Summary
以下に説明する、解剖学的に遠い脳領域全体に複数のポリマー電極アレイを移植し、自由に移動するラットにおける慢性電気生理学的記録を用いるための方法である。調製および外科的移植は、他の種で使用するためのこれらの方法の適応を導く設計原理に重点を置いて、詳細に記載されている。
Abstract
数ヶ月から数年にわたって分散した脳領域全体の個々のニューロンの大規模な集団からの同時記録は、科学的および臨床的発展の新しい道を可能にします。柔軟なポリマー電極アレイの使用は、長持ちする記録をサポートすることができますが、記録の寿命を可能にする同じ機械的特性は、複数の挿入と慢性インプラントへの統合を困難にします。ここでは、複数のポリマー電極アレイを比較的空間的に拘束されていない脳領域のセットを標的とすることができる方法論を示す。
この方法は、その生体適合性と能力のために選択された薄膜ポリマーデバイスを利用して、長期的かつ安定した電気生理学的記録インターフェースを達成する。得られ得るインプラントは解剖学的に遠い地域の正確で、適用範囲が広いターゲティング、数ヶ月のための物理的安定性および電気騒音への強さを可能にする。この方法論は、8つの異なる解剖標的にわたって最大16台の連続挿入デバイスをサポートします。前に示したように、方法論は1024チャンネルから記録することができる。このうち、単一ニューロン記録に使用されるこのデモでは、512チャンネルが6つの記録部に分散した375の単一ユニットを生み出しました。重要なのは、この方法では、少なくとも 160 日間は単一単位を記録できることです。
この注入戦略は、引き込み式シリコン挿入シャトルで各デバイスを一時的にブレースすることを含め、記録の各セットのためにカスタム設計された頭蓋骨付きプラスチックベースピースにターゲット深さでデバイスをテザリングすることを含みます。シリコーンで満たされた、カスタム設計のプラスチックケース内のデバイスの安定化/保護をターゲットにします。また、移植のための装置の準備、および脳領域または配列の設計の異なった組み合わせへの適応を導くべき設計原理である。
Introduction
理想的な神経インプラントは、数週間から数ヶ月にわたって分散脳領域の非常に多数の個々のニューロンから記録します。柔軟なポリマー電極アレイは、数ヶ月間記録する長寿と個々のニューロン1、2、3を追跡するための安定性を備えた電気生理学的記録を提供します。しかし、せん断損傷4を低減し、生体適合性および記録能力2、3、5、6、7を付与する同じ機械的特性、 8は、彼らの剛性対応に対して脳への挿入に挑戦を提起します。以前の研究は、最大4つの32チャネル配列を達成したが、ソートされた単一ニューロンの総収量は報告されていない2、3、9である。逆に、シリコンベースの電極アレイは、高密度、多領域インプラントで使用されてきましたが、これらの技術は、数ヶ月(長寿)にわたってニューロンからのスパイクを記録したり、そのタイムスケールで同じニューロン(安定性)を追跡する能力を欠いているか、または複数の脳領域にわたって数百の個々のニューロンから記録する密度。ここで提示される方法は、現在のポリマー電極アレイベースの方法における挿入数の少ない数を克服し、それによって、複数の解剖学的に遠い領域における多数の個々のニューロンの電気生理学的記録のための手段を提供する月、多くの日にわたって同じ個々のニューロンから記録する安定性を持つ。
マイクロワイヤーやシリコンベースの戦略の代わりにポリマー基板を使用することの重要性に関していくつかの議論があります。Dhawale et al.10によって示されるように、マイクロワイヤーは確かにげっ歯類で数ヶ月間安定した記録が可能であるが、インプラントは単一の領域で16個のテトロードに限られていた。マイクロワイヤーインプラントのサイズをスケールアップすると、比較的高い上限に達し、非ヒト霊長類11で達成される最大1792の埋め込まれたチャネルで。しかし、マイクロワイヤアレイの構築は、シリコンナノファブリケーションプロセスと互換性がないため、非常に時間がかかり、建設12、13の間に各チャネルを個別に手動で処理する必要があります。 、14.したがって、この技術が録画チャンネルの大幅な増加をサポートできるかどうかは明らかではありません。
現在のシリコンデバイスは、単一のモノリシックデバイス15、16、17、18、19に数百または1000以上の電極を配置することができます。最新のシリコン製造プロセスは、材料に関係なく、より小さな断面領域を持つデバイスを生成し、グリア活性化20、21、22、23を少なくします、24以上の準拠デバイス。シリコンプローブ単一単位記録寿命の報告にはばらつきがあり、比較的大きなシリコンプローブが長期記録25、26を提供できることを示すものもある。特に、市販されている最新のシリコンデバイス17は、数ヶ月間記録する寿命を持ち、ここで説明する方法で使用されるシャンクと非常によく似た断面領域を持っています(Jun et al.2017 17: 70 μm x 20 μm、ここで説明するデバイスと Chung et al. 20191: 68 μm – 80 μm x 14 μm)。安定性の違いにより、このプローブは数週間にわたって同じニューロンから記録できることが実証されていません。これは、アレイ脳界面27、28における微小運動、不安定性、および神経膠シスを引き起こすことが知られている頭蓋骨への直接テザリングと同様に、硬質シリコンの使用のいくつかの組み合わせによるものである可能性が高い。神経組織と共に移動できる装置を構築するには、柔らかい5、29、フレキシブル7の材料が必要です。多くの利用可能なポリマー(GeddesとRoeder30、Fattahi etal.31、およびレビューのためのウェルトマンら32を参照)は、マイクロワイヤーの柔軟性と安定性を有し、ナノファブリケーションプロセスと互換性があります。シリコンデバイスの緻密なパッキング。
