Summary
Dans cette étude, nous présentons un protocole pour l'extraction de cortisol de la nageoire et de la mâchoire des espèces d'esturgeons. Les niveaux de cortisol de fin et de mâchoire ont été plus loin examinés en comparant deux solvants de lavage suivis des essais d'ELISA. Cette étude a mis à l'essai la faisabilité du cortisol de mâchoire comme indicateur de stress nouveau.
Abstract
Les objectifs de cette étude étaient de développer une technique pour l'extraction du cortisol à partir d'ailerons d'esturgeon à l'aide de deux solvants de lavage (eau et isopropanol) et de quantifier les différences dans les niveaux de cortisol des nageoires parmi trois principales espèces d'esturgeons. Les nageoires ont été récoltées à partir de 19 esturgeons sacrifiés, dont sept bélugas (Huso huso), sept Sibériens (Acipenser baerii), et cinq sevruga (A. stellatus). Les esturgeons ont été élevés dans des fermes iraniennes pendant deux ans (2017-2018), et l'analyse de l'extraction du cortisol a été menée en Corée du Sud (janvier-février 2019). Des mâchoires de cinq H. huso ont également été employées pour l'extraction de cortisol. Les données ont été analysées à l'aide de la procédure générale de modèle linéaire (GLM) dans l'environnement SAS. Les coefficients de variation intra- et inter-assay étaient respectivement de 14,15 et 7,70. En bref, la technique d'extraction du cortisol consistait à laver les échantillons (300 à 10 mg) avec 3 ml de solvant (eau ultrapure et isopropanol) deux fois, rotation à 80 tr/min pendant 2,5 min, séchage à l'air des échantillons lavés à température ambiante (22-28 oC) pendant 7 jours, séchage supplémentaire les échantillons à l'aide d'un batteur de perles à 50 Hz pendant 32 min et les broyant en poudre, en appliquant 1,5 ml de méthanol à la poudre séchée (75 à 5 mg), et la rotation lente (40 tr/min) pendant 18 h à température ambiante avec mélange continu. Après extraction, les échantillons ont été centrifuges (9 500 x g pour 10 min), et 1 mL de supernatant a été transféré dans un nouveau tube de microcentrifuge (1,5 mL), incubé à 38 oC pour évaporer le méthanol, et analysé par l'intermédiaire d'un essai immunosorbent lié aux enzymes (ELISA) . Aucune différence n'a été observée dans les niveaux de cortisol des nageoires chez les espèces ou dans les niveaux de cortisol des nageoires et des mâchoires entre les solvants de lavage. Les résultats de cette étude démontrent que la matrice de mâchoire d'esturgeon est un indicateur alternatif prometteur d'effort aux matrices pleines.
Introduction
Le cortisol est un indicateur fiable du stress animal. L'extraction de cortisol fournit un cadre valide pour les chercheurs pour surveiller les niveaux de stress et les modèles généraux dans les facteurs de stress. Par exemple, des études antérieures ont mené la validation méthodologique des mesures de cortisol de cheveux utilisant diverses méthodes chez l'homme1,2, singes3,4, bovins5, moutons6, et poisson rouge7,8. Chez les espèces de poissons, il a été démontré que les mesures du cortisol dans des matrices telles que les écailles, le mucus cutané, les excréments et le sang9 fournissent des informations sur la santé des poissons. Lorsque l'échantillonnage sanguin est problématique ou que les écailles font défaut, d'autres matrices pour l'extraction du cortisol sont nécessaires. Chez les poissons, les matrices alternatives peuvent inclure la mâchoire, un tissu dur similaire à la dent humaine10.
