गए थे। पहले पलटन से जानवरों से प्राप्त जमे हुए ऊतकों का मूल्यांकन ~ 3.5 महीनों के लिए फ्रीजर भंडारण के बाद किया गया था। दूसरी पलटन से जानवरों से प्राप्त जमे हुए ऊतकों का मूल्यांकन ~ 6 महीने के लिए भंडारण के बाद किया गया था। विशेषता "हेजहोग" आकृति विज्ञान का प्रदर्शन करने वाले धूमकेतु, भारी क्षतिग्रस्त कोशिकाओं (अनिश्चित एटिजियोलॉजी जिसमें साइटोटॉक्सिकिटी या यांत्रिक तनाव शामिल हो सकते हैं) का संकेत है, % पूंछ डीएनए के स्कोरिंग में शामिल नहीं थे; हेजहोग का प्रतिशत, जो पूरी तरह से आकृति विज्ञान के दृश्य निरीक्षण पर पहचाना जाता है, ओईसीडी टीजी 4899के अनुसार अलग से सारणीबद्ध किया गया था। मतलब % पूंछ डीएनए दो साथियों में जानवरों के लिए परिणाम (१०० कोशिकाओं/पशु स्कोरिंग के आधार पर) चित्रा 2एमें संक्षेप में कर रहे हैं । जमे हुए ऊतक का उपयोग करने वाले सभी तरीकों ने ताजा ऊतक की तुलना में हमेशा सांख्यिकीय रूप से अलग नहीं होने वाले मूल्यों का उत्पादन किया। यह देखते हुए कि ताजा चूहा जिगर में % पूंछ डीएनए के लिए अनुशंसित ऊपरी सीमा 6%9है, इन परिणामों को प्रदर्शित करता है कि इन तरीकों में से कोई भी जमे हुए ऊतक के मूल्यांकन के लिए अच्छी तरह से काम कर सकते हैं । कीमा समाधान कम से कम समान रूप से प्रदर्शन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से व्यापारी माध्यम; चूंकि उत्तरार्द्ध तैयार करने के लिए अधिक समय लेने वाला है, बाद के अध्ययनों के लिए कीमा समाधान चुना गया था। दूसरे पशु पलटन से ऊतकों में नुकसान में कोई सांख्यिकीय महत्वपूर्ण अंतर नहीं थे जो ~ 3.5 महीनों के भंडारण के बाद संसाधित पहली पलटन से ऊतकों की तुलना में प्रसंस्करण से पहले ~ 6 महीने तक जमे हुए संग्रहीत किए गए थे। कुल मिलाकर, % हेजहोग ने % पूंछ डीएनए को समानांतर किया, हालांकि ताजा ऊतक के सापेक्ष जमे हुए ऊतकों में % हेजहोग % पूंछ डीएनए(चित्रा 2बी)की तुलना में अधिक परिवर्तनशील था। ताजा ऊतक में इन अंत बिंदुओं के लिए मूल्यएक आधाररेखा प्रदान करते हैं जिसके खिलाफ ठंड के तरीकों द्वारा शुरू की गई डीएनए क्षति कलाकृतियों का अंदाजा लगाया जा सकता है।

