Summary
Este protocolo describe varios procedimientos para preparar muestras de tejido congelado de alta calidad en el momento de la necropsia para su uso en el ensayo del cometa para evaluar el daño del ADN: 1) tejido picado, 2) células epiteliales raspadas del tracto gastrointestinal, y 3) tejido en cubos muestras, que requieren homogeneización utilizando un dispositivo de picado de tejido.
Abstract
El ensayo del cometa está ganando popularidad como un medio para evaluar el daño del ADN en las células y tejidos cultivados, particularmente después de la exposición a productos químicos u otros factores estresantes ambientales. El uso del ensayo de cometas en pruebas reglamentarias del potencial genotóxico en roedores ha sido impulsado por la adopción de una directriz de prueba de la Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económicos (OCDE) en 2014. Los portaobjetos de ensayo de cometas se preparan típicamente a partir de tejido fresco en el momento de la necropsia; sin embargo, la congelación de muestras de tejido puede evitar desafíos logísticos asociados con la preparación simultánea de diapositivas de múltiples órganos por animal y de muchos animales por estudio. La congelación también permite enviar muestras desde la instalación de exposición a un laboratorio diferente para su análisis, y el almacenamiento de tejido congelado facilita el aplazamiento de la decisión de generar datos de daño de ADN para un órgano determinado. El ensayo del cometa alcalino es útil para detectar roturas de doble y una sola cadena de ADN relacionadas con la exposición, lesiones alcalinas-lábiles y roturas de hebras asociadas con la reparación incompleta de escisión del ADN. Sin embargo, el daño del ADN también puede ser el resultado de cizallamiento mecánico o procedimientos de procesamiento de muestras inadecuados, confundiendo los resultados del ensayo. La reproducibilidad en la recolección y procesamiento de muestras de tejido durante las necropsias puede ser difícil de controlar debido a la fluctuación del personal de laboratorio con diferentes niveles de experiencia en la recolección de tejidos para el ensayo del cometa. Mejorar la coherencia a través de la capacitación de actualización o el despliegue de unidades móviles con personal de laboratorio experimentado es costoso y puede no ser siempre factible. Para optimizar la generación constante de muestras de alta calidad para el análisis de ensayos de cometas, se evaluó un método para homogeneizar cubos de tejido congelados con flash utilizando un dispositivo de picado de tejido personalizado. Las muestras preparadas para el ensayo del cometa por este método se compararon favorablemente en calidad con las muestras de tejido fresco y congelado preparadas por picado durante la necropsia. Además, se midió el daño basal bajo en el ADN en las células de cubos congelados de tejido después de un almacenamiento prolongado.
Introduction
El ensayo del cometa se utiliza cada vez más como un medio para evaluar el daño del ADN en células cultivadas y tejidos expuestos a productos químicos u otros factores de estrés ambientales1. El ensayo puede detectar roturas de doble y una sola cadena de ADN, lesiones alcalinas-lábiles y roturas de una sola cadena asociadas con la reparación incompleta del ADN. La directriz del Consejo Internacional para la Armonización de los Requisitos Técnicos de Productos Farmacéuticos de Uso Humano (ICH) para ensayos farmacéuticos recomienda un ensayo de rotura de hebras de ADN, como el ensayo del cometa como una segunda prueba para complementar el ensayo de micronúcleos de eritrocitos para evaluar la genotoxicidad in vivo y como prueba de seguimiento para evaluar el modo de acción en los órganos diana de la inducción tumoral2. La Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA) recomienda el ensayo in vivo del cometa como una prueba de seguimiento adecuada para investigar la pertinencia de un resultado positivo en una prueba de genotoxicidad in vitro3. En 2014, se aprobó una directriz de ensayo de la OCDE para el ensayo de cometas de roedores, aumentando así la aceptabilidad del ensayo para su uso en pruebas reglamentarias del potencial genotóxico. El ensayo se basa en la separación electroforética de bucles de ADN relajados y fragmentos que migran de nucleoides de células lysed. Básicamente, las células individuales están incrustadas en agarosa que se ha en capas en las diapositivas del microscopio. Las diapositivas se sumergen en el tampón de lisis seguido de una solución alcalina (pH > 13), que permite que el ADN nuclear estrechamente enrollado se relaje y se relaje. Las diapositivas se colocan en un campo eléctrico, que estimula la migración del ADN cargado negativamente hacia el ánodo, creando imágenes que se asemejan a los cometas; la cantidad relativa de ADN en la cola del cometa en comparación con la cabeza del cometa es directamente proporcional a la cantidad de daño del ADN; El contenido de ADN en la cola se cuantifica típicamente mediante un software de imágenes digitales.
Debido a que el ensayo del cometa detecta ADN fragmentado, la cuantificación precisa del daño del ADN inducido por la exposición puede confundirse por la fragmentación de la cromatina asociada con la necrosis o la apoptosis resultante de la citotoxicidad o el estrés inducidos por el tratamiento. Además, el daño del ADN puede ocurrir como resultado de un cizallamiento mecánico o un procesamiento inadecuado de muestras4. La importancia de mantener el tejido cosechado refrigerado antes de la preparación de la diapositiva para minimizar el nivel basal de daño en el ADN se ha demostrado previamente5,6. Muchos laboratorios preparan diapositivas de ensayo de cometas a partir de tejido fresco; sin embargo, esto puede ser logísticamente difícil al preparar diapositivas de múltiples tipos de tejidos por animal en un estudio con un gran número de animales. Además, esto presenta un problema cuando la preparación y el análisis de diapositivas se producen en un laboratorio remoto, lo que requiere el envío de muestras. Por ejemplo, el Programa Nacional de Toxicología de los Estados Unidos incluye el ensayo del cometa como un componente de su programa de pruebas de toxicología genética (https://ntp.niehs.nih.gov/testing/types/genetic/index.html) y a veces incorpora el ensayo en estudios de toxicidad por dosis repetidas de 28 o 90 días; esto requiere la recolección de tejido por el laboratorio en la vida y la transferencia de muestras a otro laboratorio para su análisis. Para lograr esto, las piezas de tejido se pican, y / o células epiteliales del tracto gastrointestinal se raspan y las suspensiones celulares se congelan y se almacenan en un congelador para su posterior envío y almacenamiento por el laboratorio receptor hasta el análisis7. El manejo adecuado de las muestras es crucial para obtener datos de alta calidad utilizando tejido congelado; sin embargo, la manipulación reproducible de muestras de tejidos durante las necropsias realizadas por personal en constante cambio es difícil de controlar, especialmente en laboratorios de la vida que no cosechan rutinariamente tejidos para el ensayo del cometa. La capacitación más actualizada del personal de necropsia o el uso de una unidad móvil atendida por personal de laboratorio experimentado para recoger muestras de tejido fresco o congelado es a menudo demasiado costosa, no factible, o simplemente infravalorada.
Para asegurar mejor la generación constante de muestras de tejido de alta calidad para su transferencia a un sitio remoto para el análisis de ensayos de cometas, se exploró la utilidad de un método publicado6 de preservación de tejidos a partir de cubos de tejido congelados. En este método, los cubos congelados de tejido se cargan en un dispositivo de picado de tejido de acero inoxidable(Figura 1) que se coloca en un tubo de microcentrífuga que contiene tampón frío. El cubo de tejido se empuja a través de una pequeña malla de calibre al final del dispositivo. Forzando repetidamente la suspensión de tejido a través del tamiz de malla en ambas direcciones varias veces resulta en una suspensión de una sola célula relativamente uniforme. Las muestras preparadas por este método se compararon favorablemente en calidad con muestras de tejido fresco y congelado preparadas por picado. Como beneficio adicional, a diferencia de las muestras picadas, los cubos de tejido se pueden almacenar congelados durante períodos prolongados de tiempo y todavía producen resultados de alta calidad en el ensayo del cometa.
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Protocol
Los tejidos fueron cosechados durante la realización de estudios realizados en instalaciones acreditadas por la AAALAC en laboratorios contractuales NTP de acuerdo con las regulaciones de Buenas Prácticas de Laboratorio (21 CFR Parte 58) y protocolos de uso animal aprobados por el Animal Institucional Comité de Cuidado y Uso (IACUC) en cada laboratorio.
1. Cosecha y procesamiento de tejidos
NOTA: Es útil preparar tubos de muestra duplicados (por ejemplo, hígado) o transferir aproximadamente la mitad de una muestra a otro tubo de almacenamiento (por ejemplo, duodeno, estómago) para permitir el reanálisis, si es necesario. Para minimizar la posible variabilidad de muestra a muestra para los tejidos del tracto intestinal, se recomienda tener cuidado de tomar muestras de la misma región de tejido en relación con el estómago para cada animal, y una muestra se divide para generar muestras duplicadas. Los fórceps plásticos se recomiendan para transferir tejidos pegajosos como el cerebro. Como opción, las preparaciones de tejido picado, raspado o homogeneizado pueden filtrarse para lograr suspensiones homogéneas de una sola célula utilizando un colador celular de 40 m unido a un tubo cónico.
- Retire los tejidos, órganos y desechos de conexión adheridos de los órganos de interés. Inmediatamente después de la extracción, swish el órgano vigorosamente en una lancha de pesaje de tamaño medio que contiene 7 ml de solución de picado en frío recién preparado (Mg++,Ca+ + y fenol rojo solución de sal equilibrada de Hank, 10% v / v DMSO, y 20 mM EDTA pH 7.5) para eliminar la sangre residual y los desechos.
- Transfiera cada órgano a otra bote de pesaje limpia que contenga suficiente solución de picado en frío (7 ml) para mantener el tejido sumergido, sobre hielo, hasta su posterior procesamiento.
- Retire una sección de cada órgano de interés y colóquela en un casete de incrustación. Arreglo en 10% de formalina tamponada neutra, guarnición, e incrustación de parafina de acuerdo con los procedimientos estándar del laboratorio para una posible evaluación de histopatología futura.
- Para el hígado, corte una sección longitudinal de 5 mm del lóbulo izquierdo y abotee suavemente en 7 ml de solución de picado en frío. Coloque la tira de tejido en un bote de pesaje de tamaño medio limpio que contenga 7 ml de solución de picado en frío y manténgala sobre hielo hasta que esté lista para procesarse más (paso 1.8 o 1.11).
- Para el duodeno, corte una porción de 10 mm del duodeno proximal al estómago. Con una aguja de 21–25 G, enjuague para eliminar los desechos y bacterias.
- Inserte la aguja en un extremo del duodeno y enjuague con 1 ml de solución de picado en frío.
- Enjuague la otra dirección volteando el duodeno y repitiendo con otra solución de 1 ml de picado. Deseche la aguja.
- Cortar el duodeno y enjuagar en 7 ml de solución de picado antes de ponerlo en una embarcación de pesaje de tamaño medio que contenga 7 ml de solución de picado limpio; mantener en hielo hasta que esté listo para procesarmás (paso 1.8 o 1.11).
- Para el cerebro, puede ser útil para dividir primero el cerebro en dos hemisferios; un hemisferio se puede guardar para una posible histopatología (ver paso 1.2).
- Diseccionar la(s) región(s) cerebral(es) de interés y suavemente swish en 7 ml de solución de picado en frío.
- Transfiera los tejidos a un bote de pesaje de tamaño mediano limpio que contenga 7 ml de solución de picado en frío y manténgalos sobre hielo hasta que estén listos para procesarse más (paso 1.8 o 1.11; tenga en cuenta que las regiones pequeñas como el cerebelo y el hipocampo pueden no requerir más recortes).
- Para el estómago
- Retire y deseche el forestomach. Abra el estómago glandular y lave libre de alimentos usando 7 ml de tampón de picado frío en un bote de pesaje de tamaño mediano.
- Retire una tira de 5 mm de estómago glandular proximal al duodeno para la fijación para una posible evaluación histopatología (ver paso 1.2).
- Coloque el estómago restante en 7 ml de tampón de picado frío en un bote de pesaje de tamaño mediano e incubar sobre hielo durante 15-30 min.
NOTA: Este paso de incubación puede no ser necesario; este paso se incluyó en el protocolo de validación JaCVAM, pero no se menciona en la directriz de prueba de la OCDE8,9. - Transfiera el estómago a una pieza limpia de parafina (o plato de Petri o bote de pesaje) y raspe suavemente el epitelio superficial dos o más veces usando una hoja de bisturí o un rascador de politefluoroeteno (PTFE) para eliminar los desechos. Recoger la mucosa gástrica con fórceps y enjuagar con 1 ml de tampón de picado frío utilizando un pipeta. Transfiera el tejido estomacal a una superficie o plato limpio.
- Raspar cuidadosamente el epitelio estomacal 4–5 veces (más, si es necesario) en la solución de picado (típicamente 250 l/ratón o 500-1.000 l/rata) con la parte posterior de una cuchilla de bisturí o un rascador de PTFE para liberar las células. Opcionalmente, enjuague el tejido con un volumen aproximadamente igual de solución de picado para recuperar más células. Recoger la solución de picado que contiene las células liberadas utilizando un pipeta y transferir a un tubo de microcentrífuga en el hielo.
- Para muestras de tejido de picado, corte una sección de 3-4 mm de tejido hepático o cerebral o 5 mm de duodeno y transfiera a un tubo de microcentrífuga etiquetado de 1,5 o 2,0 ml que contenga 1 ml de solución de picado en frío. Picado rápidamente (30 s) con tijeras de picado hasta que se disperse finamente, manteniendo la muestra fría. La muestra debe verse ligeramente turbia; sin embargo, es común que queden algunas piezas que se asienten en la parte inferior del tubo.
- Para utilizar el tejido fresco, mantenga los tubos que contienen tejido picado o células epiteliales raspadas sobre hielo; utilizar el tejido para preparar los portaobjetos dentro de aproximadamente 1 h de la cosecha (delineado en la sección 2).
- Para congelar las muestras de tejido, inmediatamente después de la picadura o recolección de células epiteliales raspadas
- Fije la tapa del tubo y el tubo de caída en un matraz Dewar que contenga nitrógeno líquido; pueden mantenerse en nitrógeno líquido durante la duración de la necropsia (3 h).
- Recuperar tubos usando un cordón y colocar en hielo seco para ordenar. Transfiera los tubos a una caja de congelador sobre hielo seco y almacene la caja en un congelador de -80 oC.
- Para preparar cubos congelados de tejido, corte varios trozos pequeños de tejido (4 mm de diámetro y 6 mm de longitud; Figura 1).
- Colócalos individualmente directamente en un bote de pesaje mediano u otro recipiente adecuado que contenga nitrógeno líquido.
- Espere unos segundos hasta que las piezas se congelen por completo y transfiera cubos de tejido congelado individuales a un tubo de microcentrífuga etiquetado o criotubo mantenido en hielo seco; no permita que las piezas se agrupen durante el proceso de congelación.
- Transfiera los tubos a una caja de congelador sobre hielo seco y almacene la caja en un congelador de -80 oC.
2. Preparación de diapositivas
-
Para tejido picado/raspado
- Mantenga los tubos que contienen tejidos frescos sobre hielo húmedo.
- Coloque los tubos de tejido congelado en un baño de agua a temperatura ambiente hasta que las muestras estén completamente descongeladas, a la vez que se asegura de que se mantengan frías. Transfiera inmediatamente los tubos al hielo.
- Inmediatamente antes de retirar las células para su transferencia a agarosa (paso 2.3), mezcle cada suspensión celular suavemente; para muestras no filtradas, permita que trozos grandes se asienten en la parte inferior del tubo. Mantenga todos los tubos en hielo hasta que se hayan preparado diapositivas para todas las muestras.
-
Para tejido en cubos
- Recuperar los tubos que contienen cubos de tejido del congelador de 80 oC y mantener en hielo seco hasta la preparación del deslizamiento.
- Aliquot 1 mL del medio del comerciante (0,14 M NaCl, 1,47 mM KH2PO4, 2,7 mM KCl, 8,1 mM Na2HPO4, 10 mM NaEDTA, pH 7.4) o solución de picado en un tubo de microcentrífuga de 1,7 mL etiquetado para cada muestra y mantener en hielo.
- Trabajando rápidamente para evitar la descongelación de tejidos, coloque un cubo de tejido en el extremo abierto de un dispositivo de picado de tejido a temperatura ambiente(Figura 1). Se pueden utilizar varias piezas de tejido; si es necesario, el tejido congelado se puede cortar o agrietar en trozos más pequeños utilizando un mortero frío y un pestillo para reducir el tamaño del cubo para caber en el dispositivo.
- Inserte rápidamente un émbolo de jeringa que coincida con el tamaño en el dispositivo para empujar el tejido hacia el extremo de la malla que luego debe colocarse en el tubo de microcentrífuga que contiene una solución de picado en frío; evitar forzar el líquido a desbordar el tubo. Sumerja el extremo de malla del dispositivo durante aproximadamente 5-10 s en la solución de picado en frío para permitir que el tejido se descontezcan por completo.
- Presione completamente el émbolo hasta que las células se ven extruyendo a través de los poros de malla. A continuación, tire del émbolo hacia arriba aproximadamente 2,5 cm y presione hacia abajo completamente; repetir el proceso varias veces hasta que la solución de picado se vuelva turbia.
- Si es necesario, la muestra puede concentrarse para aumentar la densidad celular mediante centrifugación refrigerada durante 5 min a 1100 rpm y eliminación de una porción del sobrenadante.
- Repita el proceso para todas las muestras utilizando un dispositivo de picado de tejido limpio para cada muestra.
- Transfiera 50 ml de suspensión celular a un tubo que contenga 450 ml de agarosa de punto de fusión bajo al 0,5% a 37 oC.
NOTA: Los volúmenes se pueden ajustar, pero la cantidad de agarosa debe ser del 1%. - Preparar y puntuar diapositivas como se describió anteriormente10,11.
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Representative Results
Estudio 1
El hígado fue cosechado de dos cohortes de ratas macho Sprague Dawley administradas aceite de maíz durante 4 días, escalonadas por una semana. Se prepararon diapositivas a partir de tejido recién picado, tejido picado congelado y tejido en cubo congelado procesado en la solución de cintura o medio de Merchant utilizando el dispositivo de picado de tejido. Los tejidos congelados obtenidos de animales de la primera cohorte se evaluaron después del almacenamiento del congelador durante 3,5 meses. Los tejidos congelados obtenidos de animales de la segunda cohorte fueron evaluados después del almacenamiento durante 6 meses. Los cometas que presentaban la morfología característica del "erizo", indicativa de células muy dañadas (de etiología incierta que puede incluir citotoxicidad o estrés mecánico), no se incluyeron en la puntuación de ADN de cola %; el porcentaje de erizos, identificado únicamente tras la inspección visual de la morfología, se tabulaba por separado según el TG 4899de la OCDE. Los resultados medios del porcentaje de ADN de cola para los animales de las dos cohortes (basados en la puntuación de 100 células/animal) se resumen en la Figura 2A. Todos los métodos que utilizan tejido congelado produjeron valores más altos, aunque no siempre estadísticamente diferentes, que el tejido fresco. Teniendo en cuenta que el límite superior recomendado para % de ADN de cola en hígado de rata fresco es 6%9, estos resultados demuestran que cualquiera de estos métodos puede funcionar bien para evaluar el tejido congelado. La solución de picado tuvo un desempeño al menos igual igual que el medio del comerciante; ya que este último consume más tiempo para prepararse, se seleccionó la solución de picado para estudios posteriores. No hubo diferencias estadísticamente significativas en el daño en los tejidos de la segunda cohorte animal que se habían almacenado congelados durante 6 meses antes del procesamiento en comparación con los tejidos de la primera cohorte procesados después de 3,5 meses de almacenamiento. En general, el % de erizos fue paralelo al ADN de cola %, aunque el % de los erizos de los tejidos congelados en relación con el tejido fresco fue más variable que para el ADN de cola porcentual(Figura 2B). Los valores de estos puntos finales en el tejido fresco proporcionan una línea de base contra la cual se puede medir el daño del ADN que se introduce de forma artefacto.
Estudio 2
A las hembras B6C3F1 se les administró salina normal o mutageno, metanoesulfonato etílico (EMS) a 200 mg/kg/día en salina normal durante tres días. El tejido se extrae 3 h después de la administración de la dosis final y se procesa fresco en el ensayo del cometa. El tejido adicional se congeló después de ser picado en la solución de picado o recogido como cubos. Las muestras en cubos se procesaron posteriormente en solución de picado utilizando el dispositivo de tamiz inmediatamente antes de la preparación de las diapositivas de cometas. Bajo la premisa de que las células que exhiben la morfología del erizo representan células en el extremo superior del continuo daño del ADN inducido por productos químicos, los erizos que se pueden alojar por el software de imágenes fueron incluidos en la puntuación automatizada de % de ADN de cola. Los resultados del ADN de la cola % (basados en la puntuación de 150 células/animales) se resumen en la Figura 3. El tejido hepático congelado como cubos y posteriormente procesado utilizando el dispositivo de picado de tejido produjo resultados muy similares a los obtenidos para el tejido recién picado. Los valores de ADN de cola porcentual fueron algo más altos para el tejido picado congelado, pero los valores basales para el tejido picado congelado estaban por debajo del 6%, como se recomienda para el hígado de rata fresco en las directrices de prueba de la OCDE para el ensayo del cometa9. Se midió un aumento estadísticamente significativo del daño del ADN inducido por EMS en muestras de tejido procesadas por los tres métodos.
Estudio 3
Partes del tejido hepático recolectadas de ratones hembra B6C3F1 en un estudio de toxicidad de 90 días de un producto químico de prueba realizado por un laboratorio remoto fueron picadas o cortadas en cubos, congeladas y enviadas durante la noche en hielo seco a este laboratorio para su análisis. El tejido picado se analizó después de 2 meses de almacenamiento del congelador(Figura 4). Las células que aparecieron en la inspección visual eran erizos pero eran escorzables por el software de imágenes se incluyeron en las mediciones de ADN de cola % (150 células puntuadas/animales). El número de erizos (ya sean que se puedan alojar o no) identificados únicamente tras la inspección visual de la morfología en un total de 150 células/animales se taba por separado para proporcionar información sobre la frecuencia de estas células altamente dañadas. En general, el daño del ADN (medido como ADN de cola porcentual) en el tejido picado congelado fue alto en todos los grupos de dosis con una variabilidad de animal a animal sustancial, incluso en el grupo de control del vehículo. Los resultados del ADN de cola porcentual se correlacionaron con % de erizos (identificados únicamente sobre la base de la morfología), lo que indica que los erizos contribuyeron sustancialmente al alto nivel de daño del ADN observado en estas muestras. Sobre la base del alto nivel de fondo del daño del ADN medido en el tejido picado, el tejido en cubo congelado se analizó posteriormente después de 22 meses de almacenamiento(Figura 4). Tanto el daño en el ADN como el porcentaje de erizos eran muy bajos en el tejido en cubo congelado flash que se había preparado en paralelo con las muestras de tejido picado. Por lo tanto, las células altamente dañadas reflejadas por la morfología del erizo en las muestras de tejido picado claramente no fueron el resultado de un proceso biológico, pero probablemente fueron introducidas por la interrupción mecánica y / o calentamiento del tejido durante el procedimiento de picado antes de ser congelado flash; estos datos se consideraron poco fiables. Afortunadamente, el análisis del tejido en cubocongelado proporcionó un resultado claro, a saber, la falta de una respuesta de daño al ADN en el hígado de ratones hembra después de tres meses de exposición al producto químico de prueba. Los resultados proporcionados por este estudio de caso ejemplifican el riesgo asociado con la preparación de tejidos picados por un laboratorio relativamente inexperto y demuestran la utilidad del método de tejido en cubo congelado para eludir este problema.
Figura 1: Dispositivo de picado de tejido y émbolo utilizado para preparar una suspensión de una sola célula de tejido congelado. El prototipo de dispositivo (4,5 mm de diámetro interior, tamaño de malla de 0,4 mm) fue proporcionado amablemente por el Dr. Gunnar Brunborg (NorGenotech, Oslo, Noruega). El panel de la derecha proporciona un ejemplo de un cubo de tejido de tamaño adecuado para su uso con el dispositivo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Comparación del daño del ADN medido en muestras de hígado de ratón frescas y congeladas. El hígado se extrae de dos cohortes escalonadas (n a 5/grupo/cohorte) de ratas macho Sprague Dawley que administraron aceite de maíz durante 4 días. Se prepararon diapositivas a partir de tejido recién picado, tejido picado congelado y tejido en cubo congelado procesado en la solución de cintura o medio de Merchant utilizando el dispositivo de picado de tejido. Los tejidos congelados se analizaron 3,5 y 6 meses después de la necropsia para las cohortes 1 y 2, respectivamente. Los cometas clasificados como erizos basados en morfología no se incluyeron en la puntuación de ADN de cola %. (A) La cohorte significa % de resultados de ADN de cola. (B) Significación % resultados de erizo. Las barras de error reflejan la desviación estándar. Se realizaron análisis estadísticos para comparar los tejidos congelados con los tejidos frescos de cada cohorte y comparar los resultados entre las dos cohortes para cada método de preparación de tejidos. *Estadísticamente diferente(p < 0.05) de tejido picado fresco dentro de la misma cohorte usando la prueba t del estudiante; #statistically diferentes(p < 0,05) del tejido picado fresco dentro de la misma cohorte utilizando la prueba Mann-Whitney para datos no distribuidos normalmente; • diferencia estadística(p < 0,05) entre cohortes que utilizan la prueba t del estudiante. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Comparación del daño del ADN inducido por emS en tejido hepático procesado por diferentes procedimientos. % medio de ADN de cola para ratones hembra B6C3F1 administrados por vehículo o 200 mg/kg/día EMS durante tres días (n a 5/grupo). Los hígados se cosecharon 3 h después de la administración de la dosis final y se procesaron frescos en el ensayo del cometa. El tejido hepático adicional se congeló después de ser picado en la solución de picado o recogido como cubos; las muestras en cubos se homogeneizaron utilizando el dispositivo de picado de tejido inmediatamente antes de la preparación de las diapositivas del cometa. Para garantizar que las células en el extremo superior del continuo daño del ADN inducido por el SME no se excluyan del análisis, se incluyeron los cometas que tras la inspección visual parecían cumplir con la descripción morfológica de los erizos, pero que se encontraban que eran escorzables por el software de imágenes. Las barras de error reflejan la desviación estándar. La prueba t de un estudiante se utilizó para comparar la cantidad de daño en el ADN en animales expuestos a EMS con la de los animales de control del vehículo para cada método de preparación de la muestra. *Aumento estadísticamente significativo a p < 0,05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Estudio de caso que demuestra la utilidad del método de cubo congelado y los datos de alta calidad obtenidos después de un almacenamiento prolongado. Partes del tejido hepático recolectadas de ratones hembra B6C3F1 expuestos a diversas concentraciones de un producto químico de prueba durante 90 días (n x 5/grupo) fueron picadas o cortadas en cubos y congeladas en el laboratorio de la vida y posteriormente enviadas a este laboratorio para su análisis. El tejido picado se analizó después de 2 meses de almacenamiento; debido a la mala calidad de los datos, el tejido en cubo congelado se analizó posteriormente después de 22 meses de almacenamiento. Para garantizar que las células en el extremo superior del continuo daño del ADN inducido por productos químicos no se excluyeron del análisis, se incluyeron datos de células escortables que, tras la inspección visual parecían ser erizos. (A) Grupo significa % resultados de ADN de cola. En comparación con el tejido picado, se obtuvieron resultados de alta calidad a partir de tejido en cubo congelado, incluso después de un almacenamiento prolongado. (B) Grupo significa % resultados de erizo. La mala técnica de picado es evidente a partir del extenso daño no biológico del ADN observado como cometas erizos en las muestras de tejido picado. Las barras de error reflejan la desviación estándar. Se utilizó un ANOVA con prueba de Dunnett para evaluar una respuesta positiva al producto químico de prueba para cada método de preparación de la muestra. No se detectaron grupos de dosis estadísticamente significativas(p < 0.05) para ninguno de los dosmétodos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Daño basal del ADN medido en tejidos cerebrales de ratas congeladas. Los resultados del ensayo de cometas se proporcionan para tejidos picados o en cubos congelados que representan varias regiones diferentes del cerebro de ratas Sprague Dawley machos y hembras. Los datos (generados por la inclusión de cometas de erizo escorables) se cotejaron en varios estudios; n Número total de tejidos cerebrales evaluados para cada método de preparación de la muestra. Las barras de error reflejan la desviación estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Como se demostró anteriormente7,12,13, tejido picado congelado con flash correctamente manejado proporciona buenos resultados en el ensayo del cometa. De hecho, los valores basales de ADN de cola porcentual para el hígado de rata y ratón picado congelado según lo normal son del 6 %, como se recomienda en la directriz de prueba9 de la OCDE para muestras de hígado de rata recién picada. Se han obtenido buenos resultados por múltiples laboratorios utilizando una variedad de tipos de tejidos que han sido picados y almacenados congelados; Del mismo modo, células epiteliales congeladas flash raspadas de órganos en el tracto gastrointestinal se han utilizado con éxito en el ensayo del cometa7,12,13,14. El tejido picado/raspado congelado parece ser relativamente estable durante al menos varios meses. El método que emplea la homogeneización de cubos de hígado congelados flash utilizando un dispositivo de picado de tejido originalmente descrito por Jackson et al.6, produce resultados en el ensayo del cometa al menos comparable y típicamente mejor (es decir, niveles basales más bajos de daño en el ADN) que los obtenidos para el hígado picado congelado. Esta metodología también es aplicable a otros tipos detejidos 6; en nuestra experiencia, se han obtenido excelentes resultados de forma similar utilizando duodeno en cubocongelado (datos no mostrados) y tejido cerebral(Figura 5). Sin embargo, el dispositivo de tamiz puede no ser susceptible de homogeneización de todos los tipos de tejido. En un estudio piloto, encontramos que el tejido cardíaco muscular no podía ser forzado fácilmente a través del dispositivo de tamiz, lo que resulta en una mala recuperación celular; en su lugar, la picadura del tejido inmediatamente después de la descongelación produjo suspensiones celulares con valores basales de porcentaje de ADN de cola comparables a los picados antes de la congelación del flash (datos no mostrados). En particular, cuando se manipula correctamente durante la necropsia (es decir, mantener el frío y la humedad; parpadear congelado según piezas individuales y no se permite descongelar parcialmente), el tejido en cubos congelado con flash ha producido un daño de ADN basal muy bajo incluso después de aproximadamente dos años de almacenamiento del congelador(Figura 4).
El uso de suspensiones celulares congeladas o tejido en cubos en el ensayo del cometa ofrece varias ventajas sobre el tejido fresco, incluyendo: 1) la facilitación de la recolección simultánea de múltiples tipos de tejido para el análisis de cometas; 2) facilitación de la recolección de tejidos en un laboratorio en la vida y transferencia de muestras a un laboratorio diferente para su análisis; 3) conveniencia de aplazar la decisión de analizar un tejido dado durante meses. Aunque la homogeneización del tejido congelado en el momento de la preparación del portaobjetos es más engorrosa que la piquedeste del tejido fresco en el momento de la cosecha, el uso de tejido en cubos congelado ofrece varios beneficios adicionales que incluyen: 1) ningún requisito para el personal entrenado en el ensayo del cometa (por ejemplo, unidad móvil) o suministros/reactivos especializados en la necropsia; 2) menos oportunidades para errores técnicos (por ejemplo, calentamiento de muestras; liberación insuficiente de células; tamaño de muestra de tejido subóptimo) durante la necropsia; 3) oportunidad mínima de introducir daños mecánicos en el ADN durante el procesamiento de la muestra (por ejemplo, cizallamiento de picado); y 4) daño basal bajo en el ADN, incluso después de un almacenamiento prolongado.
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Disclosures
Este trabajo fue apoyado por el Programa de Investigación Intramuros del NIH, Instituto Nacional de Ciencias de la Salud Ambiental (NIEHS) bajo el contrato HHSN273201300009C; sin embargo, las declaraciones, opiniones o conclusiones contenidas en ellas no representan necesariamente las declaraciones, opiniones o conclusiones del NIEHS, nides o el gobierno de los Estados Unidos.
Acknowledgments
Los autores están en deuda con Lincoln Martin y Kelley Owens por la asistencia técnica de expertos preparando y puntuando diapositivas de cometas y la Dra. Carol Swartz para realizar análisis estadísticos. Los autores también reconocen las contribuciones de apoyo de los miembros de los programas de Toxicología Genética, Toxicología Investigativa y Necropsia en ILS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryovials | Corning Costar | 430488 | |
| Dental Wax Sheets | Electron Microscopy Sciences | 72670 | |
| Dissecting (Mincing) Micro Scissors | Fisher Scientific | 08-953-1B | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Gibco | 14175-079 | |
| KCl | Teknova | P0315-10 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Low Melting Point Agarose | Lonza | 50081 | |
| Microfuge Tubes (1.7 mL) | Corning | 3207 | |
| Na2EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | |
| Neutral Buffered Formalin | Leica | 600 | |
| Scalpel Blades | Miltex | 4-110 | |
| Syringe Plunger (1 mL) | Fisher Scientific or Vitality Medical | 14-826-88; 8881901014 | Becton Dickinson or Monoject tuberculin syringe |
| Tissue Mincing Device | NorGenoTech (Oslo, Norway) | None | Small variability in diameter observed which can affect snuggness of plunger. |
| Tweezers, plastic | Trade Winds Direct | DF8088N | Reinforced nylon, nonsterile, blunt tip, autoclavable; tradewindsdirect.com |
| Weigh Boats | Krackler Scientific/Heathrow Scientific | 6290-14251B |
References
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