Summary
Bu protokol, DNA hasarı değerlendirmek için kuyruklu yıldız testinde kullanılmak üzere nekropsi sırasında yüksek kaliteli dondurulmuş doku örnekleri hazırlamak için çeşitli prosedürler açıklar: 1) kıyılmış doku, 2) gastrointestinal sistemden kazınmış epitel hücreleri, ve 3) küp doku bir doku kıyma cihazı kullanarak homojenizasyon gerektiren örnekler.
Abstract
Kuyruklu yıldız tsay, özellikle kimyasallara veya diğer çevresel strese maruz kaldıktan sonra, kültürlü hücre ve dokularda DNA hasarını değerlendirmek için bir araç olarak popülerlik kazanıyor. Kemirgenlerdeki genotoksik potansiyel için yapılan düzenleyici testlerde kuyruklu yıldız titrelerinin kullanımı, 2014 yılında Ekonomik İşbirliği ve Kalkınma Örgütü (OECD) test kılavuzunun benimsenmesi ile yürütülmüştür. Kuyruklu yıldız asa slaytları genellikle nekropsi sırasında taze dokudan hazırlanır; ancak, dondurucu doku örnekleri hayvan başına birden fazla organdan ve çalışma başına birçok hayvandan slaytların eşzamanlı hazırlanması ile ilişkili lojistik zorlukları önleyebilir. Donma aynı zamanda maruz kalma tesisinden analiz için farklı bir laboratuvara numune lerin sevkiyatını sağlar ve dondurulmuş dokunun depolanması, belirli bir organ için DNA hasar verileri oluşturma kararının ertelenmesini kolaylaştırır. Alkali kuyruklu yıldız testi, pozlamaya bağlı DNA çift ve tek iplikçikli kırıkları, alkali-labile lezyonlarını ve eksik DNA eksizyonu onarımı ile ilişkili iplikçik kırıklarını tespit etmek için yararlıdır. Ancak, DNA hasarı da mekanik kesme veya yanlış numune işleme prosedürleri, tahsin sonuçları kafa karıştırıcı neden olabilir. Nekropsiler sırasında doku örneklerinin toplanması ve işlenmesinde tekrarlanabilirlik, kuyruklu yıldız tadına göre dokuların hasat edilmesinde farklı düzeyde deneyime sahip laboratuvar personelinin dalgalanması nedeniyle kontrol edilmesi zor olabilir. Deneyimli laboratuvar personeliyle çalışan tazeleme eğitimi veya mobil ünitelerin konuşlandırılması yoluyla tutarlılığın artırılması maliyetlidir ve her zaman mümkün olmayabilir. Kuyruklu yıldız tahlil analizi için yüksek kaliteli örneklerin tutarlı nesil optimize etmek için, özelleştirilmiş doku kıyma cihazı kullanarak doku flaş dondurulmuş küpleri homojenleştirme için bir yöntem değerlendirildi. Bu yöntemle kuyruklu yıldız tadına göre hazırlanan numuneler, nekropsi sırasında kıyma ile hazırlanan taze ve dondurulmuş doku örnekleriile kalite açısından olumlu karşılaştırılabı. Ayrıca, uzun süreli depolandıktan sonra dondurulmuş doku küplerinden hücrelerde düşük bazsatır DNA hasarı ölçüldü.
Introduction
Kuyruklu yıldız tsay giderek kimyasallar veya diğer çevresel stres 1 maruz kültürlü hücre ve dokularda DNA hasarı değerlendirmek için bir araç olarakkullanılır. Titrek, DNA çift ve tek iplikçikli sonları, alkali-labile lezyonlarını ve eksik DNA onarımı ile ilişkili tek iplikçikli sonları tespit edebilir. Farmasötik testler için Farmasötik Ürünler için Teknik Gerekliliklerin Uyumlaştırılması Uluslararası Konseyi (ICH) farmasötik testler için kılavuz, kemirgen eritrosit mikronükleus testini sağlamak için ikinci bir test olarak kuyruklu yıldız testi gibi bir DNA iplikçik kırılması testi önerir ve tümör indüksiyonu hedef organlarında eylem modunu değerlendirmek için bir takip testiolarak 2. Avrupa Gıda Güvenliği Otoritesi (EFSA) in vivo kuyruklu yıldız testi bir in vitro genotoksisite testi olumlu bir sonucun alaka araştırmak için uygun bir takip testi olarak önerir3. 2014 yılında, kemirgen kuyruklu yıldız testi için bir OECD test kılavuzu onaylanarak, genotoksik potansiyelin düzenleyici testlerinde kullanılmak üzere testin kabul edilebilirliği artırıldı. Test, sakinleştirilmiş DNA döngüleri ve lized hücrelerin çekirdeklerinden göç eden parçaların elektroforetik olarak ayrılmasına dayanır. Temel olarak, tek hücreler mikroskop slaytlar üzerine katmanlı olmuştur agarose gömülüdür. Slaytlar daha sonra bir alkalin (pH > 13) çözeltisi, sıkıca sarılmış nükleer DNA dinlenmek ve gevşemek için izin veren bir lysis tampon batırılır. Slaytlar daha sonra bir elektrik alanına yerleştirilir, bu da negatif yüklü DNA'nın atota doğru göçüne neden olur ve kuyruklu yıldıza benzeyen görüntüler oluşturur; kuyruklu yıldız kuyruğundaki göreceli DNA miktarı, kuyruklu yıldız kafasıyla karşılaştırıldığında DNA hasarının miktarıyla doğru orantılıdır; Kuyruktaki DNA içeriği genellikle dijital görüntüleme yazılımı kullanılarak ölçülür.
