Summary
이 프로토콜은 DNA 손상을 평가하기 위해 혜성 분석실험에 사용하기 위해 부검 시 고품질 냉동 조직 샘플을 준비하기 위한 몇 가지 절차를 설명합니다: 1) 다진 조직, 2) 위장관에서 긁힌 상피 세포, 3) 큐브 조직 조직 다진 장치를 사용하여 균질화를 요구하는 샘플.
Abstract
혜성 분석은 배양 된 세포와 조직에서 DNA 손상을 평가하는 수단으로 인기를 얻고 있으며, 특히 화학 물질이나 다른 환경 스트레스 에 노출 된 후. 설치류에서 genotoxic 잠재력에 대한 규제 테스트에서 혜성 분석의 사용은 2014 년 경제 협력 및 개발 기구 (OECD) 테스트 가이드 라인의 채택에 의해 구동되었다. 혜성 분석 슬라이드는 전형적으로 부검시에 신선한 조직에서 제조된다; 그러나, 동결 조직 견본은 동물 당 그리고 연구 당 많은 동물에서 다중 기관에서 슬라이드의 동시 준비와 관련되었던 물류 도전을 피할 수 있습니다. 동결은 또한 분석을 위해 다른 실험실에 노출 시설에서 샘플을 선적 할 수 있으며, 냉동 조직의 저장은 주어진 기관에 대한 DNA 손상 데이터를 생성하는 결정을 연기 용이하게. 알칼리성 혜성 분석은 불완전한 DNA 절제 수선과 관련되었던 노출 관련 DNA 이중 및 단 하나 물가 나누기, 알칼리-labile 병변 및 가닥 나누기를 검출하기 위해 유용합니다. 그러나 DNA 손상은 또한 기계적 전단 또는 부적절한 샘플 처리 절차로 인해 분석 결과를 혼란스럽게 할 수 있습니다. 부검 중 조직 샘플의 수집 및 처리의 재현성은 혜성 분석에 대한 조직 을 수확하는 경험이 다양한 수준의 실험실 직원변동으로 인해 제어하기 어려울 수 있습니다. 숙련된 실험실 인력으로 구성된 모바일 장치의 재교육 또는 배포를 통해 일관성을 향상시키는 것은 비용이 많이 들며 항상 실현 가능하지는 않을 수 있습니다. 혜성 분석 분석을 위한 고품질 샘플의 일관된 생성을 최적화하기 위해 맞춤형 조직 채굴 장치를 사용하여 조직의 플래시 냉동 큐브를 균질화하는 방법을 평가하였다. 이 방법에 의해 혜성 분석에 대해 제조된 샘플은 부검 시 다진 에 의해 제조된 신선 및 냉동 조직 샘플에 대한 품질면에서 유리하게 비교하였다. 더욱이, 낮은 기준선 DNA 손상은 장기간 저장다음 조직의 동결 된 큐브에서 세포에서 측정되었다.
Introduction
혜성 분석기는 화학 물질 또는 다른 환경 스트레스제에 노출된 배양 된 세포 및 조직에서 DNA 손상을 평가하는 수단으로 점점 더 많이 사용된다1. 이 분석은 불완전한 DNA 복구와 관련되었던 DNA 이중 및 단 하나 물가 휴식, 알칼리-labile 병변 및 단 하나 물가 나누기를 검출할 수 있습니다. 국제항암제 시험용 인체사용기술요건의 조화(ICH) 가이드라인은 생체내 유독성 평가를 위한 설치류 적혈구 미세핵분석실험을 보충하기 위한 제2시험으로서 혜성분석과 같은 DNA 가닥 파괴 분석실험을 권고하고, 종양유도2의표적기관에서의 행동모드를 평가하기 위한 후속검사로 한다. 유럽식품안전청(EFSA)은 생체외 유독성 시험3에서 양성 결과의 관련성을 조사하기 위한 적절한 후속 시험으로서 생체 내 혜성 분석기를3권장한다. 2014년, 설치류 혜성 분석실험에 대한 OECD 시험 지침이 승인되어, 따라서 게노독성 전위내성의 규제 시험에 사용하기 위한 분석법의 수용성을 증가시킨다. 분석은 용해 된 세포의 핵에서 이동하는 이완된 DNA 루프 및 파편의 전기 동화성 분리에 근거를 두었습니다. 기본적으로, 단 하나 세포는 현미경 슬라이드에 겹쳐진 agarose에 내장됩니다. 슬라이드는 다음 알칼리성 (pH > 13) 솔루션 다음에 용해 버퍼에 침지, 단단히 코일 핵 DNA가 이완하고 긴장을 풀 수 있습니다. 슬라이드는 다음 양극을 향해 음전하 DNA의 이동을 자극하는 전기장에 배치, 혜성을 닮은 이미지를 만드는; 혜성 머리와 비교된 혜성 꼬리에 있는 DNA의 상대적인 양은 DNA 손상의 양에 정비례합니다; 꼬리의 DNA 함량은 전형적으로 디지털 이미징 소프트웨어를 사용하여 정량화됩니다.
