Summary
本稿では、ゲノムにおける高分解能融解分析(HRM)ベースの標的誘導局所病変(TILLING)として説明されているプロトコルを紹介する。この方法は、DNA二重の融解時の蛍光変化を利用し、挿入/欠失(Indel)および単塩基下属(SBS)の両方のハイスループットスクリーニングに適しています。
Abstract
ゲノムにおける標的誘発局所病変(TILLING)は、誘導変異のハイスループットスクリーニングのための逆遺伝学の戦略である。しかし、TILLINGシステムは挿入/欠失(Indel)検出の適用性が低く、従来のTILLINGはCEL Iヌクレアーゼ消化やゲル電気泳動のようなより複雑なステップを必要とします。スループットと選択効率を向上させ、インデルとシングルベース置換(SB)の両方のスクリーニングを可能にするために、新しい高解像度融解(HRM)ベースのTILLINGシステムが開発されました。ここでは、詳細なHRM-TILLINGプロトコルを提示し、変異スクリーニングにおけるその応用を示す。この方法は、高温での二本鎖DNAの変異を測定することにより、PCRアンプリコンの変異を解析することができる。HRM 分析は、追加の処理を行わずに PCR 後に直接実行されます。さらに、シンプルで安全で高速な(SSF)DNA抽出方法をHRM-TILLINGと統合し、インデルとSBの両方を識別します。そのシンプルさ、堅牢性と高いスループットは、米や他の作物の変異スキャンに潜在的に有用です。
Introduction
変異体は、植物機能ゲノミクスの研究と新品種の繁殖のための重要な遺伝資源です。フォワード遺伝学のアプローチ(すなわち、変異型の選択から遺伝子クローニングまたは多様性の発達まで)は、約20年前に誘発された突然変異を使用するための主かつ唯一の方法でした。McCallumら1による新しい逆遺伝学法の開発は、マッカラムら1による新しいパラダイムを開き、それ以来、多数の動植物種2に適用されている。TILLINGは、技術的に決定が困難または高価な形質(例えば、耐病性、ミネラル含有量)の繁殖に特に有用である。
TILLINGは当初、化学変異原(EMS1、3)によって誘導されるスクリーニング点変異のために開発された。これには、次の手順が含まれます: TILLING 人口の確立(s)。個々の植物のDNA調製とプール;標的DNA断片のPCR増幅;PCRアンプリコンの脱化およびアニーリングによるヘテロドプレックス形成およびCEL Iヌクレアーゼによる切断;変異体およびその特異的分子病変3,4の同定。ただし、この方法は比較的複雑で、時間がかかり、スループットが低い場合があります。より効率的で高いスループットを実現するために、削除ティリング(De-TILLING)(表1)1、3、5、6など、多くの変更されたTILLING方法が開発されています。 7,8,9,10,11,12.