Kuyruklu yıldız testi parçalanmış DNA'yı algıladığı için, maruziyete bağlı DNA hasarının doğru niceliği, tedaviye bağlı sitotoksisite veya stresten kaynaklanan nekroz veya apoptozla ilişkili kromatin parçalanması yla şaşırtılabilir. Ayrıca, DNA hasarı mekanik kesme veya yanlış numuneişleme4 sonucu oluşabilir. Dna hasarının temel düzeyini en aza indirmek için slayt hazırlama öncesinde soğutulmuş hasat doku bakımının önemi daha önce gösterilmiştir5,6. Birçok laboratuvar taze dokudan kuyruklu yıldız adaçayı slaytları hazırlar; ancak, bu çok sayıda hayvan ile yapılan bir çalışmada hayvan başına birden fazla doku türünden slaytlar hazırlarken lojistik zor olabilir. Ayrıca, bu durum, uzak bir laboratuvarda slayt hazırlama ve analizlerin yapılacağı ve numunelerin sevkiyatının gerekli olduğu bir sorun teşkil ediyor. Örneğin, ABD Ulusal Toksikoloji Programı, genetik toksikoloji test programının bir bileşeni olarak kuyruklu yıldız tökezlemeyi içerir (https://ntp.niehs.nih.gov/testing/types/genetic/index.html) ve bazen 28 veya 90 gün tekrar doz toksisite çalışmaları içine test içerir; bu, dokuların yaşam içi laboratuvar tarafından toplanmasını ve numunelerin analiz için başka bir laboratuvara aktarılmasını gerektirir. Bunu başarmak için, doku parçaları kıyılmış ve / veya gastrointestinal sistem epitel hücreleri kazınmış ve hücresel süspansiyonlar dondurulmuş ve analiz7kadar alıcı laboratuvar tarafından sonraki sevkiyat ve depolama için bir dondurucuda saklanır . Numunelerin doğru şekilde işlenmesi, dondurulmuş doku kullanılarak yüksek kaliteli veri elde edilmesi için çok önemlidir; ancak, sürekli değişen personel tarafından gerçekleştirilen nekropsiler sırasında doku örneklerinin tekrarlanabilir manipülasyonu kontrol etmek zordur, özellikle kuyruklu yıldız tayı için rutin olarak doku hasat olmayan yaşam laboratuvarlarında. Nekropsi personelinin tazelemesi eğitimi veya deneyimli laboratuvar personeli tarafından taze veya dondurulmuş doku örnekleri toplamak için personele ait bir mobil ünitenin kullanımı genellikle çok maliyetlidir, mümkün değildir veya sadece küçümsenmez.
Kuyruklu yıldız tahlil analizi için uzak bir bölgeye transfer için yüksek kaliteli doku örnekleritutarlı nesil sağlamak için, doku flash dondurulmuş küpleri doku koruma yayınlanan bir yöntem6 programı araştırıldı. Bu yöntemde, dondurulmuş doku küpleri, soğuk tampon içeren bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirilen paslanmaz çelik doku kıyma cihazına(Şekil 1)yüklenir. Doku küpü daha sonra cihazın sonunda küçük bir ölçer örgü ile itilir. Tekrar tekrar her iki yönde de örgü elek yoluyla doku süspansiyon zorlayarak nispeten düzgün tek hücreli süspansiyon ile sonuçlanır. Bu yöntemle hazırlanan numuneler, kalite olarak hem taze hem de dondurulmuş doku örnekleri ile karşılaştırıldı. Ek bir yararı olarak, kıyma örnekleri aksine, doku küpleri uzun süre dondurulmuş saklanabilir ve hala kuyruklu yıldız tahsini yüksek kaliteli sonuçlar verim.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dokular, İyi Laboratuvar Uygulamaları yönetmelikleri (21 CFR Bölüm 58) ve Kurumsal Hayvan tarafından onaylanan hayvan kullanım protokolleri uyarınca NTP sözleşme laboratuvarlarında AAALAC akredite tesislerde yapılan çalışmaların yürütülmesi sırasında hasat edildi Her laboratuvarda Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC).
1. Doku Hasat ve İşleme
NOT: Gerekirse yeniden analiz yapabilmek için yinelenen numune tüplerinin (örn. karaciğer) hazırlanması veya numunenin yaklaşık yarısının başka bir depolama tüpüne (örn. duodenum, mide) aktarılması yararlıdır. Bağırsak sistemi dokuları için olası numuneden numuneye değişkenliği en aza indirmek için, her hayvan için mideye göre aynı doku bölgesinin örnekalınmasına özen gösterilmelidir ve bir örnek çoğaltılabilir numuneler oluşturmak üzere bölünür. Plastik forseps beyin gibi yapışkan dokuların transferi için tavsiye edilir. Bir seçenek olarak, konik bir tüpe bağlı 40 μm hücreli süzgeç kullanılarak homojen tek hücreli süspansiyonlar elde etmek için kıyma, kazınmış veya homojen doku preparatları filtrelenebilir.
