Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

تحديد الطفرات من خلال ذوبان عالية الدقة في عدد السكان من الأرز الحرث

Published: September 2, 2019 doi: 10.3791/59960
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 3, 1, 4
1National Key Laboratory of Rice Biology, Zhejiang Provincial Key Laboratory of Crop Genetic Resources, Institute of Crop Science, Zhejiang University, 2Jiaxing Academy of Agricultural Sciences, 3Institute of Nuclear Agricultural Sciences, Zhejiang University, 4The New Countryside Development Institute at Zhejiang University

Summary

في هذه المقالة، نقدم البروتوكول الذي يوصف بأنه تحليل ذوبان عالية الدقة (HRM) القائم على الهدف الآفات المحلية المستحثة في الجينوم (TILLING). تستخدم هذه الطريقة تغيرات الفلورة أثناء ذوبان الحمض النووي المزدوج وهي مناسبة لفحص الإنتاجية العالية لكل من الإدراج/الحذف (Indel) وsubstition قاعدة واحدة (SBS).

Abstract

الآفات المحلية المستحثة الهدف في الجينوم (TILLING) هي استراتيجية لعلم الوراثة العكسي لفحص الإنتاجية العالية للطفرات المستحثة. ومع ذلك، فإن نظام TILLING لديه أقل قابلية للتطبيق للإدراج / الحذف (Indel) الكشف والتقليدية TILLING يحتاج خطوات أكثر تعقيدا، مثل CEL I nuclease الهضم والكهربائي هلام. ولتحسين كفاءة الإنتاجية والاختيار، ولجعل فحص كل من الركائز الأساسية والأساسية الفردية ممكناً، يتم تطوير نظام جديد للذوبان عالي الاستبانة قائم على نظام الحرث. هنا، نقدم بروتوكول مفصل لـ HRM-TILLING ونظهر تطبيقه في فحص الطفرات. يمكن لهذه الطريقة تحليل طفرات أمبليكونPC PCR عن طريق قياس إزالة الحمض النووي المزدوج الذين تقطعت بهم السبل في درجات حرارة عالية. يتم إجراء تحليل إدارة الموارد البشرية مباشرة بعد PCR دون معالجة إضافية. وعلاوة على ذلك، يتم دمج طريقة بسيطة وآمنة وسريعة (SSF) استخراج الحمض النووي مع HRM-TILLING لتحديد كل من Indels وSBSs. إن بساطتها وقوتها والإنتاجية العالية تجعلها مفيدة للمسح الضوئي للطفرات في الأرز والمحاصيل الأخرى.

Introduction

المسوخ هي الموارد الوراثية الهامة لبحوث علم الجينوم وظيفية النباتية وتربية أصناف جديدة. وكان نهج علم الوراثة المتقدم (أي من اختيار المتحولين إلى استنساخ الجينات أو تطوير الأصناف) هو الأسلوب الرئيسي والوحيد لاستخدام الطفرات المستحثة قبل حوالي 20 عاماً. وقد فتح تطوير طريقة جديدة لعلم الوراثة العكسية، TILLING (استهداف الآفات المحلية المستحثة في الجينومات) من قبل McCallum وآخرون1 نموذجا جديدا، ومنذ ذلك الحين تم تطبيقه في عدد كبير من الأنواع الحيوانية والنباتية2. الحرث مفيد بشكل خاص لسمات تربية التي هي صعبة من الناحية الفنية أو مكلفة لتحديد (على سبيل المثال، مقاومة الأمراض، والمحتوى المعدني).