DNA二重の融解中の蛍光変化に基づくHRM曲線分析は、変異スクリーニングおよびジェノタイピング13のためのシンプルで費用対効果の高い、ハイスループット法である。HRMは、EMS変異14によって誘導されるSBS変異をスクリーニングするためのHRMベースのティリング(HRM-TILLING)を含む植物研究に既に広く使用されている。ここでは、米中のγ(γ)線によって誘導される変異(インデルとSBSの両方)をスクリーニングするための詳細なHRM-TILLINGプロトコルを提示した。
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Protocol
1. 準備
-
γ線変異集団の開発
- 乾燥米種子約20,000種(水分含有量14%)γ照射施設(例えば、ガンマ細胞)で100 Gy(1 Gy/min)で137Csガンマ線を持つジャポニカ米ライン(例えば、DS552)の。
注:治療に使用される種子は、高い生存率を有する必要があります(例えば、発芽率>85%)。インディカ米の照射量は150 Gyに増加することができる。 - 苗木に発芽した後に照射された種子を播種し、苗を個別に水田に移植し、M1集団に成長させる。
注:M1プラントの直接播種は、人件費の削減にも応用できる。物理的または生物学的分離手段を使用して、他の米品種とのM1植物の交差を防ぎます。 - M1植物からM2種子をバルク収穫し、各M1パニックから1〜2種子を含み、M2集団を形成する。
注:実際には、簡略化のために、M1植物のすべての種子を収穫し、完全に混合した後、部分はM2母集団を形成するためにサンプリングされます。 - 室温で24(インディカライス)-36(ジャポニカライス)hのために水に約5,000 M2種子を浸します。その後、ペトリ皿の湿ったフィルターペーパー上で2日間37°Cで発芽する種子をしましょう。
注:より多くのM2種子を分析のために発芽させることができるので、変異体を同定する確率を高めることができる。 - 発芽した種子を小さな穴の付いた種子パネルに置き、吉田ら15から改変した培養液で3~4週間水耕栽培し、12時間光周期[昼間(30±2)°Cと夜間(24±2)°C]を用いたガラスハウスで栽培する。
- 乾燥米種子約20,000種(水分含有量14%)γ照射施設(例えば、ガンマ細胞)で100 Gy(1 Gy/min)で137Csガンマ線を持つジャポニカ米ライン(例えば、DS552)の。
- 葉組織のサンプリング:穴パンチャーを使用して、各播種の完全に伸びた葉から1枚のディスク(Φ〜2 mm)を同じ位置に切ります。
-
DNA抽出ソリューションの調製
- バッファA:5M NaOHの2mLと20%Tween 20の10 mLを追加し、50 mLの最終容積を作ります。DNA抽出前に緩衝Aを新たに調出す。
- バッファ B: 1 M トリス HCl (pH 8.0) の 20 mL と 0.5 M EDTA の 80 μL を追加し、最終的な体積を 100 mL にします。
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PCR プライマー
- HRM分析のためのプライマー:ソフトウェア(プライマープレミア5など)を使用してターゲットシーケンスを増幅するためのプライマーを設計し、商業企業によって合成します。
注:HRM は長いフラグメントの分析にあまり適用できないため、アンプリコンは 400 bp. フラグメントが高すぎる (>75%)または低すぎる (<25%)GC の内容は HRM 分析にも適していません。 - 品質管理のためのプライマー:Peng et al.16から12の米染色体に分布する24のSSRマーカーを使用してください。
- HRM分析のためのプライマー:ソフトウェア(プライマープレミア5など)を使用してターゲットシーケンスを増幅するためのプライマーを設計し、商業企業によって合成します。
2. DNA抽出
- 96ウェルPCRプレートの各ウェルに4枚のリーフディスクを入れ、バッファA溶液(50 mL/ウェル)を追加します。プレートを-80°Cの冷凍庫で10分間凍らせます。
- プレートを室温で凍結し、95°Cで10分間インキュベートします。
- 各ウェルに50μLのバッファBを加え、渦でよく混ぜます。
- 1,500 x gでプレートを1分間遠心分離します。上清はPCRの準備ができています。
3. PCR増幅
-
PCR の最適化