いくつかの神経移植の問題は、柔軟なポリマー電極アレイの使用に特異的である。これらの1つ目は、柔軟なアレイがシリコンまたはマイクロワイヤーベースの戦略のような脳に進む剛性を欠いているため、アレイの挿入です。フレキシブルデバイスの挿入戦略の大半は、この方法で行われるように基板の一時的な硬化に依存します(レビューについてはWeltman etal.32を参照)。堅いシャトルを利用しない5つの注目すべき戦略がある。まず、移植33、34の際に剛性から準拠に移行する材料を利用する方法があります。この戦略の欠点は、オイラーの座屈力計算35によって指示される座屈する前に脳組織の浸透に必要な力を達成するために比較的大きな断面積を必要とすることである。断面積のこの増加は、周囲の組織の健康に悪影響を及ぼします20,21,22,23,24.第二は、脳36の上に取り外し可能な支持構造の使用であるが、これは最小限のサポートされていない長さ(および高い座屈力)を維持するために足場の時間のかかる除去または溶解を必要とする。または、サポートされていない長さの配列を長く挿入する必要があり、それによって、より堅い配列基板またはより大きな配列断面領域が必要になります。第3は、その後35に挿入されるフレキシブル配列の穴を開ける事前浸透である。これには、正確な再配置または比較的大きな事前浸透直径、および電極アレイの剛性と断面領域が必要で、サポートされていない挿入が可能です。第四は、柔軟なデバイスを硬化させるために溶解可能なコーティングの使用です。これは、装置37の鋭い先端を維持するために特別な予防措置がとられる場合でも、挿入によって引き起こされる断面領域および急性損傷を著しく増加させる。第5は、ポリマーアレイの注入である。この戦略は、最大4つの32ch挿入2でインプラントを達成することに成功しましたが、挿入のためにはるかに大きな断面領域、250 μm - 1.5 mm外径ガラスキャピラリーチューブ9を使用する必要があり、より大きな急性損傷を引き起こします。対照的に、取り外し可能なシャトルを使用して、急性挿入に断面面積を追加しながら、可能な限り硬い材料の使用を可能にし、したがって、任意に柔軟な装置を挿入する際に理論上の最小サイズにすることができる。従って、堅いシャトルを使用して挿入は現在適用範囲が広い装置を挿入するための最も魅力的な選択である。
挿入シャトルアプローチには、適切に堅い基板と、フレキシブルデバイスを基板に組み合わせた方法の2つの要件があります。挿入シャトル材料は、典型的には、シリコン38、39、40、41、ステンレス鋼8、42、またはタングステン43、44、、45は、より小さな断面領域を可能にする堅い材料と。これらは、典型的には、ポリエチレングリコール(PEG)8、38、39、42、43、静電力40、または直接などの接着剤を使用して貼付される物理カップリング45,46.いずれの場合も、挿入後の挿入および分離の前に、電極アレイと挿入シャトルの位置合わせと結合が課題です。以下に述べ、Felix etal.39によって導入された方法の改良点は、ターゲット深さにアレイを挿入した後に除去されるPEGを使用して取り付けられたシリコン挿入シャトルで電極アレイを一時的にブレースする方法である。
慢性インプラント内の柔軟な装置によって提示される第二の挑戦は、デバイスが頭蓋骨に取り付けられたインプラントに統合されることを可能にしながら、脳内の装置を安定させることである。脳は自然な脈動、外傷後の起因する起因する頭蓋骨に対して相対的に動き、外傷後の起因性の変化、衝撃、およびその他の原因により、電極アレイは、頭蓋骨と記録ハードウェアに貼り付けられた場所に対して少なくともいくらか自由に動く必要があります。これは、インプラントターゲットのセットごとにカスタム設計された3Dプリントプラスチックベースピースを使用して達成され、複数の機能を持っています:注入中の生理生理物貯蔵所、ポリマーアレイをつなぎ付ける場所、およびシリコーンゲル用ハウジング。頭蓋骨とシリコーンゲルの上のテザリング位置は、アレイの曲率の半径を大きくし、アレイ上のより大きな圧縮力を可能にするために連携します。これにより、配列(頭蓋骨)のアンカーポイントに対する脳の動きを座屈負荷に変換することができます。
さらに課題としては、複数のアレイを収容し、振動や衝撃力を電極アレイに移さずに動物が自由に振る舞うための十分な歪み緩和を提供する必要性が含まれており、これは神経組織に対する運動を引き起こす可能性があります。硬い記録ウィンドウに対して脳が安定している必要がある同様のアプリケーションで使用されているソリューションへの適応は、この課題に対処しています。人工硬膜シーラントシリコーンゲル(材料の表)は、以前に非毒性であることが実証されており、CSF漏出47を防ぐことが証明されており、外側の腫れを防ぎ、アレイを安定させるために脳に対圧を提供します。脳表面。保護の追加層は、中粘度によってデバイスリボンに追加され、外科グレードのシリコーンエラストマーは、以前に慢性神経電極インプラント48をシールする用途に使用するために実証された。最後に、シリコーン緩衝インプラントおよびヘッドステージは動物の正常な移動性の最低の減少のための低い質量の中心を維持するように設計されている3D印刷された部分によって包まれています。