Le développement de nouvelles matrices et de techniques validées pour déterminer les niveaux de stress des poissons est particulièrement intéressant pour l'industrie du caviar, où l'esturgeon peut être exposé de façon prolongée aux facteurs de stress environnemental11. Le sexe de l'esturgeon ne peut pas être déterminé avant l'âge de 2 ans, et l'esturgeon n'a pas d'écailles. Parce que le cortisol s'accumule progressivement en matrices solides au cours du stade de croissance2,7,12, les données d'accumulation de cortisol à long terme à partir de matrices dures telles que les nageoires et les mâchoires pourraient fournir un aperçu du stress à différents stades de croissance. En revanche, les niveaux de cortisol sanguin fournissent un instantané des niveaux de stress au moment du décès et ne peuvent pas représenter avec précision le stress pendant les conditions d'élevage à long terme13,14. Avec la concurrence croissante sur le marché du caviar, de nouvelles approches visant à améliorer les conditions de stress pour la production d'œufs plus sains chez les espèces d'esturgeons pendant l'élevage à long terme (8-12 ans ou plus) sont un domaine de recherche de plus en plus important. En raison du coût élevé de l'esturgeon, les échantillons récoltés sont extrêmement coûteux (8 000 $ à 15 000 $ par poisson mature selon l'espèce et le stade de croissance), un facteur limitant pour les projets de recherche. Cependant, le développement d'une technique appropriée pour l'extraction du cortisol à partir des nageoires et des mâchoires d'esturgeon pourrait être utilement appliqué à la fois aux systèmes de pisciculture et aux poissons sauvages afin d'améliorer la qualité et la récolte des œufs d'esturgeon pour la consommation et préservation.
En plus de fournir des résultats fiables6, la sélection d'une technique appropriée d'extraction de cortisol est d'une importance cruciale pour s'assurer que d'autres composés présents dans la matrice pendant la préparation de l'échantillon ne confondent pas la sortie, ce qui pourrait conduire à résultats incohérents. Il est également important de déterminer si les niveaux de cortisol des nageoires et de la mâchoire sont influencés par les niveaux d'hormones dans l'eau environnante. Heimbârge et coll.15 ont suggéré qu'un certain nombre de facteurs peuvent influencer les niveaux de cortisol, y compris l'âge, le sexe, la grossesse, la saison, la couleur12, et la région du corps à partir de laquelle le cortisol est extrait16. Cependant, peu d'informations sont disponibles sur les effets du lavage des solvants sur l'extraction de cortisol dans les matrices de corps de poisson8, et aucun sur ces effets chez l'esturgeon, à l'exception des œufs d'esturgeon17.
Bien que l'analyse des niveaux de cortisol de base des nageoires et des mâchoires de l'esturgeon exige que le poisson soit euthanasié, cette approche n'implique pas les techniques invasives requises pour l'échantillonnage sanguin chez les esturgeons vivants. Les échantillons de nageoires et d'os de mâchoire sont facilement prélevés, et l'extraction de ces tissus peut être effectuée rapidement. De même, l'extraction et l'analyse hormonales sont simples et nécessitent peu d'équipement spécialisé.
Dans cette étude, nous présentons une technique nouvelle et facilement appliquée pour l'extraction, le lavage et la détermination du cortisol à partir des nageoires et des mâchoires de poisson, dans le but de déterminer si les niveaux de cortisol mesurés à partir de ces matrices peuvent être utilisés de façon fiable comme stress Indicateurs. Les avantages de cette technique comprennent une approche facile et non invasive8, moins de variation des données, et une production fiable1,6,8,17; la technique s'applique aux espèces de poissons sans écailles telles que l'esturgeon. La technique nécessite l'abattage du poisson, la sélection des solvants de lavage appropriés2,4, broyage approprié des échantillons3,5, essai immunosorbent enzymatique professionnel (ELISA) application5,7, et une connaissance approfondie de l'incorporation des sources de cortisol en matrices solides6.
Nous avons appliqué deux solvants de lavage différents (eau ultrapure et isopropanol) pour obtenir des niveaux baso-bas de cortisol dans les nageoires de trois espèces d'esturgeons : le béluga (Huso huso),sibérien (Acipenser baerii),et le sevruga (A. stellatus ), dans des conditions environnementales standard pour chaque espèce. Des mâchoires de H. huso ont également été employées pour évaluer le stress dans l'esturgeon. Il s'agit de la première étude à mesurer les niveaux de cortisol dans les mâchoires d'esturgeon. Les résultats de cette étude fourniront des données comparatives sur le cortisol pour les espèces d'esturgeons au stade de croissance précoce (1 an) avant la détermination du sexe.