- 各PCRウェルに以下の試薬を加える:DNAの1 μL(ステップ2.4の上清)、2xマスターミックスの5 μL(2x PCRバッファー、4mmol/L MgCl 2、0.4 mmol/L 2'-デオキシリボヌクレオシド三リン酸(dNTP)、および50 U/mL Taq DNAALの各0μLμmol/Lプライマーは、ヌクレアーゼフリー水を使用して、最大10μLの最終容積を作ります。
- 勾配対応の熱ブロックを使用して、次の PCR プログラムを使用して各ターゲット フラグメントの最適なアニーリング温度を決定します: 94 °C で 5 分、94 °C で 30 s の 40 サイクル、52- 62 °C で 30 s (勾配温度)、および 72 °C で 30 s、8分間72°Cで最終的な延長および16 °Cでホールドと。
- 最適なアニール温度を決定するために、1%アガロースゲルのアンプリコンを調べます。
注:最適なアニーリング温度は、非特異的増幅およびプライマーダイマ化なしで、ターゲットフラグメントの特定の増幅を可能にする必要があります。
-
HRM 分析用 PCR
注:ステップ2.4に記載されているように抽出されたM2苗のHRM互換プレートおよびDNAがPCRに用いられる。- 1μLのDNA(上清)、2倍マスターミックスの5μL、10μmol/Lプライマーの0.2 μL、10倍の蛍光色素の1μLの最終体積でPcRを実行します。各プレートには、1つの野生型(WT)親子サンプルと1つの陰性(DNAなし)制御が含まれる。
- 蒸発を防ぐために、各井戸にミネラルオイルの滴を追加します。
- 粘着フィルムと遠心分離機でプレートを1分間1,000 x gで密封します。
- 最適化されたアニーリング温度を使用してPCRを実行します。
注:いくつかのケースでは、蛍光色素はPCR増幅に影響を与える可能性があり、したがって、色素は、PCRの完了後に添加されます。このような場合、色素は、ポストPCR変性およびアニールによってDNA鎖に組み込まれる。
4. HRMスキャンと突然変異確認
- 粘着フィルムをプレートから取り出し、プレートをHRMマシンに挿入します。
- ファイルメニューから[新規実行]を選択するか、画面上部の[実行]ボタンを押します。
- 55 °C から 95 °C までの溶融物の開始温度と終了温度を指定します。
注:最初の実行後、溶融温度の範囲は、特定のフラグメントについて決定することができます。したがって、溶融温度は、時間を節約するために、同じフラグメントの後続の分析のために調整することができます。 - 高解像度溶融解析用のサンプルを選択し、負のコントロールに似たサンプルを除外します。
- 溶融曲線を正規化して、蛍光の始まりと終わりが同じになります。[最小低]と[最大度下]温度カーソルがカーブの領域内にあることを視覚的に確認します。
- デフォルト設定の 0.05 に設定して、F (蛍光の差) レベルを維持します。
- 標準選択リストから[共通対バリアント]を選択し、[標準感度]を選択します。
- コントロールとして WT を使用します。WTからの≥0.05の≥F値を持つサンプルは、変異植物を含むものと見なされます。
-
変異植物の同定と確認
- 各変異プールが作られた4つの植物を識別します。
- アレンら17に係るCTAB法を用いて、これらの植物のそれぞれからDNAを抽出し、いくつかの改変を行う。
注:Dna品質はさらなるPCR増幅に十分であるため、アレンら17で説明したCTAB法を用いてDNAを抽出する場合、DNaseフリーRNaseおよびNaAcは使用されない。分光光度計を用いて定量した後、DNAを~25ng/μLの最終濃度に調整します。 - PCRプライマーを使用してターゲットフラグメントを増幅し、HRM分析と同じプログラムを使用します。
- アンプリコンのサンガーシーケンシングにより、特定の分子病変を同定する。
注:PCR増幅が完了したら、サンガーシーケンシングのためにアンプリコンを会社に送ってください。分子病変は、M2植物とWTとの配列を比較することによって同定することができる。
5. 分子マーカーによる選択した変異体の品質管理
- 24個のSSRマーカーに対して、25ngのゲノムDNA(CTABプロトコルを使用して抽出)、2倍マスターミックスの5μL、10 μM SSRプライマーのそれぞれ0.2 μLの最終容積でPCRを実行します。
- 次のプログラムを使用して PCR を実行します: 94 °C で 5 分、94 °C で 30 s の 30 サイクル、55 °C で 30 s、72 °C で 30 s、 72 °C で最終的な拡張 72 °C で 72 °C.
