Summary
Este protocolo descreve vários procedimentos para a preparação de amostras de tecido congelado de alta qualidade no momento da necropsia para uso no ensaio do cometa para avaliar danos no DNA: 1) tecido picado, 2) células epiteliais raspadas do trato gastrointestinal e 3) tecido em cubos amostras, necessitando de homogeneização usando um dispositivo de picar tecido.
Abstract
O ensaio do cometa está ganhando popularidade como um meio de avaliar os danos do DNA em células e tecidos cultivados, particularmente após a exposição a produtos químicos ou outros estressores ambientais. O uso do ensaio do cometa em testes regulatórios para potencial genotóxico em roedores foi impulsionado pela adoção de uma diretriz de teste da Organização para a Cooperação e Desenvolvimento Econômico (OCDE) em 2014. Os slides de ensaio de cometasão normalmente preparados a partir de tecido fresco no momento da necropsia; no entanto, o congelamento de amostras de tecidos pode evitar desafios logísticos associados à preparação simultânea de slides de múltiplos órgãos por animal e de muitos animais por estudo. O congelamento também permite o envio de amostras da instalação de exposição para um laboratório diferente para análise, e o armazenamento de tecido congelado facilita o adiamento da decisão de gerar dados de danos de DNA para um determinado órgão. O ensaio de cometa alcalino é útil para detectar quebras de DNA de dna e fio único relacionados à exposição, lesões alcalinas-labiles e quebras de fios associadas com o reparo incompleto da excisão do DNA. No entanto, os danos no DNA também podem resultar de procedimentos mecânicos de cisalhamento ou processamento de amostras inadequados, confundindo os resultados do ensaio. A reprodutibilidade na coleta e processamento de amostras de tecidos durante necropsias pode ser difícil de controlar devido à flutuação de pessoal de laboratório com diferentes níveis de experiência na colheita de tecidos para o ensaio do cometa. Aumentar a consistência através do treinamento de atualização ou implantação de unidades móveis com pessoal de laboratório experiente é caro e nem sempre pode ser viável. Para otimizar a geração consistente de amostras de alta qualidade para análise de ensaios de cometas, foi avaliado um método para homogeneizar cubos de tecido congelados flash usando um dispositivo de picar tecido personalizado. Amostras preparadas para o ensaio do cometa por este método comparadas favoravelmente em qualidade a amostras de tecido fresco e congelado preparadas por picar durante a necropsia. Além disso, o dano baixo do DNA da linha de base foi medido em células de cubos congelados de tecido após armazenamento prolongado.
Introduction
O ensaio do cometa é cada vez mais usado como um meio de avaliar os danos do DNA em células cultivadas e tecidos expostos a produtos químicos ou outros estressores ambientais1. O ensaio pode detectar quebras de DNA duplo e único, lesões alcalinas-labiles e quebras de fios únicos associadas ao reparo incompleto do DNA. O Conselho Internacional de Harmonização dos Requisitos Técnicos para Medicamentos para Uso Humano (ICH) para testes farmacêuticos recomenda um ensaio de quebra de fios de DNA, como o ensaio do cometa como um segundo teste para complementar o ensaio do micronúcleo eritrócito de roedores para avaliação da genotoxicidade in vivo e como um teste de acompanhamento para avaliação do modo de ação em órgãos-alvo de indução de tumor2. A Autoridade Europeia de Segurança Alimentar (EFSA) recomenda o ensaio do cometa in vivo como um teste de seguimento adequado para investigar a relevância de um resultado positivo em um teste de genotoxicidade in vitro3. Em 2014, uma diretriz de teste da OCDE foi aprovada para o ensaio do cometa roedor, aumentando assim a aceitação do ensaio para uso em testes regulatórios de potencial genotóxico. O ensaio é baseado na separação eletroforética de laços de DNA relaxados e fragmentos que migram de nucleóides de células lysed. Basicamente, células únicas estão embutidas em agarose que foi colocada em camadas em slides de microscópio. Os slides são então imersos em tampão de lyse seguido de uma solução alcalina (pH > 13), que permite que o DNA nuclear bem enrolado relaxe e descontraa. Os slides são então colocados em um campo elétrico, o que estimula a migração do DNA negativamente carregado em direção ao ânodo, criando imagens que se assemelham a cometas; a quantidade relativa de DNA na cauda do cometa em comparação com a cabeça do cometa é diretamente proporcional à quantidade de dano de DNA; O conteúdo de DNA na cauda é tipicamente quantificado usando software de imagem digital.