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Protocol
Les procédures et méthodes expérimentales suivantes ont été approuvées par l'Autorité de bien-être et d'éthique des animaux de l'Université nationale de Kangwon, à Chuncheon, en République de Corée.
1. Collection Fin
- Capturez l'esturgeon doucement à l'aide d'un filet pour minimiser les blessures et le stress.
- Rincer soigneusement le poisson avec de l'eau douce, puis essuyer la surface du corps avec une serviette absorbante avant l'euthanasie.
- Frapper la tête du poisson à l'aide d'un marteau en plastique de telle sorte que le poisson est étourdi ou perd conscience. Retirer la tête à l'aide d'un couteau.
- Mesurer le poids corporel (g) et la longueur (cm).
- Après l'euthanasie, prélever des échantillons d'ailerons en coupant le plus près possible du corps à l'aide de ciseaux chirurgicaux stérilisés.
REMARQUE : Des serviettes absorbantes individuelles non recyclées doivent être utilisées pour chaque poisson. Les statistiques descriptives pour les espèces utilisées dans cette étude étaient les suivantes : esturgeon béluga (H. huso) : âge de 18 à 2,1 mois, poids corporel de 2 700 à 300 g, et longueur du corps de 55 à 5 cm; Esturgeon sibérien(A. baerii): âge de 9,6 à 2,4 mois, poids corporel de 1 750 à 250 g, et longueur du corps de 45 à 5 cm; esturgeon sévruga(A. stellatus): âge de 14 à 1,3 mois, poids corporel de 1 000 à 100 g, et longueur du corps de 65 à 5 cm.
2. Préparation de fin pour l'extraction de cortisol
- Placer les échantillons d'ailerons (un échantillon par tissu : 3 g) sur du papier de pesage de laboratoire (107 mm et 210 mm) et sécher à température ambiante pendant quelques jours jusqu'à ce qu'il soit sec.
- Enveloppez les échantillons dans des feuilles de papier d'aluminium, placez-les dans des sacs en plastique étiquetés et transférez-les au laboratoire.
- Conserver les échantillons dans un réfrigérateur pour une utilisation ultérieure, y compris le lavage, l'extraction du cortisol, le séchage et l'analyse ELISA(figure 2).
3. Analyse de cortisol de fin
- Calibrer l'échelle analytique numérique (précision : 0,0001) et peser 300 à 10 mg d'échantillons avec du papier de pesage sur la plaque à échelle.
- Laver les échantillons.
- Transférer chaque échantillon dans un tube de polypropylène conique de 15 L. Ajouter 3 ml d'isopropanol à chaque tube à l'aide d'une pipette monocanal de 5 000 l L.
- Faites pivoter les tubes à 80 tr/min pendant 2,5 min pour éliminer le cortisol et éliminer toute contamination externe potentielle. Répétez cette procédure deux fois.
- Sécher à l'air les échantillons lavés à température ambiante (22-28 oC) pendant 7 jours.
- Répétez la procédure de lavage à l'aide d'eau ultrapure comme agent de lavage.
- Extraire la mâchoire du tissu du corps à l'aide de forceps de coupe d'os. Appliquer les étapes 1.5-3.2.4 sur les échantillons de mâchoire.
- Peser (75 à 5 mg) d'échantillons de nageoires ou d'os de mâchoire séchés et moudre à l'aide d'un batteur de perles à 50 Hz pendant 32 min.
- Fournir 1,5 ml de méthanol dans chaque tube contenant une nageoire ou une mâchoire en poudre à l'aide d'une pipette de 1 000 l. Placer les échantillons sur un rotateur de tube à rotation lente (40 tr/min) pendant 18 h à température ambiante pour extraire le cortisol avec un mélange continu.
- Après l'extraction du cortisol, centrifuger les échantillons à 9 500 x g pendant 10 min à température ambiante. Après centrifugation, recueillir la couche organique supérieure contenant du cortisol (1 ml) de chaque échantillon et le placer dans un tube microcentrifuge séparé de 1,5 ml.
- Séchez les échantillons par incubation à 38 oC pour évaporer le méthanol. Gardez les échantillons de cortisol extraits sous une hotte de fumée pendant la nuit pour permettre au méthanol de se dissiper.
REMARQUE : La couche contenant du cortisol est généralement de couleur jaunâtre.
