Summary
Genredigeringsteknik har gjort det möjligt för forskare att generera zebrafiskmutanter för att undersöka genfunktionen med relativ lätthet. Här ger vi en guide för att utföra parallellembryogenotypning och kvantifiering av in situ hybridiseringsignaler i zebrafisk. Detta opartiska tillvägagångssätt ger större noggrannhet i fenotypiska analyser baserade på in situ hybridisering.
Abstract
In situ hybridisering (ISH) är en viktig teknik som gör det möjligt för forskare att studera mRNA distribution in situ och har varit en kritisk teknik i utvecklingsbiologi i årtionden. Traditionellt förlitade sig de flesta genuttrycksstudier på visuell utvärdering av ISH-signalen, en metod som är benägen att bias, särskilt i fall där providentiteter är kända a priori. Vi har tidigare rapporterat om en metod för att kringgå denna bias och ge en mer exakt kvantifiering av ISH signaler. Här presenterar vi en enkel guide för att tillämpa denna metod för att kvantifiera uttrycksnivåerna av gener av intresse för ISH-färgade embryon och korrelera det med sina motsvarande genotyper. Metoden är särskilt användbar för att kvantifiera rumsligt begränsade genuttryckssignaler i prover av blandade genotyper och det ger ett opartiskt och korrekt alternativ till de traditionella visuella bedömningsmetoderna.
Introduction
Införandet av genomredigeringsteknik (ZFN, TALENs och på senare tid, CRISPR/Cas9) har lett till en massiv ökning av antalet laboratorier runt om i världen som använder sig av dessa system för att studera funktionen hos specifika gener in vivo. Zebrafisk i synnerhet är mottagliga för genetisk manipulation och många mutanter har genererats under de senaste1,2. För utvecklingsbiologer är en av de vanligaste metoderna för att bedöma de fenotypiska konsekvenserna av genmutationer i embryonal utveckling in situ hybridisering (ISH). I avsaknad av uppenbara morfologiska defekter som skiljer homozygous mutanter från deras vilda typ eller heterozygous syskon, är det viktigt att korrekt kunna identifiera olika genotypes korrekt.
Klassisk ISH bygger på kvalitativa analyser av signalintensiteter för att dra slutsatser om regelinteraktioner mellan genen av intresse och utvalda markörgener. Även användbara, dessa analyser lider av tekniska variationer och kan vara partisk av forskarnas förväntningar. Således har en metod utvecklats för att kvantifiera genuttryck efter avbildning ISH-färgade embryon, utan förkunskaper om motsvarande genotyp. Detta följdes av en effektiv DNA-extraktion och genotypning som tillät oss att kvantitativt korrelera genotyp med genuttryck3. Medan genotypning av embryon efter ISH har använts före4,5,bildbaserad kvantifiering av ISH mönster har inte använts i stor utsträckning bortsett från ett par studier6,7. De mest populära alternativen förlitar sig på visuella scoring eller räkning av ISH-färgade celler8,9,10, båda benägna att dålig reproducerbarhet och forskare bias. Denna metod är särskilt användbar för att studera förändringar i gener med uttryck mönster som är rumsligt begränsade, såsom runx1 eller gata2b, båda uttryckta i en begränsad delmängd av aortagolv celler som kallas haemogenic endothelium11,12.
Här strävar vi efter att ge en praktisk guide till genomförandet av kvantifieringen genom bildanalys med Fiji13, samt DNA-extraktions- och genotypningsprotokollet. Detta är tänkt att visuellt illustrera vår tidigare publicerade metod3. Vår metod möjliggör en korrekt representation av variationen i genuttryck upptäcks av ISH och en opartisk tilldelning av genuttryck nivåer till specifika genotyper.
Protocol
Förfaranden som rör djurförsök regleras av Animals (Scientific Procedures) Act 1986 och har godkänts av inrikesministeriet och det lokala djurskydds- och etiska granskningsorganet.
1. Bild ISH-färgade embryon
- Förbered en glycerollösning (50–80 % i 1x PBS-buffert) och blanda för att homogenisera lösningen (t.ex. lämna i en rulle i minst 5 min). Denna lösning kan hållas i månader vid rumstemperatur.