تم تطوير الحرث في البداية لفحص الطفرات نقطة الناجمة عن الطفراتالكيميائية (على سبيل المثال، EMS 1،3). وهي تشمل الخطوات التالية: إنشاء مجموعة (مجموعات) من السكان؛ وإنشاء مجموعة من السكان؛ وإنشاء مجموعة من السكان؛ وإنشاء مجموعة من السكان؛ وإنشاء مجموعة من السكان؛ وإنشاء مجموعة من السكان؛ وإنشاء مجموعة من السكان؛ وإنشاء مجموعة من السكان؛ وإنشاء إعداد الحمض النووي وتجميع النباتات الفردية؛ تضخيم PCR لجزء الحمض النووي المستهدف؛ تشكيل heteroduplexes عن طريق denaturation والصلب من amplicons PCR والانقسام من قبل CEL I nuclease. وتحديد الأفراد المتحولين والآفات الجزيئية المحددة3،4. ومع ذلك، لا يزال هذا الأسلوب معقدة نسبياً، وتستغرق وقتاً طويلاً، وانخفاض الإنتاجية. لجعله أكثر كفاءة ومع زيادة الإنتاجية، تم تطوير العديد من طرق الحرث المعدلة،مثل حذف الحرث (De-TILLING) (الجدول 1)1،3،5،6، 7،8،9،10،11،12.

تحليل منحنى إدارة الموارد البشرية، الذي يقوم على التغيرات الفلورية أثناء ذوبان الحمض النووي المزدوج، هو طريقة بسيطة وفعالة من حيث التكلفة، وعالية الإنتاجية لفحص الطفرات والنمط الجيني13. وقد استخدمت إدارة الموارد البشرية بالفعل على نطاق واسع في البحوث النباتية بما في ذلك HRM القائم على الحرث (HRM-TILLING) لفحص الطفرات SBS الناجمة عن الطفرات EMS14. هنا، قدمنا بروتوكولات مفصلة لـ HRM-TILLING لفحص الطفرات (كل من Indel وSBS) التي تسببها أشعة غاما (γ) في الأرز.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1 - الأعمال التحضيرية

  1. تطوير السكان المتحولين بأشعة غاما
    1. علاج حوالي 20،000 بذور الأرز المجفف (مع محتوى الرطوبة من حوالي 14٪) من خط الأرز جابونيكا (على سبيل المثال، DS552) مع 137Cs أشعة غاما في 100 غراي (1 غراي / دقيقة) في منشأة التشعيع γ (على سبيل المثال، خلية غاما).
      ملاحظة:البذور المستخدمة للعلاج يجب أن يكون لها قدرة عالية على البقاء (على سبيل المثال، مع معدل الإنبات > 85٪). ويمكن زيادة جرعة التشعيع لأرز إنديكا إلى 150 غراي.
    2. زرع البذور المشعة بعد الإنبات على سرير الشتلات وزرع الشتلات بشكل فردي إلى حقل الأرز وتنمو في السكان M 1.
      ملاحظة:البذر المباشر للنباتات M1 متفرقيمكن أيضا أن تطبق لتوفير تكلفة العمالة. منع تجاوز النباتات M1 مع أصناف الأرز الأخرى باستخدام وسائل العزل المادي أو البيولوجي.
    3. البذور M2 الحصاد بالجملة من النباتات M1، مع 1-2 البذور من كل M1 الذعر، لتشكيل السكان M2.
      ملاحظة: في الممارسة العملية والبساطة، وحصاد جميع بذور النباتات M1 وبعد خلط كامل، يتم أخذ عينات جزء لتشكيل السكان M2.
    4. نقع حوالي 5000 M2 البذور في الماء لمدة 24 (الأرز إنديكا) -36 (الأرز جابونيكا) ح في درجة حرارة الغرفة. ثم ترك البذور لتنبت في 37 درجة مئوية لمدة 2 أيام على ورقة فلتر رطبة في أطباق بيتري.
      ملاحظة:يمكن أن تنبت المزيد من البذور M2 للتحليل لزيادة احتمال تحديد المتحولين.
    5. ضع البذور المنبتة على ألواح البذر مع الثقوب الصغيرة وزراعتها مائيًا لمدة 3-4 أسابيع في حل ثقافي تم تعديله من يوشيدا وآخرون15 في منزل زجاجي مع فترة تصوير ية 12 ساعة [النهار (30±2) درجة مئوية وليلية (24±2) درجة مئوية].
  2. أخذ العينات من الأنسجة ورقة: قطع قرص واحد (Φ ~ 2 ملم) من ورقة الموسعة بالكامل من كل البذر في نفس الموقف باستخدام ثقب اللكم.
  3. إعداد حلول استخراج الحمض النووي
    1. المخزن المؤقت A: إضافة 2 مل من 5 M هيدروكسيد الصوديوم و 10 مل من 20٪ توين 20 لجعل المجلد النهائي من 50 مل. إعداد جديد العازلة A قبل استخراج الحمض النووي.
    2. المخزن المؤقت B: إضافة 20 مل من 1 M Tris-HCl (درجة الحموضة 8.0) و 80 ميكرولتر من 0.5 M EDTA لجعل حجم نهائي من 100 مل.
  4. التمهيديات PCR
    1. التمهيديات لتحليل إدارة الموارد البشرية: تصميم التمهيديات لتضخيم التسلسل المستهدف باستخدام البرمجيات (على سبيل المثال، التمهيدي Premier5) وتوليفها من قبل شركة تجارية.
      ملاحظة:لأن إدارة الموارد البشرية أقل قابلية للتطبيق على تحليل الشظايا الطويلة، وبالتالي، يجب أن تكون التضخيمات أقل من 400 نقطة أساس. أو منخفضة جدا (<25٪) كما أن محتوى GC ليس جيدًا لتحليل إدارة الموارد البشرية.
    2. التمهيديات لمراقبة الجودة: استخدام 24 علامات SSR موزعة على 12 كروموسومات الأرز من بنغ وآخرون16.

