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Neuroscience

多柔性聚合物电极阵列的慢性植入

Published: October 4, 2019 doi: 10.3791/59957
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 2, 3, 2, 2, 3, 2, 4,5, 4, 4, 4, 4,5, 2,6
1Medical Scientist Training Program and Neuroscience Graduate Program, University of California San Francisco, 2Kavli Institute for Fundamental Neuroscience, Center for Integrative Neuroscience, and Department of Physiology, University of California San Francisco, 3Bioengineering Graduate Program, University of California San Francisco, 4Center for Micro- and Nanotechnology, Lawrence Livermore National Laboratory, 5Neuralink Corp., 6Howard Hughes Medical Institute
* These authors contributed equally

Summary

下面介绍一种在解剖距离脑区域植入多个聚合物电极阵列的方法，用于自由移动大鼠的慢性电生理记录。详细介绍了制备和手术植入，重点是设计原则，以指导这些方法的适应，以便用于其他物种。

Abstract

在数月到数年内，从分布在的大脑区域中同时记录大量单个神经元，将开辟新的科学和临床发展途径。使用柔性聚合物电极阵列可以支持持久的记录，但相同的机械性能，允许记录的寿命，使多次插入和集成到慢性植入物的挑战。这是一种方法，通过这种方法，多个聚合物电极阵列可以定位到相对空间上不受约束的大脑区域。

该方法利用薄膜聚合物器件，选择其生物相容性和能力，以实现长期稳定的电生理记录接口。由此产生的植入物能够准确、灵活地定位解剖远距离区域，几个月的身体稳定性和对电气噪声的鲁棒性。该方法支持多达16个串行插入的设备，跨越8个不同的解剖目标。如前所述，该方法能够从 1024 个通道进行录制。其中，用于单个神经元录制的演示中的 512 个通道产生了分布在 6 个记录站点的 375 个单单元。重要的是，此方法还可以记录单个单位至少 160 天。

这种植入策略，包括临时支撑每个设备与可伸缩的硅插入穿梭，涉及将设备在其目标深度与头骨粘附塑料基片，是为每个记录集定制设计的目标，以及稳定/保护设备在硅胶填充，定制设计的塑料外壳。还包括用于植入的设备的准备，以及应指导适应不同大脑区域或阵列设计组合的设计原则。

Introduction

理想的神经植入物将在数周到数月内记录分布式大脑区域中大量单个神经元。柔性聚合物电极阵列提供电生理记录，具有长达数月记录的寿命和跟踪单个神经元1、2、3的稳定性。然而，同样的机械性能，减少剪切损伤4，并赋予生物相容性和记录能力2，3，5，6，7， 8对它们与僵硬的同龄人相比，对大脑的插入构成了挑战。以前的工作最多完成了四个32通道数组，但排序假定的单神经元的总产能未报告2，3，9。相反，基于硅的电极阵列被用于高密度、多区域植入物，但这些技术既无法记录数月（寿命）神经元的峰值，也缺乏跟踪该时间刻度上相同神经元（稳定性）的能力，或者从多个大脑区域的数百个独立神经元中记录的密度。这里介绍的方法克服了目前基于聚合物电极阵列的方法中的插入次数少，从而为多个原子远区域的大量单个神经元的电生理学记录提供了手段。月，与稳定性记录从相同的单个神经元在多天。

关于使用聚合物基板而不是微线或硅基策略的重要性，存在着一些争论。正如Dhawale等人10所证明的，微线确实能够在啮齿动物体内进行长达数月的稳定记录，尽管植入体在单个区域被限制在16个三分线内。扩大微线植入物的大小达到相对较高的上限，在非人类灵长类动物11中达到1792个植入通道。然而，微线阵列的构造与硅纳米制造工艺不相容，因此非常耗时，需要在施工过程中单独手动处理每个通道。 ， 14.因此，目前尚不清楚此技术是否支持录制频道的数量级增长。

