Chronische implantatie van meerdere flexibele polymeer elektrode arrays

Summary

Hieronder beschreven is een methode voor implantatie van meerdere polymeer elektrode arrays in anatomisch verre hersengebieden voor chronische elektrofysiologische opname in vrij bewegende ratten. Voorbereiding en chirurgische implantatie worden gedetailleerd beschreven, met de nadruk op ontwerpprincipes om de aanpassing van deze methoden voor gebruik bij andere soorten te begeleiden.

Abstract

Gelijktijdige opnames van grote populaties van individuele neuronen over gedistribueerde hersengebieden gedurende maanden tot jaren zullen nieuwe mogelijkheden van wetenschappelijke en klinische ontwikkeling mogelijk maken. Het gebruik van flexibele polymeer elektrode arrays kan langdurige opname ondersteunen, maar dezelfde mechanische eigenschappen die zorgen voor een lange levensduur van de opname maken meerdere inserties en integratie in een chronisch implantaat een uitdaging. Hier is een methodologie waarmee meerdere polymeer elektrode arrays kunnen worden gericht op een relatief ruimtelijk onbelemmerd aantal hersengebieden.

De methode maakt gebruik van dun-film polymeer apparaten, geselecteerd voor hun biocompatibiliteit en vermogen om lange termijn en stabiele elektrofysiologisch opname-interfaces te bereiken. Het resulterende implantaat maakt nauwkeurige en flexibele targeting van anatomisch verre gebieden, fysieke stabiliteit voor maanden, en robuustheid aan elektrische ruis. De methodologie ondersteunt maximaal zestien seriële ingevoegde apparaten in acht verschillende anatomische targets. Zoals eerder gedemonstreerd, de methodologie is geschikt voor het opnemen van 1024 kanalen. Van deze, de 512 kanalen in deze demonstratie gebruikt voor single neuron opname leverde 375 enkele eenheden verdeeld over zes opnamelocaties. Belangrijk is dat deze methode ook enkele eenheden voor ten minste 160 dagen kan opnemen.

Deze implantatie strategie, inclusief het tijdelijk bracen van elk apparaat met een inklapbare silicium-plaatsings shuttle, omvat het Tethering van apparaten op hun doel diepten naar een met schedel vastgehouden plastic basisstuk dat op maat is ontworpen voor elke set van opname doelstellingen en stabilisatie/bescherming van de apparaten in een met silicone gevulde, op maat ontworpen plastic behuizing. Ook bedekt is de bereiding van hulpmiddelen voor implantatie, en ontwerpprincipes die aanpassing aan verschillende combinaties van hersengebieden of array ontwerpen moeten begeleiden.

Introduction

Een ideaal neurale implantaat zou opnemen van een zeer groot aantal individuele neuronen in gedistribueerde hersengebieden gedurende weken tot maanden. Flexibele polymeer elektrode arrays bieden elektrofysiologische opnames met de levensduur om maanden lang op te nemen en de stabiliteit om individuele neuronen te volgen^1,2,3. Echter, dezelfde mechanische eigenschappen die vermindering van de afschuiving schade⁴ en verlenen biocompatibiliteit en opname mogelijkheid^{2,3,5,6,7, 8} vormen een uitdaging voor hun inbrengen in de hersenen ten opzichte van hun stijve tegenhangers. Vorig werk volbracht een maximum van 4 32-Channel arrays, maar de totale opbrengst van gesorteerde vermoedelijke enkelvoudige neuronen is niet gerapporteerd^2,3,9. Omgekeerd, silicium-gebaseerde elektrode arrays zijn gebruikt in hoge dichtheid, multi-regio implantaten, maar deze technologieën niet de mogelijkheid om op te nemen van de pieken van neuronen gedurende maanden (levensduur) of om te volgen van de dezelfde neuronen (stabiliteit) op die tijdschaal, of de dichtheid om op te nemen van honderden afzonderlijke neuronen in meerdere hersengebieden. De hier gepresenteerde methode overkomt het lage aantal inserties in de huidige polymeer-elektrode array-gebaseerde methoden, waardoor middelen worden geboden voor de elektrofysiologisch registratie van grote aantallen individuele neuronen in meerdere anatomisch verre gebieden voor maanden, met de stabiliteit om op te nemen van de dezelfde individuele neuronen over vele dagen.

Er is enige discussie over het belang van het gebruik van een polymeer substraat in plaats van Microwire-of Silicon-based strategieën. Zoals aangetoond door Dhawale et al.¹⁰, zijn micro draden inderdaad geschikt voor maandenlange stabiele opnames bij knaagdieren, hoewel de implantaten beperkt waren tot 16 tetrodes in één regio. Het vergroten van de grootte van het verwarmings-implantaat bereikt een relatief hoge bovengrens, met maximaal 1792 geïmplanteerde kanalen bereikt in een niet-menselijke primaat¹¹. De constructie van de verwarmings-arrays is echter onverenigbaar met silicium-nano fabricageprocessen en is daarom extreem tijdrovend, waarbij elk kanaal afzonderlijk tijdens de bouw^12,13 handmatig wordt verwerkt. ^,14. Als zodanig is het niet duidelijk of deze technologie een orde van grootte verhoging van opnamekanalen zou kunnen ondersteunen.