- 8%ポリアクリルアミドゲル上のアンプリコンを分離し、銀染色18によって増幅された断片の多型を明らかにする。
- 選択したバリアントの SSR ハプロタイプと WT を比較します。
注:誘発変異体は、多くの場合、そのWTと同一のSSRハプロタイプを有し、複数のSSRマーカーが変異体とWTの間で異なる場合、バリアントは誘発されるのではなく、遺伝的汚染物質(例えば、混合物または交差した植物)である可能性が高い。変異体18.
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Representative Results
HRM スキャンと分析
合計で、4,560M2苗から1,140個のプールされたDNAサンプルを製造し、PCR増幅を行った。OsLCT1とSPDTに対して 195 bp および 259 bp のサイズを持つ 2 つのフラグメントがそれぞれ増幅されました (表2)。ほとんどのサンプルは、WT(ΔF < 0.05)と有意に異なる溶融曲線を持っていました。WT (ΔF > 0.05) と有意に異なる HRM 曲線を、ソフトウェアによって WT とは異なる色でグループ化しました (図1)。
突然変異確認と頻度
個々の苗からのDNAサンプルを増幅に使用し、それぞれの断片を配列決定した。遺伝子の変異の種類と位置は、シーケンシングクロマトグラムによって確認することができました(図2)。2つのインデルと1つのSBSを含む3つの突然変異が4,560 M2苗から同定された(表2)。3つの変異部すべてが変異部位でヘテロジゴウスであることが判明した(図2)。
ここでの変異頻度は、TILLING集団においてゲノムに起こった変異の頻度と呼ばれる。以下の式に基づいて、変異頻度は約1/690kbに達することが判明した。
図1:OsLCT1(A,B)またはSPDT(C)遺伝子の変異に対するM2苗のHRM-TILLLING。 野生型は、蛍光差曲線の開発の基準として選ばれた。変異体は、それぞれ90.0-92.0 °Cおよび81.5-83.5 °Cの温度でΔFs > 0.05で有意に異なるHRM曲線を示した。この図は Li et al.19から変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:変異体の標的断片のクロマトグラムのシーケンシング長方形のボックスは、OsLCT1の4304 bpでG→Aの変異を有するヘテロ接合部を示す(A)。OsLCT1の4240 bpでの単一ヌクレオチドA挿入は、矢印(B)で示される。SPDTの5948-5950 bpの位置にあるTTCトリヌクレオチド欠失は、黒い線(C)で示される。この図は Li et al.19から変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 省略 形 | フルネーム | 利点または適用性 | 欠点 | 参照 |
| 伝統的なティリング | ゲノムにおける誘導局所病変の標的 | スクリーニングポイント変異用 | 時間とコストがかかる | マッカラムら, 2000;ティルら, 2003 |
| エコティリング | エコタイプティリング | 自然集団における変異のスクリーニングについて | 高価で低い感受性 | コマイら, 2004 |
| 脱ティリング | 削除ティリング | 大規模な削除スクリーニングの場合 | 良好なPCRシステムに強く依存 | ロジャースら, 2009 |
| イティリング | 個別化されたティリング | パーソナライズされたTIILLING集団を用いた変異の同定 | 永続的な人口ではない | ブッシュとクリサン、2010年 |
| DHPLC ティリング | 高性能液体クロマトグラフィー-ベースのティリングを脱電 | 時間の節約 | 低スループット | コラスオンノら, 2016 |
| セク・ティリング | シーケンスによるティリング | 高スループット、非酵素システム | 比較的高価で、偽陽性が高い | Tsaiら, 2011;クマールら, 2017 |
| HRM-ティリング | 高解像度溶融ティリング | 高いスループットと時間の節約。非酵素系 | PCR フラグメントの長さの制限 | ドンら, 2009;ガディら, 2009 |
表 1: さまざまな TILLING アプローチの長所と短所。
| 遺伝子名 | ジーン・ロチ | 遺伝子機能 | プライマーシーケンス(5'-3') | 最適化後の Tm (°C) | 製品サイズ (bp) | 突然変異の数(変異タイプ) | ||
| オスルト1 | LOC_Os06g38120 | 低カドミウムトランスポーター | LCT-F: CTCGATGAGAGCATGCCC LCT-R: アガグタガアCGGCGCTAC | 61 | 195 | 2 (G-A 遷移、1-bp 挿入) | ||