혜성 분석이 단편화된 DNA를 검출하기 때문에, 노출 유도된 DNA 손상의 정확한 정량화는 처리 유도된 세포 독성 또는 긴장에서 유래한 괴사 또는 세포자멸과 관련되었던 염색질 단편화에 의해 혼동될 수 있습니다. 또한, DNA 손상은 기계적 전단 또는 부적절한 시료 처리의 결과로 발생할 수 있습니다4. DNA 손상의 기준선 수준을 최소화하기 위해 슬라이드 준비 전에 냉각 된 수확 된 조직을 유지하는 것이 이전에5,,6으로입증되었습니다. 많은 실험실은 신선한 조직에서 혜성 분석 슬라이드를 준비; 그러나, 이것은 동물의 다수를 가진 연구 결과에 있는 동물 당 다중 조직 모형에서 슬라이드를 준비할 때 물류적으로 도전적일 수 있습니다. 또한, 이것은 슬라이드 준비 및 분석이 원격 실험실에서 발생할 때 문제를 제시, 샘플의 선적을 필요로. 예를 들어, 미국 국립 독성학 프로그램은 혜성 분석물질을 그 유전독성시험 프로그램(https://ntp.niehs.nih.gov/testing/types/genetic/index.html)의 성분으로 포함하며, 때로는 28일 또는 90일 반복 투여량 독성 연구에 분석결과를 통합한다; 이것은 생활 실험실에 의하여 조직의 수집및 분석을 위한 다른 실험실에 견본의 전송을 필요로 합니다. 이를 달성하기 위해, 조직 조각은 다진, 및 /또는 위장관의 상피 세포는 긁어 및 세포 현탁액은 분석7까지수신 실험실에 의해 후속 선적 및 저장을위한 냉동및 냉동에 저장된다. 시료의 적절한 취급은 냉동 조직을 사용하여 고품질의 데이터를 얻는 데 중요합니다. 그러나, 끊임없이 변화하는 인원에 의해 수행된 부검 도중 조직 견본의 재현가능한 조작은 통제하기 어렵습니다, 특히 혜성 분석사를 위한 조직을 일상적으로 수확하지 않는 생활 실험실에서. 부검 직원의 재교육 또는 신선하거나 냉동 된 조직 샘플을 수집하기 위해 숙련 된 실험실 직원이 근무하는 모바일 유닛의 사용은 종종 너무 비싸거나 실현 가능하지 않거나 단순히 과소 평가됩니다.
혜성 분석 분석을 위한 원격 부위로의 이송을 위한 고품질 조직 샘플의 일관된 생성을 더 잘 보장하기 위해, 조직의 플래시 냉동 큐브로부터 조직 보존의 출판 방법6의 유용성을 탐구하였다. 이 방법에서, 조직의 동결된 큐브는 콜드 버퍼를 함유하는 미세원원원지 튜브에 배치되는 스테인레스 스틸 조직 채굴장치(도 1)에적재된다. 조직의 큐브는 장치의 끝에있는 작은 게이지 메쉬를 통해 밀어 넣습니다. 반복적으로 메쉬 체를 통해 여러 번 양방향으로 조직 현탁액을 강제하면 비교적 균일한 단일 세포 현탁액을 초래한다. 이 방법으로 제조된 샘플은 다진 에 의해 제조된 신선 및 냉동 조직 샘플 모두에 품질면에서 유리하게 비교하였다. 추가 혜택으로, 다진 샘플과는 달리, 조직 큐브는 오랜 시간 동안 냉동 저장 될 수 있으며 여전히 혜성 분석에서 높은 품질의 결과를 산출.
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Protocol
조직은 좋은 실험실 연습 규정 (21 CFR 파트 58)과 기관 동물에 의해 승인 된 동물 사용 프로토콜에 따라 NTP 계약 실험실에서 AAALAC 공인 시설에서 수행 된 연구의 수행 중에 수확되었다 각 실험실에서 관리 및 사용 위원회 (IACUC).
1. 조직 수확 및 가공
참고: 중복 샘플 튜브(예를 들어, 간)를 준비하거나 샘플의 약 절반을 다른 저장 튜브(예: 십이지장, 위)로 옮겨 재분석을 가능하게 하는 것이 유용하다. 장 부 조직에 대한 잠재적 인 샘플 간 가변성을 최소화하기 위해 각 동물에 대한 위장에 비해 조직의 동일한 영역을 샘플링하고 샘플을 나누어 중복 샘플을 생성하는 것이 좋습니다. 플라스틱 집게는 두뇌와 같은 끈적끈적한 조직을 옮기는 것을 추천합니다. 옵션으로서, 다진, 긁힌 또는 균질화된 조직 제제는 원점 관에 부착된 40 μm 세포 스트레이너를 사용하여 균질한 단일 세포 현탁액을 달성하기 위해 여과될 수 있다.
