Summary
Gen düzenleme teknolojileri, araştırmacıların gen fonksiyonlarını göreceli kolaylıkla araştırmak için zebra balığı mutantları oluşturmalarını sağlamıştır. Burada, zebra balıklarında in situ hibridizasyon sinyallerinin paralel embriyo genotiplemesi ve nicelemesi için bir kılavuz sa¤l›k sa¤l›k sa¤l›¤ › sa¤l›yor. Bu tarafsız yaklaşım, in situ hibridizasyona dayalı fenotipik analizlerde daha fazla doğruluk sağlar.
Abstract
In situ hibridizasyon (ISH), araştırmacıların mRNA dağılımını yerinde incelemelerini sağlayan ve on yıllardır gelişim biyolojisinde kritik bir teknik olan önemli bir tekniktir. Geleneksel olarak, çoğu gen ekspresyonu çalışması, özellikle örnek kimliklerin a priori olarak bilinen durumlarda önyargıya yatkın bir yöntem olan ISH sinyalinin görsel değerlendirmesine dayanıyordu. Daha önce bu önyargıyı aşmak ve ISH sinyallerinin daha doğru bir şekilde ölçülmesini sağlamak için bir yöntem rapor ettik. Burada, ISH lekeli embriyolara ilgi genlerinin ifade düzeylerini ölçmek ve buna karşılık gelen genotiplerle ilişkilendirmek için bu yöntemi uygulamak için basit bir kılavuz sayılacağız. Yöntem, karışık genotip örneklerinde mekansal olarak kısıtlı gen ekspresyonu sinyallerini ölçmek için özellikle yararlıdır ve geleneksel görsel puanlama yöntemlerine tarafsız ve doğru bir alternatif sağlar.
Introduction
Genom düzenleme teknolojilerinin (ZFN, TALENs ve daha yakın zamanda CRISPR/Cas9) piyasaya sürülmesi, vivo'daki belirli genlerin işlevini incelemek için dünya çapında bu sistemlerden yararlanan laboratuvar sayısında büyük bir artışa yol açmıştır. Özellikle zebra balığı genetik manipülasyon için münasip ve birçok mutantlar yakın geçmiş1,2üretilmiştir. Gelişimsel biyologlar için, embriyonik gelişimde gen mutasyonlarının fenotipik sonuçlarını değerlendirmenin en yaygın yöntemlerinden biri yerinde hibridizasyondur (ISH). Homozigot mutantları yabani tiplerinden veya heterozigot kardeşlerinden ayıran bariz morfolojik kusurların yokluğunda, farklı genotipleri doğru bir şekilde tanımlayabilmek gerekir.
Klasik ISH, ilgi geni ile seçilen marker genleri arasındaki düzenleyici etkileşimler hakkında sonuçlar elde etmek için sinyal yoğunluklarının nitel analizlerine dayanır. Yararlı olsa da, bu analizler teknik farklılıklardan muzdariptir ve araştırmacı beklentilerine göre önyargılı olabilir. Böylece, ilgili genotip önceden bilgisi olmadan, ISH lekeli embriyolar görüntüleme sonra gen ekspresyonunu ölçmek için bir yöntem geliştirilmiştir. Bunu etkili bir DNA çıkarma ve genotipleme izledi ve bu da gen ekspresyonu ile genotipi kantitatif olarak ilişkilendirmemizi sağladı3. Embriyosonrası ISH genotipleme önce kullanılmış olsa da4,5, ISH desenleri görüntü tabanlı niceleme yaygın çalışmaları bir çift dışında kullanılmamıştır6,7. En popüler alternatifler görsel puanlama veya ISH lekeli hücrelerin sayma güveniyor8,9,10, her ikisi de kötü tekrarlanabilirlik ve araştırmacı önyargı eğilimli. Bu yöntem, runx1 veya gata2bgibi mekansal olarak kısıtlanmış ifade desenleri ile genlerdeki değişiklikleri incelemek için özellikle yararlıdır , her ikisi de hemojenik endotel denilen aort taban hücrelerinin sınırlı bir alt kümesi ifade11,12.
Burada, Fiji13kullanarak görüntü analizi ile niceleme nin uygulanması için pratik bir kılavuz sağlamayı ve DNA çıkarma ve genotipleme protokolünü sağlamayı hedefliyoruz. Bu görsel olarak daha önce yayınlanmış yöntem3göstermek içindir. Yöntemimiz, ISH tarafından saptanan gen ekspresyonundaki varyasyonun doğru bir şekilde temsil edilmesine ve gen ekspresyonu düzeylerinin belirli genotiplere tarafsız bir şekilde atanmasına olanak sağlar.
