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Genetics

Identificare le mutazioni con lo scioglimento ad alta risoluzione in una popolazione di riso TILLING

Published: September 2, 2019 doi: 10.3791/59960
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 3, 1, 4
1National Key Laboratory of Rice Biology, Zhejiang Provincial Key Laboratory of Crop Genetic Resources, Institute of Crop Science, Zhejiang University, 2Jiaxing Academy of Agricultural Sciences, 3Institute of Nuclear Agricultural Sciences, Zhejiang University, 4The New Countryside Development Institute at Zhejiang University

Summary

In questo articolo, presentiamo il protocollo descritto come ad alta risoluzione di fusione di analisi di fusione (HRM)-based Target Induced Local Lesions In ducedato In genomes (TILLING). Questo metodo utilizza cambiamenti di fluorescenza durante la fusione del DNA duplex ed è adatto per lo screening ad alto throughput di inserimento/eliminazione (Indel) e singola sostituzione di base (SBS).

Abstract

Target Induced Local Lesions In Genomes (TILLING) è una strategia di genetica inversa per lo screening ad alto throughput delle mutazioni indotte. Tuttavia, il sistema TILLING ha meno applicabilità per il rilevamento di inserimento/eliminazione (Indel) e TILLING tradizionale richiede passaggi più complessi, come la digestione di nucleale CEL I e l'elettroforesi gel. Per migliorare la produttività e l'efficienza di selezione, e per rendere possibile lo screening di entrambi gli Indels e le singole sottostizioni di base (SBS), viene sviluppato un nuovo sistema DI fusione ad alta risoluzione (HRM) basato su . Qui, presentiamo un protocollo DETTAGLIATO HRM-TILLING e mostriamo la sua applicazione nello screening delle mutazioni. Questo metodo è in grado di analizzare le mutazioni degli amplificatori PCR misurando la denaturazione del DNA a doppio filamento ad alte temperature. L'analisi HRM viene eseguita direttamente dopo la PCR senza ulteriori elaborazioni. Inoltre, un metodo di estrazione del DNA semplice, sicuro e veloce (SSF) è integrato con HRM-TILLING per identificare sia Indels che SBS. La sua semplicità, robustezza e produttività elevata lo rendono potenzialmente utile per la scansione delle mutazioni nel riso e in altre colture.

Introduction

I mutanti sono importanti risorse genetiche per la ricerca di genomica funzionale delle piante e l'allevamento di nuove varietà. Un approccio genetico in avanti (cioè dalla selezione mutante alla clonazione genica o allo sviluppo di varietà) era il metodo principale e unico per l'uso di mutazioni indotte circa 20 anni fa. Lo sviluppo di un nuovo metodo di genetica inversa, TILLING (Targeting Induced Local Lesions In Genomes) di McCallum et al.1 ha aperto un nuovo paradigma e da allora è stato applicato in un gran numero di specie animali e vegetali2. TILLING è particolarmente utile per l'allevamento di tratti tecnicamente difficili o costosi da determinare (ad esempio, resistenza alle malattie, contenuto minerale).

TILLING è stato inizialmente sviluppato per le mutazioni dei punti di screening indotte da mutageni chimici (ad esempio, EMS1,3). Esso comprende i seguenti passaggi: la creazione di una popolazione/e TILLING; preparazione e raggruppamento del DNA di singole piante; amplificazione PCR del frammento di DNA bersaglio; eterodulessi formazione per denaturazione e annessione di amplificatori PCR e scissione da ceL I nucleasi; e l'identificazione degli individui mutanti e delle loro specifiche lesioni molecolari3,4. Tuttavia, questo metodo è ancora relativamente complesso, richiede tempo e bassa velocità effettiva. Per renderlo più efficiente e con una maggiore produttività, sono stati sviluppati molti metodi TILLING modificati, come la cancellazione DI TILLING (De-TILLING) (Tabella 1)1,3,5,6, 7,8,9,10,11,12.