Huidige silicium-apparaten kunnen honderden of zelfs meer dan duizend elektroden op een enkel monolithische apparaat^{15,16,17,18,19}plaatsen. De nieuwste silicium fabricageprocessen genereren apparaten met kleinere dwarsdoorsnede gebieden, ongeacht het materiaal, wat resulteert in minder gliacellen activering^{20,21,22,23 ,24} en meer compatibele apparaten. Er is een variabiliteit in rapporten van Silicon probe single-unit opname levensduur, met sommige wat aangeeft dat relatief grote silicium sondes kunnen bieden op lange termijn opname^25,26. Met name de nieuwste commercieel verkrijgbare silicium-apparaten¹⁷ hebben de lange levensduur om enkele maanden op te nemen en hebben transversale gebieden die zeer vergelijkbaar zijn met de schachten die worden gebruikt in de hier beschreven methode (Jun et al. 2017¹⁷: 70 μm x 20 μm, hier beschreven apparaten en in Chung et al. 2019¹: 68 μm – 80 μm x 14 μm). Vanwege het verschil in stabiliteit, deze sonde is niet aangetoond te kunnen opnemen van de dezelfde neuronen gedurende weken. Dit is waarschijnlijk te wijten aan een combinatie van het gebruik van rigide silicium en directe Tethering aan de schedel, waarvan bekend is dat ze micromotion, instabiliteit en gliose veroorzaken bij de array-Brain interface^27,28. Om een apparaat te construeren dat met het zenuwweefsel kan bewegen, zijn materialen die zacht zijn^5,29 en flexibele⁷ vereist. Veel beschikbare polymeren (Zie Geddes en Roeder³⁰, fattahi et al.³¹, en weltman et al.³² voor beoordelingen) hebben de flexibiliteit en stabiliteit van micro draden en zijn ook compatibel met de nano fabricageprocessen, die het mogelijk maken de dichte verpakking van silicium apparaten.

Verschillende neurale implantatie problemen zijn specifiek voor het gebruik van flexibele polymeer elektrode arrays. De eerste van deze is het inbrengen van de array, omdat flexibele arrays niet de stijfheid hebben om te worden gevorderd in de hersenen, zoals Silicon-of Microwire-gebaseerde strategieën. Het merendeel van de plaatsings strategieën voor flexibele apparaten is afhankelijk van een tijdelijke verstijving van het substraat zoals in deze methode wordt gedaan (Zie Weltman et al.³² ter beoordeling). Er zijn vijf opmerkelijke strategieën die geen gebruik maken van een stijve shuttle. Ten eerste zijn er methoden die gebruik maken van materialen die overstappen van rigide naar compliant bij implantatie^33,34. Een nadeel van deze strategie is dat het een relatief groot dwarsdoorsnede gebied vereist om de kracht te bereiken die nodig is voor penetratie van hersenweefsel voordat knik wordt gedicteerd door Eulers knik kracht berekening³⁵. Deze toename van het transversale gebied zal een negatieve invloed hebben op de gezondheid van het omringende weefsel^{20,21,22,23,24}. Ten tweede is het gebruik van een afneembare ondersteunende structuur boven de hersenen³⁶, hoewel dit tijdrovende verwijdering of ontbinding van steigers vereist om een minimale niet-ondersteunde lengte (en hoge knik kracht) te behouden. Als alternatief zou de array moeten worden ingevoegd met een langere niet-ondersteunde lengte, waardoor een stijvere array-substraat of een groter cross-sectionele gebied van de array nodig is. Derde is pre-penetratie om een gat te openen voor de flexibele array te worden ingevoegd in daarna³⁵. Dit vereist nauwkeurige heropening of relatief grote pre-penetratie diameter, en elektrode-array stijfheid en dwarsdoorsnede gebied om niet-ondersteunde invoeging mogelijk te maken. Ten vierde is het gebruik van onoplosbaar coatings om het flexibele apparaat te verstijven. Dit verhoogt aanzienlijk het dwarsdoorsnede gebied en acute schade veroorzaakt door inbrengen, zelfs wanneer speciale voorzorgsmaatregelen worden genomen om de scherpe punt van een apparaat te behouden³⁷. Ten vijfde is de injectie van de polymeer array. Deze strategie heeft succes gehad bij het bereiken van implantaten met tot 4 32-CH inserties², maar vereist het gebruik van een veel groter dwarsdoorsnede gebied voor het inbrengen, een 250 μm-1,5 mm buitendiameter glazen capillaire buis⁹, waardoor grotere acute schade. In tegenstelling, met behulp van een verwisselbare shuttle, terwijl het toevoegen van cross-sectionele gebied aan de acute inbrengen, maakt het mogelijk om het gebruik van de stijfste mogelijke materialen, en kan daarom de theoretische minimale grootte bij het invoegen van een willekeurig flexibel apparaat. Zo is het inbrengen met behulp van een stijve shuttle momenteel de aantrekkelijkste optie voor het invoegen van flexibele apparaten.

Er zijn twee vereisten voor elke insertie shuttle aanpak: een voldoende stijf substraat en een manier om het flexibele apparaat aan de ondergrond te koppel. Plaatsings shuttle materialen zijn typisch silicium^38,39,40,41, roestvrij^{staal 8,42}, of wolfraam^{43,44, 45}, met stijvere materialen die kleinere dwarsdoorsnede gebieden mogelijk maken. Deze worden meestal aangebracht met behulp van een lijm zoals polyethyleenglycol (PEG)^{8,38,39,42,43}, elektrostatische krachten⁴⁰, of direct fysieke koppeling^45,46. In alle gevallen zijn de uitdagingen de uitlijning en koppeling van de elektrode-array en de plaatsings shuttle vóór het inbrengen en ontkoppelen na het inbrengen. Hieronder vindt u een verfijning van de methode die door Felix et al.³⁹ is geïntroduceerd om de elektrode-array tijdelijk te laten accolades met een silicium-plaatsings shuttle, bevestigd met behulp van Peg, die wordt verwijderd na het inbrengen van de array op de doeldiepte.

Een tweede uitdaging die wordt gepresenteerd door flexibele apparaten binnen een chronisch implantaat is dat van het stabiliseren van het apparaat in de hersenen, terwijl het nog steeds mogelijk is om het apparaat te integreren in een implantaat dat aan de schedel is bevestigd. De hersenen beweegt ten opzichte van de schedel als gevolg van natuurlijke pulsaties, post-traumatische edemateuze veranderingen, impact, en andere oorzaken, en de elektrode-array moet daarom op zijn minst enigszins vrij om te bewegen ten opzichte van waar het is aangebracht op de schedel en het opnemen van hardware. Dit wordt bereikt met behulp van een 3D-gedrukte kunststof basisstuk, op maat ontworpen voor elke set van implantaat doelen, dat heeft meerdere functies: een zoutreservoir tijdens de implantatie, locatie om de polymeer arrays Tether, en behuizing voor silicone gel. De Tethering-locatie boven de Skull and silicone gel werkt samen om een grotere kromtestraal te creëren voor de array en daardoor grotere drukkrachten op de array mogelijk te maken. Dit op zijn beurt zorgt voor beweging van de hersenen ten opzichte van de ankerpunten van de array (schedel) worden vertaald in knikbelasting.