Protocol
Hayvan denekleri ile ilgili prosedürler Hayvanlar (Bilimsel Prosedürler) Yasası 1986 tarafından düzenlenir ve İçişleri Bakanlığı ve yerel Hayvan Refahı ve Etik İnceleme Kurumu tarafından onaylanmıştır.
1. Görüntü ISH lekeli embriyolar
- Bir gliserol çözeltisi hazırlayın (50%-80% 1x PBS tampon) ve karışımı çözelti homojeize (örneğin, en az 5 dakika bir rulo bırakın). Bu çözelti oda sıcaklığında aylarca saklanabilir.
- Yerinde hibridizasyon sonra14,15,16,17, 3 mL Pasteur pipet ile gliserol çözeltisine embriyo transferi ve en az 5 dakika yerleşmek için bırakın. Görüntüleme embriyolar 24 hpf (saat sonra döllenme) daha büyük ise, onlar açıklandığı gibi ağartılmış olabilir18.
- Görüntülemeden sonra ISH lekeli embriyoları transfer etmek için yeterli PCR tüpünü hazırlayın ve etiketlayın.
- 3 mL Pasteur pipet ile bir cam depresyon slayt kuyunun altına% 100 gliserol ekleyin.
- 3 mL Pasteur pipetkullanarak, tek bir ISH lekeli embriyoyu dijital fotoğraf makinesi ve alt ve üst aydınlatma ile donatılmış stereomikroskop altında gerektiğinde cam kaydırağa ve yönlendirmeye aktarın.
NOT: Embriyoları görüntüleme için konumlandırmak için jel yükleme pipet uçlarını kullanın, ancak diğer araçlar (örn. forseps, diseksiyon iğnesi) eşit derecede yeterli olacaktır. - İlk embriyoyu kullanarak, aydınlatma ve maruz kalma süresini istenilen büyütmede ayarlayın. Aynı deneydeki tüm embriyolar için bu koşulları kullanın (örneğin, heterozigot mutant incross'tan 40 embriyo görüntüleme, aydınlatma, maruz kalma süresi ve büyütme herkes için aynı olduğundan emin olun).
- Gerektiği kadar embriyo görüntüle. Her görüntüyü benzersiz bir numarayla etiketleyin. Görüntülemeden sonra, embriyoyu aynı numarayla etiketlenmiş bir PCR tüpüne/plakasına aktarın.
NOT: Görüntüler TIF dosyaları olarak kaydedilmelidir, ancak diğer biçimler de yeterlidir.- Gerekirse, PCR tüpler / plakalar aşırı gliserol kaldırın.
NOT: Bu noktada, embriyolar oda sıcaklığında birkaç hafta PCR tüplerde saklanabilir.
- Gerekirse, PCR tüpler / plakalar aşırı gliserol kaldırın.
2. ISH lekeli embriyoların DNA'sını ayıklayın ve genotip
NOT: Burada, HoTSHOT yöntemi19'a dayalı genomik DNA'yı %95-%1003DNA çıkarma verimi ile izole etmek için güvenilir ve ucuz bir yöntem kullanın.
- Görüntüleme tamamlandıktan sonra, her tüpe 40-75 μL alkali lysis tamponu (örneğin, HoTSHOT) ekleyin.
- 95 °C'de yaklaşık 30 dakika kuluçkaya yatın ve eşit hacimde nötralizasyon tamponu eklemeden önce tüpleri 4 °C'ye kadar soğutun. 4 °C'de bir gecede kuluçka PCR verimliliğini artırabilir.
NOT: Bu noktada genomik DNA genotipleme için kullanılabilir veya -20 °C'de saklanabilir. - Uygun bir yöntemle genotip örnekleri (örneğin, HRMA, RFLP)3,20,21 ilgi mutasyonu için gerekli.
- Her örneğe karşılık gelen genotipi not edin (örn. bir elektronik tablo yazılımı kullanarak).