अध्ययन 2
मादा B6C3F1 चूहों को तीन दिनों के लिए सामान्य खारा में २०० मिलीग्राम/किलो/दिन में सामान्य खारा या म्यूटजेन, एथिल मीथेनसल्फोनेट (ईएमएस) प्रशासित किया गया था । ऊतक अंतिम खुराक प्रशासन के बाद 3 घंटे काटा गया था और धूमकेतु परख में ताजा संसाधित । अतिरिक्त ऊतक कीमा बनाने के समाधान में कीमा बनाया जा रहा है या क्यूब्स के रूप में एकत्र होने के बाद जमे हुए फ़्लैश था । क्यूब किए गए नमूनों को बाद में धूमकेतु स्लाइड तैयार करने से तुरंत पहले छलनी डिवाइस का उपयोग करके कीमा समाधान में संसाधित किया गया था। इस आधार पर कि हेजहोग आकृति विज्ञान का प्रदर्शन करने वाली कोशिकाएं रासायनिक-प्रेरित डीएनए क्षति के सातत्य के उच्च अंत में कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करती हैं, इमेजिंग सॉफ्टवेयर द्वारा स्कॉर्ग्स को% पूंछ डीएनए के स्वचालित स्कोरिंग में शामिल किया गया था। % पूंछ डीएनए परिणाम (स्कोरिंग १५० कोशिकाओं/पशु के आधार पर) चित्रा 3में संक्षेप में कर रहे हैं । जिगर के ऊतकों क्यूब्स के रूप में जमे हुए और बाद में ऊतक कीमा बनाने वाले उपकरण का उपयोग कर संसाधित बहुत हौसले कीमा बनाया हुआ ऊतक के लिए प्राप्त उन लोगों के समान परिणाम मिले । % पूंछ डीएनए मूल्यों जमे हुए कीमा बनाया हुआ ऊतक के लिए कुछ हद तक अधिक थे, लेकिन जमे हुए कीमा बनाया हुआ ऊतक के लिए आधारभूत मूल्यों 6% से नीचे थे, के रूप में धूमकेतु परख9के लिए ओईसीडी परीक्षण दिशानिर्देश में ताजा चूहा जिगर के लिए सिफारिश की । ईएमएस-प्रेरित डीएनए क्षति में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण वृद्धि सभी तीन तरीकों द्वारा संसाधित ऊतक नमूनों में मापी गई थी ।