目前的硅器件可以在单个单片器件15、16、17、18、19上放置数百个甚至一千个电极。最新的硅制造工艺产生具有较小横截面面积的器件，无论材料如何，产生的胶质活化更少 20、21、22、23，24个及更符合要求的设备。硅探头单单元记录寿命的报告有变异性，一些报告表明，相对较大的硅探头可以提供长期记录25，26。值得注意的是，最新的商用硅器件17具有长达数月的使用寿命，其横截面区域与本文所述方法中使用的刀柄非常相似（Jun等人2017年17：70μm x 20 μm，此处描述的装置和 Chung 等人 20191： 68 μm = 80 μm x 14 μm）。由于稳定性的差异，该探针尚未证明能够在几周内从相同的神经元进行记录。这可能是由于一些组合使用刚性硅，以及直接系绳到头骨，已知会导致微运动，不稳定，和胶质胶质瘤在阵列-大脑接口27，28。为了构建一个能与神经组织一起移动的装置，需要软5、29和柔性7的材料。许多可用的聚合物（见Geddes和Roeder30，Fattahi等人31，和Weltman等人32审查）具有微线的灵活性和稳定性，并且与纳米制造工艺兼容，这允许硅器件的密集包装。

一些神经植入问题特定于柔性聚合物电极阵列的使用。首先是插入阵列，因为柔性阵列缺乏像硅或微线策略那样进入大脑的刚性。柔性器件的大多数插入策略都依赖于基板的暂时硬化，如此方法所示（见Weltman等人32进行审查）。有五个值得注意的策略，没有利用刚性穿梭。首先，有一些方法利用在植入33、34时从刚性过渡到合规的材料。这种策略的一个缺点是，它需要一个相对较大的横截面区域，以达到穿透脑组织所需的力，然后根据Euler的屈曲力计算35进行屈曲。横截面面积的增加将对周围组织的健康造成负面影响20、21、22、23、24。第二是使用大脑36上方的可移动支撑结构，虽然这需要费时地拆除或溶解脚手架，以保持最小的不受支持的长度（和高屈曲力）。或者，它将要求以较长的不受支持的长度插入阵列，因此需要更硬的阵列基板或更大的阵列横截面区域。第三是预穿透，打开一个洞，将柔性阵列插入后35。这需要精确的重新调整或相对较大的预穿透直径，以及电极阵列刚度和横截面区域，以允许不受支持的插入。第四是使用可溶解的涂层来强化柔性装置。这大大增加了横截面面积和插入造成的急性损伤，即使采取了特殊的预防措施来保存设备37的尖头。第五是聚合物阵列的注入。这种策略已经成功地实现了植入，最多4个32-ch插入2，但需要使用一个更大的横截面区域插入，一个250μm × 1.5毫米外径玻璃毛细管9，造成更大的急性损伤。相反，使用可移动的穿梭，同时向急性插入添加横截面区域，允许使用最坚硬的材料，因此，在插入任意灵活的设备时，可以确定理论上的最小尺寸。因此，使用刚性穿梭插入是目前插入柔性设备最有吸引力的选项。

任何插入穿梭方法都有两个要求：一种是适当的刚性基板，另一种是将柔性装置与基板耦合的方法。插入穿梭材料通常是硅38，39，40，41，不锈钢8，42，或钨43，44，45，用更硬的材料，允许更小的横截面区域。这些通常用胶粘剂，如聚乙烯乙二醇 （PEG）8，38，39，42，43，静电40，或直接物理耦合45，46.在所有情况下，挑战都是电极阵列和插入穿梭在插入和插入后分离前的对齐和耦合。下面叙述的是 Felix 等人39引入的方法的改进，该方法使用 PEG 连接的硅插入穿梭暂时支撑电极阵列，该插入器在将阵列插入到目标深度后被移除。

慢性植入物内柔性设备带来的第二个挑战是稳定大脑内的设备，同时仍允许将设备集成到连接到颅骨的植入物中。由于自然脉动、创伤后水肿变化、影响和其他原因，大脑相对于颅骨移动，因此，电极阵列必须至少可以相对于附着在头骨上的位置和记录硬件移动。这是使用 3D 打印塑料基件实现的，该基件针对每组植入靶点进行定制设计，具有多种功能：植入过程中的盐水储液罐、用于系住聚合物阵列的位置以及硅胶外壳。头骨和硅胶上方的系绳位置共同为阵列创建更大的曲率半径，从而允许阵列上更大的压缩力。这反过来又允许大脑相对于阵列（骷髅）的锚点移动转换为屈曲载荷。