- Efter in situ hybridisering14,15,16,17, överföra embryon till glycerol lösning med en 3 mL Pasteur pipett och låt nöja sig med minst 5 min. Om bildembryon som är äldre än 24 hpf (timmar efter befruktning) kan de blekas enligtbeskrivningen 18.
- Förbered och märk tillräckligt med PCR-rör för att överföra ISH-färgade embryon efter avbildning.
- Tillsätt 100% glycerol till botten av brunnen i ett glas depression bild med en 3 mL Pasteur pipett.
- Med hjälp av en 3 mL Pasteur pipett, överföra en enda ISH-målat embryo till glasrutschbanan och orientera efter behov enligt ett stereomikroskop utrustad med en digitalkamera och botten och topp belysning.
OBS: Använd gellastning spipett spetsar för att placera embryon a-bilder, men andra verktyg (t.ex. pincett, dissekera nål) kommer att vara lika tillräcklig. - Justera belysningen och exponeringstiden vid önskad förstoring med hjälp av det första embryot. Använd dessa villkor för alla embryon i samma experiment (dvs. om bildbehandling 40 embryon från ett heterozygous mutantincross, se till att belysningen, exponeringstiden och förstoringen är desamma för alla).
- Bild så många embryon som krävs. Märk varje bild med ett unikt nummer. Efter avbildning, överför embryot till ett PCR-rör/platta märkt med samma nummer.
Bilder ska sparas som TIF-filer, men andra format är också tillräckliga.- Vid behov, ta bort överflödig glycerol i PCR-rören/plattorna.
OBS: Vid denna punkt kan embryona lagras i PCR-rören i flera veckor vid rumstemperatur.
- Vid behov, ta bort överflödig glycerol i PCR-rören/plattorna.
2. Extrahera DNA och genotyp ish-färgade embryon
OBS: Här, använd en tillförlitlig och billig metod för att isolera genomisk DNA baserat på HoTSHOT metod19 med en DNA-extraktionseffektivitet på 95%-100%3.
- När avbildningen är klar, tillsätt 40-75 μL alkalisk lysbuffert (t.ex. HoTSHOT) till varje rör.
- Inkubera vid 95 °C i ca 30 min och kyl rören till 4 °C innan du lägger till en lika stor volym neutraliseringsbuffert. En inkubation över natten vid 4 °C kan förbättra PCR-effektiviteten.
OBS: Vid denna punkt kan genomiska DNA användas för genotypning eller lagras vid -20 °C tills det krävs. - Genotypprover med en lämplig metod (t.ex. HRMA, RFLP)3,20,21 efter behov för omvandling av intresse.
- Observera genotyp som motsvarar varje prov (t.ex. med hjälp av ett kalkylbladsprogram).
3. Kvantifiera pixelintensiteten hos ISH-färgade embryon (bildanalys med fijiansk programvara)
- Om du vill kvantifiera in situ-hybridiseringssignalintensiteten (ISH) konverterar du alla bilder till 8-bitars gråskala enligtbeskrivningen 3. Om bilderna har sparats som . TIF-filer använder du ett Fiji-makro för batchkonvertering3. Du kan också konvertera bilder i andra format (t.ex. . JPG) till . TIF använder lämplig programvara och konvertera sedan till 8-bitars gråskala med Fiji. För enkelhetens skull, här är steg-för-steg förfarande som publicerades tidigare3, med vissa ändringar.
- Öppna bilder i Fiji och invertera bilden med Redigera > Invertera. Ändra sedan bildtypen till 8-bitars (Bild > Typ > 8-bitars).
- Rita området med intresse (ROI) manuellt med hjälp av polygonmarkeringsverktyget på bilden runt om i regionen som innehåller signalen.
- Tryck på t för att öppna ROI-hanteraren. Använd kommandot Mått för ROI-hanteraren för att mäta intensiteten i roi.Use the ROI manager's Measure command to measure the nsity of the ROI. Kopiera medelvärdet från resultatfönstret till ett kalkylbladsprogram.
- Flytta samma ROI, vilket säkerställer samma storlek och form som den ursprungliga regionen, till en region i zebrafisk som inte innehåller någon färgning. Upprepa steg 3.4 för att mäta bakgrunden.
- För att få den genomsnittliga pixelintensiteten hos ISH-signalen subtrahera medelvärdet för bakgrundsregionen från den färgade regionen för varje embryo.
- Tilldela varje intensitetsvärde till en genotyp (från steg 2.3).