Como o ensaio do cometa detecta DNA fragmentado, a quantificação precisa de danos de DNA induzidos por exposição pode ser confundida pela fragmentação da cromatina associada à necrose ou apoptose resultante de citotoxicidade ou estresse induzidos pelo tratamento. Além disso, danos no DNA podem ocorrer como resultado de cisalhamento mecânico ou processamento inadequado da amostra4. A importância de manter o tecido colhido refrigerado antes da preparação do slide para minimizar o nível de base de dano de DNA foi previamente demonstrada5,6. Muitos laboratórios preparam slides de ensaio sinuosos de tecido fresco; no entanto, isso pode ser logisticamente desafiador ao preparar slides de múltiplos tipos de tecidos por animal em um estudo com um grande número de animais. Além disso, apresenta um problema quando a preparação e análise de slides devem ocorrer em um laboratório remoto, necessitando de remessa de amostras. Por exemplo, o Programa Nacional de Toxicologia dos EUA inclui o ensaio do cometa como um componente de seu programa de testes toxicológicos genéticos (https://ntp.niehs.nih.gov/testing/types/genetic/index.html) e às vezes incorpora o ensaio em estudos de toxicidade de repetição de 28 ou 90 dias; isso requer a coleta de tecidos pelo laboratório em vida e a transferência de amostras para outro laboratório para análise. Para isso, as peças de tecido são picadas e/ou células epiteliais do trato gastrointestinal são raspadas e as suspensões celulares são congeladas e armazenadas em um congelador para posterior embarque e armazenamento pelo laboratório receptor até a análise7. O manuseio adequado das amostras é crucial para a obtenção de dados de alta qualidade utilizando tecido congelado; no entanto, a manipulação reprodutível de amostras de tecidos durante necropsias realizadas por pessoas em constante mudança é difícil de controlar, especialmente em laboratórios em vida que não coletam tecidos rotineiramente para o ensaio do cometa. O treinamento de atualização da equipe de necropsia ou o uso de uma unidade móvel com pessoal de laboratório experiente para coletar amostras de tecido fresco ou congelado é muitas vezes muito caro, inviável ou simplesmente desvalorizado.
Para garantir melhor a geração consistente de amostras de tecido de alta qualidade para transferência para um local remoto para análise de ensaios de cometas, foi explorada a utilidade de um método publicado6 de preservação de tecidos a partir de cubos de tecido congelados flash. Neste método, cubos congelados de tecido são carregados em um dispositivo de picar tecido de aço inoxidável(Figura 1) que é colocado em um tubo de microcentrífuga contendo tampão frio. O cubo de tecido é então empurrado através de uma pequena malha de bitola na extremidade do dispositivo. Forçar repetidamente a suspensão do tecido através da peneira de malha em ambas as direções várias vezes resulta em uma suspensão celular única relativamente uniforme. Amostras preparadas por este método comparadas favoravelmente em qualidade a amostras de tecido fresco e congelado preparadas por picar. Como um benefício adicional, ao contrário das amostras picadas, os cubos de tecido podem ser armazenados congelados por períodos prolongados de tempo e ainda produzir resultados de alta qualidade no ensaio do cometa.
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Protocol
Os tecidos foram colhidos durante a realização de estudos realizados em instalações credenciadas pela AAALAC nos laboratórios de contratos da NTP, de acordo com as normas de Boa Prática laboratorial (21 CFR Parte 58) e protocolos de uso animal aprovados pelo Animal Institucional Comitê de Cuidado e Uso (IACUC) em cada laboratório.
1. Colheita e Processamento de Tecidos
NOTA: É útil preparar tubos de amostra duplicados (por exemplo, fígado) ou transferir aproximadamente metade de uma amostra para outro tubo de armazenamento (por exemplo, duodeno, estômago) para permitir a reanálise, se necessário. Para minimizar a potencial variabilidade amostral para tecidos do trato intestinal, recomenda-se que sejam tomados cuidados para a amostragem da mesma região do tecido em relação ao estômago para cada animal, e que uma amostra seja dividida para gerar amostras duplicadas. Fórceps de plástico são recomendados para a transferência de tecidos pegajosos, como o cérebro. Como opção, as preparações de tecido picado, raspada ou homogeneizada podem ser filtradas para obter suspensões unicelulares homogêneas usando um filtro de células de 40 μm ligado a um tubo cônico.
- Remova qualquer tecido de conexão, órgãos e detritos ligados de órgãos de interesse. Imediatamente após a remoção, swish o órgão vigorosamente em um barco de pesagem de tamanho médio contendo ~7 mL de solução de picar recém-preparada a frio (Mg++, Ca++ e fenol solução de sal balanceado de Hank, 10% v/v DMSO, e 20 mM EDTA pH 7.5) para remover sangue residual e detritos.