3. ISH lekeli embriyoların piksel yoğunluğunu ölçün (Fiji yazılımı kullanılarak görüntü analizi)
- in situ hibridizasyon (ISH) boyama sinyal yoğunluğunu ölçmek için, açıklanan gibi 8-bit gri tonlama tüm görüntüleri dönüştürmek3. Görüntüler olarak kaydedilirse. TIF dosyaları, toplu dönüştürme için bir Fiji makro kullanın3. Alternatif olarak, görüntüleri diğer biçimlerde dönüştürün (örn. . JPG) için . Uygun yazılım kullanarak TIF ve daha sonra Fiji kullanarak 8-bit gri tonlama dönüştürmek. Kolaylık sağlamak için, burada daha önce 3 ,bazı değişiklikler ile yayınlandı adım adım yordamdır.
- Fiji'deki görüntüleri açın ve Görüntü Edit > Invertile tersine çevirin. Daha sonra görüntü türünü 8-bit(Resim > Yazın > 8-bit)olarak değiştirin.
- Çokgen seçim aracını kullanarak, ilgi bölgesini (RoI) sinyali içeren bölgenin etrafındaki görüntüye el ile çizin.
- YG yöneticisini açmak için t tuşuna basın. YG'nin yoğunluğunu ölçmek için YG yöneticisinin Ölçü komutunu kullanın. Sonuçlar penceresinden ortalama değeri elektronik tablo yazılımına kopyalayın.
- Orijinal bölgeyle aynı boyut ve şekli sağlayarak aynı Yatırım Getirisini herhangi bir boyama içermeyen zebra balığının bölgesine taşıyın. Arka planı ölçmek için 3.4 adımını tekrarlayın.
- ISH sinyalinin ortalama piksel yoğunluğunu elde etmek için, her embriyo için lekeli bölgenin arka plan bölgesinin ortalama yoğunluk değerini çıkarın.
- Her yoğunluk değerini bir genotip (adım 2.3'ten) atayın.
4. Sonuçları uygun istatistiksel testlerle analiz etmek
- Normal dağılımdaki sapmaları tanımlamak için bir Q-Q çizimindeki tüm değerleri çizin.
NOT: Normal dağılım Kolmogorov-Smirnov testi veya Shapiro-Wilk testi ile de doğrulanabilir. Ancak, büyük örneklem boyutları için bu testlerde yanlış pozitif riski yüksektir. - Normal dağılımdan güçlü sapmalar varsa, devam etmeden önce normal olarak dağıtıldıklarından emin olmak için tüm değerleri (ln veya sqrt işlevlerini kullanarak) dönüştürün.
- Her genotip (wt vs. heterozigot vs. mutant) için atanan değerler arasındaki farkları %95 güven düzeyleriyle 2 kuyruklu ANOVA ile analiz edin, Levene testi ve Welch düzeltmesi ile varyansların eşitliğini hesaba katın. Her bir genotip çifti arasındaki çift yönlü karşılaştırmalar için, Tukey'in (eşit varyanslar) veya Games-Howell (eşit olmayan varyanslar) post-hoc testini kullanın.
- Dönüşüme rağmen değerler normal olarak dağıtılmazsa, sıralanan değerler arasındaki farkları analiz etmek için parametrik olmayan bir test (Kruskall-Wallis) kullanın ve post-hoc Dunn'ın bonferroni düzeltmesi ile çift yönlü çoklu karşılaştırma testi Karşılaştırma.
- Dönüştürülmemiş değerleri (3.6 adımdan) sonuçların en iyi temsili için nokta çizimleri olarak çizin.
Representative Results
Burada, görüntü nicelliği ve embriyo genotipleme için boru hattının pratik uygulamasını başka bir yerde yayınlanmış olaraktanımlıyoruz 3. Yöntemin iş akışı Şekil 1'degösterilmiştir. Bu yöntemin nasıl kullanılacağını göstermek için, ISH bir runx1W84X/+22 incross(Şekil 2)33 hpf embriyodnt3bb.1 için yapıldı. 130 embriyo protokolde ayrıntılı olarak aynı aydınlatma koşulları kullanılarak ve benzersiz bir sayı ile etiketleme görüntülendi. Görüntülemeden sonra, her embriyo genotipleme için bir PCR tüpüne transfer edildi. Bu noktada, görüntü çözümlemesi her görüntüye bir piksel yoğunluğu değeri atfetmek için gerçekleştirilmiştir. Genotip daha sonra ilgili görüntüye atanmış ve piksel yoğunluğu değerleri istatistiksel analiz için kendi genotiplerine göre gruplandırilmiştir. Runx1W84X/W84X mutantlarında dnmt3bb.1 ekspresyonunda bir azalma saptırıldı (Şekil 2A,B)3, önceki gözlemlerle uyum içinde5. İlginçtir ki, runx1W84X/+ heterozigot embriyolar dnmt3bb.1 ekspresyonunda(Şekil 2A,B)yabani tip kardeşlere göre anlamlı bir farklılık göstermedi, runx1'in bir kopyasının uygun seviyelerde dnmt3bb.1 ifadesini korumak için yeterli olduğunu düşündürdü.
