Summary
Dit protocol beschrijft verschillende procedures voor het voorbereiden van hoogwaardige bevroren weefselmonsters op het moment van obductie voor gebruik in de komeettest om DNA-schade te beoordelen: 1) gehakt weefsel, 2) geschraapte epitheelcellen uit het maag-darmkanaal en 3) in blokjes gelopen weefsel monsters, die homogenisatie vereisen met behulp van een weefselhakkende apparaat.
Abstract
De komeettest wint aan populariteit als middel om DNA-schade in gekweekte cellen en weefsels te beoordelen, met name na blootstelling aan chemicaliën of andere milieustressoren. Het gebruik van de komeettest bij regelgevingstests op genotoxische mogelijkheden bij knaagdieren is in 2014 ingegeven door de goedkeuring van een testrichtlijn van de Organisatie voor Economische Samenwerking en Ontwikkeling (OESO). Komeettestdia's worden meestal bereid uit vers weefsel op het moment van obductie; echter, bevriezing weefsel monsters kunnen voorkomen dat logistieke uitdagingen in verband met gelijktijdige voorbereiding van dia's van meerdere organen per dier en van veel dieren per studie. Het invriezen maakt het ook mogelijk om monsters van de blootstellingsfaciliteit naar een ander laboratorium te verzenden voor analyse, en de opslag van bevroren weefsel vergemakkelijkt het uitstellen van een beslissing om DNA-schadegegevens voor een bepaald orgaan te genereren. De alkalische komeettest is nuttig voor het detecteren van blootstelling-gerelateerde DNA dubbele en single-streng pauzes, alkali-labiele laesies, en streng breekt geassocieerd met onvolledige DNA excisie reparatie. Echter, DNA-schade kan ook het gevolg zijn van mechanische scheren of onjuiste monster verwerking procedures, verstoren de resultaten van de test. Reproduceerbaarheid bij het verzamelen en verwerken van weefselmonsters tijdens de obductie kan moeilijk te controleren zijn als gevolg van fluctuerend laboratoriumpersoneel met wisselende ervaring in het oogsten van weefsels voor de komeettest. Het verbeteren van de consistentie door bijscholing of inzet van mobiele eenheden met ervaren laboratoriumpersoneel is kostbaar en mogelijk niet altijd haalbaar. Om consistente generatie van hoogwaardige monsters voor komeettestanalyse te optimaliseren, werd een methode geëvalueerd voor het homogeniseren van flash diepgevroren kubussen van weefsel met behulp van een aangepast weefselsnijdend apparaat. Monsters die met deze methode voor de komeettest zijn bereid, vergeleken in kwaliteit gunstig in kwaliteit met verse en bevroren weefselmonsters die tijdens de obductie worden geprikt. Bovendien werd een lage DNA-schade bij de uitgangswaarde gemeten in cellen van bevroren kubussen van weefsel na langdurige opslag.
Introduction
De komeettest wordt steeds vaker gebruikt als middel om DNA-schade te evalueren in gekweekte cellen en weefsels die worden blootgesteld aan chemicaliën of andere milieustressoren1. De test kan detecteren DNA dubbele- en single-streng pauzes, alkali-galiele laesies, en single-streng pauzes geassocieerd met onvolledige DNA-reparatie. De richtsnoer van de Internationale Raad voor harmonisatie van de technische voorschriften voor farmaceutische producten voor menselijk gebruik (ICH) beveelt een DNA-strengbreuk zoals de komeettest aan als een tweede test ter aanvulling van de micronucleustest van knaagdieren voor de beoordeling van in vivo genotoxiciteit en als vervolgtest voor de beoordeling van de werkingswijze in doelorganen van tumorinductie2. De Europese Autoriteit voor voedselveiligheid (EFSA) beveelt de in vivo komeettest aan als een geschikte follow-uptest om de relevantie van een positief resultaat in een in vitro genotoxiciteitstest te onderzoeken3. In 2014 werd een OESO-testrichtlijn goedgekeurd voor de test van de knaagdierkomeet, waardoor de aanvaardbaarheid van de test voor gebruik bij het testen van genotoxische stoffen in de regelgeving werd verhoogd. De test is gebaseerd op de elektroforetische scheiding van ontspannen DNA-lussen en fragmenten die migreren uit nucleoids van lysed cellen. Kortom, enkele cellen zijn ingebed in agarose die is gelaagd op microscoop dia's. Dia's worden vervolgens ondergedompeld in lysis buffer gevolgd door een alkalische (pH > 13) oplossing, die het mogelijk maakt de strak opgerolde nucleaire DNA te ontspannen en te ontspannen. Dia's worden dan geplaatst in een elektrisch veld, dat migratie van negatief geladen DNA naar de anode stimuleert, waardoor beelden ontstaan die lijken op kometen; de relatieve hoeveelheid DNA in de komeetstaart in vergelijking met de komeetkop is rechtstreeks evenredig met de hoeveelheid DNA-schade; DNA-inhoud in de staart wordt meestal gekwantificeerd met behulp van digitale imaging software.