Verdere uitdagingen omvatten de noodzaak om meerdere arrays te huisdieren en bieden voldoende trekontlasting voor het dier om zich vrijelijk te gedragen zonder overdracht van trillingen of Slag krachten naar de elektrode-arrays, wat kan leiden tot bewegingsvrijheid ten opzichte van zenuwweefsel. Aanpassingen aan oplossingen die zijn gebruikt in vergelijkbare toepassingen waarbij de hersenen stabiel moeten zijn ten opzichte van een stijf opnamescherm, hebben deze uitdaging aangepakt. Een kunstmatige durale Sealant siliconen gel (tabel van materialen), die eerder is aangetoond dat ze niet giftig zijn en CSF-lekkage⁴⁷voorkomen, biedt tegen druk aan de hersenen om uiterlijke zwelling te voorkomen en om de array te stabiliseren op het hersen oppervlak. Een extra beschermingslaag wordt toegevoegd aan het apparaat linten door de middel-viscositeit, chirurgische grade siliconen elastomeer, eerder gedemonstreerd voor gebruik in het afdichten van chronische neurale elektrode implantaten⁴⁸. Tot slot wordt het met siliconen gebufferde implantaat en de hoofdfase omhuld met 3D-gedrukte stukken die speciaal zijn ontworpen om een laag massa centrum te behouden voor een minimale reductie van de normale mobiliteit van het dier.

Dit protocol begint met een flexibele polymeer microelect rode array die is gemonteerd op een silicium-plaatsings shuttle. Het gaat met de montage van het array-shuttle-apparaat naar de 3D-gedrukte insteek stukken, beschrijft de chirurgische techniek en de bouw stappen van het implantaat die nodig zijn om een dier met succes te implanteren, en is in staat om zestien polymeer multi-elektrode te ondersteunen arrays geïmplanteerd in acht anatomisch verre gebieden in een enkele rat¹.

Dit protocol veronderstelt de uitgangsmaterialen van polymeer elektrode arrays die zijn bevestigd door de biooplos bare lijm polyethyleenglycol (PEG) aan een silicium insertion shuttle, zoals weergegeven in Felix et al.³⁹, en ten minste twee onafhankelijk beweegbare invoeging stuks: een waarop de silicium shuttle wordt gelijmd en waarvan de connector van de elektrode-array zal worden nageleefd. Dit protocol maakt ook gebruik van een derde invoegstuk om de twee invoeg stukken veiliger aan een micro manipulator met micron-schaal te bevestigen. Alle bestanden voor 3D-printen zijn te vinden op: https://github.com/jasonechung/PolymerProbe3DParts

Elke polymeer-elektrode array, die in deze methode wordt gebruikt, bestaat uit twee tot vier opname schachten, een lint dat de elektrische sporen overbrengt, en, aan het einde van het lint, een hardware-connector of een gedrukte printplaat. De elektrode-array en het lint zijn bevestigd bovenop de Silicon shuttle met PEG. Elk lint heeft een 2 cm lange x 1 mm dikke polyimide buis bevestigd aan het lint via UV-uiverbare epoxy, die loodrecht op de lengte van het lint. Elk apparaat (elektrode-array en insertie shuttle) moet worden geladen op de 3D-gedrukte insteek stukken die zullen worden gebruikt om de array in de hersenen te plaatsen en de shuttle op te trekken (Figuur 1). In dit ontwerp verplaatst de hydraulische insteek micromanipulator (groen, tafel van de materialen) de gehele insteek inrichting (stuk 1, stuk 2 en de terugtrek micromanipulator, oranje) naar de beoogde diepte. Zodra de array is losgemaakt van de insteek inrichting en vast, trekt de tweede, retractie micromanipulator (oranje) stuk 1 en de bijgevoegde shuttle onafhankelijk van de rest van de insteek inrichting, waarbij de shuttle wordt verwijderd zonder de array.

Figuur 1: inserter componenten.
A) de delen 1 en 2 worden tijdelijk met een afneembare schroef aan elkaar bevestigd en zullen later op de zuiger van de micro manipulator (oranje) worden vastgezet. B) de array en de insertie shuttle worden aan stuk 1 gehecht en de array-connector is aan stuk 2 bevestigd met dubbelzijdige tape. Stuk 3 verbindt de terugtrekking micromanipulator en de delen 1 en 2 aan de insertie micromanipulator (groen). De insertie micromanipulator is bevestigd aan een stereotactische adapter voor implantatie positionering. Stukken 1-3 worden afgebeeld in hun relatieve afmetingen. Stuk 4 is een stabiliserend stuk voor de juiste uitlijning van de pendeldienst. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Protocol

Alle in dit manuscript beschreven dierbetrokken protocollen zijn goedgekeurd door het Comité voor de verzorging en het gebruik van dieren in de UCSF.

1. bereiding van polymeer elektrode-arrays voor inbrengen (~ 30 min)

1. Bevestig stuk 1 aan stuk 2 door een schroef te plaatsen via uitgelijnde, verticaal georiënteerde gaten om de stukken samen te vergrendelen (Figuur 2). Houd deze twee stukken in een vice. Bevestig dubbelzijdige tape (tabel metmaterialen) aan de bovenkant van het stuk 2. Bevestig het stabiliserend stuk 4 aan het einde van stuk 1. Het zal op zijn plaats worden gehouden door wrijving.