अध्ययन 3
एक दूरदराज की प्रयोगशाला द्वारा आयोजित एक परीक्षण रसायन के एक ९० दिन विषाक्तता अध्ययन में महिला B6C3F1 चूहों से एकत्र जिगर के ऊतकों के कुछ हिस्सों कीमा बनाया हुआ या क्यूब्स में कटौती, फ्लैश जमे हुए थे, और विश्लेषण के लिए इस प्रयोगशाला के लिए सूखी बर्फ पर रात भर भेज दिया । कीमा बनाया हुआ ऊतक फ्रीजर भंडारण के ~ 2 महीने के बाद विश्लेषण किया गया था(चित्रा 4)। कोशिकाओं है कि दृश्य निरीक्षण पर दिखाई हेजहोग हो, लेकिन इमेजिंग सॉफ्टवेयर द्वारा झुलसा ने% पूंछ डीएनए माप (१५० कोशिकाओं रन बनाए/ हेजहोग की संख्या (चाहे स्कोर्रीय या असंप्य) केवल १५० कोशिकाओं/पशु की कुल में आकृति विज्ञान के दृश्य निरीक्षण पर पहचान की अलग से इन अत्यधिक क्षतिग्रस्त कोशिकाओं की आवृत्ति के बारे में जानकारी प्रदान करने के लिए सारणीबद्ध किया गया था । कुल मिलाकर, जमे हुए कीमा बनाया हुआ ऊतक में डीएनए क्षति (% पूंछ डीएनए के रूप में मापा) वाहन नियंत्रण समूह सहित पशु परिवर्तनशीलता के लिए पर्याप्त पशु परिवर्तनशीलता के साथ सभी खुराक समूहों में उच्च था । % पूंछ डीएनए परिणाम % हेजहोग (केवल आकृति विज्ञान के आधार पर पहचाने गए) के साथ सहसंबद्ध होते हैं, यह दर्शाता है कि हेजहोग ने इन नमूनों में देखे गए डीएनए क्षति के उच्च स्तर में काफी योगदान दिया। कीमा बनाया हुआ ऊतक में मापा डीएनए क्षति के उच्च पृष्ठभूमि स्तर के आधार पर, जमे हुए क्यूब ऊतक बाद में भंडारण के ~ 22 महीने(चित्रा 4)के बाद विश्लेषण किया गया था । दोनों डीएनए क्षति और % हेजहोग फ्लैश जमे हुए क्यूब ऊतक है कि कीमा बनाया हुआ ऊतक नमूनों के साथ समानांतर में तैयार किया गया था में बहुत कम थे । इस प्रकार, कीमा बनाया हुआ ऊतक नमूनों में हेजहॉग आकृति विज्ञान द्वारा परिलक्षित अत्यधिक क्षतिग्रस्त कोशिकाओं को स्पष्ट रूप से एक जैविक प्रक्रिया का परिणाम नहीं थे, लेकिन संभावना यांत्रिक व्यवधान और/ इन आंकड़ों को अविश्वसनीय माना गया। सौभाग्य से, जमे हुए क्यूब ऊतक के विश्लेषण ने एक स्पष्ट परिणाम प्रदान किया, अर्थात् परीक्षण रसायन के संपर्क में आने के तीन महीने बाद मादा चूहों के जिगर में डीएनए क्षति प्रतिक्रिया की कमी। इस मामले के अध्ययन द्वारा प्रदान किए गए परिणाम अपेक्षाकृत अनुभवहीन प्रयोगशाला द्वारा कीमा बनाया हुआ ऊतकों की तैयारी से जुड़े जोखिम का उदाहरण देते हैं और इस समस्या को दरकिनार करने के लिए जमे हुए क्यूब ऊतक विधि की उपयोगिता प्रदर्शित करते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: ऊतक कीमा बनाने वाला उपकरण और प्लंजर जमे हुए ऊतकों से एक सेल निलंबन तैयार करने के लिए उपयोग किया जाता है। प्रोटोटाइप डिवाइस (4.5 मिमी आंतरिक व्यास, 0.4 मिमी जाल आकार) कृपया डॉ गुन्नार ब्रूनबोर्ग (नॉर्जेनोटेक, ओस्लो, नॉर्वे) द्वारा प्रदान किया गया था। दाईं ओर पैनल डिवाइस के साथ उपयोग के लिए ऊतक के उचित आकार के घन का एक उदाहरण प्रदान करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: ताजा और जमे हुए कीमा बनाया हुआ और समरूप माउस जिगर के नमूनों में मापा डीएनए क्षति की तुलना । जिगर दो कंपित साथियों से काटा गया था (n = 5/group/पलटन) पुरुष Sprague Dawley चूहों के 4 दिनों के लिए मकई का तेल प्रशासित । स्लाइड हौसले से कीमा बनाया हुआ ऊतक, जमे हुए कीमा बनाया ऊतक से तैयार किए गए थे, और जमे हुए क्यूब ऊतक ऊतक कीमा डिवाइस का उपयोग करके मर्चेंट के माध्यम या कीमा बनाने वाले समाधान में संसाधित किए गए थे। जमे हुए ऊतकों का विश्लेषण ~ 3.5 और 6 महीने के बाद क्रमशः 1 और 2 साथियों के लिए नेक्रॉप्सी के बाद किया गया था। आकृति विज्ञान के आधार पर हेजहोग के रूप में वर्गीकृत धूमकेतु को % पूंछ डीएनए के स्कोरिंग में शामिल नहीं किया गया था। (A)पलटन का मतलब% पूंछ डीएनए परिणाम है । (B)पलटन मतलब % हेजहॉग परिणाम। त्रुटि बार मानक विचलन को दर्शाते हैं। प्रत्येक पलटन के लिए ताजा ऊतक ों के खिलाफ जमे हुए ऊतकों की तुलना करने और प्रत्येक ऊतक तैयारी विधि के लिए दो साथियों के बीच परिणामों की तुलना करने के लिए सांख्यिकीय विश्लेषण किए गए थे। * छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग करके एक ही पलटन के भीतर ताजा कीमा बनाए गए ऊतकों से सांख्यिकीय रूप से अलग(पी एंड एलटी; 0.05); सामान्य रूप से वितरित डेटा के लिए मान-व्हिटनी परीक्षण का उपयोग करके एक ही पलटन के भीतर ताजा कीमा बनाया हुआ ऊतक से अलग(पी एंड एलटी; 0.05) #statistically; ♫ छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग करके साथियों के बीच सांख्यिकीय अंतर(पी एंड एलटी;0.05) । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: विभिन्न प्रक्रियाओं द्वारा संसाधित यकृत ऊतक में ईएमएस द्वारा प्रेरित डीएनए क्षति की तुलना। मतलब % महिला B6C3F1 चूहों के लिए पूंछ डीएनए तीन दिनों के लिए वाहन या २०० मिलीग्राम/किलो/दिन ईएमएस प्रशासित (n = 5/group) । यकृत अंतिम खुराक प्रशासन के बाद 3 घंटे काटा गया और धूमकेतु परख में ताजा संसाधित । अतिरिक्त जिगर के ऊतकों को कीमा समाधान में कीमा बनाया जा रहा है या क्यूब्स के रूप में एकत्र होने के बाद जमे हुए फ्लैश था; क्यूब किए गए नमूनों को धूमकेतु स्लाइड तैयार करने से तुरंत पहले ऊतक कीमा बनाने वाले उपकरण का उपयोग करके समरूप किया गया था। ईएमएस-प्रेरित डीएनए क्षति के सातत्य के उच्च अंत में कोशिकाओं को सुनिश्चित करने के लिए विश्लेषण से बाहर नहीं रखा गया था, धूमकेतु है कि दृश्य निरीक्षण पर हेजहोग के रूपात्मक विवरण को पूरा करने के लिए दिखाई दिया, लेकिन इमेजिंग सॉफ्टवेयर द्वारा झुलसा हुआ पाया गया शामिल थे । त्रुटि बार मानक विचलन को दर्शाते हैं। एक छात्र के टी परीक्षण के खिलाफ है कि वाहन नियंत्रण जानवरों में प्रत्येक नमूना तैयारी विधि के लिए ईएमएस के संपर्क में पशुओं में डीएनए क्षति की मात्रा की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । * पी एंड एलटी; 0.05 में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण वृद्धि। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4. केस स्टडी जमे हुए घन विधि और लंबे समय तक भंडारण के बाद प्राप्त उच्च गुणवत्ता वाले डेटा की उपयोगिता का प्रदर्शन करती है। ~ 90 दिनों (एन = 5/समूह) के लिए एक परीक्षण रसायन की विभिन्न सांद्रता के संपर्क में महिला B6C3F1 चूहों से एकत्र जिगर के ऊतकों के कुछ हिस्सों को कीमा बनाया हुआ था या क्यूब्स में काटा गया था और इन-लाइफ प्रयोगशाला में जमे हुए फ्लैश थे और बाद में विश्लेषण के लिए इस प्रयोगशाला में भेज दिया गया था। कीमा बनाया हुआ ऊतक भंडारण के ~ 2 महीने के बाद विश्लेषण किया गया था; डेटा की खराब गुणवत्ता के कारण, बाद में ~ 22 महीनों के भंडारण के बाद जमे हुए क्यूब किए गए ऊतकों का विश्लेषण किया गया। रासायनिक प्रेरित डीएनए क्षति के सातत्य के उच्च अंत में कोशिकाओं को सुनिश्चित करने के लिए विश्लेषण से बाहर नहीं रखा गया था, स्कोरकरने योग्य कोशिकाओं से डेटा है कि, दृश्य निरीक्षण पर हेजहोग दिखाई दिया, शामिल थे । (A)समूह का मतलब% पूंछ डीएनए परिणाम। कीमा बनाया हुआ ऊतक की तुलना में, लंबे समय तक भंडारण के बाद भी जमे हुए क्यूब वाले ऊतकों से उच्च गुणवत्ता वाले परिणाम प्राप्त किए गए थे। (B)समूह का मतलब % हेजहॉग परिणाम। खराब कीमा तकनीक व्यापक गैर जैविक डीएनए क्षति कीमा बनाया हुआ ऊतक नमूनों में हाथी धूमकेतु के रूप में मनाया से स्पष्ट है । त्रुटि बार मानक विचलन को दर्शाते हैं। डननेट के परीक्षण के साथ एक ANOVA प्रत्येक नमूना तैयारी विधि के लिए परीक्षण रसायन के लिए एक सकारात्मक प्रतिक्रिया के लिए मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । किसी भी विधि के लिए कोई सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण(पी एंड एलटी; 0.05) खुराक समूहों का पता नहीं चला। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: बेसलाइन डीएनए नुकसान जमे हुए चूहे मस्तिष्क ऊतकों में मापा । धूमकेतु परख परिणाम जमे हुए कीमा बनाया हुआ या शावक ऊतकों के लिए प्रदान किए जाते हैं जो पुरुष और मादा स्प्राग डाले चूहों के मस्तिष्क के कई विभिन्न क्षेत्रों का प्रतिनिधित्व करते हैं। डेटा (स्कोरेबल हेजहोग धूमकेतु सहित द्वारा उत्पन्न) कई अध्ययनों पर मिलान किया गया; n = प्रत्येक नमूना तैयारी विधि के लिए मूल्यांकन किए गए मस्तिष्क ऊतकों की कुल संख्या। त्रुटि बार मानक विचलन को दर्शाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

