Summary
이 문서에서는, 우리는 고분해능 용융 분석 (HRM) 기지를 둔 표적 유도한 게놈에 있는 국소 병변으로 기술되는 프로토콜을 제시합니다 (TILLING). 이 방법은 DNA 이중의 용융 동안 형광 변화를 이용하고 삽입 / 삭제 (Indel) 및 단일 염기 서브 스티션 (SBS)의 높은 처리량 스크리닝에 적합합니다.
Abstract
게놈에서 표적 유도국부 병변 (TILLING)은 유도된 돌연변이의 높은 처리량 스크리닝을 위한 역유전학의 전략이다. 그러나 TILLING 시스템은 삽입/삭제(Indel) 검출에 대한 적용가능성이 적으며, 전통적인 틸링은 CEL I 뉴클레아제 소화 및 겔 전기 영동과 같은 보다 복잡한 단계를 필요로 합니다. 처리량 및 선택 효율을 개선하고 인델 및 단일 베이스 대체(SBS)의 스크리닝을 가능하게 하기 위해 새로운 고해상도 용융(HRM) 기반 틸링 시스템이 개발되었습니다. 여기에서, 우리는 상세한 HRM-TILLING 프로토콜을 제시하고 돌연변이 검열에 있는 그것의 응용을 보여줍니다. 이 방법은 고온에서 이중 가닥 DNA의 변이를 측정하여 PCR 앰플리컨의 돌연변이를 분석할 수 있습니다. HRM 분석은 추가 처리 없이 PCR 후 직접 수행됩니다. 또한 간단하고 안전하며 빠른 (SSF) DNA 추출 방법은 HRM-TILLING과 통합되어 인델과 SBS를 모두 식별합니다. 단순성, 견고성 및 높은 처리량은 쌀 및 기타 작물의 돌연변이 스캐닝에 잠재적으로 유용합니다.
Introduction
돌연변이는 식물 기능 유전체학 연구 및 새로운 품종의 번식을위한 중요한 유전 자원이다. 전방 유전학 접근법(즉, 돌연변이 선택에서 유전자 복제 또는 다양한 발달에 이르기까지)은 약 20년 전에 유도된 돌연변이의 사용을 위한 주요 및 유일한 방법이었다. 새로운 역유전학 방법의 개발, TILLING (게놈에서 유도 된 국소 병변 을 표적으로) McCallum et al. 1은 새로운 패러다임을 열었고 이후 많은 수의 동물 및 식물 종2에적용되었습니다. TILLING은 기술적으로 어렵거나 비용이 많이 드는 특성(예: 질병 저항성, 미네랄 함량)을 사육하는 데 특히 유용합니다.
틸링은 처음에 화학적 돌연변이원(예를 들어, EMS1,3)에의해 유도된 스크리닝 포인트 돌연변이를 위해 개발되었다. 여기에는 다음 단계가 포함됩니다. DNA 준비 및 개별 식물의 풀링; 표적 DNA 단편의 PCR 증폭; CEL I 뉴클레아제에 의한 PCR 앰플리톤 및 절단의 변성 및 어닐링에 의한 이혈형성; 돌연변이 개인및 그들의 특정 분자 병변의 확인3,4. 그러나 이 방법은 여전히 비교적 복잡하고 시간이 오래 걸리며 처리량이 낮습니다. 더 효율적이고 높은 처리량으로, 삭제 틸링 (De-TILLING)(표1)1,3,5,6,등 많은 수정 된 틸링 방법이 개발되었습니다. 7,8,9,10,11,12.
DNA 이중의 용융 동안형광 변화에 기초한 HRM 곡선 분석은, 돌연변이 스크리닝 및 유전형 분석(13)을 위한 간단하고비용 효율적이며 높은 처리량 방법이다. HRM은 이미 EMS 돌연변이 유발 에 의해 유도된 SBS 돌연변이를 스크리닝하기 위한 HRM 기반 틸링(HRM-TILLING)을 포함하는 식물 연구에서 널리 사용되고 있다14. 여기에서, 우리는 쌀에 있는 감마 (γ) 광선에 의해 유도된 돌연변이 (인델 및 SBS 둘 다)의 검열을 위한 상세한 HRM-TILLING 프로토콜을 제시했습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 준비
-
γ선 돌연변이 인구의 발달
- 약 20,000개의 말린 쌀 씨앗을 치료하십시오(수분 함량은 14%) 100 Gy (1 Gy / min)에서 137Cs 감마선을 가진 자포니카 쌀 라인 (예를 들어, DS552)의 γ 조사 시설 (예를 들어, 감마 세포).