L'analisi della curva HRM, che si basa sui cambiamenti di fluorescenza durante lo scioglimento del DNA duplex, è un metodo semplice, conveniente e ad alta produttività per lo screening delle mutazioni e la genotipizzazione13. HRM è già stato ampiamente utilizzato nella ricerca vegetale tra cui HRM basato SU TILLING (HRM-TILLING) per lo screening delle mutazioni SBS indotte dalla mutagenesi EMS14. Qui, abbiamo presentato protocolli HRM-TILLING dettagliati per lo screening delle mutazioni (sia Indel che SBS) indotti dai raggi gamma (z) nel riso.

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Protocol

1. Preparativi

  1. Sviluppo delle popolazioni mutagenizzate a raggi di raggi
    1. Trattare circa 20.000 semi di riso essiccati (con contenuto di umidità di ca. 14%) di una linea di riso japonica (ad esempio, DS552) con 137raggi gamma Cs a 100 Gy (1 Gy/min) in un impianto di irradiazione z (ad esempio, cellula gamma).
      NOTA: I semi utilizzati per il trattamento devono avere un'elevata redditività (ad esempio, con un tasso di germinazione >85%). La dose di irradiazione per il riso indica potrebbe essere aumentata a 150 Gy.
    2. Semina i semi irradiati dopo la germinazione su un letto di piantina e trapianto piantine singolarmente in un campo di risaia e crescere nella popolazione M1.
      NOTA: Seeding diretto di impianti M1 scarsamente potrebbe essere applicato anche per risparmiare sui costi di manodopera. Prevenire l'attraversamento di piante M1 con altre varietà di riso utilizzando mezzi di isolamento fisico o biologico.
    3. Raccolto alla rinfusa M2 semi dalle piante M1, con 1-2 semi da ogni M1 panico, per formare una popolazione M2.
      NOTA: In pratica e per semplicità, raccogliere tutti i semi di Piante M1 e dopo la miscelazione completa, viene campionata una porzione per formare una popolazione di M2.
    4. Immergere circa 5.000 M2 semi in acqua per 24 (riso indica)-36 (riso japonica) h a temperatura ambiente. Quindi lasciate che i semi germoglino a 37 gradi centigradi per 2 giorni su carta da filtro umida nei piatti di Petri.
      NOTA: Più semi M2 possono essere germinati per l'analisi per aumentare la probabilità di identificare i mutanti.
    5. Posizionare i semi germinati in pannelli di semina con piccoli fori e coltivarli idroponicamente per 3-4 settimane in una soluzione di coltura modificata da Yoshida et al.15 in una vetraia con un fotoperiodo di 12 h [giorno (30-2) .C e notte (24-2) .C].
  2. Campionamento dei tessuti foglia: Tagliare un disco (2 mm) dalla foglia completamente estesa di ogni seeding nella stessa posizione utilizzando un forista.
  3. Preparazione di soluzioni di estrazione del DNA
    1. Buffer A: Aggiungere 2 mL di 5 M NaOH e 10 mL del 20% Tween 20 per effettuare il volume finale di 50 mL. Preparate il tampone A prima dell'estrazione del DNA.
    2. Buffer B: Aggiungere 20 mL di 1 M Tris-HCl (pH 8,0) e 80 L di 0,5 M EDTA per un volume finale di 100 mL.
  4. Primer PCR
    1. Primers per l'analisi HRM: Progettare i primer per amplificare la sequenza di destinazione utilizzando software (ad esempio, Primer Premier5) e sintetizzare da una società commerciale.
      NOTA: Poiché HRM è meno applicabile all'analisi di frammenti lunghi e, di conseguenza, gli amplicons devono essere inferiori a 400 bp. Frammenti con troppo alto (>75%) o troppo basso (<25%) Anche i contenuti GC non sono adatti per l'analisi HRM.
    2. Primer per il controllo della qualità: utilizzare i 24 marcatori SSR distribuiti sui 12 cromosomi di riso da Peng et al.16.