2. استخراج الحمض النووي

  1. ضع 4 أقراص ورقة في كل بئر من لوحة PCR 96-well، إضافة العازلة حل (50 مل / جيدا). تجميد لوحة في -80 درجة مئوية الفريزر لمدة 10 دقيقة.
  2. قم بإزالة التجمد في درجة حرارة الغرفة، ثم قم بالحضانة عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  3. إضافة 50 درجة مئوية من العازلة B إلى كل بئر وتخلط جيدا عن طريق الدوامة.
  4. الطرد المركزي لوحة لمدة دقيقة واحدة في 1500 × ز. الـ(سوبرناتانت) جاهز لـ(بي سي آر)

3. تضخيم PCR

  1. تحسين PCR
    1. إضافة الكواشف التالية إلى كل PCR جيدا: 1 ميكرولتر من الحمض النووي (supernatant في الخطوة 2.4)، 5 ميكرولتر من2X ماستر ميكس (تحتوي على 2X PCR العازلة، 4 مليمول / L ملغ كل 2، 0.4 مليمول / L 2'deoxyribonucleoside ثلاثي الفوسفات (dNTPs)، و 50 U / mL طاقة الحمض النووي بولميراز، 0.2 L كل من 10 μmol / L التمهيديات، وجعل حجم النهائي تصل إلى 10 درجة مئوية باستخدام المياه الخالية من nuclease.
    2. استخدم كتلة حرارية قادرة على التدرج لتحديد درجة حرارة الصلب المثلى لكل جزء مستهدف باستخدام برنامج PCR التالي: 5 دقائق عند 94 درجة مئوية، تليها 40 دورة من 30 درجة مئوية عند 94 درجة مئوية، و30 درجة مئوية عند 52-62 درجة مئوية (درجة حرارة التدرج)، و30 درجة مئوية عند 72 درجة مئوية ، مع تمديد نهائي عند 72 درجة مئوية لمدة 8 دقائق وعقد عند 16 درجة مئوية.
    3. فحص amplicons على 1٪ هلام أغاروز لتحديد درجة حرارة الصلب الأمثل.
      ملاحظة:يجب أن تتيح درجة حرارة الصلب المثلى تضخيم ًا محددًا للجزء المستهدف، دون تضخيم غير محدد وتعتيم التمهيدي.
  2. PCR لتحليل إدارة الموارد البشرية
    ملاحظة:يتم استخدام لوحات متوافقة مع إدارة الموارد البشرية والحمض النووي للشتلات M2 المستخرجة كما هو موضح في الخطوة 2.4 لPCR.
    1. إجراء PCRs في حجم نهائي من 10 ميكرولتر، مع 1 ميكرولتر من الحمض النووي (supernatant)، 5 ميكرولتر من 2X ماجستير ميكس، 0.2 ميكرولتر كل من 10 ميكرومول / لتر التمهيديات، و 1 ميكرولتر من صبغة الفلورة 10x. في كل لوحة تشمل عينة واحدة من النوع البري (WT) الأصل وعنصر تحكم سلبي واحد (بدون الحمض النووي).
    2. إضافة قطرة من الزيوت المعدنية إلى كل بئر لمنع التبخر.
    3. ختم لوحة مع فيلم لاصق والطرد المركزي في 1000 × ز لمدة 1 دقيقة.
    4. تشغيل PCR باستخدام درجة حرارة الصلب الأمثل.
      ملاحظة:في حالات قليلة، قد تؤثر صبغة الفلورة على تضخيم PCR، وبالتالي يتم إضافة الصبغة بعد الانتهاء من PCR. في مثل هذه الحالات، يتم دمج الصبغة في خيوط الحمض النووي عن طريق إزالة النُشال والصلب بعد PCR.

