Summary
Detta protokoll beskriver flera förfaranden för att förbereda högkvalitativa frysta vävnadsprover vid tidpunkten för obduktion för användning i kometanalysen för att bedöma DNA-skador: 1) hackad vävnad, 2) skrapade epitelceller från mag-tarmkanalen och 3) kubikvävnad prover som kräver homogenisering med hjälp av en vävnadsfärsapparat.
Abstract
Kometanalysen ökar i popularitet som ett sätt att bedöma DNA-skador i odlade celler och vävnader, särskilt efter exponering för kemikalier eller andra miljöfaktorer. Användningen av kometanalysen vid regulatorisk testning av genotoxisk potential hos gnagare har drivits av antagandet av en testriktlinje för Organisationen för ekonomiskt samarbete och utveckling (OECD) 2014. Kometanalys diabilder är vanligtvis beredda från färsk vävnad vid tidpunkten för obduktion; Frysning av vävnadsprover kan dock undvika logistiska utmaningar i samband med samtidig beredning av diabilder från flera organ per djur och från många djur per studie. Frysning möjliggör också att prover från exponeringsanläggningen till ett annat laboratorium för analys kan överföras, och lagring av fryst vävnad underlättar att skjuta upp ett beslut om att generera DNA-skadedata för ett visst organ. Den alkaliska komet analysen är användbart för att upptäcka exponering-relaterade DNA dubbel- och enkelstränga raster, alkali-labile skador och sträng raster i samband med ofullständiga DNA excision reparation. Emellertid, DNA-skador kan också bero på mekanisk klippning eller felaktig prov bearbetning förfaranden, förvirra resultaten av analysen. Reproducerbarhet vid insamling och bearbetning av vävnadsprover under obduktioner kan vara svår att kontrollera på grund av fluktuerande laboratoriepersonal med varierande erfarenhet av att skörda vävnader för kometanalysen. Det är dyrt att förbättra konsekvensen genom repetitionsutbildning eller driftsättning av mobila enheter med erfaren laboratoriepersonal och kanske inte alltid är genomförbart. För att optimera konsekvent generering av högkvalitativa prover för kometanalysanalys utvärderades en metod för homogenisering av flashfrysta kuber av vävnad med hjälp av en anpassad vävnadsfärsapparat. Prover som beretts för kometanalysen med denna metod jämfördes positivt i kvalitet med färska och frysta vävnadsprover som beretts genom malning under obduktion. Dessutom mättes dna-skador med låg baslinje i celler från frysta kuber av vävnad efter långvarig lagring.
Introduction
Kometanalysen används i allt högre grad som ett sätt att utvärdera DNA-skador i odlade celler och vävnader som exponeras för kemikalier eller andra miljöfaktorer1. Analysen kan upptäcka DNA dubbel- och enkelsträngsbrott, alkali-labila lesioner och enstaka strängbrott i samband med ofullständig DNA-reparation. Internationella rådet för harmonisering av tekniska krav för läkemedel för humant bruk (ICH) riktlinje för farmaceutisk testning rekommenderar en DNA-sträng brott analys såsom kometen analysen som ett andra test för att komplettera gnagare erytrocyt mikrokärna analys för bedömning in vivo genoxicitet och som ett uppföljningstest för bedömning av verkningssätt i målorgan av tumör induktion2. Europeiska myndigheten för livsmedelssäkerhet (Efsa) rekommenderar in vivo-kometanalysen som ett lämpligt uppföljningstest för att undersöka relevansen av ett positivt resultat i ett in vitro-genotoxicitetstest3. År 2014 godkändes en OECD-testriktlinje för analysen av kometen för gnagare, vilket ökade acceptansen för analysen för användning vid regulatorisk testning av genotoxisk potential. Analysen är baserad på den elektroforesiska separationen av avslappnade DNA-loopar och fragment som migrerar från nukleoider i lysed celler. I grund och botten är enstaka celler inbäddade i agaros som har skiktats på mikroskop diabilder. Diabilder sänks sedan ned i lysbuffert följt av en alkalisk (pH > 13) lösning, vilket gör att tätt lindade kärn-DNA att slappna av och varva ner. Diabilder placeras sedan i ett elektriskt fält, vilket stimulerar migration av negativt laddade DNA mot anoden, vilket skapar bilder som liknar kometer; Den relativa mängden DNA i kometsvansen jämfört med komethuvudet står direkt i proportion till mängden DNA-skador. DNA-innehåll i svansen kvantifieras vanligtvis med hjälp av digital bildbehandlingsprogram.