2. Estrazione del DNA

  1. Inserire 4 dischi foglia in ogni pozzetto di una piastra PCR 96-pozzio, aggiungere buffer Una soluzione (50 mL/bene). Congelare la piastra in un congelatore a -80 gradi centigradi per 10 min.
  2. Scongelare la piastra a temperatura ambiente, e poi incubare a 95 gradi centigradi per 10 min.
  3. Aggiungete 50 l di tampone B ad ogni pozzo e mescolate bene vortice.
  4. Centrifugare la piastra per 1 min a 1.500 x g. Il supernatante è pronto per la PCR.

3. Amplificazione PCR

  1. Ottimizzazione PCR
    1. Aggiungere i seguenti reagenti a ogni pozzo PCR: 1 L L di DNA (il superatante nel passo 2.4), 5 di 2x Master Mix (contenente 2x buffer PCR, 4 mmol/L MgCl2, 0.4 mmol/L 2'-deoxyribonucleoside trefosfati (dNTP) e 50 U/mL Taq DNA polymerase, 0.2. primer a molo/L, e fare un volume finale fino a 10 ll utilizzando acqua priva di nucleato.
    2. Utilizzare un blocco termico con gradiente per determinare la temperatura di annealing ottimale per ogni frammento bersaglio utilizzando il seguente programma PCR: 5 min a 94 gradi centigradi, seguito da 40 cicli di 30 s a 94 gradi centigradi, 30 s a 52-62 gradi (temperatura del gradiente) e 30 s a 72 gradi centigradi , con un'estensione finale a 72 gradi centigradi per 8 min e una presa a 16 gradi centigradi.
    3. Esaminare gli amplificatori sui gel di agarose dell'1% per determinare la temperatura ottimale dell'annealing.
      NOTA: Una temperatura di analizzazione ottimale dovrebbe consentire un'amplificazione specifica del frammento bersaglio, senza amplificazione non specifica e dimerizzazione del primer.
  2. PCR per l'analisi HRM
    NOTA: Le piastre compatibili con HRM e il DNA delle piantine M2 estratte come descritto al punto 2.4 vengono utilizzati per la PCR.
    1. Eseguire i PCR in un volume finale di 10 gradi, con 1 oL di DNA (supernatante), 5 di 2x Master Mix, 0,2 gradi ciascuno di 10 primer a monamo/L e 1 luna di 10x di tintura a fluorescenza. In ogni piastra includere un campione di tipo selvaggio (WT) e un controllo negativo (senza DNA).
    2. Aggiungere una goccia di olio minerale ad ogni pozzo per evitare l'evaporazione.
    3. Sigillare la piastra con pellicola adesiva e centrifugare a 1.000 x g per 1 min.
    4. Eseguire la PCR utilizzando la temperatura di annealing ottimizzata.
      NOTA: In alcuni casi, il tinto a fluorescenza può influenzare l'amplificazione PCR, quindi il tinto viene aggiunto dopo il completamento della PCR. In questi casi, il colorante è incorporato nei filamenti di DNA mediante denatura e annealing post-PCR.