4. المسح الضوئي لإدارة الموارد البشرية وتأكيد الطفرات

  1. إزالة الفيلم لاصقة من لوحة وإدراج لوحة في آلة إدارة الموارد البشرية.
  2. حدد تشغيل جديد من قائمة الملفات أو اضغط على الزر تشغيل في أعلى الشاشة.
  3. حدد درجات حرارة البداية والنهاية للذوبان من 55 درجة مئوية إلى 95 درجة مئوية.
    ملاحظة:بعد التشغيل الأول، يمكن تحديد نطاق درجة حرارة الذوبان لجزء معين; وبالتالي، يمكن تعديل درجة حرارة ذوبان لتحليل لاحق من نفس الجزء لتوفير الوقت.
  4. حدد عينات لتحليل ذوبان عالية الدقة، واستبعاد عينات مماثلة للتحكم السلبي.
  5. تطبيع منحنيات ذوبان أن يكون لها نفس بداية وإنهاء الفلورة. تأكد بصرياً من أن مؤشرات درجة الحرارة أقل دقيقة وأدنى ماكس في منطقة من المنحنيات.
  6. حافظ على مستوى الفلورة (فرق الفلورة) عند الإعداد الافتراضي 0.05.
  7. حدد متغير عام مقابل متغير من قائمة تحديد المعايير واختر الحساسية العادية.
  8. استخدام WT كعنصر تحكم؛ عينات مع قيمة -F من ≥ 0.05 من WT تعتبر لاحتواء مصنع متحولة.
  9. تحديد وتأكيد النباتات المتحولة.
    1. تحديد النباتات الأربعة، والتي تم إجراء كل تجمع متحولة.
    2. استخراج الحمض النووي من كل من هذه النباتات باستخدام طريقة CTAB وفقا لألين وآخرون17 مع بعض التعديلات.
      ملاحظة:لا يتم استخدام DNase خالية من RNase وNaAc عند استخراج الحمض النووي باستخدام طريقة CTAB وصفها ألين وآخرون17، كما نوعية الحمض النووي جيدة بما فيه الكفاية لمزيد من تضخيم PCR. ضبط الحمض النووي إلى تركيز نهائي من ~ 25 نانوغرام / ميكرولتر بعد القياس الكمي باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
    3. قم بتضخيم الجزء المستهدف باستخدام التمهيديات PCR والبرنامج نفسه لتحليل إدارة الموارد البشرية.
    4. تحديد آفات جزيئية محددة عن طريق تسلسل Sanger من amplicons.
      ملاحظة:بمجرد الانتهاء من تضخيم PCR، إرسال amplicons إلى شركة لتسلسل Sanger. يمكن تحديد الآفة الجزيئية عن طريق مقارنة التسلسل بين النبات M2 وWT.