Figuur 2: montage voor array-shuttle uitlijning.
A) assemblage van stukken 1, 2, en stabiliserend stuk ter voorbereiding van de inbreng shuttle bijlage. B) de delen 1 en 2 worden samen met de duim schroef vastgehouden. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

2. Lijn de elektrode-array met de hand uit en bevestig de pendeldienst met het smalle eind segment van stuk 1. Wanneer de sonde is uitgelijnd met de lengteas van stuk 1, hecht de array-connector aan de polyimide dubbelzijdige tape op het vlakke gedeelte van stuk 2.
3. Met plastic getipt Tang, neem contact op met alleen de polyimide vleugel aangesloten op de array lint, til het inbrengen shuttle-elektrode array apparaat tip uit stuk 1, aan de buitenkant van het stabiliserend stuk (Figuur 3a).
4. Breng een kleine hoeveelheid cyanoacrylaat (tabel met materialen) of andere lijm (~ 10 μL) aan op het einde van stuk 1. Te weinig zal de insertie shuttle niet sterk hechten aan stuk 1, het riskeren van loslating tijdens het insteken of terugtrekking. Te veel Risico's overstromen de shuttle en het vasthouden van de array zelf aan stuk 1.
5. Met behulp van plastic getipt Tang, alleen contact opnemen met de polyimide vleugel aangesloten op de array lint, opnieuw uitlijnen van het apparaat met de smalle segment van stuk 1, met de vierkante tab van de invoeg shuttle (en alleen de shuttle) bovenop de lijm (Figuur 3b). Maak kleine uitlijning aanpassingen door het manipuleren van de zijkant van de siliconen shuttle of de PEG. Vermijd het aanbrengen van overmatige kracht op het lint of de schachten.

Figuur 3: uitlijning, bevestiging en sterilisatie van array-shuttle.
A) de juiste oriëntatie van het inbrengen van de shuttle-elektrode array-apparaat voor het aanbrengen van lijm op het docking station van stuk 1. Twee-schacht array-shuttle getoond. (B) polymeer elektrode array en plaatsings shuttle gemonteerd op insteek stuk, met tijdelijk stabiliserend stuk voor uitlijning. Twee-schacht array-shuttle getoond. C) inschakel inrichting in kunststof doos voor bescherming tijdens sterilisatie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

6. Breng zachte neerwaartse druk met de Tang aan beide zijden van het stabiliserende stuk en verwijder deze uit de assemblage zonder de array te verplaatsen.
7. Verwijder de gemonteerde apparaatassemblage (onderdelen 1 en 2, array, insertie shuttle en array connector) van de vice en hecht deze aan dubbelzijdige tape aan de basis van een kleine plastic doos voor sterilisatie door ethyleenoxide (figuur 3c). Stoomsterilisatie is niet geschikt voor deze apparaten.

2. ontwerp van het basisstuk

1. Bepaal craniectomie maten voor geselecteerde stereotactische doelen, evenals locaties van schedel schroeven en grond schroeven. Craniectomie grootte wordt bepaald door array footprint, met een paar honderd (~ 300) micron omtrek voor aanpassingen van de plaatsing om oppervlakte vasculatuur te voorkomen.
2. Met behulp van een ontwerp software (bijv. CAD) ontwerpt u de voetafdruk van het basisstuk om de geplande craniectomieën te omringen en past u binnen de omtrek die is gedefinieerd door de temporele Ridge en Skull schroeven, waardoor het oppervlak van de schedel wordt gemaximaliseerd dat buiten het basisstuk ligt waar lijm cementeren cement kan binden om het implantaat te hechten aan de schedel.
3. Contour het bodemoppervlak van het basisstuk zodat het kan worden vastgehouden aan de schedel zonder gaten, waardoor de kans op infectie wordt verkleind en het voorkomen van zout of siliconen elastomeer van sijpelen uit.
4. Stel de hoogte van het basisstuk in op 3-7 mm, hoog genoeg om zout en siliconen elastomeer vast te houden, maar laag genoeg om de zichtbaarheid tijdens het inbrengen van de array (s) niet te belemmeren.
   Let op: het basisstuk kan worden ontworpen met verticale palen of soortgelijke kenmerken waarop de polyimide vleugels kunnen worden vastgebonden op een punt hoger boven de schedel. Sta geen bevestigingspunten toe om de weergave te belemmeren.
5. 3D print het basisstuk (Figuur 4) en steriliseer het basisstuk vóór de implantatie.

Figuur 4: schedel bereid voor implantaat.
Durectomies compleet met schedel schroeven, basis acryl laag, en basisstuk bevestigd aan de schedel.

3. bereiding van de schedel (~ 2 h)