Omdat de komeettest gefragmenteerd DNA detecteert, kan nauwkeurige kwantificering van door blootstelling veroorzaakte DNA-schade worden verward met chromatinefragmentatie geassocieerd met necrose of apoptose als gevolg van door de behandeling veroorzaakte cytotoxiciteit of stress. Bovendien kan DNA-schade optreden als gevolg van mechanische afschuiaal of onjuiste monsterverwerking4. Het belang van het behoud van geoogst weefsel gekoeld voorafgaand aan dia voorbereiding om de basislijn niveau van DNA-schade te minimaliseren is eerder aangetoond5,6. Vele laboratoria bereiden komeettestdia's van vers weefsel; Dit kan echter logistiek uitdagend zijn bij het voorbereiden van dia's van meerdere weefseltypen per dier in een studie met een groot aantal dieren. Bovendien vormt dit een probleem wanneer diavoorbereiding en -analyse zich in een extern laboratorium moeten voordoen, waardoor de verzending van monsters noodzakelijk is. Bijvoorbeeld, het Amerikaanse National Toxicology Program bevat de komeet test als onderdeel van haar genetische toxicologie testen programma (https://ntp.niehs.nih.gov/testing/types/genetic/index.html) en soms bevat de test in 28 of 90 dagen herhalen dosis toxiciteit studies; dit vereist het verzamelen van weefsel door het in-life laboratorium en de overdracht van monsters naar een ander laboratorium voor analyse. Om dit te bereiken, worden weefselstukken gehakt, en/of epitheelcellen van het maag-darmkanaal worden geschraapt en cellulaire suspensuspensie worden flash bevroren en opgeslagen in een vriezer voor latere verzending en opslag door het ontvangende laboratorium tot analyse7. Een goede behandeling van monsters is van cruciaal belang voor het verkrijgen van gegevens van hoge kwaliteit met behulp van bevroren weefsel; echter, reproduceerbare manipulatie van weefselmonsters tijdens necropsies uitgevoerd door steeds veranderende personeel is moeilijk te controleren, vooral bij in-life laboratoria die niet routinematig oogsten weefsels voor de komeet test. Opfristraining van obductiepersoneel of het gebruik van een mobiele eenheid die wordt bemand door ervaren laboratoriumpersoneel om verse of bevroren weefselmonsters te verzamelen, is vaak te duur, niet haalbaar of gewoon ondergewaardeerd.
Om een consistente generatie van hoogwaardige weefselmonsters beter te garanderen voor overdracht naar een afgelegen locatie voor comettestanalyse, werd het nut van een gepubliceerde methode6 van weefselbehoud van vlambevroren kubussen van weefsel onderzocht. Bij deze methode worden bevroren blokjes weefsel geladen in een roestvrijstalen weefselverwikringsapparaat (figuur 1) dat in een microcentrifugebuis met koude buffer wordt geplaatst. De kubus van weefsel wordt vervolgens geduwd door een kleine meter gaas aan het einde van het apparaat. Herhaaldelijk dwingen van het weefsel suspensie door de mesh zeef in beide richtingen meerdere malen resulteert in een relatief uniforme eencellige suspensie. Monsters bereid door deze methode gunstig in kwaliteit vergeleken met zowel verse als bevroren weefsel monsters bereid door hakken. Als bijkomend voordeel, in tegenstelling tot gehakte monsters, kunnen weefselkubussen gedurende langere tijd bevroren worden opgeslagen en nog steeds resultaten van hoge kwaliteit opleveren in de komeettest.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Weefsels werden geoogst tijdens het uitvoeren van studies uitgevoerd in AAALAC-geaccrediteerde faciliteiten in NTP-contractlaboratoria in overeenstemming met de good laboratory practice regelgeving (21 CFR Deel 58) en diergebruik protocollen goedgekeurd door de Institutional Animal Commissie zorg en gebruik (IACUC) in elk laboratorium.
1. Weefseloogst en -verwerking
LET OP: Het is nuttig om dubbele monsterbuizen (bijvoorbeeld lever) voor te bereiden of ongeveer de helft van een monster over te brengen naar een andere opslagbuis (bijvoorbeeld twaalfvingerige darm, maag) om indien nodig een heranalyse mogelijk te maken. Om de potentiële variabiliteit van monster tot monster voor darmkanaalweefsels te minimaliseren, wordt aanbevolen om ervoor te zorgen dat hetzelfde weefselgebied ten opzichte van de maag voor elk dier wordt bemonsterd en een monster wordt verdeeld om dubbele monsters te genereren. Plastic tangen worden aanbevolen voor het overbrengen van kleverige weefsels zoals de hersenen. Als optie kunnen gehakte, geschraapte of gehomogeniseerde weefselpreparaten worden gefilterd om homogene eencellige suspensuspensuspen te bereiken met behulp van een 40 μm celzeef die aan een conische buis is bevestigd.