5. مراقبة الجودة من المسوخ المختارة مع علامات الجزيئية

  1. إجراء PCR لعلامات SSR 24 في حجم نهائي من 10 μL مع 25 نانوغرام من الحمض النووي الجينومي (المستخرجة باستخدام بروتوكول CTAB)، 5 ميكرولتر من مزيج رئيسي 2X، 0.2 ميكرولتر من كل من 10 μM SSR التمهيدية.
  2. تشغيل PCR باستخدام البرنامج التالي: 5 دقائق في 94 درجة مئوية، تليها 30 دورات من 30 s في 94 درجة مئوية، 30 s في 55 درجة مئوية و 30 s في 72 درجة مئوية، مع تمديد النهائي في 72 درجة مئوية لمدة 7 دقائق.
  3. فصل amplicons على 8٪ هلام بوليأكريلاميد وتكشف عن تعدد الأشكال من شظايا تضخيم الفضة تلطيخ18.
  4. مقارنة أنماط haplotypes SSR من المتغيرات المحددة وWT.
    ملاحظة:غالباً ما يكون لدى المسوخ المستحثة أنماط هابلوبي ات وقاية من الـ WT، إذا كانت أكثر من علامة SSR واحدة مختلفة بين البديل والوزن الأوّل، فإن المتغير مرتفع من المرجح أن يكون ملوثًا وراثيًا (على سبيل المثال، خليط أو نبات متخطّى) بدلاً من الأيض المستحث متحولة18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

المسح الضوئي وتحليل إدارة الموارد البشرية

وإجمالاً، تم إنتاج 140 1 عينة من الحمض النووي المجمع من 560 4 شتلة من الشتلات M2 وأُخضعت لتضخيم PCR. تم تضخيم جزأين بحجم 195 نقطة أساس و259 نقطة أساس لـ OsLCT1 وSPDT على التوالي (الجدول 2). وكان لمعظم العينات منحنيات ذوبان لا تختلف اختلافا كبيرا عن WT (ΔF < 0.05). تم تجميع منحنيات إدارة الموارد البشرية المختلفة بشكل ملحوظ عن الـ WT (ΔF > 0.05) بلون مختلف عن الوزن العالمي حسب البرنامج (الشكل1).

تأكيد الطفرة والتردد

واستُخدمت عينة من الحمض النووي من شتلة فردية للتضخيم، وتم تسلسل الشظية ذات الصلة. ويمكن تأكيد نوع الطفرة والموقف على الجينات من خلالالتسلسل اللوني (الشكل 2). تم تحديد ثلاث طفرات بما في ذلك اثنين من الإندلو وSBS واحد من 4560 M2 الشتلات (الجدول2). وقد وجد أن جميع الأجزاء المتحولة الثلاثة كانتمتغايرة في موقع الطفرة (الشكل 2).

حدث تردد الطفرة هنا المشار إليه باسم تواتر الطفرة في الجينوم في مجموعة من سكان TILLING. استناداً إلى الصيغة أدناه، تم العثور على أن تردد الطفرة بلغ حوالي 1/690 كيلو بايت.

Equation 1

Figure 1
الشكل 1: HRM-TILLING من M2 الشتلات للطفرات في OsLCT1 (A, B) أو SPDT (C) الجينات. تم اختيار النوع البري كمرجع لتطوير منحنيات الفرق الفلورية. وأظهرت المسوخ منحنيات إدارة الموارد البشرية مختلفة بشكل ملحوظ مع ΔFs > 0.05 في درجات حرارة 90.0-92.0 درجة مئوية و 81.5-83.5 درجة مئوية، على التوالي. تم تعديل هذا الرقم من لي وآخرون19. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تسلسل الأجزاء المستهدفة من المسوخ. يشير المربع المستطيل إلى موقع heterozygous مع طفرة من G → A في4304 نقطة أساس من OsLCT1 (A); واحدة [نوكليوتيد] واحدة [ا] إدراج في ال 4240 [بب] من [أسلست1] أشرت سهم ([ب]); و [تتك] [ترينوكليوتيد] أشرت حذف في الموقعة من 5948-5950[بب] من [سبد] بخطّ سوداء ([ C). تم تعديل هذا الرقم من لي وآخرون19. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