このプロトコルは、シリコン挿入シャトルに取り付けられた柔軟なポリマーマイクロ電極アレイから始まります。これは、3Dプリント挿入片へのアレイシャトル装置の取り付けを進め、動物を正常に移植するために必要な外科的技術とインプラント構築ステップを説明し、16のポリマー多極をサポートすることができる単一のラット1に8つの解剖学的に遠い領域に埋め込まれた配列。
このプロトコルは、Felix etal.39に示すように、バイオ分解可能な接着剤ポリエチレングリコール(PEG)によってシリコン挿入シャトルに取り付けられたポリマー電極アレイの出発材料を仮定し、少なくとも2つの独立して可動挿入するピース:シリコンシャトルが接着され、電極アレイのコネクタが付着するものです。このプロトコルはまた、ミクロンスケールのマイクロマニピュレータに2つの挿入片をより安全に取り付けるために、第3の挿入片を使用します。3D印刷のためのすべてのファイルは次のhttps://github.com/jasonechung/PolymerProbe3DPartsで見つけることができます。
この方法で使用される各ポリマー電極アレイは、2〜4回の記録シャンク、電気的痕跡を伝えるリボン、および、リボンの端に、ハードウェアコネクタまたはプリント回路基板で構成される。電極アレイとリボンは、PEGでシリコンシャトルの上に固定されています。各リボンには、UV硬化性エポキシを介してリボンに取り付けられた長さ2cm x 1mmの厚いポリイミドチューブがあり、リボンの長さに垂直に伸びています。各デバイス(電極アレイと挿入シャトル)は、アレイを脳に挿入し、シャトルを引き込むために使用される3Dプリントの挿入片にロードする必要があります(図1)。この設計では、油圧挿入マイクロマニピュレータ(緑色、材料の表)は、挿入装置全体(ピース1、ピース2および引き込みマイクロマニピュレータ、オレンジ)をターゲット深さに移動します。アレイが挿入装置から取り外され固定されると、2番目のリトラクションマイクロマニピュレータ(オレンジ)は、挿入装置の残りの部分から独立してピース1と付属のシャトルを引き込み、シャトルを取り外さずに取り外します。配列。
図 1: インサーター コンポーネント。
(A)ピース 1 と 2 は取り外し可能なネジで一時的に固定され、後で引き込みマイクロマニピュレータピストン (オレンジ) にドッキングされます。(B)アレイと挿入シャトルはピース1に付着し、アレイコネクタは両面テープでピース2に取り付けられています。ピース3は、リトラクションマイクロマニピュレータとピース1および2を挿入マイクロマニピュレータ(緑色)に接続する。挿入マイクロマニピュレータはインプラントの位置のための立体的なアダプターに固定される。ピース1-3は、その相対的なサイズで描かれています。ピース4は、挿入シャトルの適切な位置合わせのための安定化片である。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Protocol
この原稿に記載されているすべての動物関連プロトコルは、UCSFの機関動物ケアおよび使用委員会によって承認されています。
1. 挿入用ポリマー電極アレイの調製(約30分)
- ピース1をピース2に取り付け、ネジを通して位置合わせされた垂直方向の穴を挿入して、ピースを一緒にロックします(図2)。この2つを悪徳に持ちなさい。両面テープ (材料のテーブル)をピース 2 の上部に取り付けます。安定したピース4をピース1の端に取り付けます。それは摩擦によって所定の位置に保持されます。
図2:アレイシャトル位置合わせのアセンブリ。
(A)挿入シャトルアタッチメントを準備するピース1、2、および安定化片の組み立て。(B)ピース1と2を親指ねじと一緒に保持する。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
- 手で、電極アレイを位置合わせし、挿入シャトルをピース1の狭い端部に取り付けます。プローブがピース1の縦軸に位置合わせされた場合は、アレイコネクタをピース2の平らな部分にあるポリイミド両面テープに貼り付けます。
- プラスチック製の先端鉗子を用いて、アレイリボンに取り付けられたポリイミド翼のみに接触し、挿入シャトル電極装置先端をピース1から、安定化片の外側に持ち上げる(図3A)。
- ピース1の末端に少量のシアノクリレート(材料表)またはその他の接着剤(~10 μL)を塗布します。少なすぎると、挿入シャトルがピース1に強く付着せず、挿入または引き込み時に剥離する危険性があります。シャトルがあふれ、アレイ自体をピース1に付着させるリスクが多すぎます。
- プラスチック製の先端鉗子を使用して、アレイリボンに取り付けられたポリイミド翼のみに接触し、デバイスをピース1の狭いセグメントに再位置合わせし、挿入シャトルの正方形タブ(およびシャトルのみ)を接着剤の上に置きます(図3B)。シリコンシャトルまたはPEGの側面を操作して、小さな位置合わせ調整を行います。リボンやシャンクに過度の力を加えないようにしてください。