进一步的挑战包括需要容纳多个阵列，并提供足够的应变缓解，使动物在不将振动或冲击力转移到电极阵列的情况下自由行动，这可能导致相对于神经组织的运动。适应在类似应用中使用的解决方案，其中大脑必须相对于刚性记录窗口保持稳定，这解决了这一难题。人工硬膜密封胶硅胶（材料表），先前已被证明是无毒的，防止CSF泄漏47，提供对大脑的反压力，以防止向外膨胀和稳定阵列大脑表面。通过中粘度、手术级硅胶弹性体，在设备色带中增加了一层额外的保护层，先前用于密封慢性神经电极植入物48。最后，硅胶缓冲植入物和头台被定制为保持低质量中心的3D打印件包裹，以尽量减少动物的正常活动。

该协议从安装在硅插入穿梭上的柔性聚合物微电极阵列开始。它将阵列穿梭装置安装到 3D 打印的插入件上，描述成功植入动物所需的手术技术和植入结构步骤，并能够支持 16 个聚合物多电极阵列被植入8个解剖学遥远的区域，在一只大鼠1。

该协议假定生物可溶解的胶粘剂聚乙烯乙二醇 （PEG） 连接到硅插入穿梭的聚合物电极阵列的起始材料，如 Felix 等人39所示，以及至少两个独立可移动插入件：硅穿梭将粘附在一起，电极阵列的连接器将粘附在其中。该协议还使用第三个插入件更安全地将两个插入件连接到微米级微操作器。所有 3D 打印文件可在：https://github.com/jasonechung/PolymerProbe3DParts

此方法中使用的每个聚合物电极阵列由两到四个记录刀柄、一个输送电气痕迹的带状物组成，在色带末端由硬件连接器或印刷电路板组成。电极阵列和色带固定在硅穿梭顶部，带有 PEG。每条丝带有一个2厘米长x1毫米厚的聚酰亚胺管连接到丝带通过UV固化环氧树脂，延伸垂直于丝带的长度。每个设备（电极阵列和插入穿梭）必须加载到3D打印的插入件上，这些插入件将用于将阵列插入大脑并收回穿梭（图1）。在此设计中，液压插入微操作器（绿色，材料表）将整个插入装置（第 1 件、第 2 件和回缩微操作器橙色）移动到其目标深度。一旦阵列从插入装置分离并固定，第二个缩回式微操作器（橙色）将收回第 1 块，并且连接的穿梭独立于插入装置的其余部分，在不取代的情况下拆下穿梭数组。

Figure 1
图 1：插入器组件。
（A） 第 1 件和第 2 件用可拆卸螺钉暂时固定在彼此上，稍后将停靠在回缩式微操作器活塞（橙色）上。（B） 阵列和插入穿梭粘附在 1 件上，阵列连接器用双面胶带连接到第 2 块。第 3 部分将回缩微操作器和第 1 件和第 2 件连接到插入式微操作器（绿色）。插入微操作器固定在用于植入物定位的立体定向适配器上。第 1-3 件以相对大小表示。第 4 块是用于正确对齐插入滑闸的稳定件。请点击此处查看此图的较大版本。

Protocol

本手稿中描述的所有动物相关协议均已获得 UCSF 机构动物护理和使用委员会的批准。

1. 制备用于插入的聚合物电极阵列（约30分钟）

  1. 将 1 件连接到第 2 件，通过对齐的垂直孔插入螺钉，将件子锁在一起（图 2）。把这两块拿在一个副子上。将双面胶带 （材料表） 连接到第 2 件的顶部.将稳定件 4 连接到第 1 件的末端。它将通过摩擦进行就地进行。

Figure 2
图 2：阵列-穿梭对齐的装配体。
（A） 组装件 1、2 和稳定件，以准备插入穿梭附件。（B） 第 1 件和第 2 件用拇指螺钉放在一起。请点击此处查看此图的较大版本。

  1. 用手对齐电极阵列，并将插入穿梭与第 1 件的窄端段连接。当探头与第 1 件的纵向轴对齐时，将阵列接头粘附到第 2 件的平面部分的聚酰亚胺双面胶带上。
  2. 使用塑料尖钳，仅接触连接到阵列带的聚酰亚胺翼，将插入的穿梭电极阵列装置从 1 号件上提起到稳定片的外部（图 3A）。
  3. 在 1 件的末端涂抹少量氰丙烯酸酯（材料表）或其他粘合剂（±10 μL）。太少不会将插入穿梭牢固地粘附到第 1 块，在插入或缩回过程中会面临分离的风险。太多的风险溢出穿梭和坚持阵列本身到片1。
  4. 使用塑料倾斜钳，仅接触连接到阵列带的聚酰亚胺翼，将器件与第 1 块的狭窄部分重新对齐，并将插入穿梭（仅插入的穿梭）的方形卡舌固定在胶水上（图 3B）。通过操纵硅穿梭或 PEG 的侧面进行小的对齐调整。避免对色带或刀柄施加过大的力。