اختصار الاسم الكامل المزايا أو الانطباق عيوب مرجع
الحرث التقليدي استهداف الآفات المحلية المستحثة في الجينوم لفحص الطفرات نقطة استهلاك الوقت والتكلفة McCallum et al., 2000; Till et al., 2003
الحرث البيئي الحرث البيئي لفحص الطفرات في السكان الطبيعيين حساسية مكلفة ومنخفضة Comai et al., 2004
إزالة الحرث الحذف الحرث لفحص حذف كبير يعتمد بشدة على نظام PCR جيد روجرز وآخرون، 2009
إيتيلينغ الحرث الفردي تحديد الطفرات باستخدام مجموعات سكانية شخصية من نوع TIILLING السكان غير الدائمين بوش وكريسان، 2010
دهلكل-تيلينغ إزالة الصبغة اللونية السائلة عالية الأداء القائمة على الحرث توفير الوقت الإنتاجية المنخفضة كولاسونو وآخرون، 2016
سيق-تيلينغ الحرث حسب التسلسل الإنتاجية العالية، نظام غير الأنزيمية مكلفة نسبيا وأعلى إيجابية كاذبة Tsai et al., 2011; كومار وآخرون, 2017
الموارد البشرية- الحرث عالية الدقة ذوبان الحرث الإنتاجية العالية وتوفير الوقت؛ نظام غير الأنزيمية حد طول جزء PCR Dong et al., 2009; غادي وآخرون، 2009

الجدول 1: مزايا وعيوب مختلف نُهُج الحرث.

اسم الجينات جين لوكي جين وظيفة تسلسل التمهيدي (5 '-3') Tm بعد التحسين (درجة مئوية) حجم المنتج (bp) عدد الطفرات (نوع الطفرة)
OsLCT1 LOC_Os06g38120 انخفاض الناقل الكادميوم LCT-F: CTCGGTGTAAGCATC LCT-R: AGAGTCAGGAACGCGGCTAC 61 195 2 (G-A الانتقال، 1-bp الإدراج)
SPDT LOC_Os06g05160 ناقل توزيع الفوسفور الشبيه بـ SULTR SPDT-F: TTCTCGGAGGAGGCTAAT SPDT-R: CCACGCATTCTGGTTACAT 52 259 1 (حذف 3-bp)

الجدول 2: معلومات عن جينتين مستهدفتين، وتضخيم PCR، والطفرات المحددة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وقد ثبت أن الحرث أداة وراثية عكسية قوية لتحديد الطفرات المستحثة للتحليل الوظيفي للجينات وتربية المحاصيل. بالنسبة لبعض الصفات التي لا يمكن ملاحظتها أو تحديدها بسهولة، يمكن أن يكون الحرث مع الكشف عن الطفرات المستندة إلى PCR عالية الإنتاجية طريقة مفيدة للحصول على المتحولين للجينات المختلفة. وقد استخدمت طريقة HRM-TILLING في مجموعات EMS-mutagenized من الطماطم12والقمح11 والكرمة20 لفحص الطفرة. في هذه الورقة، تم عرض أبسط وأقوى HRM-TILLING، ينطبق على كل من Indel وSBS فحص الطفرة.

ولتحسين الكفاءة، تم استخراج التقييمات الوطنية المعينة باستخدام طريقة SSF بدلاً من طريقة CTAB العادية، التي تستهلك الوقت والعمالة وتتطلب عوامل كيميائية سامة. وقارن Si et al.21 نوعية الحمض النووي المستخرج باستخدام طريقة SSF وCTAB. على الرغم من أنه تم العثور على أن الحمض النووي من استخراج SSF كان نقاء أقل من ذلك من استخراج CTAB، فإنه يمكن أن تلبي متطلبات PCR وتحليل إدارة الموارد البشرية في الأرز. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن الحمض النووي من استخراج SSF لا يمكن تخزينها لفترة طويلة، وبالتالي فإنه ليس مناسبا لإنشاء مكتبة متحولة دائمة.