| Spdt | LOC_Os06g05160 | SULTR様リン分布トランスポーター | SPDT-F: TTCTCGGAGGAGGCTAAT SPDT-R: CCACGCATTCTGGTTACAT | 52 | 259 | 1 (3 bp 削除) | ||
表2:2つの標的遺伝子、PCR増幅および変異の情報が同定された。
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Discussion
TILLINGは、遺伝子機能解析および作物の繁殖のために誘導された変異を同定するための強力な逆遺伝的ツールであることが証明されています。容易に観察または決定されないいくつかの形質のために、高スループットPCRベースの変異検出を用いたTILLINGは、異なる遺伝子の変異体を得るのに有用な方法であり得る。HRM-TILLING法は、変異スクリーニングのためにトマト12、小麦11およびブドウビン20のEMS変異集団で使用されている。本論文では、インデルとSBS変異スクリーニングの両方に適用可能な、よりシンプルで強力なHRM-TILLINGを実証した。
効率を向上させるために、DNは、時間と労力を要し、有毒な化学薬品を必要とする通常のCTAB法の代わりにSSF法を用いて抽出した。Siら21は、SSFおよびCTAB法を用いて抽出したDNAの品質を比較した。SSF抽出のDNAはCTAB抽出に劣る純度を持つことがわかったが、米のPCRとHRM分析の要件を満たすことができる。しかし、SSF抽出からのDNAは長期間保存できなかったため、永久変異体ライブラリーの確立には適さない。
以前の研究では、1/8変異DNAを持つプールされたサンプルは、EMSおよびガンマ変異集団14、19の両方におけるHRM分析によって野生型と区別され得た。M2植物が誘発変異に対してヘテロジゴウスである可能性があることを考慮すると、HRM-TILLINGによる変異を検出するために4つのM2植物のプールが推奨された。
より多くの変異体を得るためには、高い変異頻度を有する変異型集団を開発することも重要である。ガンマ線はM1植物の増殖に大きな影響を与えた。高用量での治療は、クロロフィル欠損変異体の頻度の増加およびM2植物18における生殖能力、種子セットおよび植物高さの劣った性能をもたらしたことが報告されている。さらに、変異原に対する耐性は種によって異なえることが知られていた。従って、M1植物における約50%の致死性(LD50)をもたらす用量は、最適な照射用量と考えた。しかしながら、Liらは異なる変異用量(165、246および389 Gy)を見つけ、再配列によってゲノム全体に同様の変異率をもたらし、低用量を暗示して変異22を生成することを暗示した。
本論文では、ガンマ誘導植物の変異スクリーニングに対するHRM-TILLINGの例を示した。本論文で説明するHRM-TILLINGは、EMS変異集団における変異のスクリーニングにも適用可能である。
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Disclosures
著者らは、利益相反がないと宣言している。
Acknowledgments
この研究は、中国国家主要研究開発プログラム(No.2016YFD0102103)と中国国家自然科学財団(No.31701394)によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2× Taq plus PCR Master Mix | Tiangen, China | KT201 | PCR buffer, dNTP and polymerase for PCR amplification |
| 96-well plate | Bio-rad, America | MSP-9651 | Specific plate for PCR in HRM analysis |
| Mastercycler nexus | Eppendorf, German | 6333000073 | PCR amplification |
| LightScanner | Idaho Technology, USA | LCSN-ASY-0011 | For fluorescence sampling and processing |
| CALL-IT 2.0 | Idaho Technology, USA | For analysis of the fluorescence change | |
| EvaGreen | Biotium, USA | 31000-T | Fluorescence dye of HRM |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific, USA | ND2000 | For DNA quantification |
References
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