- 관심 있는 장기에서 연결된 연결 조직, 장기 및 이물질을 제거하십시오. 제거 직후, ~ 7 mL의 차갑게 준비된 다진 용액 (Mg++, Ca++ 및 페놀 적색 행크의 균형 잡힌 소금 용액, 10 % v / v DMSO 및 20 mM EDTA pH 7.5)을 함유 한 중간 크기의 계량 보트에서 장기를 힘차게 휘젓고 잔여 혈액과 이물질을 제거하십시오.
- 각 장기를 충분한 (~7 mL) 차가운 다진 용액을 함유한 다른 깨끗한 계량 보트로 옮기고, 추가 처리가 될 때까지 얼음위에 침수된 조직을 유지합니다.
- 관심있는 각 기관의 섹션을 제거하고 포함 카세트에 놓습니다. 10% 중성 완충 포르말린, 트림 및 파라핀을 향후 조직 병리학 평가를 위한 실험실의 표준 절차에 따라 수정하십시오.
- 간장의 경우 왼쪽 엽의 5mm 세로 부분을 자르고 차가운 다진 용액의 ~ 7 mL에 부드럽게 휘저어 주세요. 조직의 스트립을 차가운 다진 용액의 ~ 7 mL가 들어있는 깨끗한 중간 크기의 계량 보트에 넣고 추가 처리 준비가 될 때까지 얼음위에 유지하십시오 (단계 1.8 또는 1.11).
- 십이지장의 경우 십이지장 근시의 10mm 부분을 위장으로 자른다. 21-25 G 바늘을 사용 하 여, 이물질과 박테리아를 제거 하기 위해 플러시.
- 십이지장의 한쪽 끝에 바늘을 삽입하고 1 mL의 차가운 다진 용액으로 플러시하십시오.
- 십이지장의 뒤집기와 다른 1 mL의 다진 용액으로 반복하여 다른 방향을 플러시합니다. 바늘을 버리십시오.
- 십이지장 오픈을 슬라이스하고 ~ 7 mL의 깨끗한 다진 용액을 포함하는 중간 크기의 계량 보트에 넣기 전에 채굴 용액의 ~ 7 mL로 헹구십시오. 추가 처리 가 준비될 때까지 얼음 위에 유지하십시오(1.8 단계 또는 1.11단계).
- 뇌의 경우 먼저 뇌를 두 개의 반구로 나누는 것이 유용할 수 있습니다. 하나의 반구는 가능한 조직 병리학을 위해 저장할 수 있습니다 (1.2 단계 참조).
- 관심있는 뇌 영역을 해부하고 차가운 다진 용액의 ~ 7 mL에서 부드럽게 휘저어 주세요.
- 조직(들)을 차가운 다진 용액의 ~ 7 mL를 함유한 깨끗한 중형 계량 보트로 옮기고 추가 처리 준비가 될 때까지 얼음 위에 유지합니다(단계 1.8 또는 1.11; 소뇌 및 해마와 같은 작은 부위는 더 이상 트리밍이 필요하지 않을 수 있음).
- 위장용
- 포위를 제거하고 폐기하십시오. 배를 열고 중간 크기의 계량 보트에서 ~ 7 mL의 차가운 다진 버퍼를 사용하여 음식에서 씻어 냅니다.
- 가능한 조직 병리학 평가를 위한 고정을 위해 십이지장에 5 mm 의 선 위 근엽 을 제거하십시오 (단계 1.2 참조).
- 남은 배를 중간 크기의 계량 보트에 차가운 다진 완충액 ~7 mL에 넣고 얼음에 15-30 분 동안 배양하십시오.
참고: 이 배양 단계는 필요하지 않을 수 있습니다. 이 단계는 JaCVAM 유효성 검사 프로토콜에 포함되었지만 OECD 시험 지침8,,9에는언급되지 않았습니다. - 깨끗한 파라핀 조각(또는 페트리 접시 또는 계량 보트)으로 위를 옮기고 메스 블레이드 또는 폴리테트라플루오로에엔(PTFE) 스크레이퍼를 사용하여 표면 상피를 2회 이상 부드럽게 긁어 내어 이물질을 제거합니다. 집게로 위 점막을 집어 들고 파이펫을 사용하여 1 mL의 차가운 다진 버퍼로 헹구고 헹구어 보세요. 깨끗한 표면이나 접시에 위 조직을 전송합니다.