Birçok zebra balığı mutantları aksi takdirde morpholino oligonükleotidler (MOs) gibi fonksiyon teknolojilerinin diğer kaybı kullanılarak tespit edilebilir bir embriyonik fenotip göstermek için başarısız. Bu tutarsızlık off-hedef etkileri de dahil olmak üzere nedenlerle bir dizi atfedilebilir, maternal protein telafisi, hipomorfik alel23 veya genetik tazminat yeni keşfedilen fenomen24,25,26,27. Bu örnekte, daha önce lmo4a MO kullanılarak yayınlanan verilerden bu yana runx1 ifadesinin lmo4auob100 mutantlarında azaltılmış veya kaybedilip kaybedilmediği sorulduğunda runx1'nin lmo4a morfolojilerinde azaldığını öne sürmüştür28. Burada, analiz yabani tip ve lmo4auob100 homozigot mutantlar arasında runx1 ekspresyonunda anlamlı bir fark saptamadı3 (Şekil 3A,B). Tek embriyo qPCR ile daha fazla analiz lmo4auob100 mutantlarda runx1 ekspresyonunda küçük ama önemli bir azalma olduğunu göstermiştir(Şekil 3C). Bu nedenle, görüntü nicelemesi ifade düzeylerinde küçük farklılıklar tespit etmek mümkün olmayabilir. Alternatif olarak, tespit ettiğimiz genotipler arasındaki farkın eksikliği gerçektir ve qPCR deneyleri hem lmo4a hem de runx1 ifade edildiği telenchephalon gibi diğer dokularda runx1 ekspresyonundaki değişiklikleri tespit ediyor. Araştırmacılar her zaman qPCR gibi bağımsız bir yöntem ile sonuçlarını doğrulamak gerekir, ama ideal akış sitometri tarafından ilgi doku için zenginleştirici, örneğin.
ISH'in yüksek arka plana sahip olduğu nadir durumlarda(Şekil 3D),bu alanın piksel yoğunluğu değeri o kadar yüksektir ki sinyal değerinden çıkarma negatif bir sayı üretir ve bu gibi durumlarda bu embriyolar analizden çıkarılır. Deneyimlerimize göre, bu runx1-probedembriyolar3 yaklaşık% 0.4 oluştu ama deneyler, problar veya reaktifler toplu arasında değişebilir. Bu yöntemin bir sınırlama olsa da, yüksek arka plan düşük frekans genel sonuçları etkilemek için çok düşüktür.
Arka plan düzeltmeleri için farklı alanları seçmenin etkisini test etmek için, ilk olarak runx1 ISH sinyalinin piksel yoğunluğunu 28 hpf embriyoda ölçtük ve arka plan düzeltmeleri için farklı bölgeleri kullandık (Şekil 4). Dört farklı bölge seçildi: gövde bölgesinde iki (R1 ve R2), biri sarısı bölgesinde (lekesiz, ancak arka plan boyama biriktirme olasılığı yüksek) ve yatırım getirisine daha küçük bir alan ön (R4, Şekil 4B). Bu bölgelerdeki piksel yoğunluğunun ölçülmesi, Yatırım Getirisi ile her iki arka plan alanı arasındaki yoğunlukta göreceli olarak kararlı bir fark olduğunu göstermiştir(Şekil 4C). Ancak, R3 her zaman çok yüksek değerler gösterdi (Yatırım Getirisi olanlar üzerinde). Ters çevirme ve 8-bit dönüşüm sonra, sarısı bölge çok parlak görünür ve bu nedenle bir arka plan düzeltme olarak kullanmak için uygun değildir. R2 Yatırım Getirisine daha yakındı ancak bazı ISH sinyali içeriyordu ve düzeltme için kullanmak, R1 (ISH sinyalinden uzakta, daha fazla dorsally bulunan) veya R4 ile karşılaştırıldığında ortalama piksel yoğunluğunu azalttı. Bu nedenle, R1 veya R4 arka plan düzeltmesi için kullanılabilecek uygun alanlardır (R4 alanı R1'den daha küçük olmasına rağmen). Daha sonra, runx1 ifadesini karşılaştırırken R1 veya R4 kullanımının sonuçları nasıl etkilediğini karşılaştırmak istiyoruz. Bunun için dll4+/- heterozigot29'u aşıladık ve runx1 ekspresyonunu rastgele seçilmiş yabani tip ve dll4-/-embriyolarda analiz ettik (Şekil 4E). Arka plan düzeltmesi için R1 veya R4 kullanılması tek tek değerleri etkilemiş olsa da, aynı genotipteki ortalama piksel yoğunlukları önemli ölçüde farklı değildi(Şekil 4E). Ayrıca, runx1 ifadesinin karşılaştırılması hala arka plan düzeltmesi olarak R1 veya R4 alanlarını kullanan genotipler arasında benzer ortalama yoğunluk değerleri verir (sırasıyla μR1=16.3 ve μR4=18.2). Birlikte ele alındığında, arka plan alanı seçimi önemli olmasına rağmen, ana kriter sarısı bölgeleri içermez olduğu sonucuna (arka plan boyama birikimieğilimli) ve arka plan piksel yoğunluğu değerlerini çarpık herhangi bir (özel) boyama içermemesi gerektiği.