- Herhangi bir bağlı bağlı doku, organ ve enkaz kaldırın organ (lar) ilgi. Çıkarıldıktan hemen sonra, kalan kan ve enkazkaldırmak için ,7 mL soğuk taze hazırlanmış kıyma çözeltisi (Mg++, Ca++ ve fenol kırmızısız Hank's Balanced Salt Solution, 10% v/v DMSO ve 20 mM EDTA pH 7.5) içeren orta büyüklükte bir tartım teknesinde organı şiddetle swish.
- Her organı, daha fazla işleme yapılına kadar, dokuların buz üzerinde, buzun altında tutmak için yeterli (~7 mL) soğuk kıyma solüsyonu içeren başka bir temiz tartı teknesine aktarın.
- İlgi çeken her organın bir bölümünü çıkarın ve katıştırma kasetine yerleştirin. Gelecekteki histopatoloji değerlendirmesi için laboratuvarın standart prosedürlerine göre %10 nötr tamponlu formalin, trim ve parafin ilerler.
- Karaciğer için sol lobun 5 mm boyuna kısmını kesin ve ~7 mL soğuk kıyma çözeltisinde hafifçe swish. Doku şeridini ~ 7 mL soğuk kıyma çözeltisi içeren temiz bir orta boy tartım teknesine yerleştirin ve daha fazla işlemeye hazır olana kadar buz üzerinde bakım ını yapın (adım 1.8 veya 1.11).
- Duodenum için, mideye duodenum proksimal 10 mm kısmını kesti. 21-25 G iğne kullanarak, enkaz ve bakterileri temizlemek için floş.
- İğneyi duodenumun bir ucuna yerleştirin ve 1 mL soğuk kıyma çözeltisi ile yıkayın.
- Duodenumu ters çevirerek ve 1 mL kıyma çözeltisi ile tekrarlayarak diğer yönü temizleyin. İğneyi at.
- Duodenumu açık dilimleyin ve ~7 mL kıyma çözeltisi içeren orta boy bir tartım teknesine koymadan önce kıyma çözeltisinin ~7 mL'sinde durulayın; daha fazla işlemeye hazır olana kadar buzüzerinde muhafaza edin (adım 1.8 veya 1.11).
- Beyin için, ilk iki yarımküreye beyin bölmek için yararlı olabilir; bir yarımküre olası histopatoloji için kaydedilebilir (bkz. adım 1.2).
- İlgi beyin bölgesi (ler) diseksiyon ve yavaşça soğuk kıyma çözeltisi ~ 7 mL swish.
- Doku(lar) ~7 mL soğuk kıyma çözeltisi içeren temiz bir orta boy tartım teknesine aktarın ve daha fazla işlemeye hazır olana kadar buzüzerinde bakım ını yapın (adım 1.8 veya 1.11; beyincik ve hipokampus gibi küçük bölgelerin daha fazla budama gerektirmeyebileceğini unutmayın).
- Mide için
- Ön mideyi çıkarın ve atın. Glandüler mideyi kesin ve orta büyüklükteki bir tartı teknesinde ~7 mL soğuk kıyma tamponu kullanarak gıdalardan arınarak yıkanın.
- Olası histopatoloji değerlendirmesi için fiksasyon için duodenuma 5 mm'lik salgı bezi mide proksimal şeridini çıkarın (bkz. adım 1.2).
- Kalan mideyi orta boy bir tartı teknesinde soğuk kıyma tamponunun ~7 mL'sine yerleştirin ve 15-30 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın.
NOT: Bu kuluçka adımı gerekli olmayabilir; Bu adım JaCVAM doğrulama protokolüne dahil edildi, ancak OECD testkılavuzunda belirtilmemiştir 8,9. - Mideyi temiz bir parafin parçasına (veya Petri kabına veya tartı teknesine) aktarın ve enkazları temizlemek için neşter bıçağı veya politetetraflorotenen (PTFE) kazıyıcı kullanarak yüzey epitelini iki veya daha fazla kez kazıyın. Bir pipet kullanarak 1 mL soğuk kıyma tamponu ile forceps ve durulamak ile gastrik mukozayı almak. Mide dokusunu temiz bir yüzeye veya tabağa aktarın.
- Hücreleri serbest bırakmak için mide epitelini kıyma çözeltisinde (genellikle 250 μL/fare veya 500-1.000 μL/rat) 4-5 kez (gerekirse daha fazla) bir neşter bıçağının veya PTFE kazıyıcının arkasına kazıyın. İsteğe bağlı olarak, daha fazla hücre kurtarmak için kıyma çözeltisi yaklaşık eşit hacimli doku durulayın. Bir pipet kullanarak serbest hücreleri içeren kıyma çözeltisi toplamak ve buz üzerinde bir mikrosantrifüj tüpü ne aktarım.
- Doku örnekleri için, karaciğer veya beyin dokusunun 3-4 mm'lik bir bölümünü veya ~5 mm duodenum'u kesip 1 mL soğuk kıyma solüsyonu içeren 1,5 veya 2,0 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Numunesoğuk tutarken, ince dağılana kadar kıyma makası ile hızlı bir şekilde kıyma (≤30 s). Örnek biraz bulutlu görünmelidir; ancak, tüpün altına yerleşecek bazı parçaların kalması yaygındır.
- Taze doku kullanmak için, buz üzerinde kıyılmış doku veya kazınmış epitel hücreleri içeren tüpler korumak; yaklaşık 1 saat hasat içinde kuyruklu yıldız slaytları hazırlamak için doku kullanın (bölüm 2'de özetlenmiştir).