Eftersom kometanalysen detekterar fragmenterat DNA kan korrekt kvantifiering av exponeringsinducerad DNA-skada blandas ihop genom kromatinfragmentering som är associerad med nekros eller apoptos till följd av behandlingsinducerad cytotoxicitet eller stress. Dessutom kan DNA-skador uppstå till följd av mekanisk klippning eller felaktig provbearbetning4. Vikten av att bibehålla skördad vävnad kyld före glidpreparering för att minimera baslinjen nivån av DNA-skador har tidigare visat5,6. Många laboratorier förbereda kometanalys diabilder från färsk vävnad; Detta kan dock vara logistiskt utmanande när man förbereder bilder från flera vävnadstyper per djur i en studie med ett stort antal djur. Dessutom utgör detta ett problem när bildberedning och analys ska ske på ett avlägset laboratorium, vilket kräver transport av prover. Till exempel innehåller US National Toxicology Program kometanalys som en del av dess genetiska toxikologiska testprogram (https://ntp.niehs.nih.gov/testing/types/genetic/index.html) och ibland innehåller analysen i 28 eller 90 dagars studier upprepad dos toxicitet; Detta kräver vävnadsinsamling genom in-life-laboratoriet och överföring av prover till ett annat laboratorium för analys. För att åstadkomma detta hackas vävnadsbitar och/eller epitelceller i mag-tarmkanalen skrapas och cellulära suspensioner är flashfrysta och lagras i en frys för efterföljande transport och lagring av det mottagande laboratoriet fram till analys7. Korrekt hantering av prover är avgörande för att få högkvalitativa data med hjälp av fryst vävnad. Reproducerbar manipulering av vävnadsprover under obduktioner som utförs av ständigt föränderlig personal är dock svår att kontrollera, särskilt vid livförsäkringslaboratorier som inte rutinmässigt skördar vävnader för kometanalysen. Repetitionsutbildning av obduktionspersonal eller användning av en mobil enhet bemannad av erfaren laboratoriepersonal för att samla in färska eller frysta vävnadsprover är ofta för dyr, inte genomförbar eller helt enkelt undervärderad.
För att bättre säkerställa konsekvent generering av högkvalitativa vävnadsprover för överföring till en avlägsen plats för kometanalysanalys undersöktes nyttan av en publicerad metod6 för vävnadskonservering från flashfrysta kuber av vävnad. I denna metod lastas frysta kuber av vävnad i en rostfri vävnadsfärsapparat(figur 1)som placeras i ett mikrocentrifugrör som innehåller kallbuffert. Kuben av vävnad trycks sedan genom en liten mätare mesh i slutet av enheten. Upprepade gånger tvingar vävnad suspension genom mesh sikten i båda riktningarna flera gånger resulterar i en relativt enhetlig encellig suspension. Prover som bereds med denna metod jämfördes positivt i kvalitet med både färska och frysta vävnadsprover som bereds genom malning. Som en extra fördel, till skillnad från malet prover, vävnad kuber kan lagras fryst under längre tidsperioder och fortfarande ger hög kvalitet resultat i kometen analysen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Vävnader skördades under genomförandet av studier som utförts vid AAALAC-ackrediterade anläggningar vid NTP-kontraktslaboratorier i enlighet med god laboratoriesed (21 CFR Del 58) och protokoll för användning av djur som godkänts av det institutionella djuret vård- och användningskommittén (IACUC) vid varje laboratorium.
1. Vävnadsskörd och bearbetning
OBS: Det är användbart att bereda dubbla provrör (t.ex. lever) eller överföra ungefär hälften av ett prov till ett annat förvaringsrör (t.ex. tolvfingertarmen, magen) för att möjliggöra nyanalys vid behov. För att minimera eventuell variation mellan prov och prov för tarmvävnader rekommenderas att man tar hand om samma vävnadsregion i förhållande till magen för varje djur, och ett prov delas upp för att generera dubbla prover. Plast pincett rekommenderas för överföring av klibbiga vävnader såsom hjärnan. Som tillval kan malet, skrapat eller homogeniserat vävnadspreparat filtreras för att uppnå homogena single cell-suspensioner med hjälp av en 40 μm cellsil som är fäst vid ett koniskt rör.
- Ta bort alla bifogade anslutande vävnader, organ och skräp från organ (er) av intresse. Omedelbart efter avlägsnande, swish orgel kraftigt i en medelstor våg båt som innehåller ~ 7 ml kall nyberedd malningslösning (Mg++, Ca++ och fenol rödfri Hank's Balanced Salt Solution, 10% v / v DMSO, och 20 mM EDTA pH 7,5) för att ta bort kvarvarande blod och skräp.