- Transfira cada órgão para outro barco de pesagem limpo contendo solução suficiente (~7 mL) de picar frio para manter o tecido submerso, no gelo, até o processamento posterior.
- Remova uma seção de cada órgão de interesse e coloque-o em um de incorporação. Fixação em formalina tampão neutra 10% neutra, aparar e parafina embutida de acordo com os procedimentos padrão do laboratório para possível avaliação histopatológica futura.
- Para o fígado, corte uma seção longitudinal de 5 mm do lobo esquerdo e deslize suavemente em ~7 mL de solução de picar frio. Coloque a tira de tecido em um barco de pesagem de tamanho médio limpo contendo ~7 mL de solução de picar frio e mantenha no gelo até que esteja pronto para processar ainda mais (passo 1.8 ou 1.11).
- Para o duodeno, corte uma porção de 10 mm do duodeno proximal ao estômago. Usando uma agulha de 21-25 G, lave para remover detritos e bactérias.
- Insira a agulha em uma extremidade do duodeno e lave com 1 mL de solução de picar frio.
- Lave a outra direção virando o duodeno e repetindo com outra solução de 1 mL de picar. Descarte a agulha.
- Corte o duodeno abra e enxágue-o em ~7 mL de solução de picar antes de colocá-lo em um barco de pesagem de tamanho médio contendo ~7 mL de solução de picar limpo; manter no gelo até que esteja pronto para processar mais (etapa 1.8 ou 1.11).
- Para o cérebro, pode ser útil dividir o cérebro em dois hemisférios; um hemisfério pode ser salvo para possível histopatologia (ver passo 1.2).
- Disseque as regiões cerebrais de interesse e deslize suavemente em ~7 mL de solução de picar frio.
- Transfira os tecidos para um barco de pesagem de tamanho médio limpo contendo ~7 mL de solução de picar frio e mantenha no gelo até que esteja pronto para processar ainda mais (etapa 1.8 ou 1.11; observe que pequenas regiões como o cerebelo e o hipocampo podem não precisar de qualquer corte adicional).
- Para o estômago
- Remova e descarte o estômago. Abra o estômago glandular e lave-se livre de alimentos usando ~7 mL de tampão de picar frio em um barco de pesagem de tamanho médio.
- Remova uma tira de 5 mm de estômago glandular proximal ao duodeno para fixação para possível avaliação histopatológica (ver passo 1.2).
- Coloque o estômago restante em ~7 mL de tampão de picar frio em um barco de pesagem de tamanho médio e incubar no gelo por 15-30 min.
NOTA: Esta etapa de incubação pode não ser necessária; esta etapa foi incluída no protocolo de validação do JaCVAM, mas não é mencionada na diretriz de teste da OCDE8,9. - Transfira o estômago para um pedaço limpo de parafina (ou placa de Petri ou barco de pesagem) e raspe suavemente o epitélio superficial duas ou mais vezes usando uma lâmina de bisturi ou um raspador de politetrafluoroetene (PTFE) para remover detritos. Pegue a mucosa gástrica com fórceps e enxágue com 1 mL de tampão de picar frio usando uma pipeta. Transfira o tecido estomacal para uma superfície ou prato limpo.
- Raspe cuidadosamente o epitélio estomacal 4-5 vezes (mais, se necessário) na solução de picar (tipicamente 250 μL/mouse ou 500-1.000 μL/rato) com a parte de trás de uma lâmina de bisturi ou raspador PTFE para liberar as células. Opcionalmente, enxágue o tecido com um volume aproximadamente igual de solução de picar para recuperar mais células. Coletar a solução de picar contendo células liberadas usando uma pipeta e transferir para um tubo de microcentrífuga no gelo.
- Para a picar amostras de tecido, corte uma seção de 3-4 mm de tecido hepático ou cerebral ou ~5 mm de duodeno e transfira para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ou 2,0 mL rotulado contendo 1 mL de solução de picar frio. Picanha rápido (≤30 s) com tesouras picadas até dispersar finamente, mantendo a amostra fria. A amostra deve parecer ligeiramente nublada; no entanto, é comum que algumas peças permaneçam que se acomodem no fundo do tubo.
- Para usar o tecido fresco, mantenha tubos contendo tecido picado ou células epiteliais raspadas no gelo; use o tecido para preparar lâminas de cometa dentro de aproximadamente 1h de colheita (delineado na seção 2).