Şekil 1: Paralel görüntü niceleme ve genotipleme protokolünün iş akışı. Mutant alel için balık heterozigotunun çaprazından toplanan embriyolar, standart BIR ISH protokolü ile ölçülen gen için incelenir. Görüntülemeden sonra, 0.2 mL PCR tüpiçinde doğrudan embriyoya lysis tamponu eklenerek HotSHOT protokolü kullanılarak genomik DNA çıkarılır ve ardından 95 °C'de 30 dk kuluçka yada 30 dk kuluçka yada dır. Bu DNA, embriyoların PCR, PCR ve restriksiyon parça uzunluğu polimorfizmi (RFLP), KASP tahlilleri veya başka uygun yöntemlerle genotipleme için kullanılır. Buna paralel olarak, her embriyo için görüntüler ters ve 8-bit gri tonlama dönüştürülür. ISH sinyali (sarı) ve arka plan (mavi) içeren aynı şekil ve boyuttaki ROI'lar el ile seçilir ve ölçülür. İlgili genotiplere atanan ölçümler istatistiksel olarak analiz edilir. Dobrzycki ve ark.3'tenuyarlanmışşekil bu rakamın daha büyük bir sürümünü görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: runx1 mutantlarında görüntü niceliği ISH tarafından dnmt3bb.1 ekspresyonunun azaldığı düzeylerde ortaya koymaktadır. (A) 33 hpf yabani tip (mavi), runx1+/W84X (yeşil) ve runx1W84X/W84X (turuncu) embriyolarında dnmt3bb.1 ifadesini gösteren örnek ish görüntüleri dorsal aortada. (B) Runx1W84X/W84Xembriyolarında (n=36) dnmt3bb.1 mRNA piksel yoğunluğu değerleri yabani tiplere (n=32) ve heterozigotlara (n=62) göre anlamlı olarak azalmıştır (ANOVA, p < 0.001). Varyasyon katsayıları yabani tip, heterozigot ve mutant gruplar için sırasıyla %24, %22 ve %21'dir. Mavi, yeşil ve turuncu veri noktası, A panelindeki örnek görüntülere karşılık gelir. Çubuklar ± s.d. ***p<0.001 (Games-Howell post-hoc testi) anlamına gelir. Dobrzycki ve ark.3'tenuyarlanmışşekil bu rakamın daha büyük bir sürümünü görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: Lmo4auob100mutantlarında ISH tarafından runx1 ekspresyon düzeylerinin ölçülmesi. (A) 28 hpf yabani tip (mavi), heterozigot (yeşil) ve lmo4auob100/uob100 (turuncu) embriyolarda runx1 için ISH'nin temsili görüntüleri, dorsal aorttaki ifadeyi gösterir. (B) Runx1 mRNA sinyalinin sayısallaştırılması, ISH tarafından tespit edilen 28 hpf yabani tip (n=15), heterozigot lmo4a+/- (het) (n=34) ve lmo4auob100/uob100 mutant (n=18) embriyoları farklı genotipler arasında runx1 piksel yoğunluğunda anlamlı bir fark göstermez (ANOVA,> p 0.6). Mavi, yeşil ve turuncu veri noktası, A panelindeki örnek görüntülere karşılık gelir. Çubuklar, normalleştirilmiş runx1 mRNA düzeylerini (2-ΔCt)tek yabani tipte (mavi; n=12) ve lmo4auob100/uob100 (mut, turuncu; n=12) embriyolarında (mut, turuncu; n=12) gösteren ve mutantlarda vahşi tipe göre runx1 seviyelerinin azaldığını gösteren ortalama ± s.d.