- Överför varje organ till en annan ren väg båt som innehåller tillräcklig (~ 7 ml) kall malningslösning för att bibehålla vävnaden under vatten, på is, tills vidare bearbetning.
- Ta bort en del av varje organ av intresse och placera den i en inbäddning kassett. Fix i 10% neutral buffrad formalin, trim och paraffin bädda in enligt laboratoriets standardförfaranden för eventuella framtida histopathology utvärdering.
- För levern, skär en 5 mm längsgående del av den vänstra loben och försiktigt swish i ~ 7 ml kall malningslösning. Placera vävnadsremsan i en ren medelstor vågbåt som innehåller ~7 ml kallfäringslösning och håll den på is tills den är redo att bearbetas ytterligare (steg 1.8 eller 1.11).
- För tolvfingertarmen, skär en 10 mm del av tolvfingertarmen proximala till magen. Med en 21–25 G-nål, spola för att avlägsna skräp och bakterier.
- För in nålen i ena änden av tolvfingertarmen och spola med 1 ml kallfäringslösning.
- Spola åt andra hållet genom att vända tolvfingertarmen över och upprepa med ytterligare 1 ml malningslösning. Kasta nålen.
- Skiva tolvfingertarmen öppna och skölj den i ~7 ml malningslösning innan du lägger den i en medelstor vågbåt som innehåller ~7 ml ren malningslösning; behålla på is tills de är redo att bearbetas ytterligare (steg 1.8 eller 1.11).
- För hjärnan kan det vara användbart att först dela upp hjärnan i två halvklot; en halvklot kan sparas för eventuell histopatologi (se steg 1.2).
- Dissekera hjärnans region (er) av intresse och försiktigt swish i ~ 7 ml kall malning lösning.
- Överför vävnader till en ren medelstor vågbåt som innehåller ~7 ml kallfärslösning och underhåll på is tills de är redo att bearbeta ytterligare (steg 1.8 eller 1.11; observera att små regioner som lillhjärnan och hippocampus kanske inte kräver någon ytterligare trimning).
- För magen
- Ta bort och kassera skogsomachen. Skär upp körtelmagen och tvätta fritt från mat med ~ 7 ml kall malningsbuffert i en medelstor vågbåt.
- Ta bort en 5 mm remsa av glandular magen proximala till tolvfingertarmen för fixering för eventuell histopathology utvärdering (se steg 1.2).
- Placera den återstående magen i ~7 ml kallfäringsbuffert i en medelstor vågbåt och inkubera på is i 15–30 min.
OBS: Detta inkubationssteg kanske inte är nödvändigt. detta steg ingick i JaCVAM-valideringsprotokollet, men nämns inte i OECD:s testriktlinje8,9. - Överför magen till en ren bit paraffin (eller petriskål eller väga båt) och skrapa försiktigt ytan epitel två eller flera gånger med hjälp av en skalpell blad eller en polytetrafluoreten (PTFE) skrapa för att ta bort skräp. Plocka upp magslemhinnan med pincett och skölj med 1 ml kall malningsbuffert med hjälp av en pipet. Överför magvävnaden till en ren yta eller maträtt.
- Skrapa försiktigt magepitelet 4–5 gånger (mer, om nödvändigt) i malningslösning (vanligtvis 250 μL/mus eller 500-1 000 μL/råtta) med baksidan av ett skalpelelblad eller PTFE-skrapa för att frigöra cellerna. Alternativt, skölj vävnad med en ungefär lika stor mängd malningslösning för att återställa fler celler. Samla upp malningslösningen som innehåller utsläppta celler med hjälp av en pipet och överför till ett mikrocentrifugrör på is.
- För malning av vävnadsprover, skär en 3–4 mm sektion av lever- eller hjärnvävnaden eller ~5 mm tolvfingertarmen och överför till ett märkt 1,5 eller 2,0 ml mikrocentrifugrör som innehåller 1 ml kallfäringslösning. Färs snabbt (≤30 s) med hacka sax tills den är fint spridd, samtidigt som provet är kallt. Provet ska se något grumligt ut. Det är dock vanligt att vissa bitar att förbli som kommer att bosätta sig till botten av röret.
- För att använda vävnaden färsk, underhålla rör som innehåller hackad vävnad eller skrapade epitelceller på is; använda vävnaden för att förbereda kometglas inom cirka 1 h skörd (beskrivs i avsnitt 2).