जैसा कि पहले7,,12,,13का प्रदर्शन किया गया था, ठीक से संभाला फ्लैश जमे हुए कीमा बनाया हुआ ऊतक धूमकेतु परख में अच्छे परिणाम प्रदान करता है। वास्तव में, हमारी प्रयोगशाला में तैयार जमे हुए कीमा बनाया हुआ चूहा और माउस जिगर के लिए बेसलाइन% पूंछ डीएनए मूल्य आम तौर पर ‧6% हैं, जैसा कि ताजा कीमा बनाया हुआ चूहा जिगर के नमूनों के लिए ओईसीडी परीक्षण दिशानिर्देश9 द्वारा अनुशंसित है। कई प्रकार के ऊतक ों का उपयोग करके कई प्रयोगशालाओं द्वारा अच्छे परिणाम प्राप्त किए गए हैं जिन्हें कीमा बनाया हुआ और जमे हुए संग्रहीत किया गया है; इसी तरह, गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ट्रैक्ट में अंगों से स्क्रैप फ्लैश फ्रोजन एपिथेलियल कोशिकाओं को धूमकेतु परख7,12, 13,,,14में सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है ।13 जमे हुए कीमा बनाया हुआ/स्क्रैप ऊतक कम से कई महीनों के लिए अपेक्षाकृत स्थिर प्रतीत होता है । मूल रूप से जैक्सन एट अल.6द्वारा वर्णित ऊतक कीमा उपकरण का उपयोग करके यकृत के फ्लैश फ्रोजन क्यूब्स के समरूपीकरण को नियोजित करने वाली विधि, धूमकेतु परख में परिणाम कम से कम तुलनीय और आम तौर पर बेहतर (यानी, डीएनए क्षति के निचले आधारभूत स्तर) जमे हुए कीमा बनाया हुआ जिगर के लिए प्राप्त लोगों की तुलना में। यह कार्यप्रणाली अन्य ऊतकप्रकारों परभी लागू होती है 6 ; हमारे अनुभव में, उत्कृष्ट परिणाम इसी तरह जमे हुए क्यूबडुडेनम (डेटा नहीं दिखाए गए) और मस्तिष्क के ऊतकों(चित्रा 5)का उपयोग करके प्राप्त किए गए हैं। हालांकि, छलनी डिवाइस सभी ऊतक प्रकार के समरूपीकरण के लिए उत्तरदायी नहीं हो सकता है। एक प्रायोगिक अध्ययन में, हमने पाया कि मांसपेशियों के दिल के ऊतकों को छलनी डिवाइस के माध्यम से आसानी से मजबूर नहीं किया जा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप खराब सेल रिकवरी होती है; इसके बजाय, ऊतक को तुरंत विगलन पर कीमा बनाने से बेसलाइन % पूंछ डीएनए मूल्यों के साथ कोशिका निलंबन मिले जो फ्लैश फ्रीजिंग (डेटा नहीं दिखाए गए) से पहले कीमा बनाया हुआ उन लोगों के बराबर है। विशेष रूप से, जब necropsy के दौरान ठीक से संभाला (यानी, ठंडा और नम रखा; फ्लैश व्यक्तिगत टुकड़े के रूप में जमे हुए और आंशिक रूप से गल करने की अनुमति नहीं), फ्लैश जमे हुए क्यूब ऊतक फ्रीजर भंडारण के लगभग दो साल के बाद भी बहुत कम बेसलाइन डीएनए क्षति मिली है(चित्रा 4)।