참고: 치료에 사용되는 씨앗은 높은 생존율을 가져야합니다 (예 : 발아율 >85 %). 인디카 쌀에 대한 조사 용량은 150 Gy로 증가 될 수있다. - 모종 침대에서 발아 한 후 조사 된 씨앗을 뿌리고 모종을 개별적으로 논에 이식하고 M1 인구로 성장시킵니다.
참고: M1 공장의 직접 파종은 인건비를 절감하기 위해 드물게 적용 될 수 있습니다. M1 식물이 다른 쌀 품종과 교차하는 것을 방지하여 물리적 또는 생물학적 격리 수단을 사용하십시오. - M1 식물에서 대량 수확 M2 씨앗, 각 M에서 1-2 씨앗1-2 공황, M을 형성하기 위해2 인구.
참고 : 연습과 단순하기 위해, M1 식물의 모든 씨앗을 수확하고 완전히 혼합 한 후, 부분은 M2 인구를 형성하기 위해 샘플링된다. - 실온에서 약 5,000 M2 씨앗을 물에 담그고 24 (인디카 쌀)-36 (자포니카 쌀) h. 그런 다음 페트리 접시에 축축한 필터 종이에 2 일 동안 37 °C에서 발아 씨앗을 보자.
참고: 돌연변이를 식별 할 확률을 높이기 위해 분석을 위해 더 많은 M2 씨앗을 발아 할 수 있습니다. - 발아 된 씨앗을 작은 구멍이있는 파종 패널에 놓고 Yoshida 등15에서 변형 된 배양 용액에서 3-4 주 동안 수경으로 성장시키고 12 시간 포토 기간 [주간 (30 ±2) ° C 및 밤 (24 ±2) °C]를 가진 유리 하우스에서.
- 약 20,000개의 말린 쌀 씨앗을 치료하십시오(수분 함량은 14%) 100 Gy (1 Gy / min)에서 137Cs 감마선을 가진 자포니카 쌀 라인 (예를 들어, DS552)의 γ 조사 시설 (예를 들어, 감마 세포).
- 잎 조직의 샘플링 : 구멍 펀처를 사용하여 동일한 위치에서 각 시드의 완전히 확장 된 잎에서 하나의 디스크 (Φ ~ 2mm)를 잘라.
-
DNA 추출 솔루션 의 준비
- 버퍼 A: 5 M NaOH 의 2 mL과 20% 트웬 20의 10 mL를 추가하여 최종 부피를 50 mL로 만듭니다. DNA 추출 전에 버퍼 A를 신선하게 준비합니다.
- 버퍼 B: 1M Tris-HCl(pH 8.0)의 20 mL과 0.5M EDTA의 80 μL을 추가하여 최종 부피를 100 mL로 만듭니다.
-
PCR 프라이머
- HRM 분석을 위한 프라이머: 소프트웨어(예: 프라이머 Premier5)를 사용하여 대상 서열을 증폭하고 상업적 회사에 의해 합성하기 위한 설계 프라이머.
참고: HRM은 긴 조각의 분석에 덜 적용하기 때문에 앰플리온은 400 bp 미만이어야합니다. 또는 너무 낮음(&25%) GC 콘텐츠는 HRM 분석에도 좋지 않습니다. - 품질 관리를위한 프라이머 : Peng 등16에서12 쌀 염색체에 분포 된 24 개의 SSR 마커를 사용합니다.
- HRM 분석을 위한 프라이머: 소프트웨어(예: 프라이머 Premier5)를 사용하여 대상 서열을 증폭하고 상업적 회사에 의해 합성하기 위한 설계 프라이머.