- För frysning av vävnadsproverna, omedelbart efter malning eller insamling av skrapade epitelceller
- Säkra rörlocket och släpp röret i en Dewar kolv som innehåller flytande kväve; rör kan hållas i flytande kväve under den tid som obduktionen (≤3 h).
- Hämta rör med en slev och placera på torris för att sortera. Överför rör till en fryslåda på torris och förvara kartong i en -80 °C frys.
- För att förbereda frysta kuber av vävnad, skär flera små bitar av vävnad (≤4 mm i diameter och ~6 mm i längd; Bild 1).
- Släpp dem individuellt direkt i en medelstor vågbåt eller annat lämpligt kärl som innehåller flytande kväve.
- Vänta några sekunder för bitarna att frysa helt och överföra enskilda frysta vävnadskuber till en märkt microcentrifug rör eller cryotube underhålls på torris; låt inte bitarna klumpa ihop sig under frysningsprocessen.
- Överför rör till en fryslåda på torris och förvara kartong i en -80 °C frys.
2. Skjut Förberedelser
-
För hackad/skrapad vävnad
- Underhåll rör som innehåller färska vävnader på våt is.
- Placera rör av frusen vävnad i ett vattenbad i rumstemperatur tills proverna är helt upptinad, samtidigt som de hålls kalla. Överför omedelbart rören till is.
- Omedelbart innan celler tas ut för överföring till agaros (steg 2.3), blanda varje cellfjädring försiktigt. för icke-filtrerade prover, låt stora bitar bosätta sig till botten av röret. Behåll alla rör på is tills rutschbanor har förberetts för alla prover.
-
För kubikvävnad
- Hämta rör som innehåller vävnadskuber från 80 °C-frysen och behåll på torris tills glidberedningen.
- Alikvot 1 ml köpmansmedium (0,14 M NaCl, 1,47 mM KH2PO4,2,7 mM KCl, 8,1 mM Na2HPO4,10 mM NaEDTA, pH 7.4) eller malningslösning till ett märkt 1,7 ml mikrorifcentrifugeringsrör för varje prov och underhåll på is.
- Arbeta snabbt för att undvika vävnadupptining, placera en kub av vävnad i den öppna änden av en rumstemperatur vävnadsdådningsanordning (figur 1). Flera vävnadsbitar kan användas; Vid behov kan den frusna vävnaden skäras eller knäckas i mindre bitar med hjälp av en kall mortel och mortelstöt för att minska kubens storlek för att passa in i enheten.
- Sätt snabbt in en storleksanpassad sprutkolv i enheten för att driva vävnaden till nätänden som sedan ska placeras i mikrocentrifugröret som innehåller kallfärslösning. undvika att tvinga vätskan att svämma över röret. Sänk ned enhetens nätände i ca 5–10 s i den kalla malningslösningen så att vävnaden kan tina helt.
- Tryck helt ner kolven tills cellerna ses extrudera genom nätporna. Dra sedan upp kolven ca 2,5 cm och tryck ner igen helt; upprepa processen flera gånger tills malningslösningen blir grumlig.
- Vid behov kan provet koncentreras för att öka celltätheten genom kyld centrifugering i 5 min vid 1100 varv/min och avlägsnande av en del av supernatanten.
- Upprepa processen för alla prover med hjälp av en ren vävnadsfräsningsanordning för varje prov.
- Överför 50 μl cellfjädring till ett rör som innehåller 450 μL av 0,5 % låg smältpunkt agatrose vid 37 °C.