図3:アレイシャトルの位置合わせ、取り付け、殺菌。
(A)ピース1のドッキングステーションに接着剤を塗布するための挿入シャトル電極アレイ装置の適切な向き。2シャンクアレイシャトルが表示されます。(B)ポリマー電極アレイと挿入シャトルは、アライメントのための一時的な安定化ピースで、挿入片に取り付けられています。2シャンクアレイシャトルが表示されます。(C)滅菌時の保護のためにプラスチック製の箱に包まれた挿入装置。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
- 安定部分の両側に鉗子で穏やかな下向き圧力を加え、配列を動かさずにアセンブリから取り外します。
- 取り付けられた装置アセンブリ(ピース1および2、アレイ、挿入シャトル、およびアレイコネクタ)をバイスから取り外し、エチレンオキシドによる殺菌用の小さなプラスチックボックスのベースに両面テープで貼り付けます(図3C)。蒸気殺菌は、これらのデバイスには適していません。
2. ベースピースのデザイン
- 選択した定位ターゲットの頭蓋切除サイズと、頭蓋骨ねじとアースネジの位置を決定します。頭蓋切除のサイズは配列の足跡によって決定され、表面の血管系を避けるために配置調節のための数百(〜300)ミクロン円周と。
- 設計ソフトウェア(CADなど)を使用して、計画された頭蓋骨を囲み、側頭尾根と頭蓋骨ネジで定義された周囲に収まるベースピースのフットプリントを設計し、ベースピースの外側にある頭蓋骨表面積を最大化します。接着剤の接着セメントは、頭蓋骨にインプラントを付着させるために結合することができます。
- ベースピースの底面を輪郭を描いて、隙間なく頭蓋骨に付着できるようにし、感染の可能性を減らし、生理生理生理生理生またはシリコーンエラストマーが外れるのを防ぎます。
- ベースピースの高さを3~7mmに設定し、生理生理生理生理とシリコーンエラストマーを保持するのに十分な高さですが、アレイ挿入時の視認性を妨げないように十分に低く設定します。
注:ベースピースは、ポリイミド翼が頭蓋骨の上のポイントでつながることができる垂直ポストまたは同様の特徴で設計することができます。アタッチメント ポイントがビューを妨げないようにします。 - 3Dはベースピース(図4)を印刷し、埋め込み前にベースピースを殺菌します。
図4:インプラント用に用意された頭蓋骨。
頭蓋骨に固定された頭蓋骨のねじ、ベースアクリル層およびベースピースと完全なdurectomi。
3. 頭蓋骨の準備(~2時間)
- インプラントの重量を支えるために400g以上のラットを選択する。雄のロングエバンスラットは、生後6〜12ヶ月で使用された。
- ラットを麻酔する。動物を麻酔室に入れなさい。5%のイオフランをオンにします。
- ケタミン(50mg/kg)、キシラジン(6mg/kg)、アトロピン(0.14mg/kg)の精米内投与量を注入する。
- 足のピンチからの撤退がないことを確認することにより、手順全体を通じて20分ごとに麻酔深度を監視し、呼吸数は50〜75呼吸/分のままです。
- ラットに目のミントを適用します。
- ネズミの頭を剃る。
- 動物を立体ホルダーに入れます。
- ポビドネ-ヨウ素外科スクラブのそれぞれ3つの交互スクラブでスクラブし、続いて滅菌生理食生をスクラブすることによって外科部位を準備する。
- 頭皮に0.5%リドカインの0.2 ccを注入します。
- 頭蓋骨の中間線で、少なくとも3mmの前部を子羊に、3mm後部をラムダにさらす矢状切開を行う。
- 綿棒を使用して骨膜を取り除く。
- ステレオタクティック機器でブレグマでゼロにされたデカルト座標面を使用してメスで頭蓋骨を採点することにより、挿入および頭蓋切除部位をマークします。
- 鉗子で取り除くことができる骨の薄い層を残して、頭蓋骨切除部位をドリル。デュラを公開しないでください。これは、デュラを破壊することなく、骨のほこりの頭蓋骨を洗浄することができます。
- 骨の粉塵が穴に入るのを防ぐために、骨ねじを一度に1本ずつドリルで挿入します。骨のほこりを取り除くために寛大な等位灌漑を使用してください。約50グラムのインプラントの場合は、10~12本のネジを使用してください。チタンねじはオッセオインテグレーション49を可能にする。
- 脳に影響を与えることなく、頭蓋骨を完全に貫通する深さにネジを進める。
- 少なくとも 1 本のボーン ネジを電気伝導電線に接続して、回路アースとして機能させます。
- すべての掘削が完了したら、生理生理物洗浄で骨粉塵の頭蓋骨をきれいにします。
- 綿棒または他の吸収剤で頭蓋骨を乾燥させ、接着剤の接着剤セメント(材料の表)の初期層をネジに適用します(げっ歯類の頭蓋骨にエナメルエトシャントを使用しないでください)。この予備的な接着剤の接着セメント層はインプラントの接着を高め、後の付着ステップの分娩を減らす。
- 各頭蓋切除部位に残っている骨の薄い層を取り除きます。
- 血管系を避けながら、曲がった先端を持つ30ゲージの針を使用してデュラを切開します。切開の長さは挿入シャトルの寸法と一致する。
- 出血がある場合は、穏やかな生理的な点滴で手動で灌漑し、出血が止まるまで続行しません。