4. Analysera resultaten med lämpliga statistiska tester
- Rita alla värden på en Q-Q-plot för att identifiera eventuella avvikelser från normal distribution.
OBS: Normal distribution kan också verifieras med Kolmogorov-Smirnov testet eller Shapiro-Wilk testet. För stora urvalsstorlekar finns det dock en hög risk för falska positiva i dessa tester. - Om det finns starka avvikelser från normal distribution, omvandla alla värden (med ln eller sqrt funktioner) för att se till att de normalt distribueras innan du fortsätter.
- Analysera skillnaderna mellan de värden (omvandlas vid behov) som tilldelats varje genotyp (wt vs. heterozygote vs mutant) med 2-stjärtade ANOVA med 95% förtroendenivåer, står för jämlikhet mellan varianser med en Levene test och Welch korrigering. För parvis jämförelser mellan varje par genotyper, använd Tukeys (lika varianser) eller Games-Howell (ojämlika avvikelser) efter hoc-test.
- Om värdena normalt inte distribueras trots omvandlingen, använd ett icke-parametriskt test (Kruskall-Wallis) för att analysera skillnaderna mellan rangordnade värden och ett posthoc Dunns multipeljämförelser test med Bonferroni korrigering för parvis Jämförelser.
- Rita de otransformerade värdena (från steg 3.6) som punktområden för bästa representation av resultaten.
Representative Results
Här beskriver vi den praktiska tillämpningen av rörledningen för bildkvantifiering och embryogenotypning som publiceras på annat håll3. Arbetsflödet för metoden visas i figur 1. För att illustrera hur man använder denna metod utfördes ISH för dnmt3bb.1 i 33 hpf embryon från en runx1W84X/+22 incross ( figur2). 130 embryon avvisades med samma belysningsförhållanden som beskrivs i protokollet och märkt dem med ett unikt nummer. Efter avbildning överfördes varje embryo till ett PCR-rör för genotypning. Nu utfördes bildanalysen för att tillskriva ett pixelintensitetsvärde till varje bild. Genotypen tilldelades sedan till motsvarande bild och pixelintensitetsvärdena grupperade enligt deras genotyp för statistisk analys. En minskning av dnmt3bb.1-uttrycket upptäcktes i runx1W84X/W84X mutanter (figur 2A, B)3, i samförstånd med tidigare observationer5. Intressant, runx1W84X / + heterozygous embryon visade inga signifikanta skillnader i dnmt3bb.1 uttryck(Figur 2A, B) jämfört med dess vilda typ syskon, vilket tyder på att en kopia av Runx1 är tillräcklig för att upprätthålla dnmt3bb.1 uttryck på lämpliga nivåer.
Många zebrafisk mutanter misslyckas med att visa en embryonal fenotyp som annars kan upptäckas med andra förlust av funktion teknik som morpholino oligonucleotides (MOs). Denna diskrepans kan hänföras till ett antal orsaker inklusive off-target effekter, moderns proteinersättning, en hypomorf allel23 eller den nyligen upptäckta fenomenet genetisk ersättning24,25,26,27. I det här exemplet frågade vi om runx1 uttryck minskades eller förlorades i lmo4auob100 mutanter sedan tidigare publicerade data med hjälp av en lmo4a MO föreslog att runx1 minskar i lmo4a morfoner28. Här visade analysen inga signifikanta skillnader i runx1 uttryck mellan vilda typer och lmo4auob100 homozygous mutanter3 (figur 3A, B). Ytterligare analys av qPCR för ett enda embryo visade att det fanns en liten men signifikant minskning av runx1-uttryck i lmo4auob100 mutanter (figur 3C). Det är därför möjligt att bildkvantifiering kanske inte kan upptäcka små skillnader i uttrycksnivåer. Alternativt är bristen på skillnad mellan genotyper som vi upptäckt verklig och qPCR experiment upptäcker förändringar i runx1 uttryck i andra vävnader som telenchephalon där både lmo4a och runx1 uttrycks. Forskare bör alltid kontrollera sina resultat med en oberoende metod som qPCR, men helst berikande för vävnad av intresse genom flöde cytometri, till exempel.