OBS: Volymerna kan justeras, men mängden agaros bör vara ≤1%. - Förbered och betygsbilder enligt beskrivningen tidigare10,11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Studie 1
Levern skördades från två kohorter av hane Sprague Dawley råttor administreras majsolja för 4 dagar, förskjutna med en vecka. Diabilder var beredda från nyfärad vävnad, fryst hackad vävnad och fryst kubikvävnad bearbetas i Merchants medium eller malning lösning med hjälp av vävnadsfärsning enheten. Frysta vävnader från djur från den första kohorten utvärderades efter fryslagring i ~3,5 månader. Frysta vävnader som erhållits från djur från den andra kohorten utvärderades efter lagring i ~ 6 månader. Kometer som uppvisar den karakteristiska morfologin "igelkott", som tyder på kraftigt skadade celler (av osäker etiologi som kan innefatta cytotoxicitet eller mekanisk påfrestning), ingick inte i poängsättningen av % svans-DNA. Andelen igelkottar, som identifierades enbart vid visuell inspektion av morfologi, tabellulerades separat enligt OECD TG 4899. De genomsnittliga % svans-DNA-resultaten för djuren i de två kohorterna (baserade på poängsättning av 100 celler/djur) sammanfattas i figur 2A. Alla metoder med frusen vävnad producerade värden högre, men inte alltid statistiskt annorlunda, än färsk vävnad. Med tanke på att den rekommenderade övre gränsen för % svans-DNA hos färsk råttlever är 6%9,visar dessa resultat att någon av dessa metoder kan fungera bra för att utvärdera fryst vävnad. Malningslösning utförs minst lika bra som Merchant's medium; eftersom det senare är mer tidskrävande att förbereda, valdes malningslösning för efterföljande studier. Det fanns inga statistiskt signifikanta skillnader i skador i vävnader från den andra djurkohorten som hade lagrats fryst i ~ 6 månader före bearbetning jämfört med vävnader från den första kohorten bearbetas efter ~ 3,5 månaders lagring. Totalt sett parallellerade % igelkottar % svans-DNA, även om % igelkottar i de frysta vävnaderna i förhållande till färsk vävnad var mer varierande än för % svans-DNA (figur 2B). Värdena för dessa effektmått i den friska vävnaden ger en baslinje mot vilken DNA-skador som artefaktiskt införs genom frysningsmetoderna kan mätas.
Studie 2
Honhöna-möss från B6C3F1 administrerades normal koksaltlösning eller mutagen, etylmetansulfonat (EMS) vid 200 mg/kg/dag i normal koksaltlösning i tre dagar. Vävnaden skördades 3 h efter den slutliga dosen administrering och bearbetas färska i kometanalysen. Ytterligare vävnad var blixt fryst efter att ha malet i malning lösning eller samlas som kuber. Kubikprover bearbetades därefter i malningslösning med siktanordningen omedelbart före beredningen av kometrutschbanor. På antagandet att celler som uppvisar igelkott morfologi representerar celler i den övre delen av kontinuum av kemisk-inducerad DNA-skada, igelkottar scorable av bildframställning programvara ingick i den automatiserade scoring av % svans DNA. % svans-DNA-resultat (baserat på poängsättning 150 celler/djur) sammanfattas i figur 3. Levervävnad fryst som kuber och därefter bearbetas med hjälp av vävnadsfärsningsanordningen gav resultat som var mycket lika dem som erhållits för nyfärad vävnad. Dna-värdena i % svans var något högre för den frysta malda vävnaden, men basvärdena för den frysta malda vävnaden var under 6 %, vilket rekommenderas för färsk råttlever i OECD:s testriktlinje för kometanalys9. En statistiskt signifikant ökning av EMS-inducerad DNA-skada mättes i vävnadsprover som bearbetats med alla tre metoderna.
Studie 3
Delar av levervävnad som samlats in från kvinnliga B6C3F1 möss i en 90 dagars toxicitet studie av en testkemikalie som utförs av ett avlägset laboratorium maldes eller skärs i kuber, blixt fryst, och levereras över natten på torris till detta laboratorium för analys. Mald vävnad analyserades efter ~ 2 månaders fryslagring (figur 4). Celler som vid visuell inspektion visade sig vara igelkottar men som kunde koras av bildtagningsprogrammet ingick i % svans-DNA-mätningar (150 celler som fick/djur). Antalet igelkottar (oavsett om de är scorable eller nonscorable) identifieras enbart vid okulärbesiktning av morfologi i totalt 150 celler / djur var tabulated separat för att ge information om frekvensen av dessa mycket skadade celler. Totalt sett var DNA-skadan (mätt som % svans-DNA) i fryst mald vävnad hög i alla dosgrupper med betydande variation mellan djur och djur, även i fordonskontrollgruppen. Dna-resultaten i %svans korrelerade med % igelkottar (identifierade enbart på grundval av morfologi), vilket tyder på att igelkottar i hög grad bidrog till den höga nivå av DNA-skador som observerades i dessa prover. Baserat på den höga bakgrundsnivån av DNA-skador mätt i den malda vävnaden analyserades frusen kubikvävnad efter ~22 månaders lagring (figur 4). Både DNA-skador och % igelkottar var mycket låga i blixtfryst kubikvävnad som hade utarbetats parallellt med de malet vävnadsproverna. De mycket skadade cellerna som reflekterades av igelkottsmorfologin i de malet vävnadsproverna var således uppenbarligen inte resultatet av en biologisk process, utan introducerades sannolikt genom mekaniska störningar och/eller vävnadsuppvärmning under malningsförfarandet innan de blixtfrysdes. dessa uppgifter ansågs vara otillförlitliga. Lyckligtvis gav analysen av frusen kubikvävnad ett tydligt resultat, nämligen bristen på dna-skador i levern hos kvinnliga möss efter tre månaders exponering för testkemikalien. De resultat som lämnats av denna fallstudie exemplifierar risken i samband med beredning av malda vävnader av en relativt oerfaren laboratorium och visa nyttan av frysta kubik vävnad metod för att kringgå detta problem.