(C) Boxplotları temsil eder. *p < 0.05(t testi). (D) Yüksek arka plan gösteren 28 hpf embriyo (runx1, sarı ok uçları için boyanmış) üzerinde bir ISH deney örneği. Dobrzycki ve ark.3'tenuyarlanmışşekil bu rakamın daha büyük bir sürümünü görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4: Arka plan yoğunluğu düzeltmesinin ölçüm sonuçlarına etkisi. (A) 28 hpf'de yabani tip embriyoda runx1 ISH boyamasının temsili görüntüsü. (B) Ters çevirme ve 8-bit'e dönüştürmeden sonra aynı görüntü. İlgi alanı (YG) yeşil ve arka plan düzeltme (R1-R4) için kullanılan dört farklı alanlarda vurgulanır sarı vurgulanır. (C) Panel B'de gösterilen tüm bölgelerdeki ham piksel yoğunluğu ölçümleri R3'teki yoğunluğun (sarısı) Yatırım Getirisi'ndeki gerçek ISH sinyalinden (n=11) sürekli olarak daha yüksek olduğunu unutmayın. (D) R1, R2 ve R4 arka plan alanlarını kullanarak RoI'daki Runx1 ifade düzeyleri. Yatırım getirisi, R1, R2 ve R3~28500 piksel alanları; R4~8500 piksel. Arka plan düzeltmesi (ROI-R3) tutarlı bir şekilde negatif değerler verdiği için R3 arka planının bu karşılaştırma için kullanılmadığını unutmayın. (E) Runx1 ekspresyon düzeyleri vahşi tip ve dll4-/- mutantlar arka plan düzeltmesi için R1 veya R4 kullanarak (her örnek için n=10). D ve E panellerinde istatistiksel analiz, piksel yoğunluğu değerlerinin normal olarak dağıtılmadığını varsayarak parametrik olmayan Kruskal-Wallis testi kullanılarak gerçekleştirildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
Gen ekspresyonunu ölçmek için bu yöntemi kullanırken birkaç faktör göz önünde bulundurulmalıdır. Ölçümler arasındaki değişkenliği azaltmak için görüntüleme koşulları deney boyunca (örneğin aydınlatma, maruz kalma süreleri ve embriyo konumlandırması) korunmalıdır. Numuneler arasındaki boyama farklılıkları maskelenebileceğinden, numunelerin aşırı boyanmasını önlemek için kritik bir nokta dır. Örneğin, Xenopus laevis embriyolarında Eto2 yokluğunda VegfA ekspresyonundaki azalma30 ancak 24 saatlik bir süre içinde dikkatlice izleyerek tespit edilebilir. Bu nedenle, doygunluğa ulaşmadan, ifadesini en iyi temsil eden her gen için yeterli boyama düzeylerini ampirik olarak belirlemek iyi bir uygulamadır. Overstaining ayrıca dönüştürülmüş 8 bitlik gri tonlama görüntülerinde arka plan pikselinin yoğunluğunu yapay olarak artıracak ve niceliklendirme sonuçlarını çarpıtacaktır. Ekstrem durumlarda, embriyonik dokularda arka plan düzeyi seçilen YG'deki ISH sinyalinden daha yüksek olabilir ve bu örnekler analizdışında tutulmalıdır. Benzer bir fenomen, lekesiz sarının arka plan düzeltmesi için uygunluğunu test ettiğimizde gözlenmiştir(Şekil 4). Ters çevirme ve 8-bit'e dönüştürmeden sonra, sarısı bölgesindeki koyu pikseller embriyodaki ISH sinyalinden daha parlak hale gelir ve arka plandaki düzeltilmiş değerleri negatif hale getirir. Böylece, arka plan düzeltme için sarısı kullanmaktan kaçının. Embriyodaki pigmentli alanlarda arka plan sinyalinin ölçülmesi (örneğin, gözler veya gövdenin sırt kısmı 26/28 hpf'den itibaren) nicel sonuçları eşit şekilde çarpıtacak ve ayrıca kaçınılmalıdır. Zebra balığı embriyolarının ISH18'den önce veya sonra beyazlatma protokolleri ve görüntüleme tavsiye edilmeden önce 24 hpf'den büyük embriyoların beyazlatma protokolleri vardır.