I sällsynta fall där ISH har hög bakgrund(figur 3D)är pixelintensitetsvärdet för detta område så högt att subtraktion från signalvärdet ger ett negativt antal och i sådana fall skulle dessa embryon uteslutas från analysen. Enligt vår erfarenhet inträffade detta i cirka 0,4% av runx1-probedembryon3 men kan variera mellan experiment, sonder eller partier av reagenser. Även om det kan vara en begränsning av metoden, är den låga frekvensen av hög bakgrund mycket osannolikt att påverka de övergripande resultaten.
För att testa effekten av att välja olika områden för bakgrundskorrigeringar mätte vi först pixelintensiteten hos runx1 ISH-signalen i 28 hpf-embryon, med hjälp av olika regioner för bakgrundskorrigeringar (figur 4). Fyra olika regioner valdes ut: två i stamregionen (R1 och R2), en i ägguleregionen (ofläckade, men sannolikt kommer att ackumulera bakgrundsfärgning) och ett mindre område sett till ROI (R4, figur 4B). Mätning av pixelintensitet i dessa regioner visade en relativt stabil skillnad i intensitet mellan ROI och något av bakgrundsområdena(figur 4C). R3 visade dock alltid mycket höga värden (ovanför dem i ROI). Efter inversion och konvertering till 8-bitars, äggule regionen verkar mycket ljus och därmed inte är lämplig för användning som en bakgrundskorrigering. R2 var närmare ROI men innehöll några ISH signal, och använda den för korrigering minskade den genomsnittliga pixelintensiteten jämfört med antingen R1 (ligger ytterligare dorsalt, bort från ISH signal) eller R4. Således är antingen R1 eller R4 lämpliga områden som kan användas för bakgrundskorrigering (trots att området R4 är mindre än R1). Därefter ville vi jämföra hur användningen av R1 eller R4 påverkade resultatet när du jämför runx1-uttryck. För detta incrossed vi dll4+/- heterozygotes29 och analyserade runx1 uttryck i slumpmässigt utvalda vilda typ och dll4-/-embryon (Figur 4E). Även om användning av R1 eller R4 för bakgrundskorrigering påverkade enskilda värden var medelvärdet för pixelintensiteter inom samma genotyp inte signifikant olika(figur 4E). Dessutom ger jämförelseav runx1-uttryck fortfarande liknande medelvärdesvärden mellan genotyper som bakgrundkorrigering(μR1=16,3 respektive μR4=18,2). Sammantaget drog vi slutsatsen att även om valet av bakgrundsområde är viktigt, är de viktigaste kriterierna att det inte innehåller äggula regioner (benägna att ackumulering av bakgrundsfärgning) och att det inte bör innehålla någon (specifik) färgning som kan skeva pixelintensitetsvärdena för bakgrunden.
Figur 1: Arbetsflöde för parallellbildskvantifiering och genotypningsprotokoll. Embryon som samlats in från ett incross av fisk heterozygous för en mutant allel undersöks för den uppmätta genen med en standard ISH protokoll. Efter avbildning extraheras genomisk DNA med Hjälp av HotSHOT-protokollet genom att lägga till lysbufferten direkt på embryot i ett 0,2 ml PCR-rör, följt av en 30 min inkubation vid 95 °C. Detta DNA används för genotypning av embryon amorger genom PCR, PCR och begränsning fragmentlängd polymorfism (RFLP), KASP analyser eller någon annan lämplig metod. Samtidigt är bilderna för varje embryo inverterade och omvandlas till 8-bitars gråskala. ROI med identisk form och storlek som innehåller ISH-signalen (gul) och bakgrund (blå) väljs och mäts manuellt. Mätningarna, som tilldelas motsvarande genotyper, analyseras statistiskt. Figur anpassad från Dobrzycki et al.3Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Bildkvantifiering i runx1 mutanter avslöjar minskade nivåer av dnmt3bb.1 uttryck av ISH. (AExempel på bilder av ISH i 33 hpf vild typ (blå), runx1+/W84X (grön) och runx1W84X/W84X (orange) embryon, som visar dnmt3bb.1 uttryck i dorsala stora. (B)Pixelintensitetsvärden för dnmt3bb.1 mRNA i runx1W84X/W84X-embryon(n=36) minskas avsevärt jämfört med vilda typer (n=32) och heterozygoter (n=62) (ANOVA, p < 0,001). Variationskoefficienterna är 24%, 22% och 21% för vilda typer, heterozygote och mutantgrupper, respektive. Blå, grön och orange datapunkt motsvarar exempelbilderna från panel A. Staplarna representerar