- 複数のデュレクトミーが行われている場合は、体温生理生理で数分ごとに定期的な灌漑など、ゲルフォームまたは別の方法で湿った部位を保ちます。
- ベースピースの根底部分の接着に備えて、綿棒または他の吸収剤で頭蓋骨を再び乾燥させます。
- 無菌ベースピースを配置します。ベースピースがブレグマをカバーする場合は、既知の距離にある別の場所をプロキシとしてマークします。
- ベースピースの周囲に接着剤の接着セメントを適用します。付着したベースピースを生理生理生理塩分で埋めます。ベースピースとスカルインターフェースの間の接体で接着剤接着セメントで漏れを特定し、パッチを当ててください(図5)。
注:これは頭蓋骨へのインプラントの十分な接着を防ぐため、人工硬膜シーラントシリコーンゲルの漏れを防ぐために、ベースピースを頭蓋骨に完全に固定することが重要です。動物は配列を挿入する準備ができています。
4. アレイのシリアル挿入とシャトルの取り消し(アレイあたり約1時間)
注:この手順は、特に1つのデバイスが後続のデバイスの移植を妨げる可能性がある複数アレイインプラントの場合は、実行不可能なデバイスで試験的に行う必要があります。
- 引き込みマイクロマニピレータピストンにピース1と2をロードします。ピース1のマイクロマニピュレータを拡張位置に、ピース3のマイクロマニピュレータを引き込んだ位置にセットします。ピストンはピース1の内側の端子深さにスライドします。ピース2は、穴を整列させた穴で、ピース3の上部に収まります。
- 挿入マイクロマニピタピストンにピース3をロードし、ピース3の下側にネジで固定します(図5A,B)。
- 2と3を一緒に積み込みねじ、挿入マイクロマニピュレータを動かして挿入装置全体を動かすことを(図5C)。
- ピース1と2を一緒に保持するネジを取り外します。ピース1はピース2とは独立して移動し、装置からの挿入シャトルを別々に引き込むことを可能にする。
- このネジをピストントラックに垂直なピース1の横穴に挿入し、ネジがピストンに圧力をかけるまで挿入します。これは図5Dに見られるように、ピース1が引き込みピストンに従って動く保証します。装置が定位装置に取り付けられているときに視界を妨げない横の穴を選びなさい。
図5:インサーターの組み立て。
(A)マイクロマニピュレータにピース3を取り付ける. (B) ピース1および2の取り付けは挿入装置に取り付ける。(C)電極アレイ挿入シャトル装置を搭載した挿入片。(D)親指ねじ保持片1及び2を一緒に取り外した。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
- 頭蓋からゲルフォームを取り除きます。ステレオタイプターゲティングには、実数またはプロキシブレグマを使用します。デバイスを挿入部位に移動する場合は、頭蓋骨の上に少なくとも数センチメートルの高さを維持します。
- 頭蓋骨または脳の近くにあるアレイシャトル装置の長時間を避けて、凝縮が挿入前または挿入中に挿入シャトルからアレイを切り離す可能性を減らします。これが発生した場合は、脳と頭蓋骨の上のアレイシャトル装置を上げ、乾燥して再付着するのを待ちます。
- 表面血管系を避けるためにインプラント座標を調整します。頭蓋切除術および小児摘出術の間のように、容器を直接貫通することは避けてください。
- デバイスを活発に挿入し(~25 μm/s)、装置が脳に入るまで立体計測器で下げる。装置はすぐに脳に浸透しない。抵抗とディンプリングの程度は、ターゲットの位置とデバイスの設計(例えば、2対4のシャンク、先端角度)に依存しますが、ディンプリングは通常1mmを超えません(図6)。
図6:アレイシャトル挿入。
アレイシャトルは、ターゲット深さに脳に進み込みます。4シャンクアレイシャトルが表示されます。
- 脳内に一度、マイクロマニピュレータで低く、ターゲット深さにアプローチする速度を低下させます。
- 定位アームを使用して、25 μm/s で挿入を開始します。
- マイクロマニピュレータを使用して、ターゲット深さより2mm~1mm上の場合、10 μm/sで挿入します。
- マイクロマニピュレータでの低速挿入は、目標深さより1mm~500μmの場合に5μm/sにします。
- ターゲットへの最終500 μmの間にさらに1-2 μm/sへの遅い挿入。
- デバイスの翼(水平ポリイミドチューブ)と下げ中の挿入点を可視化し、早期のシャトルアレイの剥離を避けます。
- 目標深度に達したら(図7A)、ポリイミド翼を軽く硬化性アクリルまたはシアノクリレートなどの別の接着剤を介してベースピース取り付け部位に二国間に固定する(材料の表)。結露は、これらの表面に収集し、接着を防ぐことができるように、必要に応じて、翼やベースピース上の取り付けポイントを乾燥させます。可視性やその他のスペースの制約が必要な場合は、通常、ポリイミド翼を 1 つだけに固定するだけで十分です。
- 溶解する前に、PEGはアレイと挿入シャトルインターフェースの上に座っている球状の塊として現れます(図7A)。シャトルに付着した位置で、体温生理生理生理をアレイにそっと滴下してPEGを溶かします。これが必要な時間の長さは選択されたPEGの分子量に依存し、完全な溶解は直接可視化によって確認することができる。PEG が完全に溶解した場合、アレイの境界はシャトルとピース 1 から完全に識別可能になります (図 7B)。
図7:シャトルの撤退。
