Summary
В этом исследовании мы представляем протокол для извлечения кортизола из плавника и челюстной кости видов осетровых. Уровни фин и кортизола челюстной кости были дополнительно изучены путем сравнения двух стиральных растворителей, за которыми следуют анализы ELISA. Это исследование пилотировало осуществимость кортизола челюсти в качестве нового индикатора стресса.
Abstract
Целью данного исследования было разработать методику извлечения кортизола из осетровых плавников с использованием двух стиральных растворителей (вода и изопропанол) и количественно определить любые различия в уровнях фин кортизола между тремя основными видами осетровых. Фины были собраны из 19 жертвенных осетровых, включая семь белуги(Huso huso),семь сибирских (Acipenser baerii), и пять севруга (A. stellatus). Осетровые были выращены на иранских фермах в течение 2 лет (2017-2018 гг.), а анализ добычи кортизола проводился в Корее (январь-февраль 2019 года). Челюсти из пяти H. huso также использовались для извлечения кортизола. Данные анализировались с помощью общей процедуры линейной модели (GLM) в среде SAS. Коэффициенты вариации внутри- и меж-асса составили соответственно 14,15 и 7,70. Короче говоря, метод извлечения кортизола включал мытье образцов (300 и 10 мг) с 3 мл растворителя (ультрачистая вода и изопропанол) дважды, вращение при 80 об/мин в течение 2,5 мин, высыхание промытых образцов при комнатной температуре (22-28 градусов по Цельсию) в течение 7 дней, дальнейшую сушку образцы с использованием бисера бисера на 50 Гц в течение 32 минут и измельчения их в порошок, применяя 1,5 мл метанола к сушеным порошка (75 х 5 мг), и медленное вращение (40 об/мин) в течение 18 н.ч. при комнатной температуре с непрерывным смешиванием. После извлечения, образцы были центрифугированы (9500 х г в течение 10 мин), и 1 мл супернатанта был перенесен в новую микроцентрифугую трубку (1,5 мл), инкубировали при 38 градусах Цельсия, чтобы испарить метанол, и проанализированы с помощью фермента связанных иммуносорбент анализа (ELISA) . Никаких различий в уровнях кортизола фина среди видов или в плавники и челюстной кости кортизола уровнях между мытья растворителей. Результаты этого исследования показывают, что матрица челюстной кости осетровых является перспективным альтернативным индикатором стресса для твердых матриц.
Introduction
Кортизол является надежным индикатором стресса животных. Извлечение кортизола обеспечивает действительную основу для исследователей для мониторинга уровней стресса и общих закономерностей в стрессорах. Например, предыдущие исследования провели методологическую проверку измерений кортизола волос с использованием различных методов у людей1,2, обезьяны 3,4,крупного рогатого скота5,овец6,и золотая рыбка7,8. В видах рыб, кортизол измерения в матрицах, таких как весы, слизь кожи, кала, и кровь9 было показано, чтобы обеспечить информацию о здоровье рыбы. Когда отбор проб крови является проблематичным или весы отсутствуют, альтернативные матрицы для извлечения кортизола необходимы. В рыбе, альтернативные матрицы могут включать челюстную кость, твердую ткань, похожую на человеческий зуб10.
Разработка новых матриц и проверенных методов определения уровня стресса рыбы представляет особый интерес для икры промышленности, где осетр может испытывать длительное воздействие факторов экологического стресса11. Пол осетровых не может быть определен до 2 лет, а у осетровых нет чешуи. Потому что кортизол постепенно накапливается в твердых матриц во время стадии роста2,7,12, долгосрочные данные накопления кортизола из твердых матриц, таких как плавники и челюстные кости могут обеспечить понимание стресса на разных стадиях роста. В отличие от этого, уровни кортизола в крови обеспечивают снимок уровня стресса во время смерти и не может точно представлять стресс во время длительных условий воспитания13,14. С ростом конкуренции на рынке икры все более важной областью исследований становятся новые подходы к улучшению стрессовых условий для производства более здоровых яиц среди видов осетровых при длительном выращивании (8-12 лет и более лет). Из-за высокой стоимости осетровых, собранные образцы являются чрезвычайно дорогостоящими ($ 8000-15000 за взрослую рыбу в зависимости от видов и стадии роста), ограничивающим фактором для научно-исследовательских проектов. Однако разработка соответствующего метода извлечения кортизола из осетровых плавников и челюстных костей может быть с пользой применена как к системам рыбоводства, так и к дикой рыбе для улучшения качества и сбора осетровых яиц как для потребления, так и для потребления Сохранения.