1. Selecteer een rat 400 g of hoger om het gewicht van het implantaat te ondersteunen. Mannelijke Long-Evans ratten, op 6-12 maanden oud werden gebruikt.
2. Anesthetiseer de rat. Plaats het dier in een anesthesie kamer. Schakel 5% isoflurane in.
3. Injecteer een intraperitoneale dosis ketamine (50 mg/kg), xylazine (6 mg/kg) en atropine (0,14 mg/kg).
   1. Monitor anesthesie diepte elke 20 min gedurende de hele procedure door te controleren of er geen terugtrekking uit paw pinch en ademhalingsfrequentie blijft 50-75 ademhalingen/min.
4. Breng oogzalf aan op de rat.
5. Scheer het hoofd van de rat.
6. Plaats het dier in de stereotaxic houder.
7. Bereid de operatieplaats voor door te schrobben met drie alternerende Scrubs elk van Povidon-jodium chirurgische scrub, gevolgd door een steriele zoutoplossing.
8. Injecteer 0,2 CC van 0,5% lidocaïne in de hoofdhuid.
9. Maak een sagittale incisie op de middellijn van de schedel die ten minste 3 mm voorste aan de bregma en 3 mm posterieure aan de Lambda blootstelt.
10. Verwijder het periosteum met wattenstaafjes.
11. Mark inbrengen en craniectomie sites door het scoren van de schedel met een scalpel met behulp van een Cartesisch coördinaat vlak Zeroed bij de bregma met een stereotactische instrument.
12. Boor craniectomie sites, waardoor een dun laagje bot die kan worden verwijderd met een tang. Dura niet blootstellen. Dit maakt het mogelijk om de schedel van bot stof te reinigen zonder Dura te verstoren.
13. Boor en steek bot schroeven, een voor een, om te voorkomen dat bot stof de gaten in te voeren. Gebruik royale isotone irrigatie om botstof te verwijderen. Gebruik voor een implantaat van ongeveer 50 gram 10-12 schroeven. Titanium schroeven maken Osseointegratie⁴⁹mogelijk.
    1. Vooruit de schroeven naar een diepte die volledig doordringt de schedel zonder gevolgen voor de hersenen.
14. Sluit ten minste één botschroef aan op een elektrisch geleidende draad om als circuit grond te functioneren.
15. Na al het boren is voltooid, reinig de schedel van bot stof met een zoute Wash.
16. Droog de schedel met wattenstaafjes of andere absorbenten en breng een eerste laag lijm cementeren cement (tabel van materialen) op de schroeven (gebruik geen glazuur-etsmiddel op knaagdier schedel). Deze voorlopige zelfklevende cementeren cement laag zal de hechting van het implantaat verhogen en de arbeid in latere adhesie stappen verminderen.
17. Verwijder de dunne laag bot die overblijft op elke craniectomie-plaats.
18. Incise Dura met een 30-gauge naald met een gebogen tip terwijl het vermijden van een vasculatuur. De lengte van de incisie komt overeen met de afmetingen van de invoeg shuttle.
    1. Als er een bloeding is, irrigeren handmatig met een milde zout druppelinfuus en ga niet door totdat het bloeden is gestopt.
19. Als er meerdere durectomieën worden uitgevoerd, houd sites vochtig met gel Foam of een andere methode, zoals regelmatige irrigatie om de paar minuten met lichaamstemperatuur zoutoplossing.
20. Droog de schedel opnieuw af met wattenstaafjes of andere absorbenten ter voorbereiding op het cementeren van de cement hechting van het basisstuk aan de schedel.
21. Plaats het steriele basisstuk. Als het basisstuk de bregma dekt, markeert u een andere locatie op een bekende afstand als een proxy.
22. Breng lijm cementeren cement aan rond de omtrek van het basisstuk. Vul het gekleefd basisstuk met zoutoplossing; Identificeer en patch lekkage met zelfklevend cementeren cement op de interface tussen het basisstuk en de schedel interface (Figuur 5).
    Opmerking: het is van cruciaal belang dat het basisstuk volledig aan de schedel wordt bevestigd om lekkage van de kunstmatige durale Sealant silicone gel te voorkomen, omdat dit een adequate hechting van het implantaat aan de schedel voorkomt. Het dier is klaar om arrays te laten ingestoken.

4. seriële inserties van arrays en intrekkingen van shuttles (~ 1 h per array)

Opmerking: deze procedure moet worden bestuurd met een niet-levensvatbaar apparaat, met name voor implantaten met meerdere array, waarbij één apparaat de implantatie van volgende apparaten kan verstoren.

1. Laad de delen 1 en 2 op de zuiger van de micro manipulator met terugtrekking. Stel de micro manipulator van stuk 1 in op een verlengde positie en de micro manipulator van de stuk 3 naar een teruggetrokken positie. De zuiger schuift naar een eind diepte in stuk 1. Stuk 2 past in het bovenste deel van stuk 3, met de gaten uitgelijnd.
   1. Laad stuk 3 op de insteek micromanipulator zuiger en bevestig op zijn plaats met een schroef aan de onderzijde van stuk 3 (Figuur 5a, B).
   2. Laad en schroef stukken 2 en 3 samen, zodat het verplaatsen van de insertie micromanipulator beweegt de hele insertie apparaat (figuur 5c).
   3. Verwijder de schroef die de delen 1 en 2 bij elkaar houdt. Stuk 1 beweegt onafhankelijk van stuk 2, om gescheiden terugtrekking van de plaatsings shuttle van het apparaat mogelijk te maken.
   4. Steek deze schroef in het laterale gat van stuk 1, loodrecht op de zuiger baan, totdat de schroef druk op de zuiger toepast. Dit verzekert dat stuk 1 beweegt volgens de intrek zuiger, zoals te zien is in figuur 5d. Zorg ervoor dat u het laterale gat kiest dat het zicht niet belemmert wanneer het apparaat op het stereotactische instrument is gemonteerd.

Figuur 5: assemblage van inserter.
A) montage van stuk 3 aan micro manipulatoren. B) bevestiging van de delen 1 en 2 op de inbouwapparatuur. C) insteek stukken met gemonteerde elektrodenarray-invoeging shuttle apparaat. D) duim schroef met deel 1 en 2 samen verwijderd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

2. Verwijder alle gelschuim van de craniectomies. Gebruik de echte of proxy bregma voor stereotactische targeting. Houd bij het verplaatsen van het apparaat naar de insertie plaats een hoogte van minimaal een paar centimeter boven de schedel.
   1. Vermijd langdurige perioden van het array-shuttle-apparaat in de buurt van de schedel of de hersenen om de kans te verkleinen dat condensatie de array vóór of tijdens het inbrengen van de pendeldienst zal losmaken. Als dit gebeurt, proberen om de array-shuttle apparaat hoog boven de hersenen en de schedel te verhogen en te wachten tot het te drogen en opnieuw te hechten.
3. Pas de implantaat coördinaten aan om oppervlakte vasculatuur te vermijden. Zoals tijdens craniectomie en durectomie, Vermijd penetrerende schepen direct.
4. Plaats het apparaat verende tred (~ 25 μm/s) en verlaag het met het stereotactische instrument totdat het apparaat de hersenen binnenkomt. Het apparaat zal niet onmiddellijk doordringen in de hersenen. De mate van weerstand en dimpelen zal afhangen van de doellocatie en het ontwerp van het apparaat (bijv. twee versus vier schachten, tiphoek), maar dimpelen meestal niet meer dan 1 mm (Figuur 6).