Figur 1: Vävnadsfärsningsanordning och kolv som används för att förbereda en enda cellfjädring från frusen vävnad. Prototypen anordning (4,5 mm innerdiameter, 0,4 mm maskstorlek) var vänligt tillhandahålls av Dr Gunnar Brunborg (NorGenotech, Oslo, Norge). Panelen till höger ger ett exempel på en lämplig storlek kub av vävnad för användning med enheten. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Jämförelse av DNA-skador mätt i färska och frysta malet och homogeniserat tivlarprover på mus. Levern skördades från två förskjutna kohorter (n = 5/grupp/kohort) av hanråttor med Sprague Dawley som administrerats majsolja i 4 dagar. Diabilder var beredda från nyfärad vävnad, fryst hackad vävnad och fryst kubikvävnad bearbetas i Merchants medium eller malning lösning med hjälp av vävnadsfärsning enheten. Frysta vävnader analyserades ~ 3,5 och 6 månader efter obduktion för kohorter 1 och 2, respektive. Kometer som klassificerats som igelkottar baserade på morfologi ingick inte i poängsättningen av % svans-DNA. (A)Kohort medelvärde % svans DNA-resultat. (B)Kohort medelvärde % igelkott resultat. Felstaplar återspeglar standardavvikelsen. Statistiska analyser gjordes för att jämföra frysta vävnader med färsk vävnad för varje kohort och för att jämföra resultaten mellan de två kohorterna för varje vävnadsberedningsmetod. *Statistiskt annorlunda (p < 0,05) från färsk hackad vävnad inom samma kohort med hjälp av Students t-test; #statistically olika (p < 0.05) från färsk hackad vävnad inom samma kohort med mann-whitney-testet för icke-normalt distribuerade data. ¥ statistisk skillnad(p < 0,05) mellan kohorter med hjälp av Students t-test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Jämförelse av DNA-skador som orsakas av EMS i levervävnad som bearbetas av olika förfaranden. Genomsnittligt % svans-DNA för hondjur B6C3F1 möss administreras fordonet eller 200 mg/kg / dag EMS i tre dagar (n = 5/grupp). Lever skördades 3 h efter den slutliga dosen administrering och bearbetas färska i kometanalysen. Ytterligare levervävnad var blixt fryst efter att ha malets i malning lösning eller samlas som kuber; kubikprover homogeniserades med hjälp av vävnadsfärsapparaten omedelbart före beredningen av kometrutschbanor. För att säkerställa celler i den övre delen av kontinuum av EMS-inducerad DNA-skada inte uteslöts från analysen, kometer som vid visuell inspektion tycktes uppfylla den morfologiska beskrivningen av igelkottar men befanns vara scorable av bildframställning programvara ingick. Felstaplar återspeglar standardavvikelsen. En students t-test användes för att jämföra mängden DNA-skador hos djur som exponerats för EMS och den i fordonets kontrolldjur för varje provberedningsmetod. * Statistiskt signifikant ökning vid p < 0,05. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 4. Fallstudie som visar nyttan av fryst kubmetod och högkvalitativa data som erhållits efter långvarig lagring. Delar av levervävnad som samlats in från hondjurs-B6C3F1-möss som exponerades för olika koncentrationer av en testkemikalie i ~90 dagar (n = 5/grupp) maldes eller skars i tärningskuber och blixtfrysdes vid det livsbebyggda laboratoriet och transporterades därefter till detta laboratorium för analys. Mald vävnad analyserades efter ~ 2 månaders lagring; på grund av den dåliga kvaliteten på data, frysta kubikvävnad analyserades därefter efter ~ 22 månaders lagring. För att säkerställa celler i den övre delen av kontinuum av kemisk-inducerad DNA-skada inte uteslöts från analysen, data från scorable celler som, vid visuell inspektion verkade vara igelkottar, ingick. (A)Grupp medelvärdet % svans DNA-resultat. Jämfört med hackad vävnad erhölls högkvalitativa resultat från frusen kubikvävnad, även efter långvarig lagring. b)Gruppmedelvärdet % igelkottsresultat. Dålig malningsteknik framgår av den omfattande icke-biologiska DNA-skada som observerats som igelkottsten i de maleta vävnadsproverna. Felstaplar återspeglar standardavvikelsen. En ANOVA med Dunnetts test användes för att utvärdera för ett positivt