- Séchez les échantillons par incubation à 38 oC pour évaporer le méthanol. Gardez les échantillons de cortisol extraits sous une hotte de fumée pendant la nuit pour permettre au méthanol de se dissiper.
4. Détection de cortisol de fin
- Décongelez les échantillons de nageoires séchées ou d'os de mâchoire à température ambiante pendant 1,5 h avant d'utiliser le kit ELISA.
- Ajouter 400 ll de tampon de phosphate, de vortex et de centrifugeuse à 1 500 x g pendant 15 min.
- Exécuter chaque échantillon (25 L) en double pour améliorer la précision et la fiabilité des tests. Supprimez toutes les données en dehors de la courbe standard en tant que valeurs aberrantes.
- Définir un lecteur de microplaque à 450 nm, puis définir à 'g dL-1 et lire la densité optique de la plaque.
- Utilisez le logiciel de microplaque avec un ajustement de courbe de régression non linéaire à quatre paramètres. Convertissez les niveaux de cortisol des échantillons obtenus à partir du logiciel en pg mg-1 en utilisant l'équation suivante :
F 10 000E (A/B) (C/D),
où F - la valeur finale du niveau de cortisol de la nageoire dans (pg mg-1), E - le volume (mL) du tampon d'analyse utilisé pour reconstituer l'extrait séché, A - la concentration (g dL-1) fournie par la sortie d'analyse, B - le poids (mg) de la nageoire soumise à des extra ction, C - le volume (mL) de méthanol ajouté à la nageoire en poudre, et D - le volume (mL) de méthanol récupéré de l'extrait et ensuite séché3.
- Utilisez le logiciel de microplaque avec un ajustement de courbe de régression non linéaire à quatre paramètres. Convertissez les niveaux de cortisol des échantillons obtenus à partir du logiciel en pg mg-1 en utilisant l'équation suivante :
5.Analyse statistique
- Divisez chaque échantillon en deux sous-échantillons avant la procédure de lavage, puis exécutez en double pendant l'essai du kit ELISA (2 à 2 à 4 observations par échantillon) afin d'améliorer la puissance du test et la fiabilité des résultats.
- Comparez les effets des deux solvants de lavage et leurs interactions en appliquant la procédure générale de modèle linéaire (GLM) dans l'environnement logiciel SAS aux données de mesure18.
- Testez les différences entre les moyens utilisant le test de Tukey à un niveau significatif de p 'lt; 0.05. Accepter 0,05 lt; p 'lt; 0.10 comme preuve d'une tendance plutôt que comme une différence significative.
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Representative Results
La technique présentée d'extraction de cortisol de nageoire a été développée et confirmée dans cette étude utilisant trois espèces d'esturgeon. Les niveaux de cortisol obtenus à l'aide d'eau ultrapure et d'isopropanol comme solvants de lavage ont été comparés (figure 2). Le cortisol des mâchoires de H. huso a été examiné pour déterminer si les mâchoires d'esturgeon pourraient être employées comme matrice alternative aux nageoires. Les effets du solvant de lavage, des espèces d'esturgeons et de leur interaction sont indiqués dans le tableau 1. Les niveaux de cortisol avaient tendance à être plus élevés dans les échantillons d'ailerons lavés à l'isopropanol que chez ceux lavés à l'eau (p - 0,089). Il n'y avait pas de différences significatives dans les niveaux de cortisol des nageoires (p - 0,525) parmi les espèces d'esturgeons. Il n'y a pas eu d'interaction significative entre les solvants de lavage et les espèces d'esturgeons (p - 0,947). Le solvant de lavage n'a eu aucun effet significatif sur le niveau de cortisol dans l'esturgeon de H. huso (p - 0,45) (tableau 2). Les coefficients de variation intra-assay et inter-assay étaient respectivement de 14,15 et 7,70. Les données ont montré une forte similitude entre les nageoires des trois espèces d'esturgeons (tableau 1) et dans les mâchoires H. huso (tableau 2). Nous n'avons pas étudié les corrélations entre les niveaux de cortisol dans les mâchoires et ceux dans les nageoires de différentes espèces d'esturgeons parce que nous avons obtenu des échantillons d'os de mâchoire seulement de H. huso. Ces relations devraient être explorées dans une étude future.