Помимо предоставления надежных результатов6, выбор соответствующего метода извлечения кортизола имеет решающее значение для обеспечения того, чтобы другие соединения, присутствующие в матрице во время подготовки образца, не смужают выход, что может привести к противоречивые результаты. Не менее важно определить, влияют ли уровень плавника и кортизола челюстной кости уровень гормонов в окружающей воде. Хаймбюрге и др.15 предположили, что ряд факторов может повлиять на уровень кортизола, включая возраст, пол, беременность, сезон, цвет12, и область тела, из которой кортизол извлекается16. Тем не менее, мало информации имеется о влиянии стирки растворителей на добычу кортизола в матрицах тела рыб8, и ни на эти эффекты у осетровых, за исключением осетровых яиц17.
Хотя анализ базовых уровней кортизола из плавников и челюстных костей осетровых требует, чтобы рыба была усыплена, этот подход не влечет за собой инвазивных методов, необходимых для взятия проб крови у живого осетра. Образцы фин и челюстной кости легко собираются, и извлечение из этих тканей может быть выполнено быстро. Аналогичным образом, экстракция гормонов и анализ являются простыми и требуют мало специализированного оборудования.
В этом исследовании мы представляем новую и легко применяемую технику для извлечения, мытья и определения кортизола из рыбных плавников и челюстных костей, с целью определения того, могут ли уровни кортизола, измеренные из этих матриц, надежно использоваться в качестве стресса Показатели. Преимущества этого метода включают простой и неинвазивный подход8, меньше вариации данных, и надежный выход1,6,8,17; этот метод применим к видам рыб без чешуи, такой как осетр. Техника требует забоя рыбы, выбора соответствующих растворителей для мытья2,4,правильной шлифовки образцов3,5,профессионального ферментосвязанного иммуносорбента (ELISA) применение5,7, и обширные знания о включении источников кортизола в твердые матрицы6.
Мы применили два различных растворителя стирки (ультрачистая вода и изопропанол) для получения базального кортизола в плавниках от трех видов осетровых: белуги (Huso huso), Сибирский (Acipenser baerii), и sevruga (A. stellatus ), в стандартных условиях окружающей среды для каждого вида. Челюсти H. huso также использовались для оценки стресса у осетровых. Это первое исследование для измерения уровня кортизола в осетровых челюстных костях. Результаты этого исследования позволят предоставить сравнительные данные кортизола для видов осетровых на ранней стадии роста (1 год) до определения пола.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Следующие экспериментальные процедуры и методы были одобрены Управлением по защите и этике животных Национального университета Канвондо, Чунчхон, Республика Корея.
1. Фин коллекция
- Захват осетровых осторожно с помощью сети, чтобы свести к минимуму травмы и стресс.
- Тщательно промыть рыбу пресной водой, а затем протрите поверхность тела абсорбирующим полотенцем перед эвтаназии.
- Ударить по голове рыбы с помощью пластикового молотка так, чтобы рыба была ошеломлена или потеряла сознание. Снимите голову ножом.
- Измерьте массу тела (г) и длину (см).
- После эвтаназии соберите образцы плавника, разрезая как можно ближе к телу с помощью стерилизованных хирургических ножниц.
ПРИМЕЧАНИЕ: Индивидуальные, не переработанные абсорбирующими полотенцами должны быть использованы для каждой рыбы. Описательная статистика по видам, использованным в данном исследовании, была следующей: белуга осетр (H. huso): возраст No 18 и 2,1 месяца, масса тела - 2700 и 300 г, а длина тела - 55 и 5 см; Сибирский осетр(A. baerii): возраст 9,6 и 2,4 месяца, масса тела - 1750 и 250 г, а длина тела - 45 и 5 см; севруга осетр(A. stellatus): возраст No 14 и 1,3 месяца, вес тела - 1000 и 100 г, а длина тела - 65 и 5 см.
2. Подготовка финдля извлечения кортизола
- Поместите образцы плавника (один образец на ткань: 3 г) на лабораторную бумагу для взвешивания (107 мм и 210 мм) и высушите при комнатной температуре в течение нескольких дней до высыхания.