- Verwijder alle bijgevoegde verbindende weefsel, organen en puin van orgaan (en) van belang. Onmiddellijk na verwijdering, zwiepen het orgel krachtig in een middelgrote weegboot met ~ 7 mL van koude vers bereide snijden oplossing (Mg++, Ca++ en fenol rood-vrije Hank's Balanced Salt Solution, 10% v / v DMSO, en 20 mM EDTA pH 7.5) om restbloed en puin te verwijderen.
- Breng elk orgaan over naar een andere schone weegboot met voldoende (~ 7 mL) koude snijdende oplossing om het weefsel onder water te houden, op ijs, tot verdere verwerking.
- Verwijder een gedeelte van elk orgaan van belang en plaats het in een inbedding scassette. Fix in 10% neutraal gebufferd formaline, trim, en paraffine insluiten volgens de standaard procedures van het laboratorium voor mogelijke toekomstige histopathologie evaluatie.
- Snijd voor de lever een 5 mm lengtegedeelte van de linkerkwab en swish in ~ 7 mL koude snijoplossing. Plaats de strook weefsel in een schone middelgrote weegboot met ~ 7 mL koude snijden oplossing en handhaven op ijs tot klaar om verder te verwerken (stap 1.8 of 1.11).
- Snijd voor de twaalfvingerige darm een 10 mm gedeelte van de twaalfvingerige proximal in de maag. Met behulp van een 21-25 G naald, spoelen om vuil en bacteriën te verwijderen.
- Steek de naald in het ene uiteinde van de twaalfvingerige darm en spoel met 1 mL koude snijdenoplossing.
- Spoel de andere richting door het omdraaien van de twaalfvingerige darm over en herhalen met nog eens 1 mL van het snijden oplossing. Gooi de naald weg.
- Snijd de twaalfvingerige darm open en spoel het in ~ 7 mL van snijoplossing alvorens het in een middelgrote weegboot met ~ 7 mL van schone snijoplossing; op ijs te houden totdat het verder kan worden verwerkt (stap 1.8 of 1.11).
- Voor de hersenen kan het nuttig zijn om de hersenen eerst in twee hemisferen te verdelen; een halfrond kan worden opgeslagen voor mogelijke histopathologie (zie stap 1.2).
- Ontleed de hersenen regio (s) van belang en zachtjes swish in ~ 7 mL van koude snijden oplossing.
- Breng weefsel(en) over naar een schone middelgrote weegboot met ~ 7 mL koude snijoplossing en onderhoud op ijs totdat het klaar is om verder te verwerken (stap 1.8 of 1.11; merk op dat kleine regio's zoals het cerebellum en de hippocampus mogelijk geen verdere trimmen nodig hebben).
- Voor de maag
- Verwijder en gooi de voormaag weg. Snijd de kliermaag open en was vrij van voedsel met behulp van ~ 7 mL van koude snijbuffer in een middelgrote weegboot.
- Verwijder een 5 mm strook kliermaag proximal aan de twaalfvingerige darm voor fixatie voor mogelijke histopathologie evaluatie (zie stap 1.2).
- Plaats de resterende maag in ~ 7 mL van koude hakken buffer in een middelgrote weegboot en incuberen op ijs voor 15-30 min.
LET OP: Deze incubatiestap is wellicht niet nodig; deze stap is opgenomen in het JaCVAM-validatieprotocol, maar wordt niet vermeld in de OESO-testrichtlijn8.9 - Breng de maag naar een schoon stuk paraffine (of petrischaal of weegboot) en schraap het oppervlakteepitheel twee of meer keer voorzichtig met behulp van een scalpelmes of een polytetrafluoroetheen (PTFE) schraper om vuil te verwijderen. Pak het maagslijmvlies op met tangen en spoel met 1 mL koude snijdende buffer met behulp van een pipet. Breng het maagweefsel naar een schoon oppervlak of schaal.
- Schraap het maagepitheel 4-5 keer (indien nodig meer) zorgvuldig in een snijdende oplossing (meestal 250 μL/muis of 500-1.000 μL/rat) met de achterkant van een scalpelmes of PTFE-schraper om de cellen vrij te geven. Eventueel, spoel weefsel met een ongeveer gelijk volume van het snijden oplossing om meer cellen te herstellen. Verzamel de snijdende oplossing met vrijgekomen cellen met behulp van een pipet en breng over op een microcentrifugebuis op ijs.
- Snijd voor weefselmonsters een 3-4 mm sectie lever- of hersenweefsel of ~ 5 mm twaalfvingerige darm en breng over naar een gelabelde microcentrifugebuis van 1,5 of 2,0 mL met 1 mL koude snijoplossing. Snel gehakt (≤30 s) met een schaar tot het fijn verspreid is, terwijl het monster koud blijft. Het monster moet er licht troebel uitzien; echter, het is gebruikelijk voor sommige stukken te blijven die zal vestigen op de bodem van de buis.
- Om het weefsel vers te gebruiken, onderhouden buizen met gehakt weefsel of geschraapte epitheelcellen op ijs; gebruik het weefsel om komeetdia's te bereiden binnen ongeveer 1 uur van de oogst (beschreven in punt 2).