Figure 1. (A) Photographie de l'esturgeon Huso huso (10 ans). (B) Caractéristiques morphologiques de l'esturgeon. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2. Infographie de l'analyse de cortisol de nageoire5,6 exécutée dans le laboratoire. Toutes les photographies présentées dans l'abstrait infographique ont été prises en laboratoire. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Espèces d'esturgeons (SS) | Solvant de lavage (WS) | Valeur P | ||||||||
| Huso huso | Acipenser baerii | Acipenser stellatus | Sem | eau | Isopropanol | Sem | Ss | Ws | SS-WS (en) | |
| Cortisol (pg mg-1) | ||||||||||
| 3.46 | 2.85 | 3.34 | 0.41 | 2.86 | 3.69 | 0.33 | 0.52 | 0.08 | 0.95 | |
Tableau 1. Niveaux de cortisol fin chez trois espèces d'esturgeons obtenus à l'aide de deux solvants de lavage différents.
| Solvant de lavage (WS) | Sem | Valeur P | ||
| eau | Isopropanol | |||
| Cortisol (pg mg-1) | 1.11 | 1.43 | 0.31 | 0.45 |
Tableau 2. Niveaux de cortisol de jawbone dans l'esturgeon de béluga (Huso huso) utilisant deux solvants différents de lavage.
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Discussion
L'esturgeon est parfois appelé un « fossile vivant » parce qu'il a exposé peu d'adaptations au cours des derniers millénaires. Le genre esturgeon Acipenser contient 27 espèces qui produisent du caviar; cependant, trois espèces (beluga, baerii et sevruga) produisent la majeure partie de l'approvisionnement mondial en caviar. Les esturgeons sont vulnérables à la surpêche et à l'interférence dans leur habitat naturel et sont donc plus en danger critique d'extinction que tout autre groupe d'espèces. L'esturgeon appartient au plus vieux groupe de vertébrés vivants, qui existe depuis 150 millions d'années. Les espèces acisseurs mûrissent et croissent lentement; certains (p. ex. H. huso) peuvent vivre 100 ans et dépasser 2 000 kg de poids. Les esturgeons sont des poissons cartilagineux sans écailles, et sont caractérisés par cinq rangées de grandes plaques osseuses appelées scutes et barbeaux tactiles situés à l'avant de la bouche (Figure 1). Les différences physiologiques entre ces espèces et d'autres poissons comprennent une diminution des réponses plasmatiques (corticostéroïdes) aux facteurs de stress environnementaux. Nos mesures de cortisol de nageoire fournissent l'évidence que l'os de mâchoire d'esturgeon accumule le cortisol en proportion aux concentrations circulantes.
Les poissons présentent de nombreuses réponses aux facteurs de stress physiques, chimiques et perçus. Ces réactions sont bien connues sous le nom de mécanismes d'adaptation qui permettent aux poissons de faire face aux perturbations environnementales et de maintenir un état homéostatique. Si un facteur de stress est suffisamment prolongé ou grave pour que le poisson ne puisse pas retrouver l'homéostasie en utilisant ses réactions naturelles, le poisson peut subir des effets néfastes, mettant en danger sa santé globale et/ou sa vie19. Le sexe de l'esturgeon peut être déterminé à partir d'environ 2 ans. Par conséquent, pour déterminer si les niveaux de cortisol et le sexe de l'esturgeon sont corrélés, il est nécessaire de documenter l'accumulation à long terme de cortisol dans les nageoires et les mâchoires (comme une nouvelle approche et une matrice alternative) de l'esturgeon. Cette étude est la première à rapporter des niveaux de cortisol des nageoires et des mâchoires chez l'esturgeon.