Figuur 6: het inbrengen van een array-shuttle.
Array-shuttle wordt uitgebreid naar de hersenen om diepte te targeten. Vier-schacht array-shuttle getoond.

5. Eenmaal in de hersenen, lager met micro manipulator, afnemende snelheid op de aanpak van de doeldiepte:
   1. Gebruik de stereotactische arm om te beginnen met het inbrengen bij 25 μm/s.
   2. Gebruik de micromanipulator om bij 10 μm/sec. te plaatsen bij 2 mm tot 1 mm boven de doeldiepte.
   3. Langzame invoeging met micro manipulator tot 5 μm/s bij 1 mm tot 500 μm boven de doeldiepte.
   4. Langzame insertie verder tot 1-2 μm/s tijdens de laatste 500 μm naar het doel.
6. Visualiseer de vleugels van het apparaat (horizontale polyimide-buizen) en het punt van inbrengen tijdens het verlagen om te voorkomen dat de voortijdige shuttle-array loslating.
7. Wanneer de doeldiepte is bereikt (figuur 7A), verankeren de polyimide vleugels bilateraal op de bevestigings plaatsen van het basisstuk via lichtuikbare acryl of een andere lijm zoals cyanoacrylaat (tafel van materialen). Droog, indien nodig, de vleugels of het bevestigingspunt op het basisstuk, omdat condensatie op deze oppervlakken kan worden verzameld en hechting wordt voorkomen. Als zichtbaarheid of andere ruimtebeperkingen vereist zijn, is het verankeren van slechts één polyimide vleugel meestal voldoende.
8. Voorafgaand aan de ontbinding, zal de PEG verschijnen als een bolvormige massa zittend bovenop de array en insertion shuttle interface (figuur 7A). Los PEG door zachtjes druipend lichaam-temperatuur zoutoplossing op de array op het punt waar het wordt vastgehouden aan de shuttle. De lengte van de tijd die nodig is zal afhangen van het molecuulgewicht van de geselecteerde PEG en volledige ontbinding kan worden geverifieerd met directe visualisatie. Wanneer de PEG volledig is opgelost, zullen de grenzen van de arrays volledig kunnen worden onderscheiden van de shuttle en stuk 1 (figuur 7b).

Figuur 7: intrekking van de shuttle.
A) het binden van vleugels vóór terugtrekking. Twee-schacht array en shuttle getoond. (B) Peg-ontbinding en vleugel adhesie met schacht functie (omcirkeld, blauw) die een visuele bevestiging van succesvolle ontkoppeling van array en shuttle mogelijk maakt tijdens terugtrekking. C) een geslaagde array-insertie na het inbrengen van de shuttle is ingetrokken. (D) basisstuk met silicone gel vullingen voor een enkele twee-schacht array inbrengen. De met lage viscositeit gebruikte silicone gel heeft een blauwe tint. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

9. Met behulp van de terugtrekking micromanipulator, Trek langzaam de insertie shuttle. Ga door met zout irrigatie (~ 1 druppel/s) op de array die wordt ingetrokken. Gebruik terugtrek snelheden die gelijk zijn aan de plaatsingssnelheid op relevante afstanden vanaf de doeldiepte:
   1. Trek het gebruik van de micromanipulator op 1-2 μm/s van de doeldiepte naar-500 μm.
   2. Versnel de terugtrekking met behulp van de micro manipulator bij 5 μm/s wanneer-500 μm tot-1 mm.
   3. Versnel de terugtrekking met behulp van de micro manipulator bij 10 μm/s wanneer-1 mm tot-2 mm.
   4. Trek het gebruik van de stereotactische arm op 25 μm/s van-2 mm vanaf het doel en naar boven.
10. Visualiseer de interface tussen de array en de insertie shuttle tijdens terugtrekking. De polymeer array wordt zichtbaar gescheiden van de shuttle en lijkt doorschijnend als de shuttle wordt teruggetrokken bij de halfronde kruising tussen schachten van de plaatsings shuttle (figuur 7b).
11. Verwijder de array-connector uit stuk 2 en verplaats naar een locatie die niet zal interfereren met daaropvolgende inserties. De polymeer elektrode-array is nu in de hersenen en niet meer verbonden met het stereotactische instrument (figuur 7C). Verwijder de insertie shuttle en andere insertie hardware.
12. Voor meervoudige inserties herhaalt u de stappen 4.1-4.9; Ga niet verder naar de volgende sectie totdat alle gewenste arrays zijn ingevoegd. Het is slecht geadviseerd om twee apparaten in te voegen binnen 250 μm van elkaar, omdat de lichte buigen van het apparaat lint tussen de hersenen en vleugels in de trekontlasting regio ten minste zo ver kan reiken.

5. implantaat constructie (~ 2 h)

1. Na de laatste array inbrengen, lege zoutoplossing uit het basisstuk met behulp van een pipet of wattenstaafje, voorzichtig zijn om de geïmplanteerde arrays of linten niet te verstoren.
2. Vul de craniectomies en het basisstuk met een laag Viscositeits siliconen elastomeer of andere kunstmatige durale Sealant. Laat het genezen (figuur 7d). Met meerdere inserties, plaats de hardware-connectors waar ze niet interfereren (figuur 8a). Oriënteer de array-connectors en construeer het implantaat, zodat de linten in hun uiteindelijke gewenste positie staan.
3. Bedek de arrays, array linten en connectors in siliconen elastomeer met een gemiddelde viscositeit. Speciale aandacht besteden aan de polymeer-connector-interface, omdat deze Soft-hard material interface gevoelig is voor beschadiging. Bedek de array linten volledig zodanig dat wanneer de middel-viscositeit siliconen geneest, ze geïmmobiliseerd.
4. Sluit de met elastomeer beklede apparaten in de ontworpen behuizing.
5. Versterking van de implantaat basis met tandheelkundige acryl. Laat acryl niet in direct contact komen met de array linten omdat de uitbreiding van het acryl terwijl het geneest de geleidende sporen kan beschadigen.
6. Breng Bupivicaïne en bacitracine zalf rond de incisie.
7. Sluit de incisie met 4-0 nylon hechtingen en huid lijm.