(A)引き込む前に翼のテザリング。ツーシャンクアレイとシャトルが表示されます。(B)PEG溶解とシャンクフィーチャー(丸で囲まれた青)を備えた翼の接着により、引き込み時にアレイとシャトルの分離が成功したことを視覚的に確認できます。(C)挿入シャトルの挿入後に正常にアレイ挿入が完了しました。(D)シリコーンゲル充填付きのベースピースで、単一の2シャンクアレイ挿入用に使用できます。使用される低粘度シリコーンゲルは青い色調を有する。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
- リトラクションマイクロマニピュレータを使用して、挿入シャトルをゆっくりと引き出します。引き込まれるアレイに対して生理生理物の灌漑(~1滴/s)を続けます。ターゲット深さからの関連する距離での挿入速度と同じリトラクション速度を使用します。
- マイクロマニピュレータをターゲット深さから-500 μmまで1-2 μm/秒でリトラクトします。
- -500 μm から -1 mm の場合は、マイクロマニピュレータを使用して引き込み速度を 5 μm/秒にします。
- マイクロマニピュレータを使用して-1 mm から -2 mm の場合は、10 μm/秒で引き込み速度を上げます。
- 定数から上向きの-2mmから25μm/sの立体アームを使用して引き込みます。
- リトラクション中にアレイと挿入シャトル間のインターフェイスを視覚化します。ポリマーアレイはシャトルから目に見えて分離し、シャトルが挿入シャトルのシャンク間の半円形のジャンクションで引き込まれるにつれて半透明に見えます(図7B)。
- ピース 2 からアレイ コネクタを取り外し、後続の挿入を妨げない場所に移動します。ポリマー電極アレイは現在脳内にあり、立体計測器に接続されなくなりました(図7C)。挿入シャトルおよびその他の挿入ハードウェアを取り外します。
- 複数の挿入の場合は、手順 4.1 から 4.9 を繰り返します。必要な配列がすべて挿入されるまで、次のセクションに移動しないでください。歪み救済領域の脳と翼の間のデバイスリボンのわずかな弓は、少なくともここまで延長することができるので、お互いの250 μm以内に2つのデバイスを挿入することはお勧めしません。
5. インプラント施工(~2時間)
- 最終的な配列挿入後、ピペットまたは綿棒を用いてベースピースから空の生理生理生理物は、埋め込まれたアレイまたはリボンを破壊しないように注意する。
- 頭蓋切開とベースピースを低粘度シリコーンエラストマー、またはその他の人工硬膜シーラントで充填します。治癒を許可する(図7D)。複数の挿入を行う場合は、干渉しない場所にハードウェア コネクタを配置します (図 8A)。適切に配列コネクタの向きを設定し、インプラントを構築し、リボンが最終的に望ましい位置に入るようにします。
- 中粘度シリコーンエラストマーでアレイ、アレイリボン、コネクタをカバーします。このソフトハード材料インターフェイスは損傷を受けやすいため、ポリマーコネクタインターフェイスに特に注意してください。中粘度シリコーンが硬化する際に固定化されるアレイリボンを完全にカバーします。
- エラストマーで覆われたデバイスを、設計されたケースに同封します。
- 歯科アクリルでインプラント基盤を補強する。アクリルがアレイリボンに直接接触するのを許さ、硬化しながらアクリルが導電性の痕跡を損傷する可能性があるためです。
- 切開部の周りにブピビケインとバシトラシンの乳化を適用します。
- 4-0ナイロン縫合糸と皮膚の接着剤を使用して切開部を閉じます。
6. 回復とインプラントケア
- 定位装置から動物を取り出し、加熱パッドの横に置きます。
- 水和動物に暖かいリンガー溶液(5 - 10 mL)の皮下注射を与えます。
- 動物がロコモティング(10~60分)になったら、ケージの半分を37°Cの加熱パッドの下に置き、2~3日間ケージに移します。
- 暖房パッドの下で、軟化した食品と水へのアクセスを与えます。
- 痛みのコントロールのために必要に応じて1週間毎24時間(皮下または経口投与)毎に2mg/kgメロキシカムで動物を注入します。
- ラットを1〜2週間治癒させ、インプラント重量に調整する(図8B)。
- インプラントの周りの組織の定期的なクロルヘキシジン洗浄を行い、刺激、感染、または脱ヒスジェンスのための毎日の検査を行います。
図8:移植からの回復後に複数挿入された配列およびラット。(A)後続の挿入を妨げない場所にあるハードウェア コネクタ。(B)A 1,024チャンネル、慢性ポリマーアレイインプラント。ニューロンの許可を受けて再現[補足図1H]1.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Representative Results
このプロトコルに続いて、1,024チャンネルの神経インプラント記録は375の単一ユニット1を生み出しました(MountainSort50、ノイズオーバーラップ<0.03、分離>0.96、単一ユニット記録に使用される512チャンネル、図9A)。このプロトコルは、異なるチャンネル数と仕様を持つ異なる数のデバイスを、記録ターゲットの異なる組み合わせに移植するために使用できます。同じプロトコルを使用して、単一ユニット記録寿命は、3つの異なるラット間で19個のデバイス(前頭前皮質の18 32チャンネルデバイス、眼窩前頭皮質の1つの64チャンネルデバイス)からのデータで少なくとも160日間実証されています(図 9B)。3匹のうちの1匹はデジタル電気的障害を起こし、4つのデバイスから記録できなかった。残りの15/19デバイスのうち、チャンネルあたり約1単位の記録歩留まり平均があった。個々のデバイスの収率は、チャネルあたり最大 2 単位までわずか数ユニットでした。同じ領域に同じ動物に移植されたデバイス上で非常に異なる収率を見ることは一般的です。