Le rôle d'un solvant de lavage de cortisol est d'enlever les sources externes de cortisol du mucus de peau9. Aerts et coll.14 ont utilisé de l'eau distillée pour éliminer la contamination externe au cortisol de la peau de poisson; dans les études précédentes2,5,12,17, nous avons comparé les effets de l'utilisation de l'isopropanol et de l'eau comme un solvant pour examiner la teneur en cortisol des cheveux. Les effets du solvant de lavage peuvent varier d'un échantillon à l'autre en raison des différences dans les propriétés des œufs d'esturgeon13, peau15, nageoires, et les mâchoires. Brossa7 a signalé que le niveau de cortisol dans les écailles de poissons rouges (Carassius auratus) est resté constant lorsque l'isopropanol a été utilisé comme solvant quel que soit le nombre de lavages, tandis que les niveaux de cortisol variaient lorsque l'eau était utilisée. Nos résultats ont montré que le solvant de lavage n'a eu aucun effet sur des niveaux de cortisol de mâchoire. Les différences entre ces études comprennent le nombre de lavages, secouant contre le vortex, la pureté de l'isopropanol, et surtout, la sensibilité ou la résistance des écailles / peau à la pénétration liquide externe. Ghassemi Nejad et coll.20 ont démontré que l'application de différents essais tels que RIA et ELISA peut entraîner des différences dans la production. Les stéroïdes sont plus solubles dans les alcools de masse moléculaire inférieure (p. ex., le méthanol) que dans les alcools de poids moléculaire plus élevé comme l'isopropanol4. L'extraction de méthanol dénature les protéines en brisant les liaisons non covalentes, permettant ainsi la libération de cortisol capillaire. Le méthanol modifie également la structure hormonale en brisant les liaisons non covalentes, ce qui entraîne la libération de cortisol dans les tissus. Pour homogénéiser efficacement les nageoires et les mâchoires de l'esturgeon avant l'extraction du méthanol, un batteur de perles peut être utilisé pour décomposer efficacement la structure tissulaire. Cette procédure nécessite du temps pour moudre complètement les échantillons de nageoires et de mâchoires; par conséquent, le processus doit être répété pour assurer la pulvérisation complète et l'homogénéisation avant l'extraction de cortisol. La rotation lente pendant 18 h permet l'élimination progressive du cortisol par lavage.
Comme suggéré dans les études précédentes des cheveux de mammifère4,5,6, sources externes ou internes de teneur en cortisol dans les nageoires et les mâchoires, autres que le sang, ne doit pas être négligée. Bien que cette étude n'ait pas été spécifiquement conçue pour étudier comment le cortisol diffuse du sang aux nageoires ou aux mâchoires, elle souligne la nécessité d'élargir nos connaissances de ce processus pour mieux interpréter les fluctuations du cortisol à partir de ces matrices. Les propriétés des nageoires et des mâchoires diffèrent de celles des écailles et de la peau. Bussy et coll.17 quantified cortisol levels in lake sturgeon (A. fulvescens) eggs to investigate environmental effects on maternal physiological condition and egg quality. Ils ont utilisé le méthyle tert-butylether (MTBE), l'acétate d'éthyle (AcOEt) MTBE, et l'éther de diéthyle (Et2O) comme solvants de lavage et ont conclu que l'acétate éthylique était le meilleur solvant d'extraction en termes de récupération et d'effet de matrice. Dans la présente étude, l'isopropanol a enlevé de plus grandes quantités de cortisol externe du mucus de peau pendant le lavage, menant à une légère surestimation du cortisol des ailerons d'esturgeon, qui doit être soigneusement considéré en interprétant des résultats d'extraction. Il est possible que l'isopropanol ait pu laver la peau de la nageoire, comme cela a été rapporté dans une étude précédente7. Isopropanol est connu pour pénétrer les follicules pileux et les écailles de poisson4,7. Les résultats de la présente étude indiquent que le choix du solvant n'a eu aucun effet significatif sur des niveaux de cortisol, suggérant que l'extraction de cortisol puisse être plus difficile dans certaines parties de la nageoire que dans d'autres utilisant l'eau ultrapure ; dans de tels cas, l'isopropanol peut être utilisé comme alternative.
Cette étude a démontré l'applicabilité de l'os de la mâchoire comme une nouvelle matrice pour l'indication fiable du stress chez l'esturgeon. Les valeurs de cortisol de mâchoire de H. huso étaient semblables à ceux extraits des nageoires de la même espèce ; les études futures devraient confirmer ce résultat parmi différentes espèces, âges, et sexes par l'analyse de corrélation. Un faible nombre de poissons a été utilisé dans la présente étude en raison du coût élevé de l'esturgeon; nous avons essayé de surmonter cette limitation en testant chaque échantillon deux fois et en dupliquant également l'extraction de méthanol pour l'ELISA. L'utilisation d'une multiplication quadruple pourrait augmenter la puissance du test pour couvrir le faible nombre d'échantillons.