- Оберните образцы в листы алюминиевой фольги, поместите в маркированные полиэтиленовые пакеты и перенесите в лабораторию.
- Храните образцы в холодильнике для дальнейшего использования, включая мойку, извлечение кортизола, сушку и анализ ELISA(рисунок 2).
3. Анализ фин кортизола
- Откалибровать цифровую аналитическую шкалу (точность: 0.0001) и взвесить 300 и 10 мг образцов с вешной бумагой на сковороде шкалы.
- Вымойте образцы.
- Перенесите каждый образец в 15 л конической полипропиленовой трубки. Добавьте 3 мл изопропанола к каждой трубке, используя одноканальный пипетку мощностью 5000 л.
- Поверните трубки при 80 об/мин в течение 2,5 мин, чтобы промыть кортизол и удалить любое потенциальное внешнее загрязнение. Повторите эту процедуру дважды.
- Воздушно-сухие промытые образцы при комнатной температуре (22-28 градусов по Цельсию) в течение 7 дней.
- Повторите процедуру мытья, используя ультрачистую воду в качестве стирального средства.
- Извлеките челюстную кость из ткани тела с помощью костяных щипцы. Нанесите шаги 1.5-3.2.4 на образцы челюстной кости.
- Взвесьте (75 х 5 мг) сушеные образцы плавника или челюстной кости и измельчите с помощью бисера на 50 Гц в течение 32 мин.
- Доставьте 1,5 мл метанола в каждую трубку, содержащую порошковый плавник или челюстную кость с помощью 1000-й пипетки. Поместите образцы на трубчатый ротатор при медленном вращении (40 об/мин) в течение 18 ч при комнатной температуре для извлечения кортизола с непрерывным смешиванием.
- После извлечения кортизола, центрифуга образцов на 9500 х г в течение 10 минут при комнатной температуре. После центрифугации соберите верхний органический слой, содержащий кортизол (1 мл) из каждого образца и поместите его в отдельную микроцентрифугную трубку размером 1,5 мл.
- Высушите образцы инкубации при 38 градусах Цельсия, чтобы испарять метанол. Держите извлеченные образцы кортизола под дымом капот на ночь, чтобы метанол рассеяться.
ПРИМЕЧАНИЕ: Кортизол-содержащий слой, как правило, желтоватого цвета.
- Высушите образцы инкубации при 38 градусах Цельсия, чтобы испарять метанол. Держите извлеченные образцы кортизола под дымом капот на ночь, чтобы метанол рассеяться.
4. Обнаружение фин кортизола
- Отморозка сушеных плавников или образцов челюстной кости при комнатной температуре 1,5 ч до использования комплекта ELISA.
- Добавьте 400 л фосфатного буфера, вихря и центрифуги при 1500 х г в течение 15 мин.
- Запустите каждый образец (25 л) в дублировать, чтобы улучшить точность и надежность анализов. Удалите любые данные за пределами стандартной кривой в качестве выбросов.
- Установите микроплитустого считывателя до 450 нм, затем установите мкг dL-1 и прочитайте оптическую плотность пластины.
- Используйте программное обеспечение микроплиты с четырехпарал-нелинейной кривой регрессии. Преобразуйте уровни кортизола в образцах, полученных из программного обеспечения, в pg mg-1 с помощью следующего уравнения:
F 10,000E (A/B) (C/D),
где F - окончательное значение уровня кортизола плавника в (pg mg-1), E - объем (мл) буфера асссе, используемого для воссоздания высушенного экстракта, А - концентрация (мкг dL-1),предусмотренная выходом асссе, B - вес (мг) плавника, подвергаемый дополнительному стека, C - объем (мл) метанола, добавленного в порошковый плавник, и D - объем (мЛ) метанола, извлеченного из экстракта и впоследствии высохшего3.
- Используйте программное обеспечение микроплиты с четырехпарал-нелинейной кривой регрессии. Преобразуйте уровни кортизола в образцах, полученных из программного обеспечения, в pg mg-1 с помощью следующего уравнения:
5.Статистический анализ
- Разделите каждый образец на два подобразца до процедуры стирки, а затем запустите дубликат во время анализа комплекта ELISA (2 - 2 и 4 наблюдения за образцом) для повышения мощности теста и надежности результатов.