さらに、ここで説明するプロトコルに従う別の外科チームは、オービト前頭皮質と側坐核を標的とする4-6 32チャネルデバイスとテトロードハイパードライブ(全インプラント)の組み合わせで、それぞれ6匹の追加動物を移植しました。重量約50g)。1匹の動物は手術の1ヶ月以内にインプラント剥離をした。術後の回復期間中に2匹目の動物が死亡し、ここで説明するプロトコルステップとは無関係である可能性が高い。残りの4匹の動物は、4-11ヶ月続いた実験の長さのために安定したインプラントで健康なままでした。単一ユニット数は、32チャンネルデバイスで以前に報告されたものと同様でした。
図9:単一単位収率および記録寿命。
(A)品質メトリックしきい値によって階層化された 512 チャネル(1,024 チャネルインプラントの)からの単一ユニット クラスターの数。MountainSort を使用した自動キュレーション (ノイズオーバーラップ 0.03、分離 0.96、右上のブラック ボックス) を使用すると、512 チャンネルから 375 個の単一ユニットが識別されました。ニューロンの許可を受けて再現 [図2A]1.(B)ラットにおける160日間の移植後(x軸)以上のチャネル(左Y軸)または16チャンネルシャンク(右Y軸)あたりのポリマーアレイの単単位収率。実線は、8シャンクにわたる平均細胞収率であり、点線±1 SE.シャンク当たりの個々のタイムポイントは、地域別に色分けされたドットとして表示されます。ニューロンの許可を受けて再現 [図3A]1.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Discussion
これは、複数のポリマー電極アレイを分散脳領域に移植し、数ヶ月にわたって単一ユニットを記録する方法である。この方法は、記録チャネルの8倍の増加と、最も近い大規模ポリマーアレイベースのシステム2、3からの挿入数の4倍の増加を表す。そのシステムは、マウスでポリマーメッシュ注入ベースのシステムを利用したが、一元単一単位の絶対数を報告しなかったため、単一ニューロン収率の比較は不可能である。
フレキシブルデバイスの挿入方法はFelix et al.39の以前のプロトコルに基づいており、重要な変更点:引き込み時のシリコンシャトルの独立した動きのための3ピース挿入装置、およびアレイのテザリングシャトルの撤回前の目標深さで、元のプロトコルで説明されている迅速な撤退の必要性を一緒に排除します。これらの変更はティッシュの損傷を最小にし、シャトルの引き込みの間に配列の安定性を維持する。バイオ分解可能な材料を持つデバイスを一時的に硬化させるなど、他の柔軟なデバイス注入戦略は、このプロトコルの後続のステップと互換性があります。インプラント内のデバイスを保護するには、脳を覆い、繊細なデバイスリボンを保護するための以前に検証された戦略を統合する必要があります。
その脆弱性のために、ポリマー電極アレイおよびシリコン挿入シャトルに直接接触したり、力を伝達したりすることを避けるために注意と注意が必要です。特に複数のデバイスを使用する場合は、あるデバイスと別のデバイスの干渉を避けるために、顕微鏡下で挿入を観察する必要があります。一般に、微量を回避し、プラスチック先端鉗子で電極アレイを穏やかに処理することが可能です。このような戦略は、例えば、ポリマー電極アレイが挿入シャトルで後退し始める場合に適している。これは、PEGが完全に溶解していない場合、またはポリマーとシリコンの間の生理生理生理またはCSFの表面張力が原因で起こりうる。
最も一般的なリカバリ可能なエラーの 1 つは、挿入シャトルからの配列の取り外しです。これは、アレイとシャトルが不完全に整列している場合、または凝縮がPEGを部分的に溶解した場合に、デバイス先端の脳のディンプルと圧力が増加するにつれて、挿入時に発生する可能性があります。アレイを再付着するには、できるだけ高く上げて、乾燥するのを待ちます(約5分)。
マルチアレイ注入手術を計画する重要な側面は、すべてのインプラントターゲットを収容し、頭蓋骨の輪郭に対するギャップなしで座るベースピースの設計です。ベースピースは、アレイの挿入前に、頭蓋骨のクリーニング、ネジの配置、および部分的な頭蓋骨の後に頭蓋骨に固定される小さなプラスチック片です。それは3つの機能を有する:1)配列の挿入後にPEGを溶解するための生理生理生理を保持するが、シリコンシャトルの引き込み前に、2)アレイがポリイミド翼によって取り付けることができる頭蓋骨表面の上の位置を提供し、それによってひずみ救助を可能にする脳内の挿入点の上のリボンに沿って、3)アレイと脳を安定させ、保護する人工硬膜シーラントを保持する。ベースピースは、手で作るか、3Dプリントすることができます。生理生理のベース部分を排水および乾燥することは、装置挿入前に非常に重要であることが観察された。これらのステップは配列および挿入シャトルの結露そして分離を防ぐ。ベースピースを乾燥させるには、ベースピースを人工硬膜シーラントで充填することも重要です。また、シリコーンゲルのフィルムが頭蓋骨から取り出しにくく、頭蓋骨へのインプラントの信頼性の高い慢性的な取り付けのための歯科アクリルの付着を防ぐため、ベースピースが漏れていないことも重要です。低粘度、生体適合性シリコーンエラストマーは、頭蓋骨およびベースピースを充填するために使用され、それを取り巻くより高い粘度シリコーンエラストマーと露出したポリマーアレイリボンを使用することが期待されます。