6. herstel en implantatie zorg

1. Verwijder het dier uit het stereotactische instrument en plaats het op zijn zijkant op een verwarmingskussen.
2. Geef een subcutane injectie van een warme Ringer's oplossing (5 – 10 mL) om het dier te hydrateren.
3. Zodra het dier is motoriek (10 – 60 min), transfer naar een kooi met de helft van de kooi onder een verwarmingsblok bij 37 °C gedurende 2-3 dagen.
4. Geef onder een verwarmingskussen toegang tot onthard voedsel en water.
5. Injecteer het dier met 2 mg/kg Meloxicam elke 24 h (subcutane of orale toediening) gedurende 1 week indien nodig voor pijn controle.
6. Laat de rat 1-2 weken om te genezen en aan te passen aan het implantaat gewicht (figuur 8b).
7. Voer regelmatig chloorhexidine wassen van het weefsel rond het implantaat en dagelijkse inspectie voor irritatie, infectie, of dehiscentie.

Afbeelding 8: meerdere ingevoegde arrays en rat na herstel van implantatie. A) hardwareconnectoren op locaties om de daaropvolgende inserties niet te verstoren. (B) een 1.024-kanaals, chronisch polymeer array-implantaat. Gereproduceerd met toestemming van neuron [aanvullend cijfer 1H]¹. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Representative Results

Naar aanleiding van dit protocol leverde een 1.024-kanaals neurale implantaat opname 375 enkelvoudige eenheden¹ (gesorteerd met mountainsort⁵⁰, ruis overlap < 0,03, isolatie > 0,96, 512 kanalen die worden gebruikt voor het opnemen van één eenheid, figuur 9a). Dit protocol kan worden gebruikt voor het implanteren van verschillende aantallen apparaten, met verschillende kanaal tellingen en specificaties, tot verschillende combinaties van opname doelen. Met hetzelfde protocol is de levensduur van één eenheid voor het opnemen aangetoond voor ten minste 160 dagen¹ in gegevens van 19 apparaten (18 32-kanaals apparaten in prefrontale cortices, 1 64-kanaal apparaat in orbitofrontale cortex) over drie verschillende ratten ( Figuur 9B). Een van de drie dieren had een digitale elektrische storing resulterend in een onvermogen om op te nemen van vier apparaten. Van de overige 15/19-apparaten was er een opname gemiddelde van ~ 1 één eenheid per kanaal. Individuele apparaten hadden een opbrengst van slechts enkele eenheden tot ~ 2 eenheden per kanaal. Het is typisch om te zien zeer verschillende rendementen op apparaten geïmplanteerd in hetzelfde dier in dezelfde regio.

Bovendien, een ander chirurgisch team volgens het protocol hier beschreven geïmplanteerde zes extra dieren elk met een combinatie van 4-6 32-kanaals apparaten gericht op orbitofrontale cortex en Nucleus accumbens, en een Tetrode Hyperdrive (totale implantaat gewicht ongeveer 50 g). Eén dier had een implantaat los binnen een maand van de operatie. Een tweede dier stierf tijdens de postoperatieve herstelperiode, waarschijnlijk niet gerelateerd aan de hier beschreven protocol stappen. De resterende vier dieren bleven gezond met stabiele implantaten die voor de duur van het experiment, die duurde 4-11 maanden. Tellingen van één eenheid waren vergelijkbaar met die eerder gerapporteerd voor 32-kanaals apparaten.

Figuur 9: rendement op één eenheid en levensduur van de opname.
(A) aantal putatieve clusters met één eenheid van 512 kanalen (van het 1.024-kanaals implantaat), gestratificeerd naar kwalitatieve metrische drempels. Geautomatiseerde curatie met behulp van MountainSort (ruis overlap 0,03, isolatie 0,96, zwarte doos in de rechterbovenhoek) resulteerde in de identificatie van 375 enkele eenheden uit de 512 kanalen. Gereproduceerd met toestemming van neuron [figuur 2A]¹. B) opbrengsten uit één eenheid voor polymeer matrices per kanaal (linker y-as) of per 16-kanaals schacht (rechter y-as) gedurende 160 dagen na implantatie (x-as) bij ratten. Ononderbroken lijn is de gemiddelde celopbrengst over 8 schachten, gestippelde lijnen ± 1 SE. individuele tijdspunten per schacht worden weergegeven als stippen met kleurcodering op regio. Gereproduceerd met toestemming van neuron [figuur 3A]¹. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Discussion

Dit is een methode voor de implantatie van meerdere polymeer elektrode arrays naar gedistribueerde hersengebieden voor het opnemen van enkelvoudige eenheden gedurende maanden. Deze methode vertegenwoordigt een 8x toename in opnamekanalen en 4x toename in aantal inserties van het dichtstbijzijnde grootschalige polymeer-array gebaseerd systeem^2,3. Dat systeem gebruikte een polymeer mesh injectie-gebaseerd systeem in de muis, maar heeft geen melding van een absoluut aantal putatieve enkelvoudige eenheden en dus een vergelijking van één neuron opbrengst is niet mogelijk.