- Doku örneklerinin dondurulması için, kazınmış epitel hücrelerinin kıyma veya toplanmasından hemen sonra
- Tüp kapağını ve damla tüpünü sıvı nitrojen içeren bir Dewar şişesine sabitle; tüpler nekropsi (≤3 h) süresince sıvı nitrojende tutulabilir.
- Bir kepçe kullanarak tüpleri alın ve sıralamak için kuru buz üzerine yerleştirin. Tüpleri -80 °C'lik bir dondurucuda kuru buz ve saklama kutusuna aktarın.
- Dondurulmuş doku küplerini hazırlamak için birkaç küçük doku parçası (≤4 mm çapında ve ~6 mm uzunluğunda; Şekil 1).
- Ayrı ayrı doğrudan orta ölçekli bir tartma tekne veya sıvı nitrojen içeren diğer uygun gemi içine bırakın.
- Parçaların tamamen donması ve tek tek dondurulmuş doku küplerini kuru buz üzerinde tutulan etiketli bir mikrosantrifüj tüpüne veya kriyotube'a aktarması için birkaç saniye bekleyin; parçaların donma işlemi sırasında bir araya toplanmış olmasını izin vermez.
- Tüpleri -80 °C'lik bir dondurucuda kuru buz ve saklama kutusuna aktarın.
2. Slayt Hazırlama
-
Kıymalı/kazınmış dokular için
- Islı buz üzerinde taze dokular içeren tüpleri bakımını yapıtın.
- Dondurulmuş doku tüplerini, numuneler tamamen eriyene kadar oda sıcaklığındaki su banyosuna yerleştirin ve soğuk tutulmalarını sağlar. Tüpleri hemen buza aktarın.
- Agarose'a (adım 2.3) transfer için hücreleri geri çekmeden hemen önce, her hücresüspansiyonuna hafifçe karıştırın; filtrelenmemiş numuneler için, büyük parçaların tüpün altına yerleşmesine izin verin. Tüm numuneler için slaytlar hazırlanana kadar tüm tüpleri buzüzerinde saklayın.
-
Küplü doku için
- 80 °C'lik dondurucudan doku küpleri içeren tüpleri alın ve slayt hazırlanınceye kadar kuru buzüzerinde muhafaza edin.
- Aliquot 1 mL Merchant's orta (0.14 M NaCl, 1.47 mM KH2PO4, 2.7 mM KCl, 8.1 mM Na2HPO4, 10 mM NaEDTA, pH 7.4) veya miskasyon çözeltisi her örnek için etiketli 1,7 mL mikrosantrifüj tüp içine ve buz üzerinde korumak.
- Doku erimesini önlemek için hızla çalışarak, oda sıcaklığındaki doku kıyma cihazının açık ucuna bir doku küpü yerleştirin (Şekil 1). Birden fazla doku parçaları kullanılabilir; gerekirse, dondurulmuş doku kesilebilir veya cihaza sığacak şekilde küp boyutunu azaltmak için soğuk bir harç ve havaneli kullanarak küçük parçalara çatlayabilir.
- Hızlı bir şekilde daha sonra soğuk kıyma solüsyonu içeren mikrocentrifuge tüp içine yerleştirilmelidir örgü ucuna doku itmek için cihaza bir boyut uyumlu şırınga piston takın; sıvıyı tüpü nakışmaya zorlamaktan kaçının. Dokunun tamamen erimesini sağlamak için cihazın örgü ucunu soğuk kıyma çözeltisine yaklaşık 5-10 s kadar batırın.
- Hücreler örgü gözenekleri ile ekstrüzyon görülene kadar tamamen piston depress. Daha sonra pistonu yaklaşık 2,5 cm yukarı çekin ve tekrar tamamen bastırın; kıyma çözeltisi bulanık hale gelene kadar işlemi birkaç kez tekrarlayın.
- Gerekirse, örnek 1100 rpm 5 dakika için soğutulmuş santrifüj ve supernatant bir kısmını n için hücre yoğunluğunu artırmak için konsantre olabilir.
- Her örnek için temiz bir doku kıyma cihazı kullanarak tüm numuneler için işlemi tekrarlayın.
- 37 °C'de %0,5 düşük erime noktası nın 450 μL'sini içeren bir tüpe 50 μL hücre süspansiyonu aktarın.