- Voor het invriezen van de weefselmonsters, onmiddellijk na het snijden of verzamelen van geschraapte epitheelcellen
- Zet het buisdeksel en laat buis in een Dewar-kolf met vloeibare stikstof; buizen mogen gedurende de levensduur van de obductie (≤3 h) in vloeibare stikstof worden gehouden.
- Haal buizen met behulp van een pollepel en plaats op droogijs te sorteren. Breng buizen naar een vriesdoos op droogijs en bewaar de doos in een vriezer van -80 °C.
- Snijd voor het bereiden van bevroren blokjes weefsel verschillende kleine stukjes weefsel (≤4 mm in diameter en ~6 mm in lengte; Figuur 1).
- Laat ze individueel direct in een middelgrote weegboot of ander geschikt vat met vloeibare stikstof vallen.
- Wacht een paar seconden tot de stukken volledig bevriezen en breng individuele bevroren weefselblokjes over op een gelabelde microcentrifugebuis of cryobuis die op droogijs wordt gehouden; laat de stukken niet samenklonteren tijdens het vriesproces.
- Breng buizen naar een vriesdoos op droogijs en bewaar de doos in een vriezer van -80 °C.
2. Voorbereiding van de dia
-
Voor gehakt/geschraapt weefsel
- Onderhoud buizen met verse weefsels op nat ijs.
- Plaats buizen van bevroren weefsel in een waterbad op kamertemperatuur totdat de monsters volledig ontdooid zijn, terwijl ze koud worden gehouden. Breng de buizen onmiddellijk op ijs.
- Onmiddellijk voorafgaand aan het terugtrekken van cellen voor overdracht naar agarose (stap 2.3), meng elke celsuspensie voorzichtig; voor niet-gefilterde monsters, laat grote brokken te vestigen op de bodem van de buis. Houd alle buizen op ijs totdat de glijbanen voor alle monsters zijn voorbereid.
-
Voor in blokjes
- Haal buizen met weefselblokjes uit de vriezer van 80 °C en blijf op droogijs tot de voorbereiding van de dia.
- Aliquot 1 mL van merchant's medium (0,14 M NaCl, 1,47 mM KH2PO4, 2,7 mM KCl, 8,1 mM Na2HPO4, 10 mM NaEDTA, pH 7.4) of snijden oplossing in een gelabelde 1,7 mL microcentrifuge buis voor elk monster en onderhouden op ijs.
- Snel werken om weefselontdooiing te voorkomen, plaats een blokje weefsel in het open uiteinde van een weefselvan de kamertemperatuur (Figuur 1). Er mogen meerdere weefselstukken worden gebruikt; indien nodig mag het bevroren weefsel met een koude mortel en stamper in kleinere stukken worden gesneden of gebarsten om de kubusgrootte te verkleinen om in het apparaat te passen.
- Plaats snel een op maat gemaakte spuitzuiger in het apparaat om het weefsel naar het gaasuiteinde te duwen, dat vervolgens in de microcentrifugebuis moet worden geplaatst die koude snijdende oplossing bevat; voorkomen dat de vloeistof wordt overlopen. Dompel het gaasuiteinde van het apparaat voor ongeveer 5-10 s onder in de koude snijdende oplossing om het weefsel volledig te laten ontdooien.
- Druk de zuiger volledig af totdat cellen worden gezien die door de mesh poriën extruderen. Trek vervolgens de zuiger ongeveer 2,5 cm omhoog en druk weer volledig naar beneden; herhaal het proces meerdere malen totdat de snijdende oplossing troebel wordt.
- Indien nodig kan het monster worden geconcentreerd om de celdichtheid te verhogen door gekoelde centrifugering gedurende 5 min bij 1100 rpm en verwijdering van een deel van de supernatant.
- Herhaal het proces voor alle monsters met behulp van een schoon weefsel snijden apparaat voor elk monster.
- Breng 50 μL celsuspensie over op een buis met 450 μL van 0,5% laag smeltpunt agarose bij 37 °C.