2. DNA 추출
- 96웰 PCR 플레이트의 각 웰에 4개의 리프 디스크를 놓고 버퍼 A 용액(50mL/well)을 추가합니다. 플레이트를 -80°C 냉동고에서 10분 동안 동결합니다.
- 실온에서 플레이트를 동결한 다음 95°C에서 10분 동안 배양합니다.
- 각 우물에 50 μL의 버퍼 B를 추가하고 소용돌이에 의해 잘 섞어.
- 1,500 x g에서 1 분 동안 접시를 원심 분리합니다. 상급PCR에 대한 준비가되어 있습니다.
3. PCR 증폭
-
PCR 최적화
- 각 PCR에 다음 시약을 잘 추가하십시오: DNA 1 μL(단계 2.4의 상판), 5 μL의 2x 마스터 믹스(2xPCR 완충액, 4 mmol/L MgCl 2, 0.4 mmol/L 2'-deoxyribonucleoside 삼인산염(dNTPs), 및 50 U/mL Taq DNA 1μl, 각 50 μL Taq DNA μmol/L 프라이머, 뉴클레아제 프리 워터를 사용하여 최종 부피를 최대 10 μL까지 만든다.
- 그라데이션 가능 열 블록을 사용하여 각 대상 단편에 대한 최적의 어닐링 온도를 결정합니다: 94°C에서 5분, 94°C에서 30s의 40사이클, 52-62°C에서 30초, 72°C에서 30초 , 72°C에서 8분 동안 최종 연장하고 16°C에서 홀드한다.
- 최적의 어닐링 온도를 측정하기 위해 1% 아가로즈 젤에 앰플리폰을 검사합니다.
참고:최적의 어닐링 온도는 비특이적 증폭 및 프라이머 이화 없이 대상 단편의 특정 증폭을 가능하게 합니다.
-
HRM 분석을 위한 PCR
참고: 단계 2.4에 기재된 바와 같이 추출된 M2 모종의 HRM 호환 플레이트 및 DNA는 PCR용으로 사용된다.- DNA(상판제) 1 μL, 2x 마스터 믹스 5 μL, 0.2 μl 각각 10μmol/L 프라이머, 10x 형광 염료 1μL의 최종 부피로 PcR을 수행합니다. 각 플레이트에서 하나의 야생 형 (WT) 부모 샘플 과 하나의 네거티브 (DNA없이) 대조군을 포함한다.
- 증발을 방지하기 위해 미네랄 오일 한 방울을 각 우물에 넣으세요.
- 1 분 동안 1,000 x g의 접착제 필름과 원심 분리기로 접시를 밀봉하십시오.
- 최적화된 어닐링 온도를 사용하여 PCR을 실행합니다.
참고: 몇 가지 경우 형광 염료가 PCR 증폭에 영향을 줄 수 있으므로 PCR 완료 후 염료가 추가됩니다. 이러한 경우에, 염료는 포스트 PCR 변성 및 어닐링에 의해 DNA 가닥으로 통합됩니다.
4. HRM 스캐닝 및 돌연변이 확인
- 플레이트에서 접착필름을 제거하고 플레이트를 HRM 기계에 삽입합니다.
- 파일 메뉴에서 새로 실행을 선택하거나 화면 상단의 실행 버튼을 누릅니다.
- 55°C ~ 95°C의 용융에 대한 시작 및 종료 온도를 지정합니다.
참고: 첫 번째 실행 후, 용융 온도의 범위는 특정 조각에 대해 결정 될 수있다; 따라서 시간을 절약하기 위해 동일한 조각의 후속 분석을 위해 용융 온도를 조정할 수 있습니다. - 고분해능 용융 분석을 위해 샘플을 선택하고 음수 제어와 유사한 샘플을 제외합니다.
- 용융 곡선을 정규화하여 동일한 시작 및 끝 형광을 갖습니다. 최소 및 최저 최대 온도 커서가 곡선 영역에 있는지 시각적으로 확인합니다.
- 기본 설정에서 F(형광의 차이) 수준을 0.05로 유지합니다.
- 표준 선택 목록에서 공통 과 변형을 선택하고 일반 민감도를 선택합니다.