Figure 3
图3：阵列穿梭的对齐、附件和灭菌。
（A） 插入穿梭电极阵列装置的正确方向，用于将胶水涂在1号件的坞站上。显示双柄阵列穿梭。（B） 聚合物电极阵列和插入穿梭安装在插入件上，带有临时稳定片进行对齐。显示双柄阵列穿梭。（C） 插入装置装在塑料盒中，在灭菌期间提供保护。请点击此处查看此图的较大版本。

  1. 用稳定件的两侧钳子施加温和的向下压力，然后将其从组件中取出，而不移动阵列。
  2. 从副件上拆下安装的设备组件（第 1 和 2 块、阵列、插入穿梭和阵列连接器），并用双面胶带将其粘附到小塑料盒的底座上，以便通过环氧乙烷进行灭菌（图 3C）。蒸汽灭菌不适用于这些设备。

2. 基件设计

  1. 确定所选立体定向目标的颅骨切除尺寸以及头骨螺钉和接地螺钉的位置。颅骨切除尺寸由阵列足迹决定，有几百微米（+300）微米周长，用于放置调整，以避免表面血管。
  2. 使用设计软件（例如，CAD），设计基件的足迹，以环绕计划的颅骨，并适合由时间脊和头骨螺钉定义的周长，最大化头骨表面积，将超出基块粘合的水泥可以结合，将植入物粘附在颅骨上。
  3. 轮廓的基片的底部表面，以便它可以粘附到头骨没有缝隙，减少感染的机会，防止盐水或硅胶弹性体渗出。
  4. 将基件的高度设置为 3-7 mm，高度足以容纳盐水和硅胶弹性体，但足够低，不会妨碍阵列插入时的可见性。
    注： 基片可以设计垂直柱或类似功能，聚酰亚胺翅膀可以系在颅骨上方的点。不允许附件点妨碍视图。
  5. 3D 打印基件（图 4），并在植入前对基件进行消毒。

Figure 4
图4：为植入准备的骷髅。
与头骨螺钉，基础丙烯酸层和固定到头骨的基片完成。

3. 头骨的准备（±2小时）

  1. 选择 400 g 或更大的大鼠以支持植入物的重量。使用6-12个月大的雄性长埃文斯大鼠。
  2. 麻醉老鼠。将动物放入麻醉室。打开 5% 的半电子。
  3. 注射腹内剂量的氯胺酮（50毫克/千克）、木兰素（6毫克/千克）和阿托品（0.14毫克/千克）。
    1. 在整个过程中，通过验证没有从爪子捏断和呼吸速率保持50-75呼吸/分钟，每20分钟监测麻醉深度。
  4. 给老鼠涂眼膏。
  5. 把老鼠的头把头去。
  6. 将动物放入立体支架。
  7. 通过洗涤部位，每个波维多内-碘手术磨砂，然后是无菌盐水，用三个交替的磨砂来准备手术部位。
  8. 将 0.2 cc 的 0.5% 利多卡因注射到头皮中。
  9. 在头骨的中线做一个下垂切口，将至少3毫米的前体暴露在胸腔前，3毫米后部暴露在羔羊。
  10. 用棉签去除渗透。
  11. 使用用笛卡尔坐标平面对颅骨进行评分，用立体定向仪器在布雷格玛处归零，标记插入和颅骨切除部位。
  12. 钻颅切除部位，留下一层薄薄的骨头，可以用钳子去除。不要暴露杜拉。这允许清洁头骨的骨尘，而不会破坏杜拉。
  13. 钻和插入骨螺钉，一次一个，以防止骨尘进入孔。使用慷慨的等子灌溉去除骨尘。对于大约 50 克的植入物，请使用 10-12 个螺钉。钛螺钉允许骨整合49。
    1. 推进螺丝的深度，完全穿透头骨，而不会影响大脑。
  14. 将至少一个骨螺钉连接到导电导线，以用作电路接地。
  15. 完成所有钻孔后，用盐水清洗骨尘的头骨。
  16. 用棉签或其他吸水剂擦干头骨，并在螺钉上涂上一层粘合水泥（材料表）（不要对啮齿动物头骨使用釉质蚀刻剂）。这种初步的粘合粘合水泥层将增加植入粘附，并减少后期粘附步骤的人工。
  17. 去除每个颅骨切除部位剩余的薄层骨。
  18. 使用带有弯曲尖端的 30 号针，同时避免任何血管。切口的长度与插入穿梭的尺寸相匹配。
    1. 如果有出血，用温和的盐水滴注手动灌溉，直到出血停止之前不要继续。
  19. 如果正在执行多个尿道，使用凝胶泡沫或其他方法保持站点湿润，例如每隔几分钟用体温盐水进行常规灌溉。
  20. 用棉签或其他吸水剂再次干燥头骨，为将基块粘附到头骨上准备。
  21. 放置无菌基片。如果基件将覆盖 bregma，则将已知距离内的另一个位置标记为代理。
  22. 在基片周围涂抹粘合水泥。用盐水填充粘附的基片;在基件和头骨界面之间的界面处用粘合水泥识别并修补任何泄漏（图5）。
    注：至关重要的是，将基块完全固定在头骨上，以防止人工硬膜密封胶硅胶泄漏，因为这将防止植入物充分粘附到头骨上。动物已经准备好插入数组了。