svar på testkemikalien för varje provberedningsmetod. Det fanns inga statistiskt signifikanta (p < 0,05) dosgrupper som upptäcktes för någon av metoderna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: DNA-skador vid baslinjen mätt i frusna råttahjärnvävnader. Kometanalysresultat tillhandahålls för frysta malda eller kubikvävnader som representerar flera olika regioner i hjärnan hos han- och honråttor. Data (som genereras av inklusive scorable igelkottar kometer) sammanställdes över flera studier; n = totalt antal hjärnvävnader som utvärderats för varje provberedningsmetod. Felstaplar återspeglar standardavvikelsen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Som visat tidigare7,12,13, korrekt hanteras blixt fryst hackad vävnad ger goda resultat i kometen analysen. Faktum är att dna-värden för svansen i svansen vid baslinjen för fryst hackad råtta- och råttalever som framställs i vårt laboratorium är vanligtvis ≤6 %, vilket rekommenderas i OECD:s testriktlinje9 för nyligen malda råttleverprover. Goda resultat har erhållits av flera laboratorier med hjälp av en mängd olika vävnadstyper som har malets och lagrats frysta; På samma sätt har flash frysta epitelceller som skrapats från organ i mag-tarmkanalen använts framgångsrikt i kometanalysen7,,12,13,14. Fryst hackad/skrapad vävnad verkar vara relativt stabil i minst flera månader. Den metod som använder homogenisering av flash frysta kuber av lever med hjälp av en vävnadsfärsningsanordning som ursprungligen beskrevs av Jackson et al.6, ger resultat i kometanalysen åtminstone jämförbar och vanligtvis bättre (dvs. lägre baslinjenivåer av DNA-skador) än de som erhålls för fryst hackad lever. Denna metod är också tillämplig på andra vävnadstyper6. enligt vår erfarenhet har utmärkta resultat på liknande sätt erhållits med frysta kubikdufingertarmen (data som inte visas) och hjärnvävnad (figur 5). Siktanordningen får dock inte vara mottaglig för homogenisering av alla vävnadstyper. I en pilotstudie fann vi att muskelmassa inte lätt kunde tvingas genom siktenheten, vilket resulterar i dålig cellåterhämtning; I stället gav malning av vävnaden omedelbart efter upptining cellupphängningar med DNA-värden i svansen vid baslinjen som är jämförbara med dem som malets före blixtfrysning (data visas inte). Särskilt när den hanteras på rätt sätt under obduktion (dvs. hålls kall och fuktig, blixtfrusen som enskilda delar och inte får delvis tina), har blixtfryst kubikvävnad gett mycket låg DNA-skada vid baslinjen även efter cirka två års fryslagring (figur 4).
Användning av antingen frysta cell suspensioner eller kubikvävnad i kometen analysen erbjuder flera fördelar jämfört med färsk vävnad inklusive: 1) underlättande av samtidig insamling av flera vävnadstyper för kometanalys; 2) underlättande av vävnadsinsamling vid ett in-life laboratorium och överföring av prover till ett annat laboratorium för analys; 3) bekvämlighet att skjuta upp ett beslut att analysera en viss vävnad i månader. Även om homogeniseringen av fryst vävnad vid tidpunkten för bildberedningen är mer besvärlig än malning av färsk vävnad vid tidpunkten för skörden, erbjuder användningen av fryst kubikvävnad flera ytterligare fördelar som omfattar: 1) inget krav för personal som utbildats i kometanalysen (t.ex. mobil enhet) eller specialiserade förnödenheter/reagenser vid obduktion; 2) Mindre möjligheter till tekniska fel (t.ex. provuppvärmning, otillräcklig utsläpp av celler, suboptimal vävnadsprovstorlek) under obduktionen. 3) minimal möjlighet att införa mekaniska DNA-skador under provbearbetning (t.ex. skjuven). och 4) DNA-skador vid låga baslinjer, även efter långvarig förvaring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Detta arbete stöddes av Intramural Research Program vid NIH, National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) enligt kontrakt HHSN273201300009C; De uttalanden, åsikter eller slutsatser som finns där representerar dock inte nödvändigtvis NIEHS, NIH:s, NIH:s eller USA:s regerings uttalanden, åsikter eller slutsatser.
Acknowledgments
Författarna står i skuld till Lincoln Martin och Kelley Owens för expert tekniskt bistånd förbereda och scoring komet diabilder och Dr Carol Swartz för att utföra statistiska analyser. Författarna erkänner också stödjande bidrag från medlemmar av genetisk toxikologi, undersökande toxikologi och obduktion program på ILS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryovials | Corning Costar | 430488 | |
| Dental Wax Sheets | Electron Microscopy Sciences | 72670 | |
| Dissecting (Mincing) Micro Scissors | Fisher Scientific | 08-953-1B | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Gibco | 14175-079 | |
| KCl | Teknova | P0315-10 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Low Melting Point Agarose | Lonza | 50081 | |
| Microfuge Tubes (1.7 mL) | Corning | 3207 | |
| Na2EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | |
| Neutral Buffered Formalin | Leica | 600 | |
| Scalpel Blades | Miltex | 4-110 | |
| Syringe Plunger (1 mL) | Fisher Scientific or Vitality Medical | 14-826-88; 8881901014 | Becton Dickinson or Monoject tuberculin syringe |
| Tissue Mincing Device | NorGenoTech (Oslo, Norway) | None | Small variability in diameter observed which can affect snuggness of plunger. |
| Tweezers, plastic | Trade Winds Direct | DF8088N | Reinforced nylon, nonsterile, blunt tip, autoclavable; tradewindsdirect.com |
| Weigh Boats | Krackler Scientific/Heathrow Scientific | 6290-14251B |
References
- van der Leede, B. J., et al. Performance and data interpretation of the in vivo comet assay in pharmaceutical industry: EFPIA survey results. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 775-776, 81-88 (2014).
- ICH. International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH) S2(R1): Guidance on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended for Human Use. ICH. , (2012).
- EFSA. Scientific opinion on genotoxicity testing strategies applicable to food and feed safety assessment. EFSA Journal. 9 (9), 2379 (2011).
- Lorenzo, Y., Costa, S., Collins, A. R., Azqueta, A. The comet assay, DNA damage, DNA repair and cytotoxicity: hedgehogs are not always dead. Mutagenesis. 28 (4), 427-432 (2013).
- Guerard, M., Marchand, C., Plappert-Helbig, U. Influence of experimental conditions on data variability in the liver comet assay. Environmental and Molecular Mutagenesis. 55 (2), 114-121 (2014).
- Jackson, P., et al. Validation of freezing tissues and cells for analysis of DNA strand break levels by comet assay. Mutagenesis. 28 (6), 699-707 (2013).
- Recio, L., Kissling, G. E., Hobbs, C. A., Witt, K. L. Comparison of Comet assay dose-response for ethyl methanesulfonate using freshly prepared versus cryopreserved tissues. Environmental and Molecular Mutagenesis. 53 (2), 101-113 (2012).
- Uno, Y., et al. JaCVAM-organized international validation study of the in vivo rodent alkaline comet assay for detection of genotoxic carcinogens: II. Summary of definitive validation study results. Mutation Research/Genetetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 786-788, 45-76 (2015).
- OECD. OECD Guideline for the Testing of Chemicals: In Vivo Mammalian Alkaline Comet Assay. OECD. 489, (2016).
- Hobbs, C. A., et al. Comet assay evaluation of six chemicals of known genotoxic potential in rats. Mutation Research/Genetetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 786-788, 172-181 (2015).
- Ding, W., Bishop, M. E., Lyn-Cook, L. E., Davis, K. J., Manjanatha, M. G. In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver. Journal of Visualized Experiments. (111), 53833 (2016).
- Hobbs, C. A., Chhabra, R. S., Recio, L., Streicker, M., Witt, K. L. Genotoxicity of styrene-acrylonitrile trimer in brain, liver, and blood cells of weanling F344 rats. Environmental and Molecular Mutagenesis. 53 (3), 227-238 (2012).
- Hobbs, C. A., et al. Comprehensive evaluation of the flavonol anti-oxidants, alpha-glycosyl isoquercitrin and isoquercitrin, for genotoxic potential. Food and Chemical Toxicology. 113, 218-227 (2018).
- Pant, K., et al. Vehicle and positive control values from the in vivo rodent comet assay and biomonitoring studies using human lymphocytes: historical database and influence of technical aspects. Environmental and Molecular Mutagenesis. 55 (8), 633-642 (2014).