في دراسة سابقة، يمكن تمييز العينات المجمعة مع الحمض النووي المتحول ة من النوع البري عن طريق تحليل إدارة الموارد البشرية في كل من EMS وغاما السكان المتحولين14،19. وبالنظر إلى النباتات M2 يمكن أن تكون heterozygous للطفرات المستحثة، وأوصى بتجميع أربعة محطات M2 للكشف عن الطفرات من قبل HRM-TILLING.

للحصول على المزيد من المتحولين، من المهم أيضا تطوير السكان المتحولين مع تردد طفرة عالية. أشعة غاما كان لها تأثير كبير على نمو النباتات M 1. وقد أفيد أن العلاج بجرعة أعلى أدى إلى زيادة وتيرة المسوخ التي تعاني من نقص الكلوروفيل والأداء المتدني للخصوبة، ومجموعة البذور وارتفاع النبات في النباتات M2 18. وعلاوة على ذلك، من المعروف أن التسامح مع الأنواع تختلف بين الأنواع المختلفة. ولذلك، فإن الجرعة التي أسفرت عن حوالي 50٪ من الفتك (LD50) في النباتات M1 تعتبر الجرعة المثلى من الإشعاع. ومع ذلك، وجد لي وآخرون جرعات طفرة مختلفة (165 و246 و389 غراي) أسفرت عن معدلات طفرة مماثلة في الجينوم كله عن طريق إعادة التسلسل، مما يعني أنه يمكن تطبيق جرعة منخفضة لتوليد الطفرات22.

وأظهرت هذه الورقة مثال HRM-TILLING لفحص الطفرات من النباتات الناجمة عن غاما. كما ينبغي أن ينطبق نظام إدارة الموارد البشرية- TILLING الوارد وصفه في هذه الورقة على فحص الطفرات في السكان الذين تُطفرة نظم الإدارة البيئية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ أنهما ليس لديهما أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وقد دعم هذا العمل البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (رقم 2016YFD0102103) والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 31701394).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2× Taq plus PCR Master Mix Tiangen, China KT201 PCR buffer, dNTP and polymerase for PCR amplification
96-well plate Bio-rad, America MSP-9651 Specific plate for PCR in HRM analysis
Mastercycler nexus Eppendorf, German 6333000073 PCR amplification
LightScanner Idaho Technology, USA LCSN-ASY-0011 For fluorescence sampling and processing
CALL-IT 2.0 Idaho Technology, USA For analysis of the fluorescence change
EvaGreen Biotium, USA 31000-T Fluorescence dye of HRM
Nanodrop 2000 Thermo Scientific, USA ND2000 For DNA quantification