De methode voor het inbrengen van een flexibel apparaat is gebaseerd op een eerder Protocol van Felix et al.³⁹, met belangrijke wijzigingen: een drie-delige insteek apparaat voor onafhankelijke beweging van de siliconen shuttle tijdens terugtrekking, en tethering van de array op de doeldiepte voorafgaand aan de terugtrekking van de shuttle, die samen de noodzaak voor de snelle terugtrekking beschreven in het oorspronkelijke protocol te elimineren. Deze veranderingen minimaliseren weefselbeschadiging en behouden de stabiliteit van de array tijdens het intrekken van de shuttle. Andere flexibele implantatie strategieën, zoals het tijdelijk verstijving van apparaten met bio-oplosbare materialen, zijn compatibel met de volgende stappen in dit protocol. Het beveiligen van de apparaten binnen het implantaat vereist het integreren van eerder gevalideerde strategieën voor het bedekken van de hersenen en het beschermen van de delicate apparaat linten.

Vanwege hun kwetsbaarheid zijn zorg en aandacht vereist om direct contact te vermijden of anderszins kracht te geven aan de polymeer elektrode arrays en de silicium-insertie shuttles. Met name bij het werken met meerdere apparaten, moet het inbrengen onder een microscoop worden geobserveerd om interferentie van het ene apparaat met de andere te voorkomen. In het algemeen is het mogelijk om een elektrode-array zachtjes met plastic getipt Tang te hanteren, waardoor de sporen worden vermeden. Een dergelijke strategie is geschikt, bijvoorbeeld als de polymeer elektrode-array begint af te trekken met de invoeg shuttle. Dit kan gebeuren als de PEG niet volledig is opgelost, of als gevolg van de oppervlaktespanning van zoutoplossing of CSF tussen het polymeer en silicium.

Een van de meest voorkomende herstelbare fouten is array loslating van de insertie shuttle. Dit kan gebeuren bij het inbrengen, als de hersenen kuiltjes en druk op het apparaat Tip toeneemt, als de array en shuttle zijn onvolkomen uitgelijnd of als condensatie gedeeltelijk de PEG is opgelost. Om een array opnieuw te hechten, Verhoog het zo hoog mogelijk boven het hersen oppervlak en wacht tot het droog is (ongeveer 5 min).

Een kritisch aspect van het plannen van een multi-array implantatie operatie is het ontwerp van het basisstuk om alle implantaat doelen tegemoet te komen en zonder gaten te zitten tegen de contour van de schedel. Het basisstuk is een klein plastic stuk dat is bevestigd aan de schedel na het schoonmaken van de schedel, schroef plaatsing en gedeeltelijke craniectomies, voorafgaand aan het inbrengen van de arrays. Het heeft drie functies: 1) om een zoutoplossing te houden voor het oplossen van de PEG na het inbrengen van de array, maar vóór silicium shuttle terugtrekking, 2) om een locatie boven het schedel oppervlak te bieden waaraan de arrays kunnen worden bevestigd door polyimide vleugels, waardoor trekontlasting mogelijk is langs het lint boven het invoegpunt in de hersenen en 3) om kunstmatige durale Sealant te houden, die de arrays en de hersenen stabiliseert en beschermt. Het basisstuk kan met de hand worden gevormd of met 3D geprint. Er werd opgemerkt dat het aftappen en drogen van het basisstuk van de zoutoplossing zeer belangrijk is voorafgaand aan het inbrengen van het apparaat. Deze stappen voorkomen condensatie en scheiding van de array en insertie shuttle. Drogen van het basisstuk is ook essentieel voor het vullen van het basisstuk met kunstmatige durale Sealant. Het is ook belangrijk dat het basisstuk niet lekt, als een film van silicone gel is moeilijk te verwijderen uit de schedel en voorkomt hechting van tandheelkundige acryl voor betrouwbare chronische bevestiging van het implantaat aan de schedel. Er wordt verwacht dat een biologisch compatibel siliconen elastomeer met lage viscositeit kan worden gebruikt om de craniectomies en het basisstuk te vullen, met een hogere viscositeit silicone elastomeer eromheen en de blootgestelde polymeer array linten.

Vooruitgang in polymeer nano fabricage zal vertalen naar polymeer-gebaseerde elektrode arrays, verminderen van de grootte van de functie en het verhogen van de mogelijke aantal elektroden in een array dichter bij die van silicium-apparaten^{15,16,17 ,18,19}. Evenzo zullen de transversale gebieden van polymeer apparaten krimpen naast de functie groottes, waardoor nog betere biocompatibiliteit⁸. Nogmaals, zoals wordt bereikt met Silicon-apparaten, zal integratie met het versterken, digitaliseren en multiplexing chips¹⁷ verder grootschalige neurale opname mogelijk maken.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D Printed Stereotax Adapter Parts (3) and Base Piece (1)	N/A	N/A	3d print parts, suggest <30 μm resolution for minimal hand finishing of parts. Files available at:
https://github.com/jasonechung/PolymerProbe3dParts
Dental Acrylic (Hygenic Repair Resin, Coltene type II quick set)	Colten/Whaledent	8886784, 8881627	Dental acrylic for use during implant construction
Hydraulic Micromanipulator (x2)	Narishige Group	MO-10	1-axis micromanipulator
Kapton Polyimide Tape	Bertech	PPTDE-1/2	Double-sided tape
Kopf Stereotax Arm	Kopf Instruments	103088R, 103088L	Standard rodent stereotax
Light Curable Dental Acrylic, Vivid Flow	Coltene/Whaledent	D33-01-00	Light curable dental acrylic for use during implant construction
Loctite Gel Control	Henkel Corp.	234790 1364076 1735574 1752699	Cyanoacrylate for adhering silicon shuttle to corresponding 3d printed part
Metabond Quick Cement	Parkell	S380	For direct application to skull to create strong connection between skull and implant
Polymer Electrode Arrays and Silicon Insertion Shuttles	Lawrence-Livermore National Laboratory	N/A	Fabricated at Lawrence-Livermore National Laboratory, polyimide electrode arrays, silicon insertion shuttle
Silicone Gel Kit, Low Viscosity	Dow Corning	03/80	Low-viscosity silicone gel for filling of 3d printed base piece
Silicone, Medium-Viscosity Kit	World Precision Instruments	Kwik-Sil	Medium-viscosity silicone gel for protection of polymer electrode arrays