medelvärde ± s.d. ***p<0.001 (Games-Howell post-hoc-test). Figur anpassad från Dobrzycki et al.3Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Mätning av runx1-uttrycksnivåer med ISH i lmo4auob100mutanter. (A)Representativa bilder av ISH för runx1 i 28 hpf vild typ (blå), heterozygous (grön) och lmo4auob100/uob100 (orange) embryon, som visar uttrycket i dorsala stora. (B)Kvantifiering av runx1 mRNA-signalen. upptäckts av ISH, från 28 hpf wild typ (n = 15), heterozygous lmo4a+/- (het) (n = 34) och lmo4auob100/uob100 mutant (n = 18) embryon från en koppling visar ingen signifikant skillnad i runx1 pixel intensitet bland de olika genotypes (ANOVA,> s 0,6). Blå, grön och orange datapunkt motsvarar exempelbilderna från panel A. Staplarna representerar medelvärde ± s.d. (C) Boxplots som visar normaliserade runx1 mRNA-nivåer(2-ΔCt) i enkel vild typ (blå; n = 12) och lmo4auob100/uob100 (mut, orange; n = 12) embryon, mätt med qRT-PCR, som visar minskade nivåer av runx1 i mutanter jämfört med vild typ. *p < 0,05(t test). (D) Exempel på ett ISH-experiment på ett 28 hpf-embryo (färgat för runx1, gula pilspetsar) med hög bakgrund. Figur anpassad från Dobrzycki et al.3Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Effekt av bakgrundsintensitetskorrigering på mätresultat. (A) Representativ bild av runx1 ISH färgning i en vild typ embryo vid 28 hpf. (B) Samma bild efter inversion och konvertering till 8-bitars. Intresseområdet (ROI) markeras i grönt och fyra olika områden som används för bakgrundskorrigering (R1-R4) markeras i gult. (C) Mätningar av oberedda pixelintensiteti alla regioner som visas i panel B. Observera att intensiteten i R3 (äggula) är genomgående högre än den faktiska ISH-signalen i ROI (n=11). (D Runx1-uttrycksnivåer i roi-stödområdena Med hjälp av bakgrundsområdena R1, R2 och R4. Områden för ROI, R1, R2 och R3 ~ 28500 pixlar; R4 ~ 8500 pixlar. Observera att R3-bakgrund inte användes för denna jämförelse eftersom bakgrundskorrigeringen (ROI-R3) konsekvent gav negativa värden. (E) Runx1-uttrycksnivåer i vild typ och dll4-/- mutanter med antingen R1 eller R4 för bakgrundskorrigering (n=10 för varje prov). Statistisk analys i panel D och E utfördes med hjälp av ett icke-parametriskt Kruskal-Wallis-test, förutsatt att pixelintensitetsvärdena normalt inte distribueras. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Några faktorer bör beaktas när du använder denna metod för att kvantifiera genuttryck. Bildförhållandena måste upprätthållas under hela experimentet (t.ex. belysning, exponeringstider och embryopositionering) för att minska variationen mellan mätningarna. En kritisk punkt är att undvika överfärgning av proverna, eftersom skillnader i färgning mellan prover kan maskeras. Till exempel kan minskningen av VegfA-uttrycket i avsaknad av Eto2 i Xenopus laevis-embryon 30 endast upptäckas genom att noggrant övervaka färgning en 24-timmarsperiod. Således är det god praxis att empiriskt bestämma tillräckliga färgningnivåer för varje gen som bäst representerar dess uttryck, utan att nå mättnad. Overstaining kommer också att artificiellt öka bakgrunden pixelintensiteten i de konverterade 8-bitars gråskalebilder och skeva kvantifieringsresultaten. I extrema fall kan bakgrundsnivån i embryonala vävnader vara högre än ISH-signalen i den valda avkastningen på roi och dessa prover bör uteslutas från analysen. Ett liknande fenomen observerades när vi testade lämpligheten hos den ofärgade äggula för bakgrundskorrigering(figur 4). Efter inversion och konvertering till 8-bitars blir de mörkare pixlarna i äggulan ljusare än ISH-signalen i embryot och gör bakgrundskorrigerade värden negativa. Undvik därför användningen av äggula för bakgrundskorrigering. Mätning av bakgrundssignalen i pigmenterade områden i embryot (t.ex. ögon eller ryggdelen av stammen från 26/28 hpf och framåt) kommer lika snedföra kvantifieringsresultaten och bör också undvikas. Det finns protokoll tillgängliga för blekning zebrafisk embryon, antingen före eller efter ISH18 och blekning embryon äldre än 24 hpf innan avbildning rekommenderas.