4. 阵列的串行插入和穿梭的撤回（每个阵列±1小时）

注：此过程应使用不可行的设备进行试验，特别是对于多阵列植入，其中一个设备可能会干扰后续设备的植入。

  1. 将件 1 和 2 装载到回缩式微操作器活塞上。将第 1 件的微操作器设置为扩展位置，将第 3 件的微操作器设置为缩回位置。活塞将滑至第 1 件内的端子深度。第 2 件适合第 3 件的顶部，孔对齐。
    1. 将第 3 块装载到插入的微型操作器活塞上，并在第 3 件的底面用螺钉固定到位（图 5A，B）。
    2. 将 2 和 3 件装入和拧在一起，以便移动插入式微操作器移动整个插入装置（图 5C）。
    3. 拆下将 1 和 2 件放在一起的螺钉。第 1 部分独立于第 2 部分移动，以允许从设备中单独收回插入穿梭。
    4. 将螺钉插入与活塞轨道垂直的 1 号件的横向孔中，直到螺钉对活塞施加压力。这可确保第 1 件按照缩回活塞移动，如图5D所示。当设备安装在立体定向仪器上时，请务必选择不会妨碍视力的横向孔。

Figure 5
图5：插入器的装配。
（A） 将第 3 件安装到微操作器. （B） 将第 1 件和 2 件的附件连接到插入装置上。（C） 插入件，带安装的电极阵列插入穿梭装置。（D） 拇指螺钉固定件 1 和 2 一起拆下。请点击此处查看此图的较大版本。

  1. 从颅骨切除术中取出任何凝胶泡沫。使用实型或代理型布雷格玛进行立体定向定位。将设备移动到插入部位时，保持头骨上方至少几厘米的高度。
    1. 避免在颅骨或大脑附近长时间使用阵列穿梭装置，以减少在插入之前或插入期间冷凝从插入穿梭中分离阵列的可能性。如果发生这种情况，尝试将阵列穿梭装置提升到大脑和头骨上方，并等待其干燥和重新粘附。
  2. 调整植入物坐标以避免表面血管。如在颅切除术和切除期间，避免直接穿透血管。
  3. 轻快地插入设备（±25 μm/s），使用立体定向仪器降低，直到设备进入大脑。该设备不会立即穿透大脑。电阻和凹陷的程度取决于目标位置和设备设计（例如，两个与四个刀柄，尖端角度），但凹陷通常不超过 1 mm（图 6）。

Figure 6
图6：阵列穿插。
阵列穿梭被推进到大脑，以瞄准深度。显示四柄阵列穿梭。

  1. 一旦进入大脑，降低与微操作器，降低速度接近目标深度：
    1. 使用立体定向臂以 25 μm/s 开始插入。
    2. 当目标深度高出 2 mm 到 1 mm 时，使用微操作器以 10 μm/s 的速度插入。
    3. 当目标深度高出 1 mm 到 500 μm 时，使用微操作器缓慢插入到 5 μm/s。
    4. 在最后 500 μm 到目标时，进一步缓慢插入到 1-2 μm/s。
  2. 可视化设备机翼（水平聚酰亚胺管）和降低过程中的插入点，以避免过早的穿梭阵列分离。
  3. 当达到目标深度（图7A）时，通过轻固化丙烯酸或其他粘合剂（如氰丙烯酸（材料表）将聚酰亚胺机翼双边锚定到基片附件部位。如有必要，干燥基片上的机翼或附着点，因为冷凝可以收集在这些表面上，防止粘附。如果可见度或其他空间限制需要，则仅锚定在一个聚酰亚胺翼翼上通常就足够了。
  4. 在溶解之前，PEG 将显示为坐在阵列和插入穿梭接口之上的球状质量（图 7A）。在阵列上轻轻滴下体温盐水，使其粘附在穿梭器上，从而溶解 PEG。这需要时间的时间长度取决于所选 PEG 的分子量，并且完全溶解可以通过直接可视化进行验证。当PEG完全溶解阵列的边界时，从穿梭和片1中可以完全分辨出阵列的边界（图7B）。

Figure 7
图7：航天飞机的回缩。
（A） 缩回前的机翼系绳。显示双轴阵列和穿梭。（B） PEG 溶解和翼粘附与刀柄特征（圆形，蓝色），允许在回缩期间直观地确认阵列和穿梭成功分离。（C） 插入穿梭后成功插入阵列。（D） 底片与硅胶填充，用于单个双柄阵列插入。使用的低粘度硅胶具有蓝色色调。请点击此处查看此图的较大版本。

  1. 使用回缩微操作器，缓慢地拔下插入穿梭。继续盐水灌溉（±1滴/s）到正在缩回的阵列上。使用与目标深度相关距离的插入速度相同的回缩速度：
    1. 使用从目标深度到 -500 μm 的 1-2 μm/s 的微操作器缩回。
    2. 当 -500 μm 至 -1 mm 时，使用 5 μm/s 的微操作器加快回缩速度。
    3. 当 -1 mm 到 -2 mm 时，使用 10 μm/s 的微操作器加快回缩速度。
    4. 使用立体定向臂从 -2 mm 向目标向上以 25 μm/s 的速度缩回。
  2. 在回缩期间可视化阵列和插入穿梭之间的接口。聚合物阵列将明显与穿梭分离，并在插入穿梭的刀柄之间的半圆形结处缩回时呈半透明（图7B）。
  3. 从第 2 块中取出阵列连接器，并移动到不会干扰后续插入的位置。聚合物电极阵列现在位于大脑中，不再连接到立体定向仪器（图7C）。拆下插入穿梭和其他插入硬件。
  4. 对于多个插入，重复步骤 4.1-4.9;在插入所有所需数组之前，不要转到下一节。在彼此250μm内插入两个装置是不明智的，因为在应变缓解区域大脑和翅膀之间轻微的弯曲可以延伸到这一点。

5. 植入物结构（±2小时）

  1. 最终阵列插入后，使用移液器或棉签从基块中空盐水，小心不要破坏植入的阵列或色带。
  2. 用低粘度硅胶弹性体或其他人工硬膜密封剂填充颅骨和基块。允许它固化 （图 7D）通过多次插入，将硬件连接器放置在不干扰的位置（图 8A）。适当定向阵列连接器，并构造植入物，使色带处于最终所需位置。
  3. 将阵列、阵列色带和连接器覆盖在中粘度硅弹性体中。特别注意聚合物-连接器接口，因为这种软硬材料界面容易损坏。完全覆盖阵列色带，使中粘硅固化时，它们固定不动。
  4. 在设计的情况下将弹性体覆盖的设备包裹在一起。
  5. 用牙科丙烯酸强化植入物底座。不要让丙烯酸直接接触阵列带，因为丙烯酸在固化时膨胀会损害导电痕迹。
  6. 在切口周围涂抹布皮维卡因和百利他卡辛药膏。
  7. 使用 4-0 尼龙缝合线和皮肤胶关闭切口。

6. 恢复和植入护理

  1. 将动物从立体定向仪器中取出，放在加热垫上。
  2. 给皮下注射温暖的环林格溶液（5~10 mL）以滋润动物。
  3. 一旦动物处于活动位置（10~60分钟），在37°C下将一半的笼子转移到笼子里，为期2-3天。
  4. 在加热垫下，提供软化的食物和水。
  5. 根据需要，每24小时注射2毫克/千克Meloxicam（皮下或口服）1周。
  6. 让大鼠1-2周愈合并调整到植入体的重量（图8B）。
  7. 定期对植入物周围的组织进行氯西丁洗涤，并每日检查刺激、感染或脱液。