Nous concluons que le type de solvant de lavage a modérément affecté l'extraction de cortisol des nageoires, mais pas des mâchoires, de l'esturgeon. Avant de généraliser la conclusion de cette étude et de valider ces résultats, d'autres recherches à l'aide de différentes espèces et solvants devraient être menées. Le présent travail fournit la preuve que la mâchoire d'esturgeon peut être appliquée comme matrice alternative dans les études futures utilisant le cortisol comme index de stress chez l'esturgeon. L'adéquation d'ELISA pour la mesure de cortisol de nageoire et de mâchoire a été également démontrée dans la présente étude. La recherche future devrait se concentrer sur deux aspects : 1) déterminer la corrélation entre les niveaux de cortisol dans les mâchoires et ceux dans les nageoires de l'esturgeon et 2) récolter des échantillons de matrice pour la mesure de cortisol des poissons plus âgés et de leur caviar pour déterminer le stress à long terme différentes espèces d'esturgeons au cours de la durée de vie.
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Disclosures
Les auteurs n'ont aucun conflit d'intérêts à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été mené à l'appui du Programme de recherche coopérative pour les sciences agricoles et le développement de la technologie (titre du projet : Analyse du changement de productivité du bétail avec changement climatique, Projet no. PJ012771), Rural Development Administration, République de Corée. En outre, cette étude a été soutenue par une subvention (No. PJ01344604) de l'équipe de nutrition et de physiologie animales, National Institute of Animal Science, RDA, Séoul, République de Corée. Les auteurs remercient le PDG de Persian Gesture, Mohammad Hassan Salmanzadeh, et son équipe, qui ont fourni des poissons des trois espèces d'esturgeons examinées dans cette étude.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Disposal latex surgical gloves | Ansell | 63754090 | |
| Platform scale-electronic weighing 100kg | Baskoolnikoo | 101 EM | |
| Serological pipette to deliver up to 24 mL | Becton Dickinson Falcon | 35-7550 | |
| Micro plate reader with 450 nm and 490 to 492 nm reference filters | BioTek | 8041000 | |
| Reagent reservoirs | BrandTech | 703459 | |
| Zipper storage plastic bag | Cleanwrap | 30cm x100m | |
| Isopropyl alcohol | Daejung chemicals & Metals | 5035-4400 | |
| Methyl alcohol | Daejung chemicals & Metals | 5558-4100 | |
| Tube rotator- MX-RL-Pro | DLAB Scientific | 824-222217777 | |
| Precision pipette to deliver 1.5 and 10 mL | Eppendorf Research Plus | M21518D | |
| Precision pipette to deliver 15 and 25 μL | Eppendorf Research Plus | R25623C | |
| Weighing paper (107 x 210 mm) | Fisherbrand | 09-898-12B | |
| Bead beater, 50/60 Hz 2A | GeneReach Biotechnology Corp | tp0088 | |
| Plate rotator with orbit capable of 500 rpm | Hangzhou Miu Instrument | MU-E30-1044 | |
| Disposable polypropylene tubes to hold at least 24 mL | Hyundai Micro | H20050 | |
| Fume hood | Kwang Dong Industrial | KD 901-22128175 | |
| Micro-centrifuge capable of 1500 x g | Labo Gene | 9.900.900.729 | |
| Mini vortex mixer | LMS | VTX-3000L | |
| Lotte aluminum foil roll | Lotte Aluminum | B0722X5FK5 | |
| Digital scale | Mettler Toledo | ME204 | |
| Ultrapure water | MDM | MDM-0110 | |
| Pipette tips | Neptune Scientific | REF 2100.N | |
| Large fish net | Pond H2O | Hoz135 | |
| Salivary cortisol kit | Salimetrics | 1-3002-4 | |
| Bone cutting forceps | Sankyo | 26-188A | |
| Precision multichannel pipette to deliver 50 μL and 200 μL | VITLAB | 18A68756 | |
| Towel | Yuhan Kimberly | 1707921546 | |
| Tissue paper (107 × 210) | Yuhan Kimberly | 41117 |
References
- Meyer, J. S., Novak, M. A. Hair cortisol: a novel biomarker of hypothalamic-pituitary- adrenocortical activity. Endocrinology. 153, 4120-4127 (2012).