- 메스 블레이드 또는 PTFE 스크레이퍼의 뒷면으로 다진 용액 (일반적으로 250 μL / 마우스 또는 500-1,000 μL / rat)에서 위 상피를 4-5 회 조심스럽게 긁어 냅니다. 선택적으로, 더 많은 세포를 복구하기 위해 거의 동일한 양의 다진 용액으로 조직을 헹구는 다. 파이펫을 사용하여 방출된 세포를 함유하는 다진 용액을 수집하고 얼음 위에 미세 원심 분리튜브로 옮김을 옮김을 전달한다.
- 조직 샘플을 다진 경우, 간 또는 뇌 조직의 3-4 mm 절편 또는 십이지장의 ~ 5mm를 자르고 1.5 또는 2.0 mL의 콜드 마칭 용액을 함유한 표지된 1.5 mL 마이크로 원심 분리튜브로 옮김을 옮김을 옮김을 합니다. 샘플을 차갑게 유지하면서 미세하게 분산 될 때까지 가위로 빠르게 다진 (≤30s). 샘플은 약간 흐린 것처럼 보입니다. 그러나 일부 조각이 튜브 의 바닥에 정착하는 것이 일반적입니다.
- 신선한 조직을 사용하려면, 다진 조직 또는 얼음에 긁힌 상피 세포를 포함하는 튜브를 유지; 약 1 시간 의 수확 (섹션 2에 설명)에서 혜성 슬라이드를 준비하기 위해 조직을 사용합니다.
- 조직 샘플을 동결하기 위해, 긁힌 상피 세포의 다진 또는 수집 직후
- 튜브 뚜껑을 고정하고 액체 질소를 함유한 Dewar 플라스크에 튜브 를 떨어 뜨리십시오. 튜브는 부검 기간 동안 액체 질소에서 유지 될 수있다 (≤3 h).
- 국자를 사용하여 튜브를 검색하고 정렬 드라이 아이스에 배치합니다. 튜브를 드라이 아이스의 냉동고 박스로 옮기고 -80°C 냉동실에 보관하십시오.
- 조직의 냉동 큐브를 준비하기 위해, 조직의 여러 작은 조각을 잘라 (직경 ≤4mm 및 ~ 6mm 길이; 그림 1).
- 액체 질소가 들어있는 중간 크기의 계량 보트 또는 기타 적합한 용기에 개별적으로 직접 떨어 뜨립니다.
- 조각이 완전히 동결하고 건조 얼음에 유지 표지 된 미세 원심 분리튜브 또는 저온 튜브에 개별 냉동 조직 큐브를 전송하는 몇 초 동안 기다립니다; 동결 과정에서 조각이 뭉쳐지지 않도록 하십시오.
- 튜브를 드라이 아이스의 냉동고 박스로 옮기고 -80°C 냉동실에 보관하십시오.
2. 슬라이드 준비
-
다진/긁힌 티슈용
- 젖은 얼음에 신선한 조직을 포함하는 튜브를 유지합니다.
- 냉동 조직의 튜브를 시료가 완전히 해동될 때까지 실온의 수조에 놓고 차가운 것을 유지하십시오. 즉시 튜브를 얼음으로 옮김을 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김을 옮김에 대십시오.
- 아가로즈로 전달하기 위해 세포를 인출하기 직전에(단계 2.3), 각 셀 현탁액을 부드럽게 혼합; 필터링되지 않은 샘플의 경우 큰 덩어리가 튜브 바닥에 정착하도록 하십시오. 슬라이드가 모든 샘플에 대해 준비될 때까지 얼음에 있는 모든 튜브를 유지합니다.
-
큐브 티슈용
- 80°C 냉동고에서 티슈 큐브가 들어 있는 튜브를 꺼내고 슬라이드 준비전까지 드라이 아이스를 유지합니다.
- 상인의 배지의 1 mL (0.14 M NaCl, 1.47 mM KH2PO4,2.7 mM KCl, 8.1 mMNa2HPO4,10 mM NaEDTA, pH 7.4) 또는 각 샘플에 대한 1.7 mL 마이크로 센트리 퓨지 튜브로 다진 용액을 각 샘플에 유지한다.
- 조직 해동을 피하기 위해 신속하게 작업하고, 실온 조직 다진 장치의 열린 끝에 조직의 큐브를 놓습니다(그림 1). 여러 조직 조각이 사용될 수있다; 필요한 경우, 동결된 조직은 장치에 맞게 큐브 크기를 줄이기 위해 차가운 모르타르 및 유봉을 사용하여 더 작은 조각으로 절단되거나 갈라질 수 있다.
- 크기 일치의 주사기 플런저를 장치에 신속하게 삽입하여 조직을 메쉬 단부로 밀어 넣은 다음 차가운 다진 용액을 함유하는 미세 원심 분리튜브에 배치해야 합니다. 액체가 튜브를 덮어 넘도록 강요하지 마십시오. 조직이 완전히 해동 될 수 있도록 차가운 다진 용액에 약 5-10 s에 대한 장치의 메쉬 끝을 담급질.