Figure 8
图8：植入后多个插入的阵列和大鼠。（A） 硬件连接器的位置，不会干扰后续的插入。（B） 1，024通道慢性聚合物阵列植入物。经神经元 [补充图 1H]1许可转载。请点击此处查看此图的较大版本。

Representative Results

遵循此协议，1，024 通道神经植入记录产生了 375 个单单元1（与 MountainSort50排序，噪声重叠 < 0.03，隔离 > 0.96，512 通道用于单单元记录，图 9A）。该协议可用于将不同数量的器件植入不同的记录目标组合中，具有不同的通道计数和规格。使用相同的协议，单单元记录寿命已演示至少160天1的数据从19个设备（18个32通道设备在前额皮质，一个64通道设备在轨道前额皮层）跨越三个不同的大鼠（图 9B.三只动物中有一只发生数字电气故障，导致无法从四台设备进行记录。在其余 15/19 器件中，每个通道的录制平均产量为 ±1 个单元。单个器件的产能只有几个单元，每个通道最多为 ±2 个单位。通常，在同一区域植入同一动物的设备上，产量会大不相同。

此外，按照此处所述的协议，一个不同的外科团队植入了另外六只动物，每个动物都带有针对轨道前额皮层和核积液的4-6个32通道装置的组合，以及Ttrode超驱动（总植入体）重量约 50 g）。一只动物在手术后一个月内将植入物分离。第二只动物在术后恢复期间死亡，可能与此处所述的协议步骤无关。其余四只动物在持续4-11个月的实验中，通过稳定的植入物保持健康。单个单位计数与之前报告的 32 通道设备相似。

Figure 9
图9：单单位产量和记录寿命。
（A） 来自 512 个通道（1，024 个通道植入体）的假定单单元群集数，按质量指标阈值分层。使用 MountainSort 进行自动固化（噪声重叠 0.03、隔离 0.96、右上角黑盒）导致从 512 个通道中识别了 375 个单个单元。经神经元 [图 2A]1许可转载。（B） 每通道（左 y 轴）或每 16 通道柄（右 y 轴）在大鼠植入后 160 天（x 轴）的聚合物阵列的单单元产量。实线是8个刀柄的平均细胞产量，虚线= 1 SE。每个刀柄的单个时间点按区域显示为颜色编码点。经神经元 [图 3A]1许可转载。请点击此处查看此图的较大版本。

Discussion

这是一种将多个聚合物电极阵列植入分布式大脑区域的方法，用于记录单个单元数月。该方法表示记录通道增加 8 倍，最近基于聚合物阵列的系统2、3的插入次数增加 4 倍。该系统在小鼠中使用了基于聚合物网状注射的系统，但没有报告假定的单单元的绝对数量，因此无法对单个神经元产量进行比较。

柔性装置的插入方法基于Felix等人39的早期协议，并作了重要修改：一个三件式插入装置，用于在缩回过程中硅穿梭的独立运动，以及阵列的系绳在航天飞机撤回之前达到目标深度，共同消除了原始协议中所述快速撤退的需要。这些变化最大限度地减少了组织损伤，并在航天飞机缩回过程中保持阵列稳定性。其他灵活的设备植入策略，如使用生物可溶解材料暂时硬化设备，与该协议的后续步骤兼容。保护植入物内的设备需要集成先前经过验证的策略，以覆盖大脑并保护细腻的设备带。

由于其脆弱性，需要小心和注意，以避免直接接触或以其他方式将力发射到聚合物电极阵列和硅插入穿梭。特别是在使用多个设备时，应在显微镜下观察插入，以避免一个设备与另一个设备的干扰。通常，可以使用塑料倾斜钳轻轻处理电极阵列，避免痕迹。例如，如果聚合物电极阵列开始随着插入穿梭缩缩，则这种策略是合适的。如果 PEG 未完全溶解，或者由于聚合物和硅之间的盐或 CSF 表面张力，则可能发生此情况。

最常见的可恢复错误之一是阵列脱离插入穿梭。当大脑酒窝和设备尖端的压力增加时，如果阵列和穿梭不完全对齐，或者冷凝已部分溶解 PEG，则可在插入时发生这种情况。要重新粘附阵列，请将其提升到大脑表面上方，然后等待其干燥（约 5 分钟）。

规划多阵列植入手术的一个关键方面是设计基件，以适应所有植入靶点，并且与头骨的轮廓没有间隙。基片是一个小塑料片，在颅骨清洁、螺钉放置和部分颅骨切除术后固定在头骨上，然后插入阵列。它有三个功能：1） 保持盐水以溶解 PEG 后阵列插入，但在硅穿梭缩回缩之前，2） 提供头骨表面上方的位置，阵列可以通过聚酰亚胺翅膀连接，从而允许应变缓解沿着带子在大脑的插入点以上，并3）举行人工硬膜密封剂，稳定和保护阵列和大脑。基件可以手工或3D打印。观察结果表明，排空和干燥盐碱基片在设备插入之前非常重要。这些步骤可防止阵列和插入穿梭的冷凝和分离。干燥基片对于用人工硬膜密封剂填充基件也至关重要。同样重要的是，基片不要泄漏，因为硅胶膜很难从头骨上去除，并且会防止牙齿丙烯酸粘附，使植入物能够可靠地慢性附着到颅骨上。预计任何低粘度、生物相容性有机硅弹性体都可用于填充颅骨和基块，其周围和裸露的聚合物阵列带具有更高的粘度硅弹性体。

聚合物纳米制造的进步将转化为基于聚合物的电极阵列，减少特征尺寸，并增加阵列中接近硅器件15、16、17的电极数量 ，18，19.同样，聚合物器件的横截面区域将随着特征尺寸而缩小，从而提供更好的生物相容性8。同样，正如硅器件所实现的，与放大、数字化和多路复用芯片17的集成将进一步实现更大规模的神经记录。

Disclosures

J.E.C 和 L.M.F. 是有关本文所述工作的待决专利的发明人。

Acknowledgments

这项工作得到了NINDS授予L.M.F和V.M.T.的U01NS090537的支持，NIMH授予J.E.C.F30MH109292，NIGH授予H.R.J.J.E.C.和H.R.R.J.J.也支持N.R.J.J.C.和H.R.R.J.J..M.J.，也得到NIGMS MSTP#T32GM007618的赠款支持。平铁研究所是西蒙斯基金会的一个部门。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3D Printed Stereotax Adapter Parts (3) and Base Piece (1) N/A N/A 3d print parts, suggest <30 μm resolution for minimal hand finishing of parts. Files available at:
https://github.com/jasonechung/PolymerProbe3dParts
Dental Acrylic (Hygenic Repair Resin, Coltene type II quick set) Colten/Whaledent 8886784, 8881627 Dental acrylic for use during implant construction
Hydraulic Micromanipulator (x2) Narishige Group MO-10 1-axis micromanipulator
Kapton Polyimide Tape Bertech PPTDE-1/2 Double-sided tape
Kopf Stereotax Arm  Kopf Instruments 103088R, 103088L Standard rodent stereotax
Light Curable Dental Acrylic, Vivid Flow Coltene/Whaledent D33-01-00 Light curable dental acrylic for use during implant construction
Loctite Gel Control  Henkel Corp.  234790 1364076 1735574 1752699 Cyanoacrylate for adhering silicon shuttle to corresponding 3d printed part
Metabond Quick Cement Parkell S380 For direct application to skull to create strong connection between skull and implant
Polymer Electrode Arrays and Silicon Insertion Shuttles Lawrence-Livermore National Laboratory N/A Fabricated at Lawrence-Livermore National Laboratory, polyimide electrode arrays, silicon insertion shuttle
Silicone Gel Kit, Low Viscosity Dow Corning 03/80 Low-viscosity silicone gel for filling of 3d printed base piece
Silicone, Medium-Viscosity Kit World Precision Instruments  Kwik-Sil Medium-viscosity silicone gel for protection of polymer electrode arrays

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神经科学，问题152，微电极阵列，聚合物神经探针，聚合物电极阵列，慢性植入，电生理学，啮齿动物，局部场势，单单元，神经元，多站点记录
多柔性聚合物电极阵列的慢性植入
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Chung, J. E., Joo, H. R., Smyth, C.… More

Chung, J. E., Joo, H. R., Smyth, C. N., Fan, J. L., Geaghan-Breiner, C., Liang, H., Liu, D. F., Roumis, D., Chen, S., Lee, K. Y., Pebbles, J. A., Tooker, A. C., Tolosa, V. M., Frank, L. M. Chronic Implantation of Multiple Flexible Polymer Electrode Arrays. J. Vis. Exp. (152), e59957, doi:10.3791/59957 (2019).

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