- Сравните эффекты двух стиральных растворителей и их взаимодействия, применяя общую линейную модель (GLM) процедуру в среде программного обеспечения SAS к данным измерений18.
- Различия в тестах между средствами, использующими тест Tukey, на уровне значимости p qlt; 0.05. Примите 0,05 зл/ р/с; 0,10 как свидетельство тенденции, а не как существенную разницу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Представленная методика извлечения кортизола была разработана и подтверждена в данном исследовании с использованием трех видов осетровых. Уровни кортизола, полученные с помощью ультрачистой воды и изопропанола, как стиральные растворители были сопоставлены(рисунок 2). Кортизол из челюстных костей H. huso был исследован, чтобы определить, могут ли осетровые челюстные кости использоваться в качестве альтернативной матрицы плавников. Эффекты стирки растворителя, видов осетровых, и их взаимодействие показаны в таблице 1. Уровни кортизола, как правило, выше в образцах плавника, промываемых изопропанолом, чем в промытых водой (р 0,089). Существенных различий в уровнях фарватора кортизола (р- 0,525) среди видов осетровых не наблюдалось. Не было существенного взаимодействия между растворителями стирки и видами осетровых (стр. 0,947). Стиральный растворитель не оказал существенного влияния на уровень кортизола у осетровых h. huso (р- 0,45)(таблица 2). Коэффициенты внутриаспокоивных и межассозами вариации составляли соответственно 14,15 и 7,70. Данные показали высокое сходство между плавниками трех видов осетровых(таблица 1) и в Челюстных костях H. huso (таблица 2). Мы не исследовали корреляции между уровнями кортизола в челюстных костях и в плавниках различных видов осетровых, потому что мы получили образцы челюстной кости только от H. huso. Эти отношения должны быть изучены в будущем исследовании.
Рисунок 1. (A) Фотография осетровых huso huso Huso (10 лет). (B) Морфологические характеристики осетровых. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2. Инфографика анализа fin кортизола5,6 выполнена в лаборатории. Все фотографии, представленные в инфографике абстрактного были приняты в лаборатории. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Виды осетровых (SS) | Растворитель стирки (WS) | P-значение | ||||||||
| Huso huso | Acipenser baerii | Acipenser stellatus | Sem | Воды | Изопропанол | Sem | Ss | Ws | СС-ВС | |
| Кортизол (пг мг-1) | ||||||||||
| 3.46 | 2.85 | 3.34 | 0.41 | 2.86 | 3.69 | 0.33 | 0.52 | 0.08 | 0.95 | |
Таблица 1. Уровни фин кортизола у трех видов осетровых, полученных с помощью двух различных растворителей для мытья.
| Растворитель стирки (WS) | Sem | P-значение | ||
| Воды | Изопропанол | |||
| Кортизол (пг мг-1) | 1.11 | 1.43 | 0.31 | 0.45 |
Таблица 2. Уровни коризола челюсти у белухи(Huso huso) с помощью двух различных растворителей для мытья.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Осетр иногда называют "живой ископаемого", потому что он показал несколько адаптаций на протяжении последних тысячелетий. Осетровый род Acipenser содержит 27 видов, которые производят икру; однако, три вида (белуга, баэрии и севруга) производят большую часть мирового предложения икры. Осетрина уязвимы для чрезмерного рыболовства и вмешательства в их естественную среду обитания и поэтому находятся под угрозой исчезновения, чем любая другая группа видов. Осетрина относится к древнейшей группе живых позвоночных, которая существует уже 150 миллионов лет. Acipenser видов созревают и растут медленно; некоторые (например, H. huso)могут жить в течение 100 лет и превышать 2000 кг в весе. Осетрина хрящевая рыба без чешуи, и характеризуются пятью рядами больших костлявых пластин, называемых скатами и тактильными колючками, расположенными в передней части рта(рисунок 1). Физиологические различия между этими видами и другими рыбами включают снижение плазмы (кортикостероидов) реакции на экологические стрессоры. Наши измерения плавника кортизола свидетельствуют о том, что челюстная кость осетровых аккумулирует кортизол пропорционально циркулирующим концентрациям.
Рыбы отображают многочисленные реакции на физические, химические и воспринимаемые стрессоры. Эти реакции хорошо известны как адаптивные механизмы, которые позволяют рыбе справиться с нарушениями окружающей среды и поддерживать гомеостатическое состояние. Если стрессор достаточно длительный или серьезный, что рыба не в состоянии восстановить гомеостаз с помощью своих естественных реакций, то рыба может испытывать неблагоприятные последствия, ставя под угрозу его общее состояние здоровья и / или жизни19. Пол осетровых можно определить примерно с 2 лет. Поэтому, чтобы определить, связаны ли уровни кортизола и пол осетровых, необходимо задокументировать длительное накопление кортизола в плавниках и челюстных костях (в качестве нового подхода и альтернативной матрицы) осетровых. Это исследование является первым сообщить плавник и челюсть кортизола уровнях у осетровых.
Роль растворителя мытья кортизола заключается в удалении внешних источников кортизола из слизи кожи9. Aerts et al.14 использовали дистиллированную воду для удаления внешнего загрязнения кортизола из кожи рыбы; в предыдущих исследованиях2,5,12,17, мы сравнили эффекты использования изопропанола и воды в качестве растворителя для изучения содержания кортизола волос. Эффекты мытья растворителя могут варьироваться между образцами из-за различий в свойствах осетровых яиц13,кожи15,плавники, и челюстные кости. Brossa7 сообщил, что уровень кортизола в масштабах золотой рыбки(Carassius auratus) оставался неизменным, когда изопропанол был использован в качестве растворителя независимо от количества мойки, в то время как уровень кортизола менялся, когда вода была использована. Наши результаты показали, что стиральный растворитель не влияет на уровень кортизола челюсти. Различия между этими исследованиями включают количество стир, тряски против вихря, чистоту изопропанола, и, что важно, чувствительность или устойчивость чешуи/кожи к внешнему проникновению жидкости. Ghassemi Nejad et al.20 продемонстрировали, что применение различных анализов, таких как РИА и ELISA, может привести к различиям в выходе. Стероиды более растворимы в спиртах с низкой молекулярной массой (например, метанол), чем в спиртах с более высоким молекулярным весом, таких как изопропанол4. Добыча метанола денатурирует белок, нарушая нековалентные связи, тем самым позволяя высвобождение кортизола для волос. Метанол также изменяет структуру гормонов, нарушая нековалентные связи, что приводит к высвобождению кортизола из тканей. Для эффективного гомогенизации осетровых плавников и челюстей до извлечения метанола, бисер может быть использован для эффективного разрушить структуру ткани. Эта процедура требует времени, чтобы полностью измельчить плавник и образцы челюстной кости; поэтому процесс должен быть повторен, чтобы обеспечить полную распыление и гомогенизацию до извлечения кортизола. Медленное вращение в течение 18 ч позволяет постепенно еснять кортизол путем мытья.
Как предлагалось в предыдущих исследованиях волос млекопитающих4,5,6, внешние или внутренние источники содержания кортизола в плавниках и челюстях, кроме крови, не следует пренебрегать. Хотя это исследование не было специально разработано, чтобы исследовать, как кортизол диффундирует от крови к плавникам или челюстям, оно подчеркивает необходимость расширения наших знаний об этом процессе, чтобы лучше интерпретировать колебания кортизола из этих матриц. Свойства плавников и челюстных костей отличаются от чешуи и кожи. Bussy et al.17 количественные уровни кортизола в озере осетровых(A. fulvescens) яйца для исследования воздействия окружающей среды на материнское физиологическое состояние и качество яиц. Они использовали метил-терт-бутилеттер (MTBE), этиловый ацетат (AcOEt) MTBE и диэтил-эфир (Et2O) в качестве стиральных растворителей и пришли к выводу, что этиловый ацетат является лучшим растворителем извлечения с точки зрения восстановления и матричного эффекта. В настоящем исследовании изопропанол удалил большее количество внешнего кортизола из слизи кожи во время мытья, что привело к небольшой переоценке кортизола из осетровых плавников, которые должны быть тщательно рассмотрены при интерпретации результатов добычи. Вполне возможно, что изопропанол был в состоянии промыть кожу плавника, как было сообщено в предыдущем исследовании7. Изопропанол, как известно, проникают волосяные фолликулы и рыбьи чешуйки4,7. Результаты настоящего исследования показывают, что выбор растворителя не оказал существенного влияния на уровень кортизола, что свидетельствует о том, что извлечение кортизола может быть более трудным в некоторых частях плавника, чем в других с использованием ультрачистой воды; в таких случаях, изопропанол может быть использован в качестве альтернативы.
