Summary
I denne undersøgelse præsenterer vi en protokol for cortisol ekstraktion fra fin og kæbeknogle af stør arter. Finne-og kæbe knoglekortisolniveauerne blev yderligere undersøgt ved at sammenligne to vaskemidler efterfulgt af ELISA-assays. Denne undersøgelse undersøgtes gennemførligheden af Jawbone cortisol som en ny stress indikator.
Abstract
Formålet med denne undersøgelse var at udvikle en teknik til ekstraktion af cortisol fra stør finner ved hjælp af to vaskemidler (vand og isopropanol) og kvantificere eventuelle forskelle i finkortisolniveauerne blandt tre primære stør arter. Finnerne blev høstet fra 19 ofrede Sturgeons, herunder syv Beluga (Huso Huso), syv sibiriske (Acipenser Acipenser) og fem Sevruga (A. Acipenser). De Sturgeons blev rejst i iranske gårde i 2 år (2017-2018), og cortisol udvinding analyse blev gennemført i Sydkorea (januar-februar 2019). Kæbe knogler fra fem H. Huso blev også brugt til cortisol ekstraktion. Data blev analyseret ved hjælp af GLM-proceduren (General Linear Model) i SAS-miljøet. De intra-og Inter-assay koefficienter for variation var henholdsvis 14,15 og 7,70. Kort sagt omfattede cortisol ekstraktions teknikken vask af prøverne (300 ± 10 mg) med 3 mL solvens (ultrapure vand og isopropanol) to gange, rotation ved 80 rpm for 2,5 min, lufttørring af de vaskede prøver ved stuetemperatur (22-28 °C) i 7 dage, yderligere tørring prøverne ved hjælp af en perle beater ved 50 Hz for 32 min og slibning dem i pulver, anvende 1,5 mL methanol til tørret pulver (75 ± 5 mg), og langsom rotation (40 rpm) for 18 h ved stuetemperatur med kontinuerlig blanding. Efter ekstraktion blev prøverne centrifugeret (9.500 x g i 10 min), og 1 ml supernatanten blev overført til et nyt mikrocentrifuge glas (1,5 ml), inkuberet ved 38 °c for at fordampe methanol og analyseret via enzym relateret immunosorbent assay (ELISA) . Der blev ikke observeret nogen forskelle i finkortisolniveauerne blandt arterne eller i kortisolniveauerne for fin-og kæbe knogler mellem vaskemidler. Resultaterne af denne undersøgelse viser, at Sturgeon Jawbone matrix er en lovende alternativ stress indikator for solide matricer.
Introduction
Cortisol er en pålidelig indikator for dyrs stress. Cortisol udvinding giver en gyldig ramme for forskere til at overvåge stress niveauer og generelle mønstre i stressorer. For eksempel, tidligere undersøgelser har gennemført metodologisk validering af hår cortisol målinger ved hjælp af forskellige metoder i mennesker1,2, aber3,4, kvæg5, får6, og guldfisk7,8. I fiskearter, cortisol målinger i matricer såsom skalaer, hud slim, fæces, og blod9 har vist sig at give oplysninger om fisk sundhed. Når blodprøvetagning er problematisk eller skalaer mangler, alternative matricer til cortisol ekstraktion er nødvendige. I fisk kan alternative matricer omfatte kæbeknoglen, et hårdt væv svarende til den menneskelige tand10.
Udviklingen af nye matricer og validerede teknikker til at bestemme fiske stress niveauer er af særlig interesse for kaviar industrien, hvor stør kan opleve langvarig udsættelse for miljømæssige stressfaktorer11. Kønnet af stør kan ikke bestemmes før 2 år, og stør har ikke skalaer. Fordi cortisol gradvist ophobes i solide matricer under vækst stadiet2,7,12, langsigtede cortisol akkumulering data fra hårde matricer såsom finner og kæbe knogler kunne give indsigt i stress niveauer i forskellige vækststadier. I modsætning hertil giver blod kortisolniveauerne et øjebliksbillede af stressniveauet på dødstidspunktet og kan ikke præcist repræsentere stress under langvarige opdrætsforhold13,14. Med den stigende konkurrence på kaviar markedet er nye tilgange til forbedring af stress betingelserne for produktion af sundere æg blandt størarter under lang tids opdræt (8-12 år eller længere) et stadigt vigtigere forskningsområde. På grund af de høje omkostninger ved stør, høstes prøver er ekstremt dyrt ($ 8000-15000 pr modne fisk afhængigt af arter og vækstfase), en begrænsende faktor for forskningsprojekter. Udviklingen af en hensigtsmæssig teknik til kortisoludvinding fra stør finner og kæbe knogler kan dog med fordel anvendes både på fiske opdrætssystemer og i vildtlevende fisk for at forbedre kvaliteten og høsten af stør-æg til både konsum og Bevarelse.
Ud over at give pålidelige resultater6er udvælgelsen af en passende cortisol ekstraktionsteknik af afgørende betydning for at sikre, at andre forbindelser, der findes i matrixen under prøvepræparation, ikke tolerererproduktionen, hvilket kan føre til usammenhængende resultater. Det er lige så vigtigt at afgøre, om fin og kæbeknogle cortisol niveauer er påvirket af hormonniveauer i det omgivende vand. Heimbürge et al.15 foreslog, at en række faktorer kan påvirke cortisol niveauer, herunder alder, køn, graviditet, sæson, farve12, og kroppen region, hvorfra cortisol udvindes16. Der foreligger dog kun få oplysninger om virkningerne af vaskemidler på cortisol ekstraktion i fisk krop matricer8, og ingen om disse virkninger i stør, undtagen for stør æg17.