Bu yöntem, tanımlanmış bir alandaki piksel yoğunluğunu eşdeğer lekesiz bir alanda arka plan piksel yoğunluğuna göre ölçmeye dayandığından, her yerde bulunan veya her yerde ifade edilen genlerin olduğu gibi nicel olarak ölçülmesi için uygun değildir. Bunun yerine, arka plan piksel yoğunluğunu ölçmek için bir alanın kolayca tespit edilebildiği mekansal olarak sınırlı bir dağılıma sahip genlerin ekspresyonunu ölçmek için uygundur. Ek analizlerimiz şimdi, arka plan düzeltmesi için daha küçük bir alan (3-4kat daha küçük) kullanmanın, Yatırım Getirisi'ninkine eşdeğer bir alan kullanmaya benzer sonuçlar verdiğini göstermektedir. Bu, arka plan düzeltmesi için embriyonun açıkça lekelenmemiş alanlarını kullanabildiği sürece, yöntemin daha geniş uzamsal alanlarda ifade edilen genlere uygulanabilirliğini (ve dolayısıyla yoğunluk ölçümleri için daha büyük ROI'lar gerektiren) genişletir.
Son olarak, deneyci önyargısını en aza indirmek için genotiplemenin paralel olarak veya görüntü niceliği sonrasında yapılmasını öneriyoruz. İkinci bir deneyciden anonimleştirilmiş numuneler üzerindeki niceliği tekraretmesini ve ilk ölçüm kümesiyle karşılaştırmasını istemek de deneyci önyargısını azaltmaya yardımcı olacaktır. Ölçülecek görüntüler genotipleme gerektirmeyen tedaviler (örneğin, yabani tip vs kimyasal inhibitör veya vahşi tip vs MO nakavt) arasındaki bir karşılaştırmadan geliyorsa, ölçümleri yapan deneyci nin kimliği kör edilmelidir. Örnek.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan.
Acknowledgments
Oxford ve Birmingham'daki Biyomedikal Hizmetleri personeline mükemmel zebra balığı yetiştiriciliği için teşekkür ederiz. T.D. Wellcome Trust Kromozomu ve Gelişim biyolojisi doktora bursu (#WT102345/Z/13/Z) tarafından finanse edilmiştir. R.M. ve M.K. İngiliz Kalp Vakfı (BHF IBSR Bursu FS/13/50/30436) tarafından finanse edildi ve cömert destek için müteşekkir. R.M. BHF Araştırma Mükemmelliği Merkezi'nin (RE/13/1/30181), Oxford'dan destek aldığını kabul eder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL PCR tubes (8-strips with lids) | StarLab | A1402-3700 | 96-well plates are equally appropriate for sample handling but beware of cross contamination between samples |
| 3 mL Pasteur pipettes | Alpha Laboratories | LW4114 | |
| Cavity slides | Brand | BR475535-50EA | |
| Digital Camera (Qimaging Micropublisher 5.0) | Qimaging | ||
| Eppendorf Microloader tips | Eppendorf | 10289651 | the tips are used to orient the embryos for imaging in glycerol |
| Excel | Microsoft | ||
| F3000 Fiber Optic Cold Light Source | Photonic | ||
| Fiji | |||
| Glycerol | Sigma | G5516-1L | |
| Graphpad Prism 8.01 | GraphPad Software, Inc. | we prefer to use Graphpad, but other statistics software packages are also suitable (e.g. SigmaPlot or SPSS) | |
| HotSHOT alkaline lysis buffer | 25 mM NaOH, 0.2 mM disodium EDTA, pH 12 | ||
| HotSHOT neutralization buffer | Tris HCl 40 mM, pH 5 | ||
| PBS (10X) pH 7.4 | Thermofisher | 70011044 | |
| Stereomicroscope with illumination stand (Nikon SMZ800N) | Nikon | ||
| Thermocycler | Thermofisher |
References
- Varshney, G. K., et al. High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9. Genome Research. 25 (7), 1030-1042 (2015).
- Varshney, G. K., et al. CRISPRz: a database of zebrafish validated sgRNAs. Nucleic Acids Research. 44 (D1), D822-D826 (2016).
- Dobrzycki, T., Krecsmarik, M., Bonkhofer, F., Patient, R., Monteiro, R. An optimised pipeline for parallel image-based quantification of gene expression and genotyping after in situ hybridisation. Biology Open. 7 (4), bio031096 (2018).