धूमकेतु परख में जमे हुए सेल निलंबन या क्यूब ऊतक का उपयोग ताजा ऊतक पर कई फायदे प्रदान करता है: 1) धूमकेतु विश्लेषण के लिए कई ऊतक प्रकारके एक साथ संग्रह की सुविधा; 2) एक इन-लाइफ प्रयोगशाला में ऊतक संग्रह की सुविधा और विश्लेषण के लिए नमूनों को एक अलग प्रयोगशाला में स्थानांतरित करना; 3) सुविधा के लिए एक महीने के लिए दिए गए ऊतक का विश्लेषण करने का निर्णय स्थगित । यद्यपि स्लाइड तैयारी के समय जमे हुए ऊतकों का समरूपीकरण फसल के समय ताजा ऊतक कीमा बनाने की तुलना में अधिक बोझिल है, जमे हुए क्यूब ऊतक का उपयोग कई अतिरिक्त लाभ प्रदान करता है जिसमें शामिल हैं: 1) धूमकेतु परख में प्रशिक्षित कर्मियों के लिए कोई आवश्यकता नहीं (जैसे, मोबाइल इकाई) या विशेष आपूर्ति/नेक्रॉप्सी में अभिकर्मक; 2) तकनीकी त्रुटियों के लिए कम अवसर (जैसे, नमूना वार्मिंग; कोशिकाओं की अपर्याप्त रिहाई; उप इष्टतम ऊतक नमूना आकार) necropsy के दौरान; 3) नमूना प्रसंस्करण के दौरान यांत्रिक डीएनए क्षति शुरू करने का न्यूनतम अवसर (उदाहरण के लिए, कतरनी कीमा बनाना); और 4) लंबे समय तक भंडारण के बाद भी कम बेसलाइन डीएनए क्षति।