- Para congelar as amostras de tecido, imediatamente após a picada ou coleta de células epiteliais raspadas
- Fixar a tampa do tubo e soltar o tubo em um frasco de Dewar contendo nitrogênio líquido; os tubos podem ser mantidos em nitrogênio líquido durante a duração da necropsia (≤3 h).
- Recupere tubos usando uma concha e coloque em gelo seco para classificar. Transfira os tubos para uma caixa de congelador em gelo seco e guarde caixa em um congelador de -80 °C.
- Para preparar cubos congelados de tecido, corte vários pequenos pedaços de tecido (≤4 mm de diâmetro e ~6 mm de comprimento; Figura 1).
- Individualmente, solte-os diretamente em um barco de pesagem de tamanho médio ou outro recipiente adequado contendo nitrogênio líquido.
- Aguarde alguns segundos para que as peças congelem completamente e transfiram cubos de tecido congelados individuais para um tubo de microcentrífuge rotulado ou criotubo mantido em gelo seco; não permita que as peças se agrupe durante o processo de congelamento.
- Transfira os tubos para uma caixa de congelador em gelo seco e guarde caixa em um congelador de -80 °C.
2. Preparação de slides
-
Para tecido picado/raspado
- Mantenha tubos contendo tecidos frescos em gelo molhado.
- Coloque os tubos de tecido congelado em um banho de água de temperatura ambiente até que as amostras sejam completamente descongeladas, garantindo que sejam mantidas frias. Transfira imediatamente os tubos para o gelo.
- Imediatamente antes de retirar as células para transferência para agarose (etapa 2.3), misture cada suspensão celular suavemente; para amostras não filtradas, permita que grandes pedaços se acomodem no fundo do tubo. Mantenha todos os tubos no gelo até que as lâminas tenham sido preparadas para todas as amostras.
-
Para tecido em cubos
- Recupere tubos contendo cubos de tecido do congelador de 80 °C e mantenha em gelo seco até a preparação do slide.
- Alíquota 1 mL do meio do Comerciante (0,14 M NaCl, 1,47 mM KH2PO4, 2,7 mM KCl, 8,1 mM Na2HPO4, 10 mM NaEDTA, pH 7.4) ou solução de picar em um tubo de microcentrífuga de 1,7 mL rotulado para cada amostra e manter no gelo.
- Trabalhando rapidamente para evitar o descongelamento do tecido, coloque um cubo de tecido na extremidade aberta de um dispositivo de picar tecido de temperatura ambiente(Figura 1). Podem ser utilizados múltiplos pedaços de tecido; se necessário, o tecido congelado pode ser cortado ou rachado em pedaços menores usando uma argamassa fria e pilão para reduzir o tamanho do cubo para caber no dispositivo.
- Insira rapidamente um êmbolo de seringa compatível com o tamanho no dispositivo para empurrar o tecido para a extremidade da malha, que deve então ser colocado no tubo de microcentrífuga que contém solução de picar frio; evite forçar o líquido a transbordar o tubo. Mergulhe a extremidade da malha do dispositivo por aproximadamente 5-10 s na solução de picar frio para permitir que o tecido descongele completamente.
- Deprima completamente o êmbolo até que as células sejam vistas extrovertendo através dos poros de malha. Em seguida, puxe o êmbolo para cima aproximadamente 2,5 cm e pressione para baixo novamente completamente; repetir o processo várias vezes até que a solução de picar se torne turva.
- Se necessário, a amostra pode ser concentrada para aumentar a densidade celular por centrifugação refrigerada por 5 min a 1100 rpm e remoção de uma parte do sobrenadante.
- Repita o processo para todas as amostras usando um dispositivo de picar tecido limpo para cada amostra.
- Transfira 50 μL de suspensão celular para um tubo contendo 450 μL de 0,5% de ponto de fusão baixo aagarose a 37 °C.
NOTA: Os volumes podem ser ajustados, mas a quantidade de agarose deve ser ≤1%. - Preparar e marcar slides como descrito anteriormente10,11.