- Bresciani, E., et al. CBFbeta and RUNX1 are required at 2 different steps during the development of hematopoietic stem cells in zebrafish. Blood. 124 (1), 70-78 (2014).
- Gore, A. V., et al. Epigenetic regulation of hematopoiesis by DNA methylation. Elife. 5, e11813 (2016).
- Fan, Y., et al. Tissue-Specific Gain of RTK Signalling Uncovers Selective Cell Vulnerability during Embryogenesis. PLoS Genetics. 11 (9), e1005533 (2015).
- Wen, B., et al. GATA5 SUMOylation is indispensable for zebrafish cardiac development. Biochimica et Biophysica Acta. 1861 (7), 1691-1701 (2017).
- Espin-Palazon, R., et al. Proinflammatory signaling regulates hematopoietic stem cell emergence. Cell. 159 (5), 1070-1085 (2014).
- Peterkin, T., Gibson, A., Patient, R. Redundancy and evolution of GATA factor requirements in development of the myocardium. Developmental Biology. 311 (2), 623-635 (2007).
- Genthe, J. R., Clements, W. K. R-spondin 1 is required for specification of hematopoietic stem cells through Wnt16 and Vegfa signaling pathways. Development. 144 (4), 590-600 (2017).
- Kalev-Zylinska, M. L., et al. Runx1 is required for zebrafish blood and vessel development and expression of a human RUNX1-CBF2T1 transgene advances a model for studies of leukemogenesis. Development. 129 (8), 2015-2030 (2002).
- Butko, E., et al. Gata2b is a restricted early regulator of hemogenic endothelium in the zebrafish embryo. Development. 142 (6), 1050-1061 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Lleras Forero, L., et al. Segmentation of the zebrafish axial skeleton relies on notochord sheath cells and not on the segmentation clock. Elife. 7, (2018).
- Jowett, T., Yan, Y. L. Double fluorescent in situ hybridization to zebrafish embryos. Trends in Genetics. 12 (10), 387-389 (1996).
- Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).
- Narayanan, R., Oates, A. C. Detection of mRNA by Whole Mount in situ Hybridization and DNA Extraction for Genotyping of Zebrafish Embryos. Bio-protocol. , e3193 (2019).
- Monteiro, R., Pouget, C., Patient, R. The gata1/pu.1 lineage fate paradigm varies between blood populations and is modulated by tif1gamma. EMBO JOURNAL. 30 (6), 1093-1103 (2011).
- Truett, G. E., et al. Preparation of PCR-quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and tris (HotSHOT). Biotechniques. 29 (1), 52-54 (2000).
- Wilkinson, R. N., Elworthy, S., Ingham, P. W., van Eeden, F. J. A method for high-throughput PCR-based genotyping of larval zebrafish tail biopsies. Biotechniques. 55 (6), 314-316 (2013).
- Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants. Developmental Dynamics. 238 (12), 3168-3174 (2009).
- Jin, H., et al. Definitive hematopoietic stem/progenitor cells manifest distinct differentiation output in the zebrafish VDA and PBI. Developement. 136 (4), 647-654 (2009).
- Stainier, D. Y. R., et al. Guidelines for morpholino use in zebrafish. PLoS Genetics. 13 (10), e1007000 (2017).
- El-Brolosy, M. A., Stainier, D. Y. R. Genetic compensation: A phenomenon in search of mechanisms. PLoS Genetics. 13 (7), e1006780 (2017).
- Rossi, A., et al. Genetic compensation induced by deleterious mutations but not gene knockdowns. Nature. 524 (7564), 230-233 (2015).
- Ma, Z., et al. PTC-bearing mRNA elicits a genetic compensation response via Upf3a and COMPASS components. Nature. 568 (7751), 259-263 (2019).
- El-Brolosy, M. A., et al. Genetic compensation triggered by mutant mRNA degradation. Nature. 568 (7751), 193-197 (2019).
- Meier, N., et al. Novel binding partners of Ldb1 are required for haematopoietic development. Development. 133 (24), 4913-4923 (2006).
- Kettleborough, R. N., et al. A systematic genome-wide analysis of zebrafish protein-coding gene function. Nature. 496 (7446), 494-497 (2013).
- Leung, A., et al. Uncoupling VEGFA functions in arteriogenesis and hematopoietic stem cell specification. Developmental Cell. 24 (2), 144-158 (2013).