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Disclosures

इस काम को अनुबंध HHSN273201300009C के तहत एनआईएच, राष्ट्रीय पर्यावरण स्वास्थ्य विज्ञान संस्थान (एनआईएचएस) के इंट्राम्यूरल रिसर्च प्रोग्राम द्वारा समर्थित किया गया था; हालांकि, बयान, राय, या उसमें निहित निष्कर्ष जरूरी बयानों, राय, या NIEHS, NIH, या संयुक्त राज्य अमेरिका सरकार के निष्कर्षका प्रतिनिधित्व नहीं करते ।

Acknowledgments

लेखक ों को विशेषज्ञ तकनीकी सहायता की तैयारी और धूमकेतु स्लाइड स्कोरिंग और सांख्यिकीय विश्लेषण प्रदर्शन के लिए डॉ कैरोल Swartz के लिए लिंकन मार्टिन और Kelley Owens के ऋणी हैं । लेखक आईएलएस में जेनेटिक टॉक्सिकोलॉजी, खोजी विष विज्ञान और नेक्रॉप्सी कार्यक्रमों के सदस्यों के सहायक योगदान को भी स्वीकार करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cryovials Corning Costar 430488
Dental Wax Sheets Electron Microscopy Sciences 72670
Dissecting (Mincing) Micro Scissors Fisher Scientific 08-953-1B
DMSO Sigma-Aldrich D8418
Hank's Balanced Salt Solution Gibco 14175-079
KCl Teknova P0315-10
KH2PO4 Sigma-Aldrich P9791
Low Melting Point Agarose Lonza 50081
Microfuge Tubes (1.7 mL) Corning 3207
Na2EDTA Sigma-Aldrich E5134
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S7907
NaCl Sigma-Aldrich S6191
Neutral Buffered Formalin Leica 600
Scalpel Blades Miltex 4-110
Syringe Plunger (1 mL) Fisher Scientific or Vitality Medical 14-826-88; 8881901014 Becton Dickinson or Monoject tuberculin syringe
Tissue Mincing Device NorGenoTech (Oslo, Norway) None Small variability in diameter observed which can affect snuggness of plunger.
Tweezers, plastic Trade Winds Direct DF8088N Reinforced nylon, nonsterile, blunt tip, autoclavable; tradewindsdirect.com
Weigh Boats Krackler Scientific/Heathrow Scientific 6290-14251B

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References

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जेनेटिक्स इश्यू 157 सिंगल सेल जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस क्षारीय धूमकेतु परख गुणसूत्र क्षति डीएनए स्ट्रैंड ब्रेक जीनोटॉक्सिकिटी वीवो ओईसीडी में
डीएनए क्षति के मूल्यांकन के लिए धूमकेतु परख में जमे हुए ऊतक का उपयोग
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Hobbs, C. A., Recio, L., Winters, J., Witt, K. L. Use of Frozen Tissue in the Comet Assay for the Evaluation of DNA Damage. J. Vis. Exp. (157), e59955, doi:10.3791/59955 (2020).

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