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Representative Results
Estudo 1
Fígado foi colhido de duas coortes de ratos machos de Sprague Dawley administrados óleo de milho por 4 dias, escalonados por uma semana. Slides foram preparados a partir de tecido recém-picado, tecido picado congelado e tecido em cubos congelados processados na solução média ou picada de Merchant usando o dispositivo de picar tecido. Os tecidos congelados obtidos de animais da primeira coorte foram avaliados após o armazenamento do congelador por ~3,5 meses. Os tecidos congelados obtidos de animais da segunda coorte foram avaliados após o armazenamento por ~6 meses. Os cometas que exibem a morfologia característica do "ouriço", indicativo de células fortemente danificadas (de etiologia incerta que pode incluir citotoxicidade ou estresse mecânico), não foram incluídos na pontuação de % DNA de cauda; o percentual de ouriços, identificado suscitado apenas após inspeção visual da morfologia, foi tabulado separadamente conforme a OECD TG 4899. Os resultados médios de DNA da cauda para os animais das duas coortes (com base na pontuação de 100 células/animal) são resumidos na Figura 2A. Todos os métodos que utilizam tecido congelado produziram valores mais elevados, embora nem sempre estatisticamente diferentes, do que os tecidos frescos. Considerando que o limite superior recomendado para % DNA de cauda em fígado de rato fresco é de 6%9, esses resultados demonstram que qualquer um desses métodos pode funcionar bem para avaliar tecido congelado. Solução de picar realizada pelo menos igualmente, bem como o meio do Comerciante; uma vez que este último é mais demorado para se preparar, a solução de picar foi selecionada para estudos subsequentes. Não houve diferenças estatisticamente significativas nos danos nos tecidos da segunda coorte animal que havia sido armazenado congelado por ~6 meses antes do processamento em comparação com os tecidos da primeira coorte processados após ~3,5 meses de armazenamento. No geral, os % ouriços paralelamente ao DNA da cauda % embora os % ouriços nos tecidos congelados em relação ao tecido fresco foram mais variáveis do que para o DNA da cauda %(Figura 2B). Os valores para esses pontos finais no tecido fresco fornecem uma linha de base contra a qual o dano de DNA introduzido pelos métodos de congelamento pode ser medido.
Estudo 2
Camundongos b6C3F1 femininos foram administrados soro fisiológico normal ou mutagênico, metanosulfonato de etila (EMS) a 200 mg/kg/dia em soro fisiológico normal por três dias. O tecido foi colhido 3h após a administração da dose final e processado fresco no ensaio do cometa. O tecido adicional foi congelado após ser picado em solução de picar ou coletado como cubos. Amostras em cubos foram posteriormente processadas em solução de picar usando o dispositivo de peneira imediatamente antes da preparação de slides de cometas. Com a premissa de que as células que exibem a morfologia do ouriço representam células na extremidade alta do contínuo dano de DNA induzido por químicos, os ouriços pelo software de imagem foram incluídos na pontuação automatizada de % DNA da cauda. Os resultados de DNA da cauda % (com base na pontuação de 150 células/animal) são resumidos na Figura 3. O tecido hepático congelado como cubos e posteriormente processado usando o dispositivo de picar tecido produziu resultados muito semelhantes aos obtidos para tecido recém-picado. Os valores de DNA da cauda % foram um pouco mais elevados para o tecido picado congelado, mas os valores de base para o tecido picado congelado foram inferiores a 6%, conforme recomendado para fígado de rato fresco na diretriz de teste da OCDE para o ensaio do cometa9. Um aumento estatisticamente significativo dos danos no DNA induzido pelo EMS foi medido em amostras de tecido processadas pelos três métodos.
Estudo 3
Porções de tecido hepático coletadas de camundongos b6C3F1 femininos em um estudo de toxicidade de 90 dias de um produto químico de teste conduzido por um laboratório remoto foram picadas ou cortadas em cubos, congeladas e enviadas durante a noite em gelo seco para este laboratório para análise. O tecido picado foi analisado após ~2 meses de armazenamento do congelador (Figura 4). As células que apareceram após a inspeção visual para serem ouriços, mas foram escoráveis pelo software de imagem foram incluídas nas medidas de DNA da cauda % (150 células pontuadas/animal). O número de ouriços (sejam escoráveis ou não) identificados unicamente após inspeção visual da morfologia em um total de 150 células/animal foi tabulado separadamente para fornecer informações sobre a frequência dessas células altamente danificadas. No geral, os danos de DNA (medidos como DNA de cauda) em tecido picado congelado foram elevados em todos os grupos de dose com variabilidade substancial animal para animal, inclusive no grupo de controle do veículo. Os resultados de DNA da cauda % correlacionados com % ouriços (identificados exclusivamente com base na morfologia), indicando que os ouriços contribuíram substancialmente para o alto nível de dano de DNA que foi observado nessas amostras. Com base no alto nível de fundo do dano de DNA medido no tecido picado, o tecido em cubo congelado foi posteriormente analisado após ~22 meses de armazenamento(Figura 4). Tanto os danos no DNA quanto os ouriços foram muito baixos no tecido em cubo congelado que havia sido preparado em paralelo com as amostras de tecido picado. Assim, as células altamente danificadas refletidas pela morfologia do ouriço nas amostras de tecido picado não foram claramente o resultado de um processo biológico, mas provavelmente foram introduzidas por interrupção mecânica e/ou aquecimento tecidual durante o procedimento de picar antes de serem congeladas; esses dados foram considerados não confiáveis. Felizmente, a análise do tecido em cubos congelados proporcionou um resultado claro, ou seja, a falta de uma resposta de dano de DNA no fígado de camundongos fêmeas após três meses de exposição ao produto químico do teste. Os resultados fornecidos por este estudo de caso exemplificam o risco associado à preparação de tecidos picados por um laboratório relativamente inexperiente e demonstram a utilidade do método de tecido em cubos congelados para contornar esse problema.