Eftersom denna metod bygger på att mäta pixelintensiteten i ett definierat område mot en bakgrundspixelintensitet i ett likvärdigt icke-färgat område, är det inte lämpligt för kvantifiering av allestädes närvarande eller nästan allestädes närvarande uttryckta gener som är. Istället är det väl lämpat för att mäta uttryck för gener med en rumsligt begränsad fördelning där ett område för mätning av bakgrundspixelintensitet kan lätt identifieras. Vår ytterligare analys tyder nu på att använda ett mindre område (3-4x mindre) för bakgrundskorrigering ger liknande resultat som att använda ett likvärdigt område som roi. Detta utökar metodens tillämplighet till gener uttryckta i bredare rumsliga områden (och kräver därmed större roi:er för intensitetsmätningar), så länge man kan använda klart ofläckade områden av embryot för bakgrundskorrigering.
Slutligen föreslår vi att genotypning utföras parallellt eller efter bildkvantitation för att minimera experimenter bias. Att be en andra experimenter att upprepa kvantifieringen på anonymiserade prover och jämföra med den första uppsättningen mätningar kommer också att bidra till att minska experimenterbias. Om de bilder som ska kvantifieras är från en jämförelse mellan behandlingar som inte kräver genotypning (t.ex. vild typ vs kemisk hämmare eller vild typ jämfört med mo knockdown), ska den experimenterare som utför mätningarna förblindas av Prov.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Vi vill tacka personalen inom Biomedical Services i Oxford och Birmingham för utmärkt zebrafiskhållning. TD finansierades av en Wellcome Trust kromosom och utvecklingsbiologi phD Stipendium (#WT102345/Z/13/Z). R.M. och M.K. finansierades av British Heart Foundation (BHF IBSR Fellowship FS/13/50/30436) och är tacksamma för deras generösa stöd. R.M. erkänner stöd från BHF Centre of Research Excellence (RE/13/1/30181), Oxford.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL PCR tubes (8-strips with lids) | StarLab | A1402-3700 | 96-well plates are equally appropriate for sample handling but beware of cross contamination between samples |
| 3 mL Pasteur pipettes | Alpha Laboratories | LW4114 | |
| Cavity slides | Brand | BR475535-50EA | |
| Digital Camera (Qimaging Micropublisher 5.0) | Qimaging | ||
| Eppendorf Microloader tips | Eppendorf | 10289651 | the tips are used to orient the embryos for imaging in glycerol |
| Excel | Microsoft | ||
| F3000 Fiber Optic Cold Light Source | Photonic | ||
| Fiji | |||
| Glycerol | Sigma | G5516-1L | |
| Graphpad Prism 8.01 | GraphPad Software, Inc. | we prefer to use Graphpad, but other statistics software packages are also suitable (e.g. SigmaPlot or SPSS) | |
| HotSHOT alkaline lysis buffer | 25 mM NaOH, 0.2 mM disodium EDTA, pH 12 | ||
| HotSHOT neutralization buffer | Tris HCl 40 mM, pH 5 | ||
| PBS (10X) pH 7.4 | Thermofisher | 70011044 | |
| Stereomicroscope with illumination stand (Nikon SMZ800N) | Nikon | ||
| Thermocycler | Thermofisher |
References
- Varshney, G. K., et al. High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9. Genome Research. 25 (7), 1030-1042 (2015).
- Varshney, G. K., et al. CRISPRz: a database of zebrafish validated sgRNAs. Nucleic Acids Research. 44 (D1), D822-D826 (2016).
- Dobrzycki, T., Krecsmarik, M., Bonkhofer, F., Patient, R., Monteiro, R. An optimised pipeline for parallel image-based quantification of gene expression and genotyping after in situ hybridisation. Biology Open. 7 (4), bio031096 (2018).
- Bresciani, E., et al. CBFbeta and RUNX1 are required at 2 different steps during the development of hematopoietic stem cells in zebrafish. Blood. 124 (1), 70-78 (2014).
- Gore, A. V., et al. Epigenetic regulation of hematopoiesis by DNA methylation. Elife. 5, e11813 (2016).
- Fan, Y., et al. Tissue-Specific Gain of RTK Signalling Uncovers Selective Cell Vulnerability during Embryogenesis. PLoS Genetics. 11 (9), e1005533 (2015).
- Wen, B., et al. GATA5 SUMOylation is indispensable for zebrafish cardiac development. Biochimica et Biophysica Acta. 1861 (7), 1691-1701 (2017).
- Espin-Palazon, R., et al. Proinflammatory signaling regulates hematopoietic stem cell emergence. Cell. 159 (5), 1070-1085 (2014).
- Peterkin, T., Gibson, A., Patient, R. Redundancy and evolution of GATA factor requirements in development of the myocardium. Developmental Biology. 311 (2), 623-635 (2007).
- Genthe, J. R., Clements, W. K. R-spondin 1 is required for specification of hematopoietic stem cells through Wnt16 and Vegfa signaling pathways. Development. 144 (4), 590-600 (2017).
- Kalev-Zylinska, M. L., et al. Runx1 is required for zebrafish blood and vessel development and expression of a human RUNX1-CBF2T1 transgene advances a model for studies of leukemogenesis. Development. 129 (8), 2015-2030 (2002).
- Butko, E., et al. Gata2b is a restricted early regulator of hemogenic endothelium in the zebrafish embryo. Development. 142 (6), 1050-1061 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Lleras Forero, L., et al. Segmentation of the zebrafish axial skeleton relies on notochord sheath cells and not on the segmentation clock. Elife. 7, (2018).
- Jowett, T., Yan, Y. L. Double fluorescent in situ hybridization to zebrafish embryos. Trends in Genetics. 12 (10), 387-389 (1996).
- Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).
- Narayanan, R., Oates, A. C. Detection of mRNA by Whole Mount in situ Hybridization and DNA Extraction for Genotyping of Zebrafish Embryos. Bio-protocol. , e3193 (2019).
- Monteiro, R., Pouget, C., Patient, R. The gata1/pu.1 lineage fate paradigm varies between blood populations and is modulated by tif1gamma. EMBO JOURNAL. 30 (6), 1093-1103 (2011).
- Truett, G. E., et al. Preparation of PCR-quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and tris (HotSHOT). Biotechniques. 29 (1), 52-54 (2000).
- Wilkinson, R. N., Elworthy, S., Ingham, P. W., van Eeden, F. J. A method for high-throughput PCR-based genotyping of larval zebrafish tail biopsies. Biotechniques. 55 (6), 314-316 (2013).
- Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants. Developmental Dynamics. 238 (12), 3168-3174 (2009).
- Jin, H., et al. Definitive hematopoietic stem/progenitor cells manifest distinct differentiation output in the zebrafish VDA and PBI. Developement. 136 (4), 647-654 (2009).
- Stainier, D. Y. R., et al. Guidelines for morpholino use in zebrafish. PLoS Genetics. 13 (10), e1007000 (2017).
- El-Brolosy, M. A., Stainier, D. Y. R. Genetic compensation: A phenomenon in search of mechanisms. PLoS Genetics. 13 (7), e1006780 (2017).
- Rossi, A., et al. Genetic compensation induced by deleterious mutations but not gene knockdowns. Nature. 524 (7564), 230-233 (2015).
- Ma, Z., et al. PTC-bearing mRNA elicits a genetic compensation response via Upf3a and COMPASS components. Nature. 568 (7751), 259-263 (2019).
- El-Brolosy, M. A., et al. Genetic compensation triggered by mutant mRNA degradation. Nature. 568 (7751), 193-197 (2019).
- Meier, N., et al. Novel binding partners of Ldb1 are required for haematopoietic development. Development. 133 (24), 4913-4923 (2006).
- Kettleborough, R. N., et al. A systematic genome-wide analysis of zebrafish protein-coding gene function. Nature. 496 (7446), 494-497 (2013).
- Leung, A., et al. Uncoupling VEGFA functions in arteriogenesis and hematopoietic stem cell specification. Developmental Cell. 24 (2), 144-158 (2013).