Это исследование продемонстрировало применимость челюстной кости в качестве новой матрицы для надежного указания стресса у осетровых. Значения кортизола h. huso были аналогичны значениям, извлеченным из плавников одного и того же вида; будущие исследования должны подтвердить этот результат среди различных видов, возрастов и полов с помощью корреляции анализа. Небольшое количество рыбы было использовано в текущем исследовании из-за высокой стоимости осетровых; мы попытались преодолеть это ограничение, проверив каждый образец дважды, а также дублируя добычу метанола для ELISA. Использование четырехкратного умножения может увеличить мощность теста для покрытия низкого числа образцов.
Мы пришли к выводу, что тип стирального растворителя умеренно повлиял на извлечение кортизола из плавников, но не челюстей, осетровых. Прежде чем обобщать заключение этого исследования и проверять эти результаты, следует провести дальнейшие исследования с использованием различных видов и растворителей. Нынешняя работа дает доказательства того, что челюстная кость осетровых может быть применена в качестве альтернативной матрицы в будущих исследованиях с использованием кортизола в качестве индекса стресса у осетровых. В настоящем исследовании также была продемонстрирована пригодность ELISA для измерения плавника и кортизола челюсти. Будущие исследования должны быть сосредоточены на двух аспектах: 1) определение корреляции между уровнями кортизола в челюстных костях и в плавниках осетровых и 2) уборка матрицы образцов для измерения кортизола из старых рыб и их икры для определения долгосрочного стресса уровень различных видов осетровых в течение всей жизни.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют конфликта интересов раскрыть.
Acknowledgments
Эта работа была проведена при поддержке Программы совместных исследований в области сельского хозяйства науки и развития технологий (название проекта: Анализ изменения продуктивности животноводства с изменением климата, Проект No. PJ012771), Управление развития сельских районов, Республика Корея. Кроме того, это исследование было поддержано грантом (Нет. PJ01344604) от команды по питанию и физиологии животных, Национальный институт наук и животных, RDA, Сеул, Республика Корея. Авторы с благодарностью признают персидского жеста генеральный директор Мохаммад Хасан Салманзаде и его команда, которая предоставила рыбу из трех видов осетровых рассмотрены в этом исследовании.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Disposal latex surgical gloves | Ansell | 63754090 | |
| Platform scale-electronic weighing 100kg | Baskoolnikoo | 101 EM | |
| Serological pipette to deliver up to 24 mL | Becton Dickinson Falcon | 35-7550 | |
| Micro plate reader with 450 nm and 490 to 492 nm reference filters | BioTek | 8041000 | |
| Reagent reservoirs | BrandTech | 703459 | |
| Zipper storage plastic bag | Cleanwrap | 30cm x100m | |
| Isopropyl alcohol | Daejung chemicals & Metals | 5035-4400 | |
| Methyl alcohol | Daejung chemicals & Metals | 5558-4100 | |
| Tube rotator- MX-RL-Pro | DLAB Scientific | 824-222217777 | |
| Precision pipette to deliver 1.5 and 10 mL | Eppendorf Research Plus | M21518D | |
| Precision pipette to deliver 15 and 25 μL | Eppendorf Research Plus | R25623C | |
| Weighing paper (107 x 210 mm) | Fisherbrand | 09-898-12B | |
| Bead beater, 50/60 Hz 2A | GeneReach Biotechnology Corp | tp0088 | |
| Plate rotator with orbit capable of 500 rpm | Hangzhou Miu Instrument | MU-E30-1044 | |
| Disposable polypropylene tubes to hold at least 24 mL | Hyundai Micro | H20050 | |
| Fume hood | Kwang Dong Industrial | KD 901-22128175 | |
| Micro-centrifuge capable of 1500 x g | Labo Gene | 9.900.900.729 | |
| Mini vortex mixer | LMS | VTX-3000L | |
| Lotte aluminum foil roll | Lotte Aluminum | B0722X5FK5 | |
| Digital scale | Mettler Toledo | ME204 | |
| Ultrapure water | MDM | MDM-0110 | |
| Pipette tips | Neptune Scientific | REF 2100.N | |
| Large fish net | Pond H2O | Hoz135 | |
| Salivary cortisol kit | Salimetrics | 1-3002-4 | |
| Bone cutting forceps | Sankyo | 26-188A | |
| Precision multichannel pipette to deliver 50 μL and 200 μL | VITLAB | 18A68756 | |
| Towel | Yuhan Kimberly | 1707921546 | |
| Tissue paper (107 × 210) | Yuhan Kimberly | 41117 |
References
- Meyer, J. S., Novak, M. A. Hair cortisol: a novel biomarker of hypothalamic-pituitary- adrenocortical activity. Endocrinology. 153, 4120-4127 (2012).
- Ghassemi Nejad, J., et al. A cortisol study: facial hair and nails. Journal of Steroids Hormonal Sciences. 7, 1-5 (2016).
- Meyer, J. S., Novak, M. A., Hamel, A., Rosenberg, K. Extraction and analysis of cortisol from human and monkey hair. Journal of Visualized Experiments. (83), e50882 (2014).
- Davenport, M. D., Tiefenbacher, S., Lutz, C. K., Novak, M. A., Meyer, J. S. Analysis of endogenous cortisol concentrations in the hair of rhesus macaques. General and Comparative Endocrinology. 147, 255-261 (2006).
- Ghassemi Nejad, J., Ataallahi, M., Park, H. K. Methodological validation of measuring Hanwoo hair cortisol concentration using bead beater and surgical scissors. Journal of Animal Science and Technology. 61, 41-46 (2019).
- Ghassemi Nejad, J., et al. Wool cortisol is a better indicator of stress than blood cortisol in ewes exposed to heat stress and water restriction. Animal. 8, 128-132 (2014).
- Brossa, A. C. Cortisol in skin mucus and scales as a measure of fish stress and habitat quality. Ph.D. dissertation. , Faculty of Veterinary Medicine, Universitat Autonoma de Barcelona. Ph.D. dissertation (2018).
- Carbajal, A., et al. Cortisol detection in fish scales by enzyme immunoassay: biochemical and methodological validation. Journal of Applied Ichthyology. 34, 1-4 (2018).
- Bertotto, D., et al. Alternative matrices for cortisol measurement in fish. Aquaculture Research. 41, 1261-1267 (2010).
- Ghassemi Nejad, J., Jeong, C., Shahsavarani, H., Sung, I. K., Lee, J. Embedded dental cortisol content: a pilot study. Endocrinology & Metabolic Syndrome. 5, 240 (2016).
- Pankhurst, N. W. The endocrinology of stress in fish: an environmental perspective. General and Comparative Endocrinology. 170, 265-275 (2011).
- Ghassemi Nejad, J., Kim, W. B., Lee, B. H., Sung, K. I. Coat and hair color: hair cortisol and serotonin levels in lactating Holstein cows under heat stress conditions. Animal Science Journal. 88, 190-194 (2017).
- Baker, M. R., Gobush, K. S., Vynne, C. H. Review of factors influencing stress hormones in fish and wildlife. Journal of Nature Conservation. 21, 309-318 (2013).
- Aerts, J., et al. Scales tell a story on the stress history of fish. PLoS One. 10, e0123411 (2015).
- Heimbürge, S., Kanitz, E., Otten, W. The use of hair cortisol for the assessment of stress in animals. General and Comparative Endocrinology. , 10-17 (2019).
- Ghassemi Nejad, J., et al. Comparing hair cortisol concentrations from various body sites and serum cortisol in Holstein lactating cows and heifers during thermal comfort zone. Journal of Veterinary Behavior: Clinical and Application Research. 30, 92-95 (2019).
- Bussy, U., Wassink, L., Scribner, K. T., Li, W. Determination of cortisol in lake sturgeon (Acipenser fulvescens) eggs by liquid chromatography tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography B. 1040, 162-168 (2017).
- SAS. 1999. SAS. User's Guide (Version 8.01 Edition). , SAS Inst. Inc. Cary, NC, USA. (1999).
- Barton, B. A. Stress in fishes: a diversity of responses with particular reference to changes in circulating corticosteroids. Integrative and Comparative Biology. 42, 517-525 (2002).
- Ghassemi Nejad, J., et al. Measuring hair and blood cortisol in sheep and dairy cattle using RIA and ELISA assay: a comparison. Biological Rhythm Research. Accepted. , (2019).