Figura 1: Dispositivo de picar tecido e êmbolo usado para preparar uma única suspensão celular a partir de tecido congelado. O protótipo do dispositivo (4,5 mm de diâmetro interno, tamanho de malha de 0,4 mm) foi gentilmente fornecido pelo Dr. Gunnar Brunborg (NorGenotech, Oslo, Noruega). O painel à direita fornece um exemplo de um cubo de tecido de tamanho adequado para uso com o dispositivo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Comparação dos danos de DNA medidos em amostras de fígado de camundongos frescos e congelados picados e homogeneizados. O fígado foi colhido de duas coortes escalonadas (n = 5/grupo/coorte) de ratos machos de Sprague Dawley administrados óleo de milho por 4 dias. Slides foram preparados a partir de tecido recém-picado, tecido picado congelado e tecido em cubos congelados processados na solução média ou picada de Merchant usando o dispositivo de picar tecido. Os tecidos congelados foram analisados ~3,5 e 6 meses após necropsia para as coortes 1 e 2, respectivamente. Cometas classificados como ouriços com base na morfologia não foram incluídos na pontuação de % DNA de cauda. (A) Coorte média % resultados de DNA de cauda. (B) Coorte média % resultados de ouriço. As barras de erro refletem o desvio padrão. Foram realizadas análises estatísticas para comparar tecidos congelados com tecidos frescos para cada coorte e comparar os resultados entre as duas coortes para cada método de preparação de tecidos. *Estatisticamente diferente(p < 0,05) de tecido picado fresco dentro da mesma coorte usando o teste t do Aluno; #statistically diferente(p < 0,05) de tecido picado fresco dentro da mesma coorte usando o teste Mann-Whitney para dados não-normalmente distribuídos; ¥ diferença estatística(p < 0,05) entre coortes utilizando o teste t do Aluno. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Comparação dos danos de DNA induzidos pelo EMS no tecido hepático processado por diferentes procedimentos. DNA médio de cauda para camundongos b6C3F1 femininos administrados ou 200 mg/kg/dia EMS durante três dias (n = 5/grupo). Os fígados foram colhidos 3h após a administração final da dose e processados frescos no ensaio do cometa. O tecido hepático adicional foi congelado após ser picado em solução de picar ou coletado como cubos; as amostras em cubos foram homogeneizadas usando o dispositivo de picar tecido imediatamente antes da preparação de slides de cometas. Para garantir que as células na extremidade alta do contínuo dano induzido pelo DNA induzido pelo EMS não fossem excluídas da análise, cometas que após inspeção visual pareciam atender à descrição morfológica dos ouriços, mas foram encontrados como escorcáveis pelo software de imagem foram incluídos. As barras de erro refletem o desvio padrão. O teste t de um aluno foi utilizado para comparar a quantidade de dano de DNA em animais expostos ao EMS com o que nos animais de controle do veículo para cada método de preparação da amostra. *Aumento estatisticamente significativo em p < 0,05. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Estudo de caso demonstrando utilidade do método cubo congelado e dados de alta qualidade obtidos após armazenamento prolongado. Porções de tecido hepático coletadas de camundongos b6C3F1 femininos expostos a várias concentrações de um produto químico de ensaio por ~90 dias (n = 5/grupo) foram picadas ou cortadas em cubos e congeladas no laboratório em vida e posteriormente enviadas para este laboratório para análise. O tecido picado foi analisado após ~2 meses de armazenamento; devido à má qualidade dos dados, o tecido em cubos congelados foi posteriormente analisado após ~22 meses de armazenamento. Para garantir que as células na extremidade alta do contínuo dano de DNA induzido por químicos não fossem excluídas da análise, foram incluídos dados de células escoráveis que, após inspeção visual, pareciam ser ouriços. (A) Grupo média % resultados de DNA da cauda. Em comparação com o tecido picado, os resultados de alta qualidade foram obtidos a partir de tecido em cubos congelados, mesmo após armazenamento prolongado. (B) Grupo média % resultados de ouriços. A técnica de picar pobres é evidente a partir do extenso dano de DNA não biológico observado como cometas de ouriço nas amostras de tecido picado. As barras de erro refletem o desvio padrão. Um ANOVA com o teste de Dunnett foi utilizado para avaliar uma resposta positiva ao produto químico de ensaio para cada método de preparação da amostra. Não foram detectados grupos de dose estatisticamente significantes(p < 0,05) para qualquer método. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Dano de DNA da linha de base medido em tecidos cerebrais congelados de ratos. Os resultados do ensaio do cometa são fornecidos para tecidos picados ou em cubos congelados representando várias regiões diferentes do cérebro de ratos machos e fêmeas de Sprague Dawley. Os dados (gerados pela inclusão de cometas de ouriço scorable) foram colhidos ao longo de vários estudos; n = número total de tecidos cerebrais avaliados para cada método de preparação da amostra. As barras de erro refletem o desvio padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Como demonstrado anteriormente7,12,13, tecido picado congelado flash devidamente manuseado fornece bons resultados no ensaio do cometa. De fato, os valores de DNA da cauda % da linha de base para fígado de rato picado congelado e fígado de rato preparado em nosso laboratório são tipicamente ≤6%, conforme recomendado pela diretriz de teste da OCDE9 para amostras de fígado de rato recém-picado. Bons resultados foram obtidos por vários laboratórios utilizando uma variedade de tipos de tecidos que foram picados e armazenados congelados; da mesma forma, células epiteliais congeladas flash raspadas de órgãos no trato gastrointestinal têm sido usadas com sucesso no ensaio do cometa7,,12,,13,14. O tecido picado/raspado congelado parece ser relativamente estável por pelo menos vários meses. O método que emprega a homogeneização de cubos de fígado congelados flash usando um dispositivo de picar tecido originalmente descrito por Jackson et al.6, produz resultados no ensaio do cometa pelo menos comparável e tipicamente melhor (ou seja, níveis de base inferiores de dano de DNA) do que aqueles obtidos para fígado picado congelado. Essa metodologia também é aplicável a outros tipos de tecidos6; em nossa experiência, excelentes resultados foram obtidos da mesma forma usando duodeno em cubos congelados (dados não mostrados) e tecido cerebral(Figura 5). No entanto, o dispositivo de peneira pode não ser passível de homogeneização de todos os tipos de tecidos. Em um estudo piloto, descobrimos que o tecido cardíaco muscular não poderia ser facilmente forçado através do dispositivo de peneira, resultando em má recuperação celular; em vez disso, picar o tecido imediatamente após o descongelamento rendeu suspensões celulares com valores de DNA de cauda de linha de base comparáveis aos picados antes do congelamento do flash (dados não mostrados). Notavelmente, quando manuseado corretamente durante a necropsia (ou seja, mantido frio e úmido; flash congelado como peças individuais e não permitido descongelar parcialmente), o tecido em cubo congelado flash tem causado danos muito baixos no DNA da linha de base mesmo após aproximadamente dois anos de armazenamento do congelador(Figura 4).
O uso de suspensões celulares congeladas ou tecido em cubos no ensaio do cometa oferece várias vantagens sobre o tecido fresco, incluindo: 1) facilitação da coleta simultânea de múltiplos tipos de tecidos para análise de cometas; 2) facilitação da coleta de tecidos em laboratório e transferência de amostras para outro laboratório para análise; 3) conveniência para adiar a decisão de analisar um determinado tecido por meses. Embora a homogeneização do tecido congelado no momento da preparação do slide seja mais complicada do que picar tecido fresco no momento da colheita, o uso de tecido em cubos congelados oferece vários benefícios adicionais que incluem: 1) não ser necessário pessoal treinado no ensaio do cometa (por exemplo, unidade móvel) ou suprimentos/reagentes especializados na necropsia; 2) menos oportunidade para erros técnicos (por exemplo, aquecimento amostral; liberação insuficiente de células; tamanho da amostra de tecido sub-ideal) durante a necropsia; 3) oportunidade mínima para introduzir dano mecânico de DNA durante o processamento da amostra (por exemplo, cisalhamento de pino); e 4) baixo dano de DNA da linha de base, mesmo após armazenamento prolongado.