NOT: Hacimler ayarlanabilir, ancak agarose miktarı ≤%1 olmalıdır. - Daha önce açıklandığı gibi slaytları hazırlayın ve puanlayın10,11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Çalışma 1
Karaciğer erkek Sprague Dawley sıçanlar iki kohorthas hasat edildi 4 gün boyunca mısır yağı uygulanan, bir hafta ile sendeledi. Slaytlar taze kıyılmış doku, dondurulmuş kıyma doku ve dondurulmuş küp doku Merchant'S orta veya kıyma çözeltisi doku kıyma cihazı kullanılarak işlenmiş hazırlanmıştır. İlk kohorttan hayvanlardan elde edilen dondurulmuş dokular yaklaşık 3,5 ay boyunca dondurucu muhafazasından sonra değerlendirildi. İkinci kohorttan hayvanlardan elde edilen dondurulmuş dokular yaklaşık 6 ay saklandıktan sonra değerlendirildi. Ağır hasarlı hücrelerin (sitotoksisite veya mekanik stres içerebilen belirsiz etiyolojisi) karakteristik "kirpi" morfolojisini sergileyen kuyruklu yıldız, % kuyruk DNA'sının skorlamalarına dahil edilmedi; sadece morfolojinin görsel incelemesi ile tanımlanan kirpi yüzdesi, OECD TG 4899'agöre ayrı ayrı tablolandı. İki kohorttaki (100 hücre/hayvan ın skoruna göre) hayvanlar için ortalama % kuyruk DNA sonuçları Şekil 2A'daözetlenmiştir. Dondurulmuş doku kullanan tüm yöntemler, her zaman istatistiksel olarak farklı olmasa da, taze dokudan daha yüksek değerler üremiştür. Taze sıçan karaciğerinde % kuyruk DNA'sı için önerilen üst sınırın %69olduğu göz önünde bulundurulduğunda, bu sonuçlar bu yöntemlerden herhangi birinin dondurulmuş dokuyu değerlendirmek için iyi iş çıkarabileceğini göstermektedir. Kıyma çözeltisi en az eşit yanı sıra Merchant's orta gerçekleştirilen; ikincisi hazırlamak için daha zaman alıcı olduğundan, sonraki çalışmalar için kıyma çözeltisi seçildi. İşlemden önce ~6 ay boyunca dondurulmuş olarak saklanan ikinci hayvan kohortunun dokularda hasar da istatistiksel olarak anlamlı bir farklılık yoktu. Genel olarak, % kirpiler % kuyruk DNA'sına paralel direnmekle birlikte, dondurulmuş dokularda taze dokuya göre % kirpiler % kuyruk DNA'sına göre daha değişkendir(Şekil 2B). Taze dokudaki bu uç noktaların değerleri, donma yöntemleriyle ortaya çıkan DNA hasarının ölçülebildiği bir temel sağlar.
Çalışma 2
Dişi B6C3F1 farelere normal salin veya mutajen, etil metansülfonat (EMS) 200 mg/kg/gün olarak normal salin üç gün süreyle uygulandı. Doku son doz uygulamasından sonra 3 saat hasat edildi ve kuyruklu yıldız tahliltaze işlenir. Ek doku kıyma çözeltisi içinde kıyılmış veya küp olarak toplandıktan sonra dondurulmuş flaş oldu. Kübik numuneler, kuyruklu yıldız slaytlarının hazırlanmasından hemen önce elek cihazı kullanılarak kıyma çözeltisinde işlenmiştir. Kirpi morfolojisini sergileyen hücrelerin, kimyasal kaynaklı DNA hasarının sürekliliği sonundaki hücreleri temsil ettiği varsayımıüzerine, görüntüleme yazılımı tarafından skorunabilen kirpiler % kuyruk DNA'sının otomatik skorlama larına dahil edilmiştir. % kuyruk DNA sonuçları (150 hücre/hayvan puanlamasına göre) Şekil 3'teözetlenmiştir. Karaciğer dokusu küpler olarak dondurulmuş ve daha sonra doku kıyma cihazı kullanılarak işlenmiş çok taze kıyılmış doku için elde edilen sonuçlara benzer sonuçlar verdi. % kuyruk DNA değerleri dondurulmuş kıyma dokusu için biraz daha yüksekti, ancak dondurulmuş kıyma dokusu için temel değerleri% 6 altında idi, kuyruklu yıldız testi için OECD test kılavuzunda taze sıçan karaciğeri için tavsiye edildiği gibi9. Her üç yöntemle işlenen doku örneklerinde EMS kaynaklı DNA hasarında istatistiksel olarak anlamlı bir artış ölçüldü.
Çalışma 3
Uzak bir laboratuvar tarafından yürütülen bir test kimyasalı 90 günlük toksisite çalışmasında kadın B6C3F1 farelertoplanan karaciğer dokusunun bölümleri kıyılmış veya küpler halinde kesilmiş, flaş dondurulmuş, ve analiz için bu laboratuvara kuru buz üzerinde bir gecede sevk edildi. Kıymalı doku, ~2 aylık dondurucu depolanmasının ardından analiz edilmiştir(Şekil 4). Görsel inceleme de kirpi olarak ortaya çıkan ancak görüntüleme yazılımı tarafından korunabilen hücreler % kuyruk DNA ölçümlerine (150 hücre/hayvan) dahil edildi. Toplam 150 hücre/hayvanda morfolojinin görsel incelemesi ile tanımlanan kirpi lerin sayısı (şcorable veya noncorable) bu yüksek hasarlı hücrelerin sıklığı hakkında bilgi sağlamak için ayrı ayrı tablolandı. Genel olarak, dondurulmuş kıyma dokusundaki DNA hasarı (% kuyruk DNA'sı olarak ölçülür) araç kontrol grubu da dahil olmak üzere hayvan değişkenliğine önemli ölçüde hayvansal değişkenlik gösteren tüm doz gruplarında yüksekti. % kuyruk DNA sonuçları % kirpiler ile ilişkili (sadece morfoloji temelinde tanımlanan), kirpiler bu örneklerde gözlenen DNA hasarı yüksek düzeyde önemli ölçüde katkıda bulunduğunu gösteren. Kıyma dokusunda ölçülen DNA hasarının yüksek arka plan seviyesine göre, dondurulmuş küp doku daha sonra ~ 22 aylık depolama dan sonra analiz edildi(Şekil 4). Kıymalı doku örneklerine paralel olarak hazırlanan dondurulmuş küp dokuda hem DNA hasarı hem de % kirpiler çok düşüktü. Böylece, kıyma doku örneklerinde kirpi morfolojisi tarafından yansıyan yüksek hasarlı hücreler açıkça biyolojik bir sürecin sonucu değildi, ama büyük olasılıkla mekanik bozulma ve / veya doku ısınma sıyrık önce dondurulmuş flaş önce mincing işlemi ile tanıtıldı; bu verilerin güvenilmez olduğu kabul edildi. Neyse ki, dondurulmuş küp doku analizi açık bir sonuç sağladı, yani test kimyasal maruz kalma üç ay sonra kadın farelerin karaciğerbir DNA hasar yanıtı eksikliği. Bu vaka çalışması nın sağladığı sonuçlar, nispeten deneyimsiz bir laboratuvar tarafından kıymalı dokuların hazırlanması ile ilişkili riski örneklemektedir ve bu sorunu atlatmak için dondurulmuş küp doku yönteminin yararını göstermektedir.