- 세포가 메쉬 모공을 통해 압출 볼 때까지 플런저를 완전히 누르는. 그런 다음 플런저를 약 2.5 cm 위로 당기고 다시 완전히 누릅니다. 다진 용액이 혼탁해질 때까지 과정을 여러 번 반복합니다.
- 필요한 경우, 샘플은 1100 rpm에서 5분 동안 냉장 된 원심분리및 상판의 일부를 제거함으로써 세포 밀도를 증가시키기 위해 농축될 수 있다.
- 각 샘플에 대한 깨끗한 조직 다듬기 장치를 사용하여 모든 샘플에 대해 이 과정을 반복합니다.
- 37°C에서 0.5% 낮은 융점 아가로즈의 450 μL을 함유하는 튜브에 50 μL의 세포 현탁액을 전달한다.
참고: 볼륨은 조정할 수 있지만 아가로즈의 양은 ≤1%여야 합니다. - 앞서 설명한 대로 슬라이드를 준비하고 점수 슬라이드10,,11.
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Representative Results
연구 1
간은 4일 동안 옥수수 오일을 투여한 수컷 스프라그 다울리 쥐의 2마리 집단으로부터 수확하였고, 1주일씩 엇갈렸다. 슬라이드는 신선하게 다진 조직, 냉동 다진 조직, 및 조직 다진 장치를 사용하여 상인의 배지 또는 다진 용액에서 처리된 냉동 큐브 조직으로부터 제조되었다. 제1 코호트로부터 동물로부터 얻은 냉동 조직을 ~3.5개월 동안 냉동보관 후 평가하였다. 제2 코호트로부터 동물로부터 얻은 냉동 조직을 ~6개월 동안 저장한 후 평가하였다. 심하게 손상된 세포 (세포 독성 또는 기계적 스트레스를 포함 할 수있는 불확실한 병인)를 나타내는 특징적인 "고슴도치"형태를 나타내는 혜성은 % 꼬리 DNA의 채점에 포함되지 않았습니다. 형태학의 육안 검사에서만 확인된 고슴도치의 백분율은 OECD TG 4899에따라 별도로 표로 표로 표로 정리되었습니다. 두 코호트(100세포/동물 채점 기준)의 동물에 대한 평균 %의 꼬리 DNA 결과는 도 2A에요약되어 있다. 냉동 조직을 사용하는 모든 방법은 신선한 조직보다 항상 통계적으로 다르지는 않지만 더 높은 값을 생성했습니다. 신선한 쥐 간에서 % 꼬리 DNA에 대한 권장 상한이 6 %9임을고려하면, 이러한 결과는 냉동 조직을 평가하는 데 잘 작동 할 수 있음을 보여줍니다. 마칭 솔루션은 적어도 상인의 매체뿐만 아니라 동등하게 수행; 후자는 준비하는 데 더 많은 시간이 걸리기 때문에 후속 연구를 위해 다진 용액을 선택했습니다. ~3.5개월 의 보관 후 처리된 제1 코호트로부터의 조직과 비교하여 처리 전 ~6개월 동안 동결보관된 제2 동물 코호트로부터의 조직에 있어서의 손상에는 통계적으로 유의한 차이가 없었다. 전반적으로, % 고슴도치는 신선한 조직에 비해 냉동 된 조직에서 % 고슴도치가 % 꼬리 DNA보다 더 가변적이었음에도 불구하고 % 꼬리 DNA와 평행화했습니다(그림 2B). 신선한 조직에 있는 이 종점에 대한 값은 동결 방법에 의해 소개된 DNA 손상 artefactually가 측정될 수 있는 기준선을 제공합니다.
연구 2
암컷 B6C3F1 마우스는 정상 식염수 또는 뮤타겐, 에틸 메탄설포네이트(EMS)를 정상 식염수에서 200 mg/kg/day로 3일 동안 투여하였다. 조직은 최종 투여 후 3시간 수확하고 혜성 분석법에서 신선히 처리하였다. 추가의 조직은 다진 용액에서 다진 후 또는 큐브로서 수집된 후 플래시 냉동되었다. 큐브된 샘플을 혜성 슬라이드의 제조 직전에 체 장치를 사용하여 다진 용액으로 이어서 처리하였다. 고슴도치 형태를 나타내는 세포가 화학적 유발 DNA 손상의 연속체의 하이 엔드에서 세포를 나타낸다는 전제하에, 이미징 소프트웨어에 의해 비장할 수 있는 고슴도치가 % 꼬리 DNA의 자동 채점에 포함되었다. %꼬리 DNA 결과(150세포/동물 채점 기준)는 그림 3에요약되어 있습니다. 간 조직은 큐브로서 동결되고 이어서 조직 다진 장치를 사용하여 처리되어 갓 다진 조직을 위해 수득된 것과 매우 유사한 결과를 산출하였다. %꼬리 DNA 값은 동결된 다진 조직에 대해 다소 높았지만, 혜성분석9에대한 OECD 시험 지침에서 신선한 쥐 간을 위해 권장되는 바와 같이, 냉동 다진 조직에 대한 기준선 값은 6% 미만이었다. EMS-유도 DNA 손상의 통계적으로 유의한 증가는 세 가지 방법 모두에 의해 처리된 조직 샘플에서 측정되었다.
연구 3
원격 실험실에서 실시한 시험 화학 물질의 90일 독성 연구에서 여성 B6C3F1 마우스로부터 채취한 간 조직의 일부를 다진 또는 큐브로 잘라내고, 플래시 냉동하고, 분석을 위해 드라이 아이스에 하룻밤 동안 출하하였다. 다진 조직을 냉동보관 후 ~2개월간 보관하여 분석하였다(도4). 육안으로 나타난 세포는 고슴도치이지만 이미징 소프트웨어에 의해 비질적이었습니다%꼬리 DNA 측정(150세포 득점/동물)에 포함되었다. 총 150 개의 세포 / 동물에서 형태학의 육안 검사에서 만 확인 된 고슴도치 (scorable 또는 비 절단 가능 여부)의 수는 이 고도로 손상된 세포의 빈도에 대한 정보를 제공하기 위해 별도로 표로 표로 정리되었습니다. 전반적으로, 동결된 다진 조직에서 DNA 손상(%tail DNA로 측정)은 비히클 대조군을 포함하여 실질적인 동물을 가진 모든 투여군에서 동물가변성에 걸쳐 높았다. % 꼬리 DNA 결과는 %고슴도치 (형태에 기초하여 전적으로 확인됨)와 상관 관계가 있으며, 고슴도치가 이 샘플에서 관찰 된 높은 수준의 DNA 손상에 실질적으로 기여했음을 나타냅니다. 다진 조직에서 측정된 DNA 손상의 높은 배경 수준에 기초하여, 냉동 큐브 조직은 ~22개월의 저장 후 이어서 분석하였다(도4). DNA 손상 및 % 고슴도치 모두 다진 조직 샘플과 병행하여 제조된 플래시 냉동 큐브 조직에서 매우 낮았다. 따라서, 다진 조직 샘플에서 고슴도치 형태에 의해 반사된 고도로 손상된 세포는 생물학적 과정의 결과가 분명하지 않았지만, 플래시 동결되기 전에 채굴 절차 동안 기계적 붕괴 및/또는 조직 온난화에 의해 도입되었을 가능성이 높다; 이러한 데이터는 신뢰할 수 없는 것으로 간주되었습니다. 다행히도, 냉동 큐브 조직의 분석은 명확한 결과를 제공, 즉 테스트 화학 물질에 노출 3 개월 다음 여성 마우스의 간에서 DNA 손상 반응의 부족. 이 사례 연구에 의해 제공되는 결과는 상대적으로 경험이 부족한 실험실에 의한 다진 조직의 제조와 관련된 위험을 예시하고 이 문제를 회피하기 위해 냉동 큐브 조직 방법의 유용성을 입증한다.
도 1: 동결된 조직으로부터 단일 세포 현탁액을 준비하는 데 사용되는 조직 채굴 장치 및 플런저. 프로토타입 장치(내경 4.5mm, 메쉬 크기 0.4mm)는 군나르 브룬보그 박사(노르웨이 오슬로)가 친절하게 제공했습니다. 오른쪽 패널은 장치와 함께 사용하기 위해 적절한 크기의 조직 큐브의 예를 제공합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 신선하고 냉동된 다진 마우스 간 샘플에서 측정된 DNA 손상의 비교. 간은 4일 동안 옥수수 오일을 투여한 수컷 스프라그다울리 쥐의 2개의 엇갈린 코호트(n=5/그룹/코호트)로부터 수확하였다. 슬라이드는 신선하게 다진 조직, 냉동 다진 조직, 및 조직 다진 장치를 사용하여 상인의 배지 또는 다진 용액에서 처리된 냉동 큐브 조직으로부터 제조되었다. 냉동 조직은 각각 코호트 1 및 2에 대한 부검 후 ~ 3.5 및 6 개월을 분석했다. 형태에 근거하여 고슴도치로 분류된 혜성은 % 꼬리 DNA의 채점에 포함되지 않았다. (A)코호트는 % 꼬리 DNA 결과를 의미한다. (B)코호트는 % 고슴도치 결과를 의미한다. 오류 막대는 표준 편차를 반영합니다. 통계 분석은 각 코호트에 대한 신선한 조직과 냉동 조직을 비교하고 각 조직 제제 방법에 대한 두 코호트 사이의 결과를 비교하기 위해 수행되었다. * 통계적으로 다른(p & 0.05) 학생의 t 테스트를 사용하여 동일한 코호트 내에서 신선한 다진 조직에서; #statistically 다른(p < 0.05) 비 정상적으로 분포된 데이터에 대한 Mann-Whitney 시험을 사용하여 동일한 코호트 내의 신선한 다진 조직으로부터; • 학생의p T-test를 사용하여 코호트 간의 통계적 차이(p<, 0.05)를 말합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 다른 절차에 의해 처리 된 간 조직에서 EMS에 의해 유도 된 DNA 손상의 비교. 암컷 B6C3F1 마우스 투여비히 또는 3일 동안 200 mg/kg/일 EMS(n=5/군)에 대한 평균 % 꼬리 DNA. 간은 최종 투여 후 3h를 수확하고 혜성 분석법에서 신선히 처리하였다. 추가의 간 조직은 다진 용액으로 다진 후 또는 큐브로서 수집된 후 플래시 냉동되었다; 큐브된 샘플을 혜성 슬라이드의 제조 직전에 조직 다진 장치를 사용하여 균질화하였다. EMS 유도 DNA 손상의 연속체의 상한선에서 세포를 보장하기 위해 분석에서 제외되지 않았으며, 육안 검사 시 고슴도치의 형태학적 설명을 충족하는 것으로 나타났지만 이미징 소프트웨어에 의해 비할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 오류 막대는 표준 편차를 반영합니다. 학생의 t-검정은 각 샘플 제조 방법에 대한 비히클 대조군 동물과 EMS에 노출된 동물의 DNA 손상량을 비교하는 데 사용되었다. *p&0.05에서 통계적으로 유의한 증가. p 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. 냉동 큐브 방법의 유용성과 장기간 저장 후 얻은 고품질 데이터를 보여주는 사례 연구. 암컷 B6C3F1 마우스로부터 채취한 간 조직의 일부를 ~90일 동안 시험 화학물질의 다양한 농도에 노출(n=5/군)에 노출시켰으며, 인라이프 실험실에서 분해또는 절단하고 이 실험실에서 냉동된 플래시를 분석하기 위해 이 실험실로 출하하였다. 다진 조직은 ~ 2개월의 저장 후 분석하였습니다; 데이터의 품질이 좋지 않아 냉동 큐브 조직이 이어서 ~ 22개월의 저장을 분석했습니다. 화학적 유발 DNA 손상의 연속체의 상한선에서 세포를 보장하기 위해 분석에서 제외되지 않았으며, 육안 검사 시 고슴도치로 나타난 코랭킹 세포로부터의 데이터가 포함되었다. (A)그룹은 꼬리 DNA 결과를 평균한다. 다진 조직에 비해, 높은 품질의 결과는 장기간 저장 한 후에도 냉동 큐브 조직에서 얻은. (B)그룹 평균 % 고슴도치 결과. 가난한 다진 기술은 다진 조직 샘플에서 고슴도치 혜성으로 관찰 된 광범위한 비 생물학적 DNA 손상에서 분명합니다. 오류 막대는 표준 편차를 반영합니다. Dunnett의 시험을 가진 ANOVA는 각 견본 준비 방법에 대한 시험 화학물질에 대한 양성 반응을 평가하기 위하여 이용되었습니다. 어느 방법에 대해도p 통계적으로 유의한(p&0.05) 투여군은 검출되지 않았다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 동결된 쥐 뇌 조직에서 측정된 기준선 DNA 손상. 혜성 분석 결과는 남성과 여성 스프라그 Dawley 쥐의 뇌의 여러 다른 영역을 나타내는 냉동 다진 또는 큐브 조직을 위해 제공됩니다. 데이터 (코콜러블 고슴도치 혜성을 포함 하 여 생성) 여러 연구를 통해 대조 되었다; n = 각 샘플 준비 방법에 대해 평가된 뇌 조직의 총 개수. 오류 막대는 표준 편차를 반영합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이전에 입증된 바와 같이7,,12,,13,제대로 처리된 플래시 냉동 다진 조직은 혜성 분석에서 좋은 결과를 제공한다. 사실, 우리의 실험실에서 제조 된 냉동 다진 쥐와 마우스 간을위한 기준 % 꼬리 DNA 값은 일반적으로 ≤6 %, 새로 다진 쥐 간 샘플에 대한 OECD 테스트 지침9에 의해 권장. 좋은 결과 다진 하 고 냉동 저장 된 조직 유형의 다양 한를 사용 하 여 여러 실험실에 의해 얻은; 마찬가지로, 위장관에서 장기로부터 긁힌 플래시 냉동 상피 세포는 혜성 분석7,,12,,13,,14에서성공적으로 사용되어 왔다. 냉동 다진 / 긁힌 조직은 적어도 몇 개월 동안 상대적으로 안정된 것으로 보인다. 원래 Jackson et al.6에의해 설명된 조직 채굴 장치를 사용하여 간플래시 냉동 큐브의 균질화를 사용하는 방법은, 냉동 다진 간을 위해 얻은 것보다 혜성 분석결과 적어도 비교되고 전형적으로 더 나은 (즉, DNA 손상의 낮은 기준선 수준)을 산출한다. 이 방법론은 또한 다른 조직 유형에 적용 할 수 있습니다6; 우리의 경험에서, 우수한 결과는 마찬가지로 동결 된 큐브 십이지장 (데이터가 도시되지 않음)과 뇌 조직을 사용하여 얻어졌습니다(그림 5). 그러나, 체 장치는 모든 조직 유형의 균질화를 할 수 없다. 파일럿 연구에서, 우리는 근육 심장 조직이 쉽게 체 장치를 통해 강제 할 수 없다는 것을 발견, 가난한 세포 복구의 결과; 대신, 해동 직후 조직을 다듬는 것은 플래시 동결 전에 다진 것과 비교할 수 있는 기준% 꼬리 DNA 값을 가진 세포 현탁액을 산출하였다(데이터는 도시되지 않음). 특히, 부검 시 제대로 처리될 때(즉, 차갑고 촉촉한 채, 플래시를 개별 조각으로 동결하고 부분적으로 해동할 수 없는 경우), 플래시 냉동 큐브 조직은 약 2년의 냉동 보관 후에도 매우 낮은 기준선 DNA 손상을 산출하였다(그림4).
혜성 분석에서 냉동 세포 현탁액 또는 큐브 된 조직의 사용은 신선한 조직에 비해 몇 가지 장점을 제공합니다 : 1) 혜성 분석을위한 여러 조직 유형의 동시 수집촉진; 2) 인라이프 실험실에서 조직 수집을 촉진하고 분석을 위해 다른 실험실로 샘플을 옮니다. 3) 몇 달 동안 주어진 조직을 분석하기로 결정하는 것을 지연시키기위한 편리함. 슬라이드 준비 시 냉동 조직의 균질화는 수확 시 신선한 조직을 다진 것보다 더 번거롭지만, 냉동 큐브 조직의 사용은 다음과 같은 몇 가지 추가 이점을 제공합니다 : 1) 혜성 분석 (예를 들어, 모바일 단위) 또는 부검에서 전문 공급 / 시약에 훈련 된 인력에 대한 요구 사항은 없습니다. 2) 기술적 오류에 대한 적은 기회 (예를 들어, 샘플 온난화; 세포의 불충분 한 방출; 하위 최적 조직 샘플 크기) 부검 중; 3) 샘플 처리 중에 기계적 DNA 손상을 도입 할 수있는 최소한의 기회 (예를 들어, 다진 전단); 및 4) 장기간 보관후에도 낮은 기준선 DNA 손상.
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Disclosures
이 작품은 NIH의 교내 연구 프로그램에 의해 지원되었다, 환경 보건 과학의 국립 연구소 (NIEHS) 계약 HHSN273201300009C에 따라; 그러나 그 안에 포함된 진술, 의견 또는 결론이 NIEHS, NIH 또는 미국 정부의 진술, 의견 또는 결론을 반드시 나타내는 것은 아닙니다.
Acknowledgments
저자는 링컨 마틴과 켈리 오웬스에게 혜성 슬라이드를 준비하고 채점하는 전문 기술 지원을 위해 빚을 지고 있으며, 캐롤 스와츠 박사는 통계 분석을 수행합니다. 저자는 또한 ILS에 있는 유전 독물학, 조사 독물학 및 necropsy 프로그램의 일원의 지원 기여를 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryovials | Corning Costar | 430488 | |
| Dental Wax Sheets | Electron Microscopy Sciences | 72670 | |
| Dissecting (Mincing) Micro Scissors | Fisher Scientific | 08-953-1B | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Gibco | 14175-079 | |
| KCl | Teknova | P0315-10 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Low Melting Point Agarose | Lonza | 50081 | |
| Microfuge Tubes (1.7 mL) | Corning | 3207 | |
| Na2EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | |
| Neutral Buffered Formalin | Leica | 600 | |
| Scalpel Blades | Miltex | 4-110 | |
| Syringe Plunger (1 mL) | Fisher Scientific or Vitality Medical | 14-826-88; 8881901014 | Becton Dickinson or Monoject tuberculin syringe |
| Tissue Mincing Device | NorGenoTech (Oslo, Norway) | None | Small variability in diameter observed which can affect snuggness of plunger. |
| Tweezers, plastic | Trade Winds Direct | DF8088N | Reinforced nylon, nonsterile, blunt tip, autoclavable; tradewindsdirect.com |
| Weigh Boats | Krackler Scientific/Heathrow Scientific | 6290-14251B |
References
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