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Disclosures
Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Pesquisa Intramural do NIH, Instituto Nacional de Ciências da Saúde Ambiental (NIEHS) contrato HHS27320130000c; no entanto, as declarações, opiniões ou conclusões nela contidas não representam necessariamente as declarações, opiniões ou conclusões do NIEHS, NIH ou do governo dos Estados Unidos.
Acknowledgments
Os autores estão em dívida com Lincoln Martin e Kelley Owens por assistência técnica especializada preparando e pontuando slides de cometas e dr. Carol Swartz para a realização de análises estatísticas. Os autores também reconhecem as contribuições solidárias dos membros dos programas de Toxicologia Genética, Toxicologia Investigativa e Necropsia do ILS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryovials | Corning Costar | 430488 | |
| Dental Wax Sheets | Electron Microscopy Sciences | 72670 | |
| Dissecting (Mincing) Micro Scissors | Fisher Scientific | 08-953-1B | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Gibco | 14175-079 | |
| KCl | Teknova | P0315-10 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Low Melting Point Agarose | Lonza | 50081 | |
| Microfuge Tubes (1.7 mL) | Corning | 3207 | |
| Na2EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | |
| Neutral Buffered Formalin | Leica | 600 | |
| Scalpel Blades | Miltex | 4-110 | |
| Syringe Plunger (1 mL) | Fisher Scientific or Vitality Medical | 14-826-88; 8881901014 | Becton Dickinson or Monoject tuberculin syringe |
| Tissue Mincing Device | NorGenoTech (Oslo, Norway) | None | Small variability in diameter observed which can affect snuggness of plunger. |
| Tweezers, plastic | Trade Winds Direct | DF8088N | Reinforced nylon, nonsterile, blunt tip, autoclavable; tradewindsdirect.com |
| Weigh Boats | Krackler Scientific/Heathrow Scientific | 6290-14251B |
References
- van der Leede, B. J., et al. Performance and data interpretation of the in vivo comet assay in pharmaceutical industry: EFPIA survey results. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 775-776, 81-88 (2014).
- ICH. International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH) S2(R1): Guidance on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended for Human Use. ICH. , (2012).
- EFSA. Scientific opinion on genotoxicity testing strategies applicable to food and feed safety assessment. EFSA Journal. 9 (9), 2379 (2011).
- Lorenzo, Y., Costa, S., Collins, A. R., Azqueta, A. The comet assay, DNA damage, DNA repair and cytotoxicity: hedgehogs are not always dead. Mutagenesis. 28 (4), 427-432 (2013).
- Guerard, M., Marchand, C., Plappert-Helbig, U. Influence of experimental conditions on data variability in the liver comet assay. Environmental and Molecular Mutagenesis. 55 (2), 114-121 (2014).
- Jackson, P., et al. Validation of freezing tissues and cells for analysis of DNA strand break levels by comet assay. Mutagenesis. 28 (6), 699-707 (2013).
- Recio, L., Kissling, G. E., Hobbs, C. A., Witt, K. L. Comparison of Comet assay dose-response for ethyl methanesulfonate using freshly prepared versus cryopreserved tissues. Environmental and Molecular Mutagenesis. 53 (2), 101-113 (2012).
- Uno, Y., et al. JaCVAM-organized international validation study of the in vivo rodent alkaline comet assay for detection of genotoxic carcinogens: II. Summary of definitive validation study results. Mutation Research/Genetetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 786-788, 45-76 (2015).
- OECD. OECD Guideline for the Testing of Chemicals: In Vivo Mammalian Alkaline Comet Assay. OECD. 489, (2016).
- Hobbs, C. A., et al. Comet assay evaluation of six chemicals of known genotoxic potential in rats. Mutation Research/Genetetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 786-788, 172-181 (2015).
- Ding, W., Bishop, M. E., Lyn-Cook, L. E., Davis, K. J., Manjanatha, M. G. In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver. Journal of Visualized Experiments. (111), 53833 (2016).
- Hobbs, C. A., Chhabra, R. S., Recio, L., Streicker, M., Witt, K. L. Genotoxicity of styrene-acrylonitrile trimer in brain, liver, and blood cells of weanling F344 rats. Environmental and Molecular Mutagenesis. 53 (3), 227-238 (2012).
- Hobbs, C. A., et al. Comprehensive evaluation of the flavonol anti-oxidants, alpha-glycosyl isoquercitrin and isoquercitrin, for genotoxic potential. Food and Chemical Toxicology. 113, 218-227 (2018).
- Pant, K., et al. Vehicle and positive control values from the in vivo rodent comet assay and biomonitoring studies using human lymphocytes: historical database and influence of technical aspects. Environmental and Molecular Mutagenesis. 55 (8), 633-642 (2014).