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McCallum, C. M., Comai, L., Green, E. A., Henikoff, S. Targeting induced local lesions IN genomes (TILLING) for plant functional genomics. Plant Physiology. 123, 439-442 (2000).
  2. Taheri, S., Abdullah, T. L., Jain, S. M., Sahebi, M., Azizi, P. TILLING, high-resolution melting (HRM), and next-generation sequencing (NGS) techniques in plant mutation breeding. Molecular Breeding. 37 (3), 40 (2017).
  3. Till, B. J., et al. Large-scale discovery of induced point mutations with high throughput TILLING. Genome Research. 13 (3), 524-530 (2003).
  4. Comai, L., Henikoff, S. TILLING: practical single nucleotide mutation discovery. The Plant Journal. 45 (4), 684-694 (2006).
  5. Comai, L., et al. Efficient discovery of DNA polymorphisms in natural populations by Ecotilling. The Plant Journal. 37, 778-786 (2004).
  6. Rogers, C., Wen, J., Chen, R., Oldroyd, G. Deletion-based reverse genetics in Medicagotruncatula. Plant Physiology. 151 (3), 1077 (2009).
  7. Bush, S. M., Krysan, P. J. ITILLING: a personalized approach to the identification of induced mutations in arabidopsis. Physiology. 154 (1), 25-35 (2010).
  8. Colasuonno, P., et al. DHPLC technology for high-throughput detection of mutations in a durum wheat TILLING population. BMC Genetics. 17 (1), 43 (2016).
  9. Tsai, H., et al. Discovery of rare mutations in populations: TILLING by sequencing. Plant Physiology. 156, 1257-1268 (2011).
  10. Kumar, A. P. K., et al. TILLING by Sequencing (TbyS) for targeted genome mutagenesis in crops. Molecular Breeding. 37, 14 (2017).
  11. Dong, C., Vincent, K., Sharp, P. Simultaneous mutation detection of three homoeologous genes in wheat by High Resolution Melting analysis and Mutation Surveyor. BMC Plant Biology. 9, 143 (2009).
  12. Gady, A. L., Herman, F. W., Wal, M. H. V. D., Loo, E. N. V., Visser, R. G. Implementation of two high through-put techniques in a novel application: detecting point mutations in large EMS mutated plant populations. Plant Methods. 5 (41), 6974-6977 (2009).
  13. Ririe, K. M., Rasmussen, R. P., Wittwer, C. T. Product differentiation by analysis of DNA melting curves during the polymerase chain reaction. Analytical Biochemistry. 245, 154-160 (1997).
  14. Lochlainn, S. O., et al. High resolution melt (HRM) analysis is an efficient tool to genotype EMS mutants in complex crop genomes. Plant Methods. 7, 43 (2011).
  15. Yoshida, S., Forno, D. A., Cock, J. H., Gomez, K. A. Laboratory manual for physiological rice. The International Rice Research Institute. , Manila, the Philippines. (1976).
  16. Peng, S. T., Zhuang, J. Y., Yan, Q. C., Zheng, K. L. SSR markers selection and purity detection of major hybrid rice combinations and their parents in China. Chinese Journal of Rice Science. 17, 1-5 (2003).
  17. Allen, G. C., Flores-Vergara, M. A., Krasynanski, S., Kumar, S., Thompson, W. F. A modified protocol for rapid DNA isolation from plant tissues using cetyltrimethymmonium bromide. Nature. 1 (5), 2320-2325 (2006).
  18. Fu, H. W., Li, Y. F., Shu, Q. Y. A revisit of mutation induction by gamma rays in rice (Oryza sativa L.): implications of microsatellite markers for quality control. Molecular Breeding. 22 (2), 281-288 (2008).
  19. Li, S., Liu, S. M., Fu, H. W., Huang, J. Z., Shu, Q. Y. High-resolution melting-based tilling of γ ray-induced mutations in rice. Journal of Zhejiang University-Science B. 19 (8), 620-629 (2018).
  20. Acanda, Y., Óscar, M., Prado, M. J., González, M. V., Rey, M. EMS mutagenesis and qPCR-HRM prescreening for point mutations in an embryogenic cell suspension of grapevine. Cell Reports. 33 (3), 471-481 (2014).
  21. Si, H. J., Wang, Q., Liu, Y. Y., Huang, J. Z., Shu, Q. Y., Tan, Y. Y. Development and application of an HRM-based, safe and high-throughput genotyping system for photoperiod sensitive genic male sterility gene in rice. Journal of Nuclear Agricultural Sciences. 31 (11), 2081-2086 (2017).
  22. Li, S., Zheng, Y. C., Cui, H. R., Fu, H. W., Shu, Q. Y., Huang, J. Z. Frequency and type of inheritable mutations induced by γ rays in rice as revealed by whole genome sequencing. Journal of Zhejiang University-Science B. 17 (12), 905 (2016).

Tags

علم الوراثة، العدد 151، تحليل ذوبان عالية الدقة، إدارة الموارد البشرية، الحرث، فحص الطفرات، Indel وSBS، أشعة غاما، الأرز
تحديد الطفرات من خلال ذوبان عالية الدقة في عدد السكان من الأرز الحرث
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, S., Yu, Y. P., Liu, S. M., Fu,… More

Li, S., Yu, Y. P., Liu, S. M., Fu, H. W., Huang, J. Z., Shu, Q. Y., Tan, Y. Y. Identifying Mutations by High Resolution Melting in a TILLING Population of Rice. J. Vis. Exp. (151), e59960, doi:10.3791/59960 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter