Summary
Этот протокол описывает несколько процедур для подготовки высококачественных образцов замороженных тканей во время некропсии для использования в анализе кометы для оценки повреждения ДНК: 1) рубленая ткань, 2) Царапины эпителиальных клеток из желудочно-кишечного тракта, и 3) кубических тканей образцы, требующие гомогенизации с помощью устройства для измельчения тканей.
Abstract
Анализ кометы набирает популярность как средство оценки повреждения ДНК в культивированных клетках и тканях, особенно после воздействия химических веществ или других экологических стрессоров. Использование анализа кометы в регулятивном тестировании генотоксического потенциала у грызунов было обусловлено принятием в 2014 году директивы Организации экономического сотрудничества и развития (ОЭСР). Комета асссея слайды, как правило, готовятся из свежей ткани во время некропсии; однако, замораживание образцов тканей может избежать логистических проблем, связанных с одновременной подготовкой слайдов из нескольких органов на животное и от многих животных в исследовании. Замораживание также позволяет отгружать образцы из объекта воздействия в другую лабораторию для анализа, а хранение замороженных тканей облегчает отсрочку принятия решения о генерации данных о повреждении ДНК для данного органа. Анализ щелочной кометы полезен для обнаружения двух- и однострочных разрывов ДНК, щелочных лабильных поражений и разрывов нитей, связанных с неполным восстановлением иссечения ДНК. Тем не менее, повреждение ДНК может также в результате механических стрижки или неправильной обработки образцов процедур, смешивая результаты анализа. Воспроизводимость в сборе и обработке образцов тканей во время некропсии может быть трудно контролировать из-за колебания лабораторного персонала с различным уровнем опыта в сборе тканей для проверки кометы. Повышение согласованности путем повышения квалификации или развертывания мобильных подразделений, укомплектованных опытным лабораторным персоналом, сопряжено с большими расходами и не всегда может быть осуществимо. Для оптимизации последовательного поколения высококачественных образцов для анализа анализа анализа комет был оценен метод гомогенизации флэш-замороженных кубов ткани с помощью настраиваемого устройства для рубки тканей. Образцы, подготовленные для анализа кометы этим методом, по сравнению по качеству с образцами свежих и замороженных тканей, подготовленными путем измельчения во время некропсии. Кроме того, низкий базовый ущерб ДНК измерялся в клетках из замороженных кубов ткани после длительного хранения.
Introduction
Анализ кометы все чаще используется в качестве средства оценки повреждения ДНК в культивированных клетках и тканях, подвергающихся воздействию химических веществ или других экологических стрессоров1. Анализ может обнаружить ДНК двух- и однострочных разрывов, щелочных лабильных поражений, и однострочные перерывы, связанные с неполным ремонтом ДНК. Международный совет по гармонизации технических требований к фармацевтическим препаратам для использования человека (ICH) руководство для фармацевтического тестирования рекомендует ДНК нити асссе, такие как анализ кометы в качестве второго теста в дополнение к грызунов эритроцита микронуклета анализа для оценки виво генотоксичности и в качестве последующего теста для оценки режима действия в целевых органов опухолиопухоли 2. Европейское управление по безопасности пищевых продуктов (EFSA) рекомендует анализ кометы in vivo в качестве подходящего последующего теста для исследования актуальности положительного результата в тесте по генококсикности in vitro3. В 2014 году было утверждено руководство ОЭСР по тестированию кометы грызунов, что увеличило приемлемость анализа для использования в регулятивном тестировании генотоксического потенциала. Анализ основан на электрофоретической разделении расслабленных циклов ДНК и фрагментов, которые мигрируют из нуклеоидов лизированных клеток. В основном, одиночные клетки встроены в агарозу, которая была слоистых на микроскоп слайды. Слайды затем погружаются в буфер лизиса, а затем щелочной (pH ) решение, которое позволяет плотно смоченной ядерной ДНК, чтобы расслабиться и расслабиться. Слайды затем помещаются в электрическое поле, которое стимулирует миграцию отрицательно заряженной ДНК к аноду, создавая изображения, напоминающие кометы; относительное количество ДНК в хвосте кометы по сравнению с головкой кометы прямо пропорционально количеству повреждений ДНК; Содержание ДНК в хвосте, как правило, количественно с помощью цифрового программного обеспечения изображений.
Поскольку анализ кометы обнаруживает фрагментированную ДНК, точная количественная количественная оценка повреждения ДНК, вызванного воздействием, может быть сбита с толку фрагментацией хроматина, связанной с некрозом или апоптозом в результате вызванной лечением цитотоксичности или стресса. Кроме того, повреждение ДНК может произойти в результате механической стрижки или неправильной обработки образцов4. Важность поддержания собранной ткани охлажденной до слайд-подготовки, чтобы свести к минимуму базовый уровень повреждения ДНК, ранее было продемонстрировано5,,6. Многие лаборатории готовят кометные асссивы слайдов из свежей ткани; однако, это может быть логистически сложной при подготовке слайдов из нескольких типов тканей на животное в исследовании с большим количеством животных. Кроме того, это создает проблему, когда подготовка и анализ слайдов должны происходить в удаленной лаборатории, что требует отгрузки образцов. Например, Национальная программа токсикологии США включает анализ кометы в качестве компонента своей программы тестирования на генетическую токсикологию (https://ntp.niehs.nih.gov/testing/types/genetic/index.html), а иногда включает анализ в 28 или 90 дней повторных исследований токсичности дозы; это требует сбора тканей лабораторией в течение всей жизни и передачи образцов в другую лабораторию для анализа. Для достижения этой цели, части ткани измельчаются, и / или эпителиальных клеток желудочно-кишечного тракта Царапины и клеточной суспензии флэш-заморожены и хранятся в морозильной камере для последующей отгрузки и хранения в приемной лаборатории до анализа7. Правильная обработка образцов имеет решающее значение для получения высококачественных данных с использованием замороженных тканей; однако, воспроизводимые манипуляции образцов тканей во время некропсии, выполняемые постоянно меняющимся персоналом, трудно контролировать, особенно в лабораториях в жизни, которые обычно не собирают ткани для анализа кометы. Освежающее обучение персонала по некропсии или использование мобильного подразделения, укомплектованного опытным лабораторным персоналом для сбора образцов свежих или замороженных тканей, зачастую является слишком дорогостоящим, неосуществимым или просто недооцененным.
Для лучшего обеспечения последовательного генерации высококачественных образцов тканей для переноса в удаленный участок для анализа анализа кометы была изучена полезность опубликованного метода6 сохранения тканей из флэш-замороженных кубов ткани. В этом методе замороженные кубики ткани загружаются в устройство для измельчения тканей из нержавеющей стали(рисунок 1), которое помещается в микроцентрифугную трубку, содержащую холодный буфер. Куб ткани затем проталкивается через небольшую калибровочная сетка в конце устройства. Неоднократное принуждение ткани суспензии через сеточное сито в обоих направлениях несколько раз приводит к относительно равномерной одноклеточной суспензии. Образцы, подготовленные этим методом, по качеству сравнивали как со свежими, так и с замороженными образцами тканей, подготовленными путем измельчения. В качестве дополнительного преимущества, в отличие от фарша, кубики тканей могут храниться замороженными в течение длительных периодов времени и по-прежнему дают высокие результаты качества в анализе кометы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ткани были собраны в ходе проведения исследований, проведенных на аккредитованных AAALAC объектах в контрактных лабораториях NTP в соответствии с правилами хорошей лабораторной практики (21 CFR Part 58) и протоколами использования животных, утвержденными Институциональным Животным Комитет по уходу и использованию (IACUC) в каждой лаборатории.
1. Урожай и обработка тканей
ПРИМЕЧАНИЕ: Полезно подготовить дубликаты пробных трубок (например, печень) или перенести примерно половину образца в другую трубку для хранения (например, двенадцатиперстной кишки, желудок), чтобы при необходимости провести повторанализа. Чтобы свести к минимуму потенциальную изменчивость образца к образцу для тканей желудочно-кишечного тракта, рекомендуется, чтобы провести пробы той же области ткани по отношению к желудку для каждого животного, и образец будет разделен для создания дублирующих образцов. Пластиковые щипцвы рекомендуется для передачи липких тканей, таких как мозг. В качестве опции, фарш, Царапины или гомогенизированные ткани препараты могут быть отфильтрованы для достижения однородных одноклеточных суспензий с помощью 40 мкм ячейки ситечко прилагается к конической трубки.
- Удалите любые прикрепленные соединительные ткани, органы и мусор из органа (ы) интерес. Сразу же после удаления, свист органа энергично в средних вес лодки, содержащей 7 мл холодного свежеприготовленного раствора измельчения (Mg,Caи фенол красно-свободного Хэнка сбалансированное решение соли, 10% V / V DMSO, и 20 мМ EDTA pH 7.5) для удаления остаточной крови и мусора.
- Перенесите каждый орган на другую чистую лодку, содержащую достаточное (7 мл) раствор холодного рубки для поддержания ткани погруженной на лед, до дальнейшей обработки.
- Удалите часть каждого интересующего органа и поместите его в встраивающую кассету. Исправить в 10% нейтральных буферизированных формалин, отделка, и парафин встраивается в соответствии со стандартными процедурами лаборатории для возможной будущей оценки гистопатологии.
- Для печени, вырезать 5 мм продольного раздела левой доли и осторожно свист в 7 мл холодного раствора измельчения. Поместите полосу ткани в чистую лодку среднего размера, содержащую 7 мл холодного раствора для рубки, и поддерживайте на льду до готовности к дальнейшей обработке (шаг 1.8 или 1.11).
- Для двенадцатиперстной кишки, вырезать 10 мм часть двенадцатиперстной кишки в живот. Использование 21-25 G иглы, флеш для удаления мусора и бактерий.
- Вставьте иглу в один конец двенадцатиперстной кишки и завить 1 мл холодного раствора для измельчения.
- Промыть другое направление, перевернув двенадцатиперстную кишу и повторяя еще 1 мл раствора для измельчения. Отбросьте иглу.
- Нарежьте двенадцатиперстную кистаю открыть и промыть его в 7 мл раствора измельчения, прежде чем положить его в средний вес лодки, содержащей 7 мл чистого раствора измельчения; поддерживать на льду до готовности к дальнейшей обработке (шаг 1.8 или 1.11).
- Для мозга, это может быть полезно сначала разделить мозг на два полушария; одно полушарие может быть сохранено для возможной гистопатологии (см. шаг 1.2).
- Вскрыть область мозга (ы) интерес и осторожно свист в 7 мл холодного раствора измельчения.
- Передача ткани (ы) на чистую лодку среднего размера, содержащую 7 мл раствора холодного рубки, и поддерживать на льду до тех пор, пока не будет готова к дальнейшей обработке (шаг 1.8 или 1.11; обратите внимание, что небольшие регионы, такие как мозжечок и гиппокамп, могут не требовать дальнейшей обрезки).
- Для желудка
- Удалите и отбросьте предыки. Отрежьте железистую животик и вымойте без пищи, используя 7 мл холодного буфера для рубки в среднеразмерной лодке.
- Удалите 5 мм полоску железистой желудочно-посадочной полосы проксимальной к двенадцатиперстной кишки для фиксации для возможной оценки гистопатологии (см. шаг 1.2).
- Поместите оставшийся желудок в буфер холодного рубки в среднеразмерную лодку и инкубировать на льду в течение 15-30 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот инкубационный шаг может и не потребоваться; этот шаг был включен в протокол проверки JaCVAM, но не упоминается в руководстве ОЭСР по тестированию8,,9. - Перенесите желудок в чистый кусок парафина (или чашку Петри или взвесить лодку) и аккуратно соскребите эпителия поверхности два или более раз с помощью скальпеля лезвия или скребка по политетрафторотена (PTFE) для удаления мусора. Возьмите слизистую оболочку желудка с щипками и промыть 1 мл холодного буфера рубки с помощью пифета. Перенесите ткани желудка на чистую поверхность или блюдо.
- Тщательно соскребите эпителия желудка 4-5 раз (больше, при необходимости) в растворе измельчения (обычно 250 л/мышь или 500-1000 л/крыса) с задней части скальпеля лезвия или PTFE скребок, чтобы освободить клетки. Дополнительно промыть ткань примерно равным объемом раствора для восстановления большего количества клеток. Соберите раствор для измельчения, содержащий высвобожденые клетки с помощью трубки и перенесите в микроцентрифугую трубку на льду.
- Для измельчения образцов тканей вырежьте 3-4 мм секции печени или ткани головного мозга или 5 мм двенадцатиперстной кишки и перенесите на помеченную 1,5 или 2,0 мл микроцентрифуговой трубки, содержащей 1 мл холодного раствора для рубки. Быстро фарш (30 с) с ножницами до тонкого рассечения, сохраняя при этом образец холодным. Образец должен выглядеть слегка облачно; однако, оно общее для некоторых частей, котор нужно остать, то которое уляжется к дну пробки.
- Для использования ткани свежей, поддерживать трубки, содержащие фарш ткани или Царапины эпителиальных клеток на льду; использовать ткани для подготовки кометных слайдов в пределах примерно 1 ч урожая (изложены в разделе 2).
- Для замораживания образцов тканей, сразу же после измельчения или сбора Царапины эпителиальных клеток
- Закрепите крышку трубки и опустите трубку в колбу Dewar, содержащую жидкий азот; трубки могут поддерживаться в жидком азоте в течение всего периода некропсии (3 ч).
- Извлекать трубки с помощью ковша и место на сухой лед для сортировки. Перенесите трубки в морозильную камеру на сухой лед и храните коробку в морозильной камере -80 градусов.
- Для приготовления замороженных кубиков ткани, вырезать несколько небольших кусочков ткани (4 мм в диаметре и 6 мм в длину; Рисунок 1).
- Индивидуально сбросьте их непосредственно в лодку среднего размера или другой подходящий сосуд, содержащий жидкий азот.
- Подождите несколько секунд, пока кусочки полностью замерзнут и переведут отдельные замороженные кубики ткани в маркированную микроцентрифугную трубку или криотубеб, поддерживаемый на сухом льду; не допускайте, чтобы кусочки слипались во время процесса замораживания.
- Перенесите трубки в морозильную камеру на сухой лед и храните коробку в морозильной камере -80 градусов.
2. Подготовка слайдов
-
Для рубленой/царапинной ткани
- Поддерживайте трубки, содержащие свежие ткани на мокром льду.
- Поместите трубки из замороженной ткани в водяную ванну комнатной температуры до тех пор, пока образцы полностью не разморозятся, обеспечивая при этом, что они остаются холодными. Немедленно перенесите трубки на лед.
- Непосредственно перед снятием клеток для переноса в агарозу (шаг 2.3) аккуратно перемешайте каждую клеточную суспензию; для нефильтрованных образцов, позволяют большие куски, чтобы осесть на дно трубки. Поддерживайте все трубы на льду до тех пор, пока не будут подготовлены горки для всех образцов.
-
Для кубисто-излёк
- Извлекайте трубки, содержащие кубики ткани из морозильной камеры 80 градусов по Цельсию и поддерживайте сухой лед до подготовки слайда.
- Aliquot 1 мл среднего торгового (0,14 M NaCl, 1,47 мМ KH2PO4, 2,7 мм KCl, 8,1 мм Na2HPO4, 10 мм NaEDTA, pH 7.4) или фарш раствор в помечены 1,7 мл микроцентрифуги трубки для каждого образца и поддерживать на льду.
- Работая быстро, чтобы избежать таяния тканей, поместите куб ткани в открытый конец комнатной температуры ткани рубки устройства(рисунок 1). Несколько частей ткани могут быть использованы; при необходимости, замороженные ткани могут быть разрезаны или трещины на более мелкие кусочки с помощью холодного раствора и пестика, чтобы уменьшить размер куба, чтобы вписаться в устройство.
- Быстро вставьте размер подобранных шприц поршень в устройство, чтобы подтолкнуть ткани к концу сетки, которые затем должны быть помещены в микроцентрифуг трубку, содержащую холодный раствор измельчения; не заставляя жидкость переполнения трубки. Погрузите конец сетки устройства примерно на 5-10 с в холодный раствор для измельчения, чтобы ткань полностью оттаивалась.
- Полностью угнетает поршень до тех пор, пока клетки не будут видны экструдируя через поры сетки. Затем потяните поршень примерно на 2,5 см и нажмите вниз снова полностью; повторить процесс несколько раз, пока раствор измельчения становится мутным.
- При необходимости образец может быть сконцентрирован для увеличения плотности клеток путем охлаждения центрифугирования в течение 5 мин при 1100 об/мин и удаления части супернатанта.
- Повторите процесс для всех образцов с помощью чистого устройства для сжигания тканей для каждого образца.
- Передача 50 зликат клеточной суспензии в трубку, содержащую 450 л 0,5% низкой точки плавления агарозы при температуре 37 градусов по Цельсию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Объемы могут быть скорректированы, но сумма агарозы должна быть 1%. - Подготовка и оценка слайдов, как описано ранее10,11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Исследование 1
Печень была собрана из двух когорт ясам Sprague Dawley крыс вводили кукурузное масло в течение 4 дней, пошатнулся на одну неделю. Слайды были подготовлены из свежеизмельченной ткани, замороженных фаршовых тканей и замороженных кубиковых тканей, обработанных в среднем или минковяющий раствор купца с помощью средства для измельчения тканей. Замороженные ткани, полученные от животных из первой когорты, оценивались после хранения морозильной камеры в течение 3,5 месяцев. Замороженные ткани, полученные от животных из второй когорты, оценивались после хранения в течение 6 месяцев. Кометы, демонстрирующие характерную морфологию «ежика», свидетельствующие о сильно поврежденных клетках (неопределенной этиологии, которая может включать цитотоксичность или механический стресс), не были включены в скоринг ДНК хвоста; процентеаек ежей, идентифицированный исключительно при визуальном осмотре морфологии, был отсеано отдельно в рамках ОЭСР TG 4899. Средние % хвост днк результаты для животных в двух когортах (на основе забил 100 клеток / животных) суммируются в рисунке 2A. Все методы использования замороженных тканей производили значения выше, хотя и не всегда статистически отличающихся, чем свежие ткани. Учитывая, что рекомендуемый верхний предел для % ХВОСТ ДНК в свежей печени крысы составляет 6%9,эти результаты показывают, что любой из этих методов может хорошо работать для оценки замороженных тканей. Решение для обрезки выполнено по крайней мере поровну, как и среда купца; так как последний занимает больше времени для подготовки, фарш решение было выбрано для последующих исследований. Статистически значимых различий в повреждениях тканей второй когорты животных, которые хранились замороженными в течение 6 месяцев до обработки, не выявлено по сравнению с тканями из первой когорты, обработанной после 3,5 месяцев хранения. В целом, % ежей параллельно % хвост ДНК, хотя % ежей в замороженных тканях по отношению к свежей ткани была более переменной, чем для % хвост ДНК (Рисунок 2B). Значения для этих конечных точек в свежей ткани обеспечивают базовый участок, на основе которого можно оценить повреждения ДНК, наносимые методами замораживания.
Исследование 2
Самки b6C3F1 мышам вводили нормальный солен или мутаген, этилметаносульфонат (EMS) при 200 мг/кг/день при нормальном солей в течение трех дней. Ткань была собрана 3 ч после введения окончательной дозы и обработана свежей в анализе кометы. Дополнительная ткань была заморожена после того, как измельчила в фарш растворе или собиралась в виде кубиков. Кубизированные образцы впоследствии обрабатывались в растворе измельчения с помощью сито-устройства непосредственно перед подготовкой кометных слайдов. На предпосылке, что клетки, демонстрирующие морфологии ежа представляют клетки на высоком конце континуума химически-индуцированного повреждения ДНК, ежи scorable программным обеспечением изображения были включены в автоматизированный скоринг % хвост ДНК. % результаты ДНК хвоста (на основе забил 150 клеток / животных) суммируются в рисунке 3. Ткань печени, замороженная в виде кубиков и впоследствии обработанная с помощью устройства измельчения тканей, дала результаты, очень похожие на полученные для свежерубленной ткани. Значение ДНК хвоста было несколько выше для замороженных фаршовых тканей, но базовые значения для замороженных фарш ткани были ниже 6%, как рекомендуется для свежей печени крысы в тесте ОЭСР руководство по анализу кометы9. Статистически значимое увеличение повреждения ДНК, вызванного ЭМС, было измерено в образцах тканей, обработанных всеми тремя методами.
Исследование 3
Части ткани печени, собранные у самок мышей B6C3F1 в 90-дневном исследовании токсичности испытательного химического вещества, проведенного удаленной лабораторией, были измельчены или нарезаны кубиками, заморожены и отправлены на ночь на сухой лед в эту лабораторию для анализа. Рубленая ткань была проанализирована после 2 месяцев хранения морозильной камеры(рисунок 4). Клетки, которые появились при визуальном осмотре, чтобы быть ежи, но были scorable по визуализации программного обеспечения были включены в % хвост днк измерений (150 клеток забил / животных). Количество ежей (будь то scorable или nonscorable), идентифицированных исключительно при визуальном осмотре морфологии в общей сложности 150 клеток/животных, было затапонно отдельно для предоставления информации о частоте этих сильно поврежденных клеток. В целом, повреждение ДНК (измеряется как % хвост ДНК) в замороженных фарш ткани была высокой во всех группах дозы с существенным животных к животному изменчивости, в том числе в группе управления транспортным средством. % хвост ДНК результаты коррелируют с % ежей (определяется исключительно на основе морфологии), что свидетельствует о том, что ежи внесли существенный вклад в высокий уровень повреждения ДНК, который наблюдался в этих образцах. На основе высокого фонового уровня повреждения ДНК, измеренного в рубленой ткани, замороженные кубики ткани были впоследствии проанализированы после 22 месяцев хранения(рисунок 4). Повреждения ДНК и % ежей были очень низкими во флэш-замороженных кубиках ткани, которые были подготовлены параллельно с образцами фарша ткани. Таким образом, сильно поврежденные клетки, отраженные морфологией ежа в образцах измельченных тканей, явно не были результатом биологического процесса, а, вероятно, были введены в результате механических нарушений и/или потепления тканей во время процедуры измельчения до того, как они были заморожены; эти данные были сочтены ненадежными. К счастью, анализ замороженных кубицовых тканей дал четкий результат, а именно отсутствие реакции повреждения ДНК в печени самок мышей после трех месяцев воздействия испытательного химического вещества. Результаты этого тематического исследования иллюстрируют риск, связанный с подготовкой измельченных тканей относительно неопытной лабораторией, и демонстрируют полезность метода замороженных кубиц для обхода этой проблемы.
Рисунок 1: Устройство для обрезки тканей и поршень, используемое для подготовки одноклеточной подвески из замороженных тканей. Прототип устройства (внутренний диаметр 4,5 мм, размер сетки 0,4 мм) любезно предоставил доктор Гуннар Брунборг (NorGenotech, Осло, Норвегия). Панель справа является примером соответствующего размера куба ткани для использования с устройством. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Сравнение повреждений ДНК, измеренных в свежих и замороженных фарш и гомогенизированных образцов печени мыши. Печень была собрана из двух шахматных когорты (n no 5/group/cohort) из мужчин Sprague Dawley крыс вводили кукурузное масло в течение 4 дней. Слайды были подготовлены из свежеизмельченной ткани, замороженных фаршовых тканей и замороженных кубиковых тканей, обработанных в среднем или минковяющий раствор купца с помощью средства для измельчения тканей. Замороженные ткани были проанализированы 3,5 и 6 месяцев после некропсии для когорт 1 и 2, соответственно. Кометы, классифицированные как ежи на основе морфологии, не были включены в скоринг ДНК хвоста. (A) Когорта означает % хвост результаты ДНК. (B) Когорта означает % результатов ежа. Бары ошибок отражают стандартное отклонение. Проводился статистический анализ для сравнения замороженных тканей со свежей ткани для каждой когорты и для сравнения результатов между двумя когортами для каждого метода подготовки ткани. «Статистически отличается(p qlt; 0.05) из свежей ткани фарша в той же когорте, используя T-тест студента; #statistically отличается(p qlt; 0.05) из свежей ткани фарша в той же когорте, используя тест Манн-Уитни для ненормально распределенных данных; статистическая разница(p qlt; 0.05) между когортами, использующими T-тест студента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Сравнение повреждений ДНК, индуцированных EMS в ткани печени, обрабатываемой различными процедурами. Средний % хвост ДНК для самок B6C3F1 мышей вводят транспортного средства или 200 мг/кг / кг EMS в течение трех дней (n No 5/group). Печень были собраны 3 ч после окончательной дозы введения и обрабатываются свежими в комете асссе. Дополнительная ткань печени была заморожена после того, как измельчила раствор для измельчения или собиралась в виде кубиков; Кубики образцов были однородны с помощью устройства измельчения тканей непосредственно перед подготовкой кометных слайдов. Для обеспечения клеток на высоком конце континуума EMS-индуцированного повреждения ДНК не были исключены из анализа, кометы, которые при визуальном осмотре, как представляется, отвечают морфологическое описание ежей, но были найдены, чтобы быть scorable по изображению программного обеспечения были включены. Бары ошибок отражают стандартное отклонение. Студенческий t-тест был использован для сравнения количества повреждений ДНК у животных, подвергшихся воздействию EMS против, что в транспортном средстве управления животных для каждого метода подготовки образца. «Статистически значимое увеличение на p qlt; 0.05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4. Тематическое исследование, демонстрирующее полезность метода замороженного куба и высококачественные данные, полученные после длительного хранения. Части тканей печени, собранные у самок мышей B6C3F1, подвергшихся воздействию различных концентраций испытательного химического вещества в течение 90 дней (n no 5/group), были измельчены или нарезаны кубиками и заморожены в лаборатории и впоследствии отправлены в эту лабораторию для анализа. Рубленая ткань была проанализирована после 2 месяцев хранения; из-за низкого качества данных, замороженные кубики ткани были впоследствии проанализированы после 22 месяцев хранения. Для обеспечения клеток на высоком конце континуума химически индуцированного повреждения ДНК не были исключены из анализа, данные из scorable клеток, которые, при визуальном осмотре, как представляется, ежи, были включены. (A) Группа означает % хвост результаты ДНК. По сравнению с рубленой тканью, из замороженных кубицовых тканей были получены высококачественные результаты даже после длительного хранения. (B) Группа означает % результатов ежа. Плохая техника измельчения проявляется в обширном небиологическом повреждении ДНК, наблюдаемом как кометы ежа в образцах фарша. Бары ошибок отражают стандартное отклонение. ANOVA с тестом Даннетта был использован для оценки положительной реакции на испытательное химическое вещество для каждого метода подготовки образца. Статистически значимых(p qlt; 0.05) доза групп ы не обнаружено ни для одного метода. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Базовый урон ДНК измеряется в замороженных тканях мозга крыс. Результаты исследования кометы предоставляются для замороженных фарша или кубик тканей, представляющих несколько различных областей мозга мужчин и женщин Sprague Dawley крыс. Данные (генерируемые в том числе scorable кометы ежа) были собраны в течение нескольких исследований; n - общее количество тканей мозга, оцениваемых для каждого метода подготовки образца. Бары ошибок отражают стандартное отклонение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Как было продемонстрировано ранее7,12,13, правильно обрабатываются флэш замороженных фарш ткани обеспечивает хорошие результаты в анализе кометы. В самом деле, базовые % хвост днк значения для замороженных фарш крысиной и мышиной печени, подготовленные в нашей лаборатории, как правило, 6%, как это рекомендовано в соответствии с рекомендацией опроведении испытаний9 для свежефарктных образцов печени крыс. Хорошие результаты были получены несколькими лабораториями с использованием различных типов тканей, которые были измельченные и хранятся замороженные; Аналогичным образом, флэш замороженные эпителиальные клетки, выскабливаемые из органов желудочно-кишечного тракта, успешно использовались в анализе кометы77,12,,13,,14. Замороженные рубленые/царапинные ткани, как представляется, относительно стабильны, по крайней мере несколько месяцев. Метод использования гомогенизации флэш-замороженных кубов печени с помощью устройства измельчения тканей, первоначально описанного Джексоном и др.6,дает результаты в анализе кометы по крайней мере сопоставимы и, как правило, лучше (т.е. более низкие базовые уровни повреждения ДНК), чем те, которые получены для замороженных фарш печени. Эта методология также применима к другим типамтканей 6; по нашему опыту, отличные результаты были получены с использованием замороженных кубик двенадцатиперстной кишки (данные не показаны) и ткани мозга(рисунок 5). Тем не менее, сито устройство не может быть поддается гомогенизации всех типов тканей. В экспериментальном исследовании, мы обнаружили, что мышечная ткань сердца не может быть легко принудительно через сито устройства, в результате чего плохое восстановление клеток; вместо этого, mincing ткани сразу же после оттаивания дали клеточной суспензии с базовыми % хвост ДНК значения сопоставимы с теми, фарш до флэш-замораживания (данные не показаны). Примечательно, что при правильном обращении во время некропсии (т.е. холодным и влажным; вспышка заморожена как отдельные части и не допускается к частичной оттепели), флэш-замороженные кубики ткани дали очень низкий базовый ущерб ДНК даже после примерно двух лет хранения морозильной камеры (Рисунок 4).
Использование либо замороженных клеточных суспензий, либо кубической ткани в анализе кометы дает ряд преимуществ по сравнению со свежей тканью, включая: 1) упрощение одновременного сбора нескольких типов тканей для анализа кометы; 2) упрощение сбора тканей в лаборатории и передача образцов в другую лабораторию для анализа; 3) удобство отложить решение о анализе данной ткани в течение нескольких месяцев. Хотя гомогенизация замороженных тканей во время подготовки слайда является более громоздкой, чем измельчение свежей ткани во время сбора урожая, использование замороженных кубических тканей предлагает несколько дополнительных преимуществ, которые включают: 1) отсутствие потребности в персонале, обученном анализу кометы (например, мобильном блоке) или специализированных принадлежностей/реагентов при некропсии; 2) меньше возможностей для технических ошибок (например, потепление образцов; недостаточное высвобождение клеток; субоптимальный размер образца ткани) во время некропсии; 3) минимальная возможность ввести механические повреждения ДНК при обработке образцов (например, рубленый сдвига); и 4) низкие базовые повреждения ДНК, даже после длительного хранения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Эта работа была поддержана Программой интрамуральных исследований NIH, Национальным институтом экологических наук (NIEHS) по контракту HHSN273201300009C; однако содержащиеся в них заявления, мнения или выводы не обязательно отражают заявления, мнения или выводы NIEHS, NIH или правительства Соединенных Штатов.