Selvom analysere baseline cortisol niveauer fra finner og kæbe knogler af stør kræver, at fiskene skal euthanized, denne fremgangsmåde ikke indebærer invasive teknikker, der kræves for blodprøvetagning i levende stør. Prøver af fin-og kæbeknogle opsamles let, og ekstraktion fra disse væv kan udføres hurtigt. Tilsvarende, hormon udvinding og analyse er ligetil og kræver lidt specialiseret udstyr.
I denne undersøgelse præsenterer vi en ny og let anvendt teknik til ekstraktion, vask og bestemmelse af cortisol fra fiske finner og kæbe knogler, med det formål at bestemme, om cortisol niveauer målt fra disse matricer kan anvendes pålideligt som stress Indikatorer. Fordelene ved denne teknik omfatter en nem og ikke-invasiv8 tilgang, mindre data variation, og pålidelig udgang1,6,8,17; teknikken gælder for fiskearter uden skalaer såsom stør. Teknikken kræver slagtning af fiskene, udvælgelse af passende vaskemidler2,4, korrekt slibning af prøver3,5, professionel enzym-forbundet immunosorbent assay (ELISA) ansøgning5,7, og omfattende viden om inkorporering af cortisol kilder i solide matricer6.
Vi anvendte to forskellige vaskemidler (ultrarent vand og isopropanol) for at opnå basal kortisolniveauer i finner fra tre stør arter: Beluga (Huso Huso), Sibirisk (Acipenser Acipenser) og Sevruga (A. Acipenser ), under normale miljøforhold for hver art. Kæbe knogler af H. Huso blev også brugt til at evaluere stress i stør. Dette er den første undersøgelse for at måle cortisol niveauer i Sturgeon jawbones. Resultaterne af denne undersøgelse vil give sammenlignende cortisol data for stør arter i den tidlige vækstfase (~ 1 år) forud for kønsbestemmelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Følgende eksperimentelle procedurer og metoder blev godkendt af dyrevelfærd og etik myndighed i Kangwon National University, Chuncheon, Republikken Korea.
1. fin samling
- Fang Sturgeon forsigtigt ved hjælp af et net for at minimere skader og stress.
- Skyl fisken forsigtigt med ferskvand, og tør derefter kroppens overflade af med et absorberende håndklæde før eutanasi.
- Hit hovedet af fiskene ved hjælp af en plastik hammer sådan, at fiskene er bedøvet eller mister bevidstheden. Fjern hovedet med en kniv.
- Mål legemsvægten (g) og længde (cm).
- Efter eutanasi, indsamle fin prøver ved at skære så tæt som kroppen som muligt ved hjælp af steriliseret kirurgisk saks.
Bemærk: der skal anvendes individuelle, ikke-genvundne absorberende håndklæder for hver fisk. Deskriptive statistikker for de arter, der anvendes i denne undersøgelse, var følgende: Beluga Sturgeon (H. Huso): alder = 18 ± 2,1 måneder, legemsvægt = 2.700 ± 300 g og legems længde = 55 ± 5 cm; Sibirisk stør (A. Acipenser): alder = 9,6 ± 2,4 måneder, legemsvægt = 1.750 ± 250 g og legems længde = 45 ± 5 cm; Sevruga Sturgeon (A. Acipenser): Alder = 14 ± 1,3 måneder, legemsvægt = 1.000 ± 100 g og legems længde = 65 ± 5 cm.
2. fin forberedelse til cortisol ekstraktion
- Finprøverne (en prøve pr. væv: ~ 3 g) placeres på laboratorie veje papir (107 mm × 210 mm) og tørres ved stuetemperatur i et par dage, indtil de er tørre.
- Wrap prøver i plader af aluminiumsfolie, sted i mærket plastikposer, og overførsel til laboratoriet.
- Opbevar prøverne i køleskab til yderligere brug, herunder vask, cortisol ekstraktion, tørring og ELISA analyse (figur 2).
3. fin kortisol analyse
- Kalibrer den digitale analyse skala (nøjagtighed: 0,0001) og afvejer 300 ± 10 mg prøver med veje papir på skalaen.
- Vask prøverne.
- Hver prøve overføres til et 15 L konisk polypropylen-rør. Der tilsættes 3 mL isopropanol til hvert rør med en 5.000 μL enkeltkanalpipette.
- Drej rørene ved 80 rpm for 2,5 min at skylle cortisol ud og fjerne enhver potentiel ekstern kontaminering. Gentag denne procedure to gange.
- Lufttørre de vaskede prøver ved stuetemperatur (22-28 °C) i 7 dage.
- Gentag vaskeproceduren med ultrarent vand som vaskemiddel.
- Udpak kæbebenet fra kropsvæv ved hjælp af knogle skærende pincet. Anvend trin 1.5-3.2.4 på kæbe knogleprøverne.
- Afvejes (75 ± 5 mg) tørrede fin-eller kæbe benprøver og sliber med en perle beater ved 50 Hz i 32 min.
- Der leveres 1,5 mL methanol til hvert rør, som indeholder pulveriseret finne eller kæbeknogle ved hjælp af en pipette på 1000 μL. Prøverne placeres på en rørrotator ved langsom rotation (40 rpm) i 18 timer ved stuetemperatur for at udtrække cortisol med kontinuerlig blanding.
- Efter cortisol ekstraktion centrifugeres prøverne ved 9.500 x g i 10 minutter ved stuetemperatur. Efter centrifugering opsamles det øverste organiske lag indeholdende cortisol (