4. Registrazione di scansione HRM e mutazione

  1. Rimuovere la pellicola adesiva dalla piastra e inserire la piastra in una macchina HRM.
  2. Selezionare Nuova esecuzione dal menu dei file o premere il pulsante Esegui nella parte superiore dello schermo.
  3. Specificare le temperature di inizio e di fine per la fusione da 55 a 95 gradi centigradi.
    NOTA: Dopo la prima corsa, l'intervallo di temperatura di fusione può essere determinato per un particolare frammento; quindi, la temperatura di fusione può essere regolata per la successiva analisi dello stesso frammento per risparmiare tempo.
  4. Selezionare i campioni per l'analisi di fusione ad alta risoluzione, escludere i campioni simili al controllo negativo.
  5. Normalizzare le curve di fusione per avere la stessa fluorescenza iniziale e finale. Verificare visivamente che i cursori di temperatura Min inferiore e Massimo inferiore si trovino in un'area delle curve.
  6. Mantenere il livello di fluorescenza (differenza di fluorescenza) all'impostazione predefinita di 0,05.
  7. Selezionare Comune rispetto a Variante dall'elenco di selezione Standard e scegliere Sensibilità normale.
  8. Utilizzare wT come controllo; i campioni con un valore di 0,05 USD da WT sono considerati come pianta mutante.
  9. Identificazione e conferma delle piante mutanti.
    1. Identificare le quattro piante, di cui ogni piscina mutante è stata fatta.
    2. Estrarre il DNA da ciascuna di queste piante utilizzando un metodo CTAB secondo Allen et al.17 con alcune modifiche.
      NOTA: RNase e NaAc senza DNase non vengono utilizzati durante l'estrazione del DNA utilizzando il metodo CTAB descritto da Allen et al.17, in quanto la qualità del DNA è sufficiente per un'ulteriore amplificazione PCR. Regolare il DNA ad una concentrazione finale di 25 ng/L dopo la quantificazione utilizzando uno spettrofotometro.
    3. Amplifica il frammento di destinazione utilizzando primer PCR e programma lo stesso come per l'analisi HRM.
    4. Identificare specifiche lesioni molecolari mediante il sequenziamento degli amplificatori di Sanger.
      NOTA: Una volta completato l'amplificazione PCR, inviare gli amplificatori a un'azienda per il sequenziamento di Sanger. La lesione molecolare può essere identificata confrontando le sequenze tra la pianta M2 e la WT.

5. Controllo di qualità dei mutanti selezionati con marcatori molecolari

  1. Eseguire la PCR per i 24 marcatori SSR in un volume finale di 10 gradi con 25 ng di DNA genomico (estratto utilizzando il protocollo CTAB), 5 -L di 2x master mix, 0,2 l di ciascuno dei 10 molle SSR da 10 M.
  2. Eseguire la PCR utilizzando il seguente programma: 5 min a 94 gradi centigradi, seguito da 30 cicli di 30 s a 94 gradi centigradi, 30 s a 55 s e 30 s a 72 gradi centigradi, con un'estensione finale a 72 gradi centigradi per 7 min.
  3. Separare gli amplificatori su gel di poliacrilammide dell'8% e rivelare il polimorfismo dei frammenti amplificati dalla colorazione argento18.
  4. Confrontare gli aplotipi SSR delle varianti selezionate e il WT.
    NOTA: I mutanti indotti hanno spesso aplotipi SSR identici al loro WT, se più di un marcatore SSR è diverso tra una variante e il WT, la variante è ad alta probabilità di essere un contaminante genetico (ad esempio, una miscela o una pianta incrociata) piuttosto che una pianta indotta mutante18.

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Representative Results

Scansione e analisi HRM

In totale, sono stati prodotti e sottoposti ad amplificazione PCR 1.140 campioni di DNA in pool da 4.560 M2. Due frammenti delle dimensioni di 195 bp e 259 bp sono stati amplificati rispettivamente per OsLCT1 e SPDT(tabella2). La maggior parte dei campioni presentava curve di fusione non significativamente diverse da quella del WT (WT & lt; 0,05). Le curve HRM significativamente diverse dal WT (F > 0,05) sono state raggruppate con colori diversi dal WT dal software (Figura 1).

Conferma e frequenza della mutazione

Un campione di DNA proveniente da una singola piantina è stato utilizzato per l'amplificazione e il rispettivo frammento è stato sequenziato. Il tipo di mutazione e la posizione sui geni potrebbero essere confermati dai cromogrammi di sequenziamento (Figura 2). Sono state identificate tre mutazioni, tra cui due Indele e una SBS, da 4.560 M2 piantine (Tabella 2). Si è scoperto che tutte e tre le parti mutanti erano eterozigo nel sito di mutazione (Figura 2).