Şekil 1: Doku kıyma cihazı ve dalgıç dondurulmuş dokudan tek hücre süspansiyon hazırlamak için kullanılır. Prototip cihaz (4.5 mm iç çapı, 0.4 mm örgü boyutu) Dr. Gunnar Brunborg (NorGenotech, Oslo, Norveç) tarafından sağlanmıştır. Sağdaki panel, cihazla birlikte kullanılmak üzere uygun büyüklükte bir doku küpü örneği sağlar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Taze ve dondurulmuş kıyma ve homojenize fare karaciğer örneklerinde ölçülen DNA hasarının karşılaştırılması. Karaciğer erkek Sprague Dawley sıçanlarının iki sendelenmiş kohort (n = 5/group/kohort) 4 gün boyunca mısır yağı uygulandı hasat edildi. Slaytlar taze kıyılmış doku, dondurulmuş kıyma doku ve dondurulmuş küp doku Merchant'S orta veya kıyma çözeltisi doku kıyma cihazı kullanılarak işlenmiş hazırlanmıştır. Dondurulmuş dokular sırasıyla 1 ve 2 kohortlar için nekropsi den sonra ~3.5 ve 6 ay analiz edildi. Morfolojiye dayalı kirpi olarak sınıflandırılan kuyruklu yıldız % kuyruk DNA'sının skorlamalarına dahil edilmedi. (A) Kohort % kuyruk DNA sonuçları anlamına gelir. (B) Kohort ortalama % kirpi sonuçları. Hata çubukları standart sapmayı yansıtır. Dondurulmuş dokuları her kohort için taze dokularla karşılaştırmak ve her doku hazırlama yöntemi için iki kohort arasındaki sonuçları karşılaştırmak için istatistiksel analizler yapılmıştır. *İstatistiksel olarak farklı(p < 0.05) öğrencinin t-testi kullanılarak aynı kohort içindeki taze kıyma dokusundan; #statistically(p < 0.05) aynı kohort içindeki taze kıyma dokusundan farklı olarak, normalde dağıtılmamış veriler için Mann-Whitney testini kullanarak; ¥ öğrencinin t-testini kullanan kohortlar arasındaki istatistiksel fark(p < 0.05). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Karaciğer dokusunda EMS tarafından indüklenen DNA hasarının farklı prosedürlerle karşılaştırılması. Dişi B6C3F1 fareler için ortalama % kuyruk DNA'sı veya 200 mg/kg/gün EMS üç gün süreyle (n = 5/grup). Karaciğerler son doz uygulaması nın ardından 3 saat hasat edildi ve kuyruklu yıldız tahliltaze işlenir. Ek karaciğer dokusu kıyma çözeltisi içinde kıyılmış veya küp olarak toplandıktan sonra dondurulmuş flaş oldu; kübik numuneler kuyruklu yıldız slaytlarının hazırlanmasından hemen önce doku kıyma cihazı kullanılarak homojenleştirildi. EMS kaynaklı DNA hasarının devamlılığı sırasındaki hücrelerin analizdışı edilmemesini sağlamak için, görsel inceleme sonucunda kirpilerin morfolojik tanımına uygun görünen ancak görüntüleme yazılımı ile korunabildiği tespit edilen kuyruklu yıldızlar dahil edilmiştir. Hata çubukları standart sapmayı yansıtır. Bir Öğrencinin t-testi, EMS'ye maruz kalan hayvanlardaki DNA hasarı nın miktarını her numune hazırlama yöntemi için araç kontrol hayvanlarındakiyle karşılaştırmak için kullanılmıştır. *P < p 0.05'te istatistiksel olarak anlamlı artış. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4. Uzun süreli depolamadan sonra elde edilen dondurulmuş küp yönteminin ve yüksek kaliteli verilerin yararını gösteren örnek çalışma. ~90 gün boyunca (n = 5/grup) çeşitli test kimyasalkonsantrasyonlarına maruz kalan dişi B6C3F1 farelerinden toplanan karaciğer dokusunun bir kısmı kıyma lı veya küp şeklinde kesilmiş ve yaşam içi laboratuvarda dondurulmuş flaş ve daha sonra analiz için bu laboratuvara sevk edilmiştir. Kıymalı doku depolama ~ 2 ay sonra analiz edildi; verilerin kalitesiz olması nedeniyle, dondurulmuş küp doku daha sonra depolama ~ 22 ay sonra analiz edildi. Kimyasal kaynaklı DNA hasarının sürekliliği sonundaki hücrelerin analizdışında kalmamasını sağlamak için, görsel inceleme sırasında kirpi olduğu ortaya çıkan korunabilir hücrelerden elde edilen veriler dahil edildi. (A) Grup ortalama % kuyruk DNA sonuçları. Kıyma lı dokuile karşılaştırıldığında, uzun süreli depolandıktan sonra bile dondurulmuş küp dokudan yüksek kaliteli sonuçlar elde edilmiştir. (B) Grup ortalama % kirpi sonuçları. Kötü kıyma tekniği, kıymalı doku örneklerinde kirpi kuyruklu yıldız olarak gözlenen biyolojik olmayan geniş DNA hasarından belirgindir. Hata çubukları standart sapmayı yansıtır. Her numune hazırlama yöntemi için test kimyasalına pozitif yanıt