- Ghassemi Nejad, J., et al. A cortisol study: facial hair and nails. Journal of Steroids Hormonal Sciences. 7, 1-5 (2016).
- Meyer, J. S., Novak, M. A., Hamel, A., Rosenberg, K. Extraction and analysis of cortisol from human and monkey hair. Journal of Visualized Experiments. (83), e50882 (2014).
- Davenport, M. D., Tiefenbacher, S., Lutz, C. K., Novak, M. A., Meyer, J. S. Analysis of endogenous cortisol concentrations in the hair of rhesus macaques. General and Comparative Endocrinology. 147, 255-261 (2006).
- Ghassemi Nejad, J., Ataallahi, M., Park, H. K. Methodological validation of measuring Hanwoo hair cortisol concentration using bead beater and surgical scissors. Journal of Animal Science and Technology. 61, 41-46 (2019).
- Ghassemi Nejad, J., et al. Wool cortisol is a better indicator of stress than blood cortisol in ewes exposed to heat stress and water restriction. Animal. 8, 128-132 (2014).
- Brossa, A. C. Cortisol in skin mucus and scales as a measure of fish stress and habitat quality. Ph.D. dissertation. , Faculty of Veterinary Medicine, Universitat Autonoma de Barcelona. Ph.D. dissertation (2018).
- Carbajal, A., et al. Cortisol detection in fish scales by enzyme immunoassay: biochemical and methodological validation. Journal of Applied Ichthyology. 34, 1-4 (2018).
- Bertotto, D., et al. Alternative matrices for cortisol measurement in fish. Aquaculture Research. 41, 1261-1267 (2010).
- Ghassemi Nejad, J., Jeong, C., Shahsavarani, H., Sung, I. K., Lee, J. Embedded dental cortisol content: a pilot study. Endocrinology & Metabolic Syndrome. 5, 240 (2016).
- Pankhurst, N. W. The endocrinology of stress in fish: an environmental perspective. General and Comparative Endocrinology. 170, 265-275 (2011).
- Ghassemi Nejad, J., Kim, W. B., Lee, B. H., Sung, K. I. Coat and hair color: hair cortisol and serotonin levels in lactating Holstein cows under heat stress conditions. Animal Science Journal. 88, 190-194 (2017).
- Baker, M. R., Gobush, K. S., Vynne, C. H. Review of factors influencing stress hormones in fish and wildlife. Journal of Nature Conservation. 21, 309-318 (2013).
- Aerts, J., et al. Scales tell a story on the stress history of fish. PLoS One. 10, e0123411 (2015).
- Heimbürge, S., Kanitz, E., Otten, W. The use of hair cortisol for the assessment of stress in animals. General and Comparative Endocrinology. , 10-17 (2019).
- Ghassemi Nejad, J., et al. Comparing hair cortisol concentrations from various body sites and serum cortisol in Holstein lactating cows and heifers during thermal comfort zone. Journal of Veterinary Behavior: Clinical and Application Research. 30, 92-95 (2019).
- Bussy, U., Wassink, L., Scribner, K. T., Li, W. Determination of cortisol in lake sturgeon (Acipenser fulvescens) eggs by liquid chromatography tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography B. 1040, 162-168 (2017).
- SAS. 1999. SAS. User's Guide (Version 8.01 Edition). , SAS Inst. Inc. Cary, NC, USA. (1999).
- Barton, B. A. Stress in fishes: a diversity of responses with particular reference to changes in circulating corticosteroids. Integrative and Comparative Biology. 42, 517-525 (2002).
- Ghassemi Nejad, J., et al. Measuring hair and blood cortisol in sheep and dairy cattle using RIA and ELISA assay: a comparison. Biological Rhythm Research. Accepted. , (2019).