La frequenza di mutazione qui indicata come la frequenza di mutazione si è verificata nel genoma in una popolazione TILLING. Sulla base della formula qui sotto, si è scoperto che la frequenza di mutazione ammontava a circa 1/690 kb.

Equation 1

Figure 1
Figura 1: HRM-TILLING di M2 Seedlings for Mutations in OsLCT1 (A, B) o SPDT (C) Geni. Il tipo selvatico è stato scelto come riferimento per lo sviluppo di curve di differenza di fluorescenza. I mutanti mostravano curve HRM significativamente diverse, rispettivamente con s > 0,05 a temperature rispettivamente di 90,0-92,0 e 81,5-83,5 gradi centigradi. Questa cifra è stata modificata da Li etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Sequenziamento cromatici di frammenti mirati di mutanti. La casella rettangolare indica un sito eteroziggoo con una mutazione di G-A a 4304 bp di OsLCT1 (A); un singolo nucleotide A inserimento al 4240 bp di OsLCT1 è indicato da una freccia (B); e una delezione del trinucleotide TTC nella posizione di 5948-5950 bp di SPDT è indicata da una linea nera (C). Questa cifra è stata modificata da Li etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

abbreviazione nome m e cognome m Vantaggi o applicabilità Svantaggi referenza
TILLING tradizionale Targeting Indotta Lesioni locali nei genomi Per le mutazioni dei punti di screening Tempo e costi McCallum et al., 2000; Fino a et al., 2003
Eco-TILLING Ecotipo-TILLING Per le mutazioni di screening nelle popolazioni naturali Bassa e bassa sensibilità Comai et al., 2004
De-TILLING Eliminazione TINEGGIO Per screening di eliminazione di grandi dimensioni Dipende fortemente da un buon sistema PCR Rogers et al., 2009
iTILLING (ITILLING) ALINAE individualizzato Identificazione delle mutazioni tramite popolazioni TIILLING personalizzate Popolazione non permanente Bush e Krysan, 2010
DHPLC-TILLING Denatura di cromatografia liquida ad alte prestazioni -based TILLING Risparmio di tempo Bassa velocità effettiva Colasuonno et al., 2016
Seq-TILLING TILLING mediante sequenziamento Alta produttività, sistema non etzymatico Falsi positivi relativamente costosi e più alti Tsai et al., 2011; Kumar et al., 2017
HRM-TILLING TILLING ad alta risoluzione Elevata produttività e risparmio di tempo; Sistema non etcida Limite della lunghezza del frammento PCR Dong et al., 2009; Gady et al., 2009

Tabella 1: I vantaggi e gli svantaggi dei vari approcci TILLING.

Nome del gene Gene Loci Funzione genica Sequenza Primer (5'-3') Tm dopo l'ottimizzazione (C) Dimensioni del prodotto (bp) Numero di mutazioni (tipo di mutazione)
OsLCT1 LOC_Os06g38120 Trasportatore di cadmio basso LCT-F: CTCGATGTTAAGCATCTCC LCT-R: AGAGTCAGGAACGCGGCTAC 61 195 2 (transizione G-A, inserimento di 1 bp)
Spdt LOC_Os06g05160 Trasportatore di distribuzione fosforo simile a SULTR SPDT-F: TTCTCGGAGGAGGCTAAT SPDT-R: CCACGCATTCTGGTTACAT 52 259 1 (eliminazione da 3 bp)

Tabella 2: Informazioni su due geni bersaglio, amplificazione PCR e mutazioni identificate.