LET OP: De volumes kunnen worden aangepast, maar de hoeveelheid agarose moet ≤1% zijn. - Dia's voorbereiden en scoren zoals eerder beschreven10,11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Studie 1
Lever werd geoogst uit twee cohorten van mannelijke Sprague Dawley ratten toegediend maïsolie voor 4 dagen, gespreid door een week. Dia's werden bereid uit vers gehakt weefsel, bevroren gehakt weefsel, en bevroren blokjes weefsel verwerkt in medium merchant's of snijden oplossing met behulp van het weefsel snijden apparaat. Bevroren weefsels verkregen van dieren uit het eerste cohort werden geëvalueerd na de opslag van de vriezer voor ~ 3,5 maanden. Bevroren weefsels verkregen van dieren uit het tweede cohort werden geëvalueerd na opslag voor ~ 6 maanden. Kometen die de karakteristieke "egel"-morfologie vertonen, die wijzen op zwaar beschadigde cellen (van onzekere etiologie die cytotoxiciteit of mechanische stress kunnen omvatten), werden niet opgenomen in de score van % staart-DNA; het percentage egels, dat uitsluitend bij visuele inspectie van de morfologie is geïdentificeerd, afzonderlijk werd getabuleerd volgens OESO TG 4899. De gemiddelde % tail DNA resultaten voor de dieren in de twee cohorten (gebaseerd op score 100 cellen/dier) worden samengevat in figuur 2A. Alle methoden met behulp van bevroren weefsel geproduceerde waarden hoger, hoewel niet altijd statistisch anders, dan vers weefsel. Gezien het feit dat de aanbevolen bovengrens voor % staart-DNA in verse rattenlever 6%9bedraagt, tonen deze resultaten aan dat elk van deze methoden goed kan werken voor de evaluatie van bevroren weefsel. Het snijden van oplossing presteerde minstens even goed evenals het middel van de Handelaar; aangezien de laatste is meer tijd in beslag te bereiden, hakken oplossing werd geselecteerd voor latere studies. Er waren geen statistisch significante verschillen in schade in weefsels van het tweede diercohort dat bevroren was opgeslagen voor ~ 6 maanden voorafgaand aan de verwerking in vergelijking met de weefsels van het eerste cohort dat na ~ 3,5 maanden opslag werd verwerkt. Over het geheel genomen waren de % egels parallel met het % staart-DNA, hoewel de % egels in de bevroren weefsels ten opzichte van vers weefsel variabeler waren dan voor % staart-DNA (figuur 2B). De waarden voor deze eindpunten in het verse weefsel bieden een basislijn waartegen de DNA-schade die door de vriesmethoden wordt geïntroduceerd, kan worden gemeten.
Studie 2
Vrouwelijke B6C3F1 muizen werden toegediend normale zoutoplossing of de mutageen, ethyl methaansulfonaat (EMS) op 200 mg/kg/dag in normale zoutoplossing gedurende drie dagen. Weefsel werd geoogst 3 uur na de laatste dosis toediening en verwerkt vers in de komeet test. Extra weefsel werd flash bevroren na te zijn gehakt in hakken oplossing of verzameld als kubussen. In blokjes geblokte monsters werden vervolgens verwerkt in een hakoplossing met behulp van de zeefinrichting vlak voor de bereiding van komeetplaten. Op de veronderstelling dat cellen die de egelmorfologie vertonen cellen vertegenwoordigen aan de hoge kant van het continuüm van chemisch geïnduceerde DNA-schade, werden egels die door de beeldvormingssoftware correerbaar zijn, opgenomen in de geautomatiseerde score van % staart-DNA. De % tail DNA resultaten (gebaseerd op score 150 cellen/dier) worden samengevat in figuur 3. Leverweefsel bevroren als kubussen en vervolgens verwerkt met behulp van het weefsel snijden apparaat leverde resultaten zeer vergelijkbaar met die verkregen voor vers gehakt weefsel. De % staart-DNA-waarden waren iets hoger voor het bevroren gehaktweefsel, maar de basiswaarden voor het bevroren gehaktweefsel waren lager dan 6%, zoals aanbevolen voor verse rattenlever in de OESO-testrichtlijn voor de komeettest9. Een statistisch significante toename van ems-geïnduceerde DNA-schade werd gemeten in weefselmonsters die volgens alle drie de methoden werden verwerkt.
Studie 3
Delen van leverweefsel verzameld van vrouwelijke B6C3F1 muizen in een 90 dagen toxiciteit studie van een test chemische uitgevoerd door een afgelegen laboratorium werden gehakt of gesneden in blokjes, flash bevroren, en verscheept 's nachts op droogijs naar dit laboratorium voor analyse. Gehakt weefsel werd geanalyseerd na ~ 2 maanden van de vriezer opslag (Figuur 4). Cellen die bij visuele inspectie egels bleken te zijn, maar door de beeldvormingssoftware corcorable waren, werden opgenomen in de % staart-DNA-metingen (150 cellen scoorden/dier). Het aantal egels (of het nu correeerbaar of niet-correeerbaar is) dat uitsluitend is geïdentificeerd bij visuele inspectie van de morfologie in een totaal van 150 cellen/dieren, werd afzonderlijk getabuleerd om informatie te verstrekken over de frequentie van deze sterk beschadigde cellen. Over het geheel genomen was de DNA-schade (gemeten als % staart-DNA) in bevroren gehakt weefsel hoog in alle dosisgroepen met aanzienlijke variabiliteit tussen dieren en dieren, ook in de controlegroep van het voertuig. De % staart-DNA-resultaten correleerden met % egels (uitsluitend geïdentificeerd op basis van morfologie), wat aangeeft dat egels aanzienlijk hebben bijgedragen aan het hoge niveau van DNA-schade dat in deze monsters werd waargenomen. Op basis van de hoge achtergrond niveau van DNA-schade gemeten in het gehaktweefsel, bevroren blokjes weefsel werd vervolgens geanalyseerd na ~ 22 maanden van opslag (Figuur 4). Zowel DNA-schade als % egels waren zeer laag in het flash bevroren kubusweefsel dat parallel met de gehakte weefselmonsters was bereid. De sterk beschadigde cellen die door de egelmorfologie in de gehakte weefselmonsters worden weerspiegeld, waren dus duidelijk niet het resultaat van een biologisch proces, maar werden waarschijnlijk geïntroduceerd door mechanische verstoring en/of weefselopwarming tijdens de hakkende procedure voordat ze werden bevroren; deze gegevens werden als onbetrouwbaar beschouwd. Gelukkig leverde de analyse van bevroren inblokjes weefsel een duidelijk resultaat op, namelijk het ontbreken van een DNA-schaderespons in de lever van vrouwelijke muizen na drie maanden blootstelling aan de teststof. De resultaten van deze casestudy illustreren het risico in verband met de bereiding van gehakte weefsels door een relatief onervaren laboratorium en tonen het nut aan van de bevroren kubusweefselmethode om dit probleem te omzeilen.
Figuur 1: Weefselhakken en zuigergebruikt om een enkele cel suspensie van bevroren weefsel voor te bereiden. Het prototype apparaat (4,5 mm binnendiameter, 0,4 mm maaswijdte) werd vriendelijk verzorgd door Dr. Gunnar Brunborg (NorGenotech, Oslo, Noorwegen). Het paneel aan de rechterkant geeft een voorbeeld van een juiste grootte kubus van weefsel voor gebruik met het apparaat. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Vergelijking van DNA-schade gemeten in verse en bevroren gehakte en gehomogeniseerde muislevermonsters. Lever werd geoogst uit twee gespreide cohorten (n = 5/groep/cohort) van mannelijke Sprague Dawley ratten toegediend maïsolie voor 4 dagen. Dia's werden bereid uit vers gehakt weefsel, bevroren gehakt weefsel, en bevroren blokjes weefsel verwerkt in medium merchant's of snijden oplossing met behulp van het weefsel snijden apparaat. Bevroren weefsels werden geanalyseerd ~ 3,5 en 6 maanden na obductie voor cohorten 1 en 2, respectievelijk. Kometen geclassificeerd als egels op basis van morfologie werden niet opgenomen in de score van % staart-DNA. (A) Cohort betekent % staart DNA resultaten. (B) Cohort gemiddelde % egelresultaten. Foutbalken weerspiegelen standaarddeviatie. Er werden statistische analyses uitgevoerd om bevroren weefsels te vergelijken met vers weefsel voor elk cohort en om de resultaten tussen de twee cohorten voor elke weefselbereidingsmethode te vergelijken. *Statistisch verschillend(p < 0,05) van vers gehakt weefsel binnen hetzelfde cohort met behulp van de t-test van de student; #statistically verschillend(p < 0,05) van vers gehakt weefsel binnen hetzelfde cohort met behulp van de Mann-Whitney-test voor niet-normaal verspreide gegevens; ¥ statistisch verschil (p < 0,05) tussen cohorten met behulp van de Student's t-test. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Vergelijking van DNA-schade veroorzaakt door EMS in Leverweefsel verwerkt door verschillende procedures. Gemiddelde % staart-DNA voor vrouwelijke B6C3F1-muizen toegediend voertuig of 200 mg/kg/dag EMS gedurende drie dagen (n = 5/groep). Levers werden geoogst 3 uur na de laatste dosis toediening en verwerkt vers in de komeet test. Extra leverweefsel werd flash bevroren na te zijn gehakt in een snijden oplossing of verzameld als kubussen; in blokjes gehomogeniseerde monsters werden gehomogeniseerd met behulp van het weefsel hakken apparaat onmiddellijk voorafgaand aan de voorbereiding van komeet dia's. Om ervoor te zorgen dat cellen aan de hoge kant van het continuüm van EMS-geïnduceerde DNA-schade niet van de analyse werden uitgesloten, werden kometen die bij visuele inspectie leken te voldoen aan de morfologische beschrijving van egels, maar door de beeldvormingssoftware scorable bleken te zijn, opgenomen. Foutbalken weerspiegelen standaarddeviatie. De t-test van een student werd gebruikt om de hoeveelheid DNA-schade bij dieren die aan EMS zijn blootgesteld, te vergelijken met die in de voertuigcontroledieren voor elke monsterbereidingsmethode. *Statistisch significante stijging bij p < 0,05. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4. Case study toont nut van bevroren kubus methode en hoge kwaliteit gegevens verkregen na langdurige opslag. Delen van leverweefsel verzameld van vrouwelijke B6C3F1 muizen blootgesteld aan verschillende concentraties van een teststof voor ~ 90 dagen (n = 5 /groep) werden gehakt of in blokjes gesneden en flash bevroren in het in-life laboratorium en vervolgens verscheept naar dit laboratorium voor analyse. Gehakt weefsel werd geanalyseerd na ~ 2 maanden van opslag; als gevolg van de slechte kwaliteit van de gegevens, bevroren kubusweefsel werd vervolgens geanalyseerd na ~ 22 maanden van opslag. Om ervoor te zorgen dat cellen aan de hoge kant van het continuüm van chemisch geïnduceerde DNA-schade niet van de analyse werden uitgesloten, werden gegevens van scorable cellen die bij visuele inspectie egels bleken te zijn, opgenomen. (A) Groep betekent % staart DNA resultaten. In vergelijking met gehakt weefsel werden resultaten van hoge kwaliteit verkregen uit bevroren blokjes weefsel, zelfs na langdurige opslag. (B) Groep gemiddelde % egelresultaten. Slechte snijden techniek blijkt uit de uitgebreide niet-biologische DNA-schade waargenomen als egel kometen in het gehaktweefsel monsters. Foutbalken weerspiegelen standaarddeviatie. Een ANOVA met Dunnett's test werd gebruikt om te evalueren voor een positieve reactie op de teststof voor elke monsterbereidingsmethode. Er waren geen statistisch significante(p < 0.05) dosisgroepen gedetecteerd voor beide methoden. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Baseline DNA schade gemeten in bevroren rattenhersenweefsel. Komeet test resultaten worden verstrekt voor bevroren gehakt of blokjes weefsels die verschillende regio's van de hersenen van mannelijke en vrouwelijke Sprague Dawley ratten. Gegevens (gegenereerd door het opnemen van scorable egelkometen) werden verzameld over verschillende studies; n = totaal aantal hersenweefsels dat voor elke methode voor het voorbereidingsmonster wordt geëvalueerd. Foutbalken weerspiegelen standaarddeviatie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zoals eerder aangetoond7,12,13, goed behandeld flash bevroren gehakt weefsel biedt goede resultaten in de komeet test. In feite zijn de DNA-waarden van de basislijn % staart voor bevroren gehakte ratten- en muizenlever die in ons laboratorium worden bereid, doorgaans ≤6%, zoals aanbevolen door de OESO-testrichtlijn9 voor vers gehakte rattenlevermonsters. Er zijn goede resultaten behaald door meerdere laboratoria met behulp van verschillende weefselsoorten die zijn gehakt en bevroren opgeslagen; ook zijn flash bevroren epitheelcellen geschraapt uit organen in het maag-darmkanaal met succes gebruikt in de komeettest7,12,13,14. Bevroren gehakt/geschraapt weefsel blijkt gedurende ten minste enkele maanden relatief stabiel te zijn. De methode waarbij gebruik wordt gemaakt van homogenisatie van flash bevroren kubussen van de lever met behulp van een weefsel snijden apparaat oorspronkelijk beschreven door Jackson etal. 6, levert in de komeet test ten minste vergelijkbaar en meestal beter (dat wil zeggen, lagere baseline niveaus van DNA-schade) dan die verkregen voor bevroren gehaktlever. Deze methode is ook van toepassing op andere weefseltypen6; in onze ervaring, uitstekende resultaten zijn eveneens verkregen met behulp van bevroren kubussen (gegevens niet getoond) en hersenweefsel (Figuur 5). Het is echter mogelijk dat de zeefinrichting niet van alle weefseltypen kan worden gehomogeniseerd. In een pilot studie, vonden we dat spierhartweefsel niet gemakkelijk kon worden gedwongen door de zeef apparaat, wat resulteert in een slechte cel herstel; in plaats daarvan, snijden het weefsel onmiddellijk na ontdooien leverde cel suspensie met baseline % staart DNA-waarden vergelijkbaar met die gehakt voorafgaand aan de flitser bevriezing (gegevens niet weergegeven). Met name wanneer het tijdens de obductie goed wordt behandeld (d.w.z. koud en vochtig gehouden; flash bevroren als afzonderlijke stukken en niet gedeeltelijk ontdooien), heeft flash bevroren kubusweefsel zeer lage DNA-schade bij de uitgangswaarde opgebracht, zelfs na ongeveer twee jaar diepvriesopslag (figuur 4).
Het gebruik van bevroren celsuspensusten of in blokjes gelopen weefsel in de komeettest biedt verschillende voordelen ten opzichte van vers weefsel, waaronder: 1) het vergemakkelijken van gelijktijdige verzameling van meerdere weefseltypen voor komeetanalyse; 2) het vergemakkelijken van het verzamelen van weefsel in een laboratorium in het leven en de overdracht van monsters naar een ander laboratorium voor analyse; 3) gemak om een beslissing om een bepaald weefsel te analyseren voor maanden uit te stellen. Hoewel de homogenisatie van bevroren weefsel op het moment van het diapreparaat omslachtiger is dan het snijden van vers weefsel op het moment van de oogst, biedt het gebruik van bevroren in blokjes gelopen weefsel verschillende bijkomende voordelen, waaronder: 1) geen vereiste voor personeel dat is opgeleid in de komeettest (bijvoorbeeld mobiele eenheid) of gespecialiseerde benodigdheden/reagentia bij obductie; 2) minder kans op technische fouten (bijvoorbeeld monsteropwarming; onvoldoende vrijkomen van cellen; suboptimale weefselmonstergrootte) tijdens obductie; 3) minimale gelegenheid om mechanische DNA-schade in te voeren tijdens de monsterverwerking (bijv. het hakken van de schaar); en 4) lage baseline DNA-schade, zelfs na langdurige opslag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dit werk werd ondersteund door het Intramural Research Program van het NIH, National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) in opdracht van HHSN273201300009C; de daarin vervatte verklaringen, meningen of conclusies vertegenwoordigen echter niet noodzakelijkerwijs de verklaringen, meningen of conclusies van NIEHS, NIH of de regering van de Verenigde Staten.
Acknowledgments
De auteurs zijn schatplichtig aan Lincoln Martin en Kelley Owens voor deskundige technische bijstand voorbereiden en scoren komeet dia's en Dr Carol Swartz voor het uitvoeren van statistische analyses. De auteurs erkennen ook de ondersteunende bijdragen van leden van de genetische toxicologie, onderzoekstoxicologie en obductie programma's op ILS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryovials | Corning Costar | 430488 | |
| Dental Wax Sheets | Electron Microscopy Sciences | 72670 | |
| Dissecting (Mincing) Micro Scissors | Fisher Scientific | 08-953-1B | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Gibco | 14175-079 | |
| KCl | Teknova | P0315-10 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Low Melting Point Agarose | Lonza | 50081 | |
| Microfuge Tubes (1.7 mL) | Corning | 3207 | |
| Na2EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | |
| Neutral Buffered Formalin | Leica | 600 | |
| Scalpel Blades | Miltex | 4-110 | |
| Syringe Plunger (1 mL) | Fisher Scientific or Vitality Medical | 14-826-88; 8881901014 | Becton Dickinson or Monoject tuberculin syringe |
| Tissue Mincing Device | NorGenoTech (Oslo, Norway) | None | Small variability in diameter observed which can affect snuggness of plunger. |
| Tweezers, plastic | Trade Winds Direct | DF8088N | Reinforced nylon, nonsterile, blunt tip, autoclavable; tradewindsdirect.com |
| Weigh Boats | Krackler Scientific/Heathrow Scientific | 6290-14251B |
References
- van der Leede, B. J., et al. Performance and data interpretation of the in vivo comet assay in pharmaceutical industry: EFPIA survey results. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 775-776, 81-88 (2014).
- ICH. International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH) S2(R1): Guidance on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended for Human Use. ICH. , (2012).
- EFSA. Scientific opinion on genotoxicity testing strategies applicable to food and feed safety assessment. EFSA Journal. 9 (9), 2379 (2011).
- Lorenzo, Y., Costa, S., Collins, A. R., Azqueta, A. The comet assay, DNA damage, DNA repair and cytotoxicity: hedgehogs are not always dead. Mutagenesis. 28 (4), 427-432 (2013).
- Guerard, M., Marchand, C., Plappert-Helbig, U. Influence of experimental conditions on data variability in the liver comet assay. Environmental and Molecular Mutagenesis. 55 (2), 114-121 (2014).
- Jackson, P., et al. Validation of freezing tissues and cells for analysis of DNA strand break levels by comet assay. Mutagenesis. 28 (6), 699-707 (2013).
- Recio, L., Kissling, G. E., Hobbs, C. A., Witt, K. L. Comparison of Comet assay dose-response for ethyl methanesulfonate using freshly prepared versus cryopreserved tissues. Environmental and Molecular Mutagenesis. 53 (2), 101-113 (2012).
- Uno, Y., et al. JaCVAM-organized international validation study of the in vivo rodent alkaline comet assay for detection of genotoxic carcinogens: II. Summary of definitive validation study results. Mutation Research/Genetetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 786-788, 45-76 (2015).
- OECD. OECD Guideline for the Testing of Chemicals: In Vivo Mammalian Alkaline Comet Assay. OECD. 489, (2016).
- Hobbs, C. A., et al. Comet assay evaluation of six chemicals of known genotoxic potential in rats. Mutation Research/Genetetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 786-788, 172-181 (2015).
- Ding, W., Bishop, M. E., Lyn-Cook, L. E., Davis, K. J., Manjanatha, M. G. In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver. Journal of Visualized Experiments. (111), 53833 (2016).
- Hobbs, C. A., Chhabra, R. S., Recio, L., Streicker, M., Witt, K. L. Genotoxicity of styrene-acrylonitrile trimer in brain, liver, and blood cells of weanling F344 rats. Environmental and Molecular Mutagenesis. 53 (3), 227-238 (2012).
- Hobbs, C. A., et al. Comprehensive evaluation of the flavonol anti-oxidants, alpha-glycosyl isoquercitrin and isoquercitrin, for genotoxic potential. Food and Chemical Toxicology. 113, 218-227 (2018).
- Pant, K., et al. Vehicle and positive control values from the in vivo rodent comet assay and biomonitoring studies using human lymphocytes: historical database and influence of technical aspects. Environmental and Molecular Mutagenesis. 55 (8), 633-642 (2014).