- WT를 컨트롤로 사용합니다. WT에서 ≥0.05의 ≥F 값을 가진 샘플은 돌연변이 식물을 포함하는 것으로 간주됩니다.
-
돌연변이 식물의 식별 및 확인.
- 각 돌연변이 풀이 만들어진 4 개의 식물을 식별합니다.
- 알렌 외17에 따라 CTAB 방법을 사용하여 이들 식물의 각각에서 DNA를 추출하는 것은 약간의 변형.
참고: DNase 없는 RNase 및 NaAc는 알렌 외17에의해 기술된 CTAB 방법을 사용하여 DNA를 추출할 때 사용되지 않으며, DNA 품질은 추가PCR 증폭을 위해 충분히 양호하기 때문에. 분광광도계를 사용하여 정량화 한 후 ~ ~ 25 ng / μL의 최종 농도로 DNA를 조정합니다. - PCR 프라이머를 사용하여 대상 조각을 증폭하고 HRM 분석과 동일하게 프로그래밍합니다.
- 앰플리곤의 Sanger 시퀀싱에 의해 특정 분자 병변을 식별합니다.
참고: PCR 증폭이 완료되면, Sanger 시퀀싱을 위해 회사에 앰플리콘을 보냅니다. 분자 병변은 M2 식물과 WT 사이의 서열을 비교하여 확인할 수 있다.
5. 분자 마커를 가진 선택된 돌연변이의 질 관리
- 24개의 SSR 마커에 대해 25 ng의 게놈 DNA(CTAB 프로토콜을 사용하여 추출됨), 5 μL의 2x 마스터 믹스, 10 μM SSR 프라이머 각각의 0.2 μL로 최종 부피에서 PCR을 수행합니다.
- 다음 프로그램을 사용하여 PCR을 실행: 94°C에서 5분, 94°C에서 30s, 55°C에서 30s, 72°C에서 30s, 72°C에서 최종 연장72°C에서 7분.
- 8 % 폴리 아크릴 아미드 젤에 앰플리컨을 분리하고 은 염색18에의해 증폭 된 조각의 다형성을 드러냅니다.
- 선택한 변형과 WT의 SSR haplotype을 비교합니다.
참고: 유도 된 돌연변이체는 종종 WT와 동일한 SSR haplotype을 가지고 있으며, 하나 이상의 SSR 마커가 변이체와 WT 사이에 다른 경우, 변이체는 유도된 것이 아니라 유전 적 오염 물질 (예를 들어, 혼합물 또는 교차 된 식물)일 가능성이 높습니다. 돌연변이18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
HRM 스캐닝 및 분석
총 4,560M2 묘목에서 1,140개의 풀링된 DNA 샘플을 생산하고 PCR 증폭을 실시하였다. 195 bp 및 259 bp의 크기의 두 단편은 각각 OsLCT1 및 SPDT에대해 증폭되었다(표 2). 대부분의 시료는 WT(ΔF < 0.05)와 크게 다르지 않은 용융 곡선을 가졌다. WT(ΔF > 0.05)와 현저히 다른 HRM 곡선은 소프트웨어에 의해 WT와 다른색상으로 그룹화되었다(그림 1).
돌연변이 확인 및 빈도
개별 묘목으로부터의 DNA 샘플을 증폭에 사용하였고, 각각의 단편을 서열화하였다. 유전자에 대한 돌연변이 유형 및 위치는 시퀀싱 크로마토그램에의해 확인될 수 있었다(도 2). 2개의 Indels 및 1개의 SBS를 포함하여 3개의 돌연변이는 4,560 M2 묘목에서 확인되었습니다 (표 2). 3개의 돌연변이 부위가 모두 돌연변이 부위에서 이형이었음이밝혀졌다(도 2).
여기서 돌연변이 빈도는 틸링 집단에서 게놈에서 발생한 돌연변이의 빈도로 지칭된다. 아래 의 수식에 기초하여, 돌연변이 빈도가 약 1/690 kb에 달하는 것으로 나타났다.
그림 1: OsLCT1 (A, B) 또는 SPDT (C) 유전자에서 돌연변이에 대한 M2 모종의 HRM 틸링. 와일드 타입은 형광 차이 곡선의 개발을 위한 기준으로 선택되었습니다. 돌연변이체는 각각 90.0-92.0°C 및 81.5-83.5°C의 온도에서 ΔFs > 0.05를 가진 현저하게 다른 HRM 곡선을 보였다. 이 수치는 Li et al.19에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 돌연변이의 표적 파편의 시퀀싱 크로마토그램. 직사각형 상자는 OsLCT1 (A)의 4304 bp에서 G →A의 돌연변이가있는이형 부위를 나타낸다; OsLCT1의 4240 bp에서 하나의 단일 뉴클레오티드 A 삽입은 화살표(B)로 표시된다; 및 SPDT의 5948-5950 bp의 위치에서 TTC 삼중뉴클레오티드 결실은흑선(C)으로 지시된다. 이 수치는 Li et al.19에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 약어 | 전체 이름 | 장점 또는 적용 가능성 | 단점 | 참조 |
| 전통적인 틸링 | 게놈에 있는 유도한 국소 병변을 표적으로 합니다 | 스크리닝 포인트 돌연변이의 경우 | 시간과 비용이 많이 듭니다. | 맥칼럼 외, 2000; 2003년 |
| 에코 틸링 | 에코 타입 틸링 | 자연 인구에 있는 검열 돌연변이를 위해 | 비용이 많이 들고 감도가 낮음 | 코마이 외, 2004 |
| 디 틸링 | 삭제 틸링 | 대형 삭제 검사용 | 좋은 PCR 시스템에 강하게 의존 | 로저스 외, 2009 |
| 아이틸링 (이틸링) | 개별화된 틸링 | 개인화된 TIILLING 인구를 이용한 돌연변이 식별 | 영구 인구가 아님 | 부시와 크리산, 2010 |
| DHPLC 틸링 | 고성능 액체 크로마토그래피 -기반 틸링 변성 | 시간 절약 | 낮은 처리량 | 콜라수온노 외, 2016 |
| 세크 틸링 | 시퀀싱에 의한 틸링 | 높은 처리량, 비효소 시스템 | 상대적으로 비용이 많이 들고 더 높은 거짓 긍정 | Tsai 외, 2011; 쿠마르 외, 2017 |
| HRM 틸링 | 고분해능 용융-틸링 | 높은 처리량 과 시간 절약; 비 효소 시스템 | PCR 조각 길이 제한 | 동 외, 2009; 가디 외, 2009년 |
표 1: 다양한 틸링 접근법의 장점과 단점.
| 유전자 이름 | 진 로치 | 유전자 기능 | 프라이머 시퀀스 (5'-3') | 최적화 후 Tm(°C) | 제품 크기(bp) | 돌연변이 수 (돌연변이 유형) | ||
| 오스LCT1 | LOC_Os06g38120 | 낮은 카드뮴 수송기 | LCT-F: CTCGATGTTAAGCATTCC LCT-R: 아그가그가아CGCGGCTAC | 61 | 195 | 2(G-A 전이, 1bp 삽입) | ||
| Spdt | LOC_Os06g05160 | SULTR 같은 인 분배 수송기 | SPDT-F: TTCTCAGGAGGAGGAT SPDT-R: CCACGCATCTGGTTACAT | 52 | 259 | 1(3-bp 삭제) | ||
표 2: 2개의 표적 유전자의 정보, PCR 증폭 및 돌연변이 확인.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
TILLING은 유전자 기능 분석 및 작물 사육을 위한 유도된 돌연변이를 식별하기 위한 강력한 역유전 적 도구임이 입증되었습니다. 쉽게 관찰되거나 결정되지 않은 일부 특성의 경우, 고처리량 PCR 기반 돌연변이 검출을 이용한 틸링은 상이한 유전자에 대한 돌연변이를 얻는 유용한 방법이 될 수 있다. HRM-TILLING 방법은 돌연변이 스크리닝을 위해 토마토12,밀11 및 포도나무20의 EMS 돌연변이 집단에서 사용되어 왔다. 이 논문에서는 인델 및 SBS 돌연변이 스크리닝모두에 적용할 수 있는 더 간단하고 강력한 HRM-TILLING이 입증되었습니다.
효율성을 개선하기 위해 DDNA는 시간과 노동력이 많이 소모되고 독성 화학 약제가 필요한 일반 CTAB 방법 대신 SSF 방법을 사용하여 추출되었습니다. Si 등21은 SSF 및 CTAB 방법을 사용하여 추출된 DNA의 품질을 비교하였다. SSF 추출의 DNA가 CTAB 추출보다 순도가 열등한 것으로 밝혀졌지만, 쌀의 PCR 및 HRM 분석 요구 사항을 충족시킬 수 있었습니다. 그러나, SSF 추출에서 DNA는 장시간 저장될 수 없었다는 것을 주목해야 한다, 따라서 영원한 돌연변이 라이브러리를 설치하기에 적합하지 않다.
이전 연구에서는, 1/8 돌연변이 DNA를 가진 풀링된 견본은 EMS와 감마 돌연변이 집단 둘 다에 있는 HRM 분석에 의해 야생 형에서 분화될 수 있었습니다14,19. M2 식물이 유도된 돌연변이에 대해 이형이 될 수 있다는 점을 고려할 때, HRM-TILLING에 의한 돌연변이 를 검출하기 위해 4개의 M2 식물을 모으는 것이 좋습니다.
더 많은 돌연변이를 얻기 위하여는, 또한 높은 돌연변이 주파수를 가진 돌연변이 집단을 개발하는 것이 중요합니다. 감마선은 M1 식물의 성장에 상당한 영향을 미쳤다. 더 높은 용량의 치료는 엽록소 결핍 돌연변이의 빈도 증가와 M2 식물에서의 불임, 종자 세트 및 식물 높이의 열등한 성능으로 인한 것으로 보고되었다18. 또한, 돌연변이 원에 대한 내성은 다른 종 사이에서 다양하다고 알려졌다. 따라서M1 식물에서 약 50%의 치사율(LD50)을 초래하는 투여량은 최적의 조사 용량으로 간주되었다. 그러나, Li et al.은 상이한 돌연변이 용량(165, 246 및 389 Gy)을 발견하여 전체 게놈에서 유사한 돌연변이 율을 발생시켰으며, 이는 낮은 용량을 암시하여 돌연변이22를생성하기 위해 적용될 수 있었다.
이 논문은 감마 유도 식물의 돌연변이 스크리닝을 위한 HRM-TILLING의 예를 보여주었다. 이 논문에 기술된 HRM-TILLING은 EMS 돌연변이 집단에서 돌연변이를 선별하기 위해서도 적용되어야 합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 작품은 중국의 국가 핵심 연구 개발 프로그램 (No. 2016YFD0102103)과 중국의 국립 자연 과학 재단 (No.31701394)에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2× Taq plus PCR Master Mix | Tiangen, China | KT201 | PCR buffer, dNTP and polymerase for PCR amplification |
| 96-well plate | Bio-rad, America | MSP-9651 | Specific plate for PCR in HRM analysis |
| Mastercycler nexus | Eppendorf, German | 6333000073 | PCR amplification |
| LightScanner | Idaho Technology, USA | LCSN-ASY-0011 | For fluorescence sampling and processing |
| CALL-IT 2.0 | Idaho Technology, USA | For analysis of the fluorescence change | |
| EvaGreen | Biotium, USA | 31000-T | Fluorescence dye of HRM |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific, USA | ND2000 | For DNA quantification |
References
- McCallum, C. M., Comai, L., Green, E. A., Henikoff, S. Targeting induced local lesions IN genomes (TILLING) for plant functional genomics. Plant Physiology. 123, 439-442 (2000).
- Taheri, S., Abdullah, T. L., Jain, S. M., Sahebi, M., Azizi, P. TILLING, high-resolution melting (HRM), and next-generation sequencing (NGS) techniques in plant mutation breeding. Molecular Breeding. 37 (3), 40 (2017).
- Till, B. J., et al. Large-scale discovery of induced point mutations with high throughput TILLING. Genome Research. 13 (3), 524-530 (2003).
- Comai, L., Henikoff, S. TILLING: practical single nucleotide mutation discovery. The Plant Journal. 45 (4), 684-694 (2006).
- Comai, L., et al. Efficient discovery of DNA polymorphisms in natural populations by Ecotilling. The Plant Journal. 37, 778-786 (2004).
- Rogers, C., Wen, J., Chen, R., Oldroyd, G.
- Bush, S. M., Krysan, P. J. ITILLING: a personalized approach to the identification of induced mutations in arabidopsis. Physiology. 154 (1), 25-35 (2010).
- Colasuonno, P., et al. DHPLC technology for high-throughput detection of mutations in a durum wheat TILLING population. BMC Genetics. 17 (1), 43 (2016).
- Tsai, H., et al. Discovery of rare mutations in populations: TILLING by sequencing. Plant Physiology. 156, 1257-1268 (2011).
- Kumar, A. P. K., et al. TILLING by Sequencing (TbyS) for targeted genome mutagenesis in crops. Molecular Breeding. 37, 14 (2017).
- Dong, C., Vincent, K., Sharp, P. Simultaneous mutation detection of three homoeologous genes in wheat by High Resolution Melting analysis and Mutation Surveyor. BMC Plant Biology. 9, 143 (2009).
- Gady, A. L., Herman, F. W., Wal, M. H. V. D., Loo, E. N. V., Visser, R. G. Implementation of two high through-put techniques in a novel application: detecting point mutations in large EMS mutated plant populations. Plant Methods. 5 (41), 6974-6977 (2009).
- Ririe, K. M., Rasmussen, R. P., Wittwer, C. T. Product differentiation by analysis of DNA melting curves during the polymerase chain reaction. Analytical Biochemistry. 245, 154-160 (1997).
- Lochlainn, S. O., et al. High resolution melt (HRM) analysis is an efficient tool to genotype EMS mutants in complex crop genomes. Plant Methods. 7, 43 (2011).
- Yoshida, S., Forno, D. A., Cock, J. H., Gomez, K. A. Laboratory manual for physiological rice. The International Rice Research Institute. , Manila, the Philippines. (1976).
- Peng, S. T., Zhuang, J. Y., Yan, Q. C., Zheng, K. L. SSR markers selection and purity detection of major hybrid rice combinations and their parents in China. Chinese Journal of Rice Science. 17, 1-5 (2003).
- Allen, G. C., Flores-Vergara, M. A., Krasynanski, S., Kumar, S., Thompson, W. F. A modified protocol for rapid DNA isolation from plant tissues using cetyltrimethymmonium bromide. Nature. 1 (5), 2320-2325 (2006).
- Fu, H. W., Li, Y. F., Shu, Q. Y. A revisit of mutation induction by gamma rays in rice (Oryza sativa L.): implications of microsatellite markers for quality control. Molecular Breeding. 22 (2), 281-288 (2008).
- Li, S., Liu, S. M., Fu, H. W., Huang, J. Z., Shu, Q. Y. High-resolution melting-based tilling of γ ray-induced mutations in rice. Journal of Zhejiang University-Science B. 19 (8), 620-629 (2018).
- Acanda, Y., Óscar, M., Prado, M. J., González, M. V., Rey, M. EMS mutagenesis and qPCR-HRM prescreening for point mutations in an embryogenic cell suspension of grapevine. Cell Reports. 33 (3), 471-481 (2014).
- Si, H. J., Wang, Q., Liu, Y. Y., Huang, J. Z., Shu, Q. Y., Tan, Y. Y. Development and application of an HRM-based, safe and high-throughput genotyping system for photoperiod sensitive genic male sterility gene in rice. Journal of Nuclear Agricultural Sciences. 31 (11), 2081-2086 (2017).
- Li, S., Zheng, Y. C., Cui, H. R., Fu, H. W., Shu, Q. Y., Huang, J. Z. Frequency and type of inheritable mutations induced by γ rays in rice as revealed by whole genome sequencing. Journal of Zhejiang University-Science B. 17 (12), 905 (2016).