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Discussion

TILLING si è dimostrato un potente strumento genetico inverso per identificare le mutazioni indotte per l'analisi funzionale genica e l'allevamento delle colture. Per alcuni tratti non facilmente osservabili o determinati, TILLING con rilevamento di mutazioni ad alto contenuto di velocità PCR può essere un metodo utile per ottenere mutanti per diversi geni. Il metodo HRM-TILLING è stato utilizzato nelle popolazioni mutagenizzate Di pomodoro12,grano11 e vine20 per lo screening delle mutazioni. In questo articolo è stato dimostrato un HRM-TILLING più semplice e potente, applicabile sia per lo screening della mutazione di Indel che SBS.

Per migliorare l'efficienza, i DNA sono stati estratti utilizzando il metodo SSF invece del normale metodo CTAB, che richiede tempo e manodopera e richiede agenti chimici tossici. 21 ha confrontato la qualità del DNA estratto utilizzando il metodo SSF e CTAB. Anche se si è scoperto che il DNA proveniente dall'estrazione SSF aveva una purezza inferiore a quella dell'estrazione CTAB, poteva soddisfare i requisiti della PCR e per l'analisi HRM nel riso. Tuttavia, va notato che il DNA dall'estrazione SSF non poteva essere conservato per molto tempo, quindi non è adatto per stabilire una biblioteca mutante permanente.

In uno studio precedente, campioni raggruppati con 1/8 di DNA mutante potrebbero essere differenziati da wild-type dall'analisi HRM in entrambe le popolazioni mutagenizzate gamma14,19. Considerando che le piante M2 potrebbero essere eterozigose per mutazioni indotte, è stato raccomandato il raggruppamento di quattro piante M2 per rilevare le mutazioni da HRM-TILLING.

Per ottenere più mutanti, è anche fondamentale sviluppare popolazioni mutagene con un'alta frequenza di mutazione. I raggi gamma hanno avuto un effetto significativo sulla crescita delle piante di M 1. È stato riferito che il trattamento con dose più elevata ha provocato una maggiore frequenza di mutanti carenti di clorofilla e prestazioni inferiori di fertilità, set di semi e altezza delle piante nelle piante di M2 18. Inoltre, si sapeva che la tolleranza ai mutageni variava tra diverse specie. Pertanto, la dose che ha portato a circa il 50% di letalità (LD50) nelle piante di M1 è stata considerata come la dose di irradiazione ottimale. Tuttavia, Li et al. ha scoperto diverse dosi di mutazione (165, 246 e 389 Gy) ha portato a tassi di mutazione simili nell'intero genoma mediante il riconcio, il che implicava che una dose bassa potrebbe essere applicata per generare mutazioni22.

Questo documento ha mostrato l'esempio di HRM-TILLING per lo screening della mutazione delle piante indotte dalla gamma. L'HRM-TILLING descritto in questo articolo dovrebbe essere applicabile anche per le mutazioni di screening nelle popolazioni mutagenizzate di EMS.

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Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto dal National Key Research and Development Program of China (n. 2016YFD0102103) e dalla National Natural Science Foundation of China (N. 31701394).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2× Taq plus PCR Master Mix Tiangen, China KT201 PCR buffer, dNTP and polymerase for PCR amplification
96-well plate Bio-rad, America MSP-9651 Specific plate for PCR in HRM analysis
Mastercycler nexus Eppendorf, German 6333000073 PCR amplification
LightScanner Idaho Technology, USA LCSN-ASY-0011 For fluorescence sampling and processing
CALL-IT 2.0 Idaho Technology, USA For analysis of the fluorescence change
EvaGreen Biotium, USA 31000-T Fluorescence dye of HRM
Nanodrop 2000 Thermo Scientific, USA ND2000 For DNA quantification

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References

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Li, S., Yu, Y. P., Liu, S. M., Fu, H. W., Huang, J. Z., Shu, Q. Y., Tan, Y. Y. Identifying Mutations by High Resolution Melting in a TILLING Population of Rice. J. Vis. Exp. (151), e59960, doi:10.3791/59960 (2019).

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