vermek için Dunnett testine sahip bir ANOVA kullanıldı. Her iki yöntem için de istatistiksel olarak anlamlı(p < 0.05) doz grubu saptamadı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Dondurulmuş sıçan beyin dokularında ölçülen temel DNA hasarı. Kuyruklu yıldız taht sonuçları erkek ve dişi Sprague Dawley sıçanlarının beyninin birkaç farklı bölgesini temsil eden dondurulmuş kıymalı veya küp dokular için sağlanmıştır. Veriler (şcorable kirpi kuyruklu yıldızları dahil edilerek oluşturulan) çeşitli çalışmalar üzerinde harmanlanmış; n = her numune hazırlama yöntemi için değerlendirilen beyin dokularının toplam sayısı. Hata çubukları standart sapmayı yansıtır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Daha önce gösterildiği gibi7,12,13, düzgün flaş dondurulmuş kıyma doku ele kuyruklu yıldız tahsiniyi iyi sonuçlar sağlar. Aslında, laboratuarımızda hazırlanan dondurulmuş kıyılmış sıçan ve fare karaciğeri için temel % kuyruk DNA değerleri, yeni kıyılmış fare karaciğeri örnekleri için OECD test rehberi9 tarafından tavsiye edilen genellikle ≤%6'dır. Dondurulmuş olarak doğrlanan ve saklanan çeşitli doku tipleri kullanılarak birden fazla laboratuvar tarafından iyi sonuçlar elde edilmiştir; aynı şekilde, gastrointestinal sistemde organlardan kazınmış flaş dondurulmuş epitel hücreleri kuyruklu yıldız titresibaşarıylakullanılmıştır7 ,12,13,14. Dondurulmuş kıyma / kazınmış doku en az birkaç ay için nispeten kararlı gibi görünüyor. Başlangıçta Jackson ve ark.6tarafından tanımlanan bir doku kıyma cihazı kullanarak karaciğer flaş dondurulmuş küplerin homojenizasyon kullanan yöntem, dondurulmuş kıyılmış karaciğer için elde edilendaha en az karşılaştırılabilir ve tipik olarak daha iyi (yani, DNA hasarı nın alt temel düzeyleri) kuyruklu yıldız tahtSonuçları verir. Bu metodoloji diğer doku tipleri6için de geçerlidir; deneyimlerimize göre, mükemmel sonuçlar benzer dondurulmuş küp duodenum (veriler gösterilmez) ve beyin dokusu(Şekil 5)kullanılarak elde edilmiştir. Ancak elek cihazı tüm doku tiplerinin homojenizasyonuna uygun olmayabilir. Bir pilot çalışmada, biz kas kalp dokusu kolayca elek cihazı ile zorlanmış olamazdı bulundu, kötü hücre kurtarma ile sonuçlanan; bunun yerine, doku hemen erime üzerine bazal % kuyruk DNA değerleri ile verilen hücre süspansiyonları miskleme bu flaş dondurma (veri gösterilmez) önce kıyılmış karşılaştırılabilir. Özellikle, nekropsi sırasında düzgün bir şekilde ele alınınca (yani, soğuk ve nemli tutulur; tek tek parçalar halinde dondurulmuş ve kısmen çözülmesine izin verilmeyen flaş), flaş dondurulmuş küp doku dondurucu depolama yaklaşık iki yıl sonra bile çok düşük temel DNA hasarı vermiştir(Şekil 4).
Kuyruklu yıldız tahlilde dondurulmuş hücre süspansiyonları veya küp doku kullanımı da dahil olmak üzere taze doku üzerinde çeşitli avantajlar sunar: 1) kuyruklu yıldız analizi için birden fazla doku türleri eşzamanlı toplama kolaylaştırma; 2) bir in-life laboratuvarda doku toplama kolaylaştırılması ve analiz için farklı bir laboratuvara numune transferi; 3) kolaylık aylarca belirli bir doku analiz etmek için bir karar ertelemek için. Slayt hazırlama sırasında dondurulmuş dokunun homojenizasyonu hasat sırasında taze doku kıyma daha hantal olmasına rağmen, dondurulmuş küp doku kullanımı dahil birkaç ek faydalar sunar: 1) kuyruklu yıldız tsurel eğitimli personel için hiçbir gereklilik (örneğin, mobil birim) veya necropsy özel sarf malzemeleri / reaktifler; 2) nekropsi sırasında teknik hatalar için daha az fırsat (örneğin, örnek ısınma; hücrelerin yetersiz salınımı; sub-optimal doku örnek boyutu) ; 3) numune işleme sırasında mekanik DNA hasarı tanıtmak için en az fırsat (örneğin, kıyma kesme); ve 4) düşük temel DNA hasarı, uzun süreli depolama sonra bile.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Bu çalışma, HHSN273201300009C sözleşmesi kapsamında NIH, Ulusal Çevre Sağlığı Bilimleri Enstitüsü (NIEHS) Intramural Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir; ancak, burada yer alan ifadeler, görüşler veya sonuçlar NIEHS, NIH veya Amerika Birleşik Devletleri hükümetinin ifadelerini, görüşlerini veya sonuçlarını temsil etmez.