ポリマーナノファブリケーションの進歩は、ポリマーベースの電極アレイに変換され、特徴サイズを小さくし、シリコンデバイス15、16、17に近いアレイ内の電極の数を増やします。 、18、19.同様に、ポリマーデバイスの断面領域は、特徴サイズと共に縮小し、さらに良好な生体適合性8を提供する。繰り返しますが、シリコンデバイスで行われているように、増幅、デジタル化、多重化チップ17との統合により、より大規模なニューラル記録がさらに可能になります。
Disclosures
J.E.C.およびL.M.F.は、ここに記載されている作品に関連する特許の発明者です。
Acknowledgments
この研究は、NINDS助成金U01NS090537をL.M.FおよびV.M.T.に、NIMH助成金F30MH109292をJ.E.Cに、NIMH助成金F30MH115582をH.R.J.J.J.E.C.およびH.R.J.J.が支援#T32GM007618フラットアイアン研究所はサイモンズ財団の一部です。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D Printed Stereotax Adapter Parts (3) and Base Piece (1) | N/A | N/A | 3d print parts, suggest <30 μm resolution for minimal hand finishing of parts. Files available at: |
| https://github.com/jasonechung/PolymerProbe3dParts | |||
| Dental Acrylic (Hygenic Repair Resin, Coltene type II quick set) | Colten/Whaledent | 8886784, 8881627 | Dental acrylic for use during implant construction |
| Hydraulic Micromanipulator (x2) | Narishige Group | MO-10 | 1-axis micromanipulator |
| Kapton Polyimide Tape | Bertech | PPTDE-1/2 | Double-sided tape |
| Kopf Stereotax Arm | Kopf Instruments | 103088R, 103088L | Standard rodent stereotax |
| Light Curable Dental Acrylic, Vivid Flow | Coltene/Whaledent | D33-01-00 | Light curable dental acrylic for use during implant construction |
| Loctite Gel Control | Henkel Corp. | 234790 1364076 1735574 1752699 | Cyanoacrylate for adhering silicon shuttle to corresponding 3d printed part |
| Metabond Quick Cement | Parkell | S380 | For direct application to skull to create strong connection between skull and implant |
| Polymer Electrode Arrays and Silicon Insertion Shuttles | Lawrence-Livermore National Laboratory | N/A | Fabricated at Lawrence-Livermore National Laboratory, polyimide electrode arrays, silicon insertion shuttle |
| Silicone Gel Kit, Low Viscosity | Dow Corning | 03/80 | Low-viscosity silicone gel for filling of 3d printed base piece |
| Silicone, Medium-Viscosity Kit | World Precision Instruments | Kwik-Sil | Medium-viscosity silicone gel for protection of polymer electrode arrays |
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