Acknowledgments
Авторы в долгу перед Линкольном Мартином и Келли Оуэнсом за экспертную техническую помощь в подготовке и скоринге кометных слайдов и доктору Кэрол Шварц за выполнение статистического анализа. Авторы также признают поддержку вклада членов генетической токсикологии, исследования токсикологии и некропсии программ в ILS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryovials | Corning Costar | 430488 | |
| Dental Wax Sheets | Electron Microscopy Sciences | 72670 | |
| Dissecting (Mincing) Micro Scissors | Fisher Scientific | 08-953-1B | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Gibco | 14175-079 | |
| KCl | Teknova | P0315-10 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Low Melting Point Agarose | Lonza | 50081 | |
| Microfuge Tubes (1.7 mL) | Corning | 3207 | |
| Na2EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | |
| Neutral Buffered Formalin | Leica | 600 | |
| Scalpel Blades | Miltex | 4-110 | |
| Syringe Plunger (1 mL) | Fisher Scientific or Vitality Medical | 14-826-88; 8881901014 | Becton Dickinson or Monoject tuberculin syringe |
| Tissue Mincing Device | NorGenoTech (Oslo, Norway) | None | Small variability in diameter observed which can affect snuggness of plunger. |
| Tweezers, plastic | Trade Winds Direct | DF8088N | Reinforced nylon, nonsterile, blunt tip, autoclavable; tradewindsdirect.com |
| Weigh Boats | Krackler Scientific/Heathrow Scientific | 6290-14251B |
References
- van der Leede, B. J., et al. Performance and data interpretation of the in vivo comet assay in pharmaceutical industry: EFPIA survey results. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 775-776, 81-88 (2014).
- ICH. International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH) S2(R1): Guidance on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended for Human Use. ICH. , (2012).
- EFSA. Scientific opinion on genotoxicity testing strategies applicable to food and feed safety assessment. EFSA Journal. 9 (9), 2379 (2011).
- Lorenzo, Y., Costa, S., Collins, A. R., Azqueta, A. The comet assay, DNA damage, DNA repair and cytotoxicity: hedgehogs are not always dead. Mutagenesis. 28 (4), 427-432 (2013).
- Guerard, M., Marchand, C., Plappert-Helbig, U. Influence of experimental conditions on data variability in the liver comet assay. Environmental and Molecular Mutagenesis. 55 (2), 114-121 (2014).
- Jackson, P., et al. Validation of freezing tissues and cells for analysis of DNA strand break levels by comet assay. Mutagenesis. 28 (6), 699-707 (2013).
- Recio, L., Kissling, G. E., Hobbs, C. A., Witt, K. L. Comparison of Comet assay dose-response for ethyl methanesulfonate using freshly prepared versus cryopreserved tissues. Environmental and Molecular Mutagenesis. 53 (2), 101-113 (2012).
- Uno, Y., et al. JaCVAM-organized international validation study of the in vivo rodent alkaline comet assay for detection of genotoxic carcinogens: II. Summary of definitive validation study results. Mutation Research/Genetetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 786-788, 45-76 (2015).
- OECD. OECD Guideline for the Testing of Chemicals: In Vivo Mammalian Alkaline Comet Assay. OECD. 489, (2016).
- Hobbs, C. A., et al. Comet assay evaluation of six chemicals of known genotoxic potential in rats. Mutation Research/Genetetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 786-788, 172-181 (2015).
- Ding, W., Bishop, M. E., Lyn-Cook, L. E., Davis, K. J., Manjanatha, M. G. In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver. Journal of Visualized Experiments. (111), 53833 (2016).
- Hobbs, C. A., Chhabra, R. S., Recio, L., Streicker, M., Witt, K. L. Genotoxicity of styrene-acrylonitrile trimer in brain, liver, and blood cells of weanling F344 rats. Environmental and Molecular Mutagenesis. 53 (3), 227-238 (2012).
- Hobbs, C. A., et al. Comprehensive evaluation of the flavonol anti-oxidants, alpha-glycosyl isoquercitrin and isoquercitrin, for genotoxic potential. Food and Chemical Toxicology. 113, 218-227 (2018).
- Pant, K., et al. Vehicle and positive control values from the in vivo rodent comet assay and biomonitoring studies using human lymphocytes: historical database and influence of technical aspects. Environmental and Molecular Mutagenesis. 55 (8), 633-642 (2014).