Acknowledgments
Yazarlar lincoln Martin ve Kelley Owens uzman teknik yardım hazırlanması ve kuyruklu yıldız slaytlar ve Dr Carol Swartz istatistiksel analizler yapmak için puanlama için borçlubulunmaktadır. Yazarlar ayrıca ILS'de Genetik Toksikoloji, Araştırmacı Toksikoloji ve Nekropsi programlarının üyelerinin destekleyici katkılarını kabul etmektedirler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryovials | Corning Costar | 430488 | |
| Dental Wax Sheets | Electron Microscopy Sciences | 72670 | |
| Dissecting (Mincing) Micro Scissors | Fisher Scientific | 08-953-1B | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Gibco | 14175-079 | |
| KCl | Teknova | P0315-10 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Low Melting Point Agarose | Lonza | 50081 | |
| Microfuge Tubes (1.7 mL) | Corning | 3207 | |
| Na2EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | |
| Neutral Buffered Formalin | Leica | 600 | |
| Scalpel Blades | Miltex | 4-110 | |
| Syringe Plunger (1 mL) | Fisher Scientific or Vitality Medical | 14-826-88; 8881901014 | Becton Dickinson or Monoject tuberculin syringe |
| Tissue Mincing Device | NorGenoTech (Oslo, Norway) | None | Small variability in diameter observed which can affect snuggness of plunger. |
| Tweezers, plastic | Trade Winds Direct | DF8088N | Reinforced nylon, nonsterile, blunt tip, autoclavable; tradewindsdirect.com |
| Weigh Boats | Krackler Scientific/Heathrow Scientific | 6290-14251B |
References
- van der Leede, B. J., et al. Performance and data interpretation of the in vivo comet assay in pharmaceutical industry: EFPIA survey results. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 775-776, 81-88 (2014).
- ICH. International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH) S2(R1): Guidance on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended for Human Use. ICH. , (2012).
- EFSA. Scientific opinion on genotoxicity testing strategies applicable to food and feed safety assessment. EFSA Journal. 9 (9), 2379 (2011).
- Lorenzo, Y., Costa, S., Collins, A. R., Azqueta, A. The comet assay, DNA damage, DNA repair and cytotoxicity: hedgehogs are not always dead. Mutagenesis. 28 (4), 427-432 (2013).
- Guerard, M., Marchand, C., Plappert-Helbig, U. Influence of experimental conditions on data variability in the liver comet assay. Environmental and Molecular Mutagenesis. 55 (2), 114-121 (2014).
- Jackson, P., et al. Validation of freezing tissues and cells for analysis of DNA strand break levels by comet assay. Mutagenesis. 28 (6), 699-707 (2013).
- Recio, L., Kissling, G. E., Hobbs, C. A., Witt, K. L. Comparison of Comet assay dose-response for ethyl methanesulfonate using freshly prepared versus cryopreserved tissues. Environmental and Molecular Mutagenesis. 53 (2), 101-113 (2012).
- Uno, Y., et al. JaCVAM-organized international validation study of the in vivo rodent alkaline comet assay for detection of genotoxic carcinogens: II. Summary of definitive validation study results. Mutation Research/Genetetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 786-788, 45-76 (2015).
- OECD. OECD Guideline for the Testing of Chemicals: In Vivo Mammalian Alkaline Comet Assay. OECD. 489, (2016).
- Hobbs, C. A., et al. Comet assay evaluation of six chemicals of known genotoxic potential in rats. Mutation Research/Genetetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 786-788, 172-181 (2015).
- Ding, W., Bishop, M. E., Lyn-Cook, L. E., Davis, K. J., Manjanatha, M. G. In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver. Journal of Visualized Experiments. (111), 53833 (2016).
- Hobbs, C. A., Chhabra, R. S., Recio, L., Streicker, M., Witt, K. L. Genotoxicity of styrene-acrylonitrile trimer in brain, liver, and blood cells of weanling F344 rats. Environmental and Molecular Mutagenesis. 53 (3), 227-238 (2012).
- Hobbs, C. A., et al. Comprehensive evaluation of the flavonol anti-oxidants, alpha-glycosyl isoquercitrin and isoquercitrin, for genotoxic potential. Food and Chemical Toxicology. 113, 218-227 (2018).
- Pant, K., et al. Vehicle and positive control values from the in vivo rodent comet assay and biomonitoring studies using human lymphocytes: historical database and influence of technical aspects. Environmental and Molecular Mutagenesis. 55 (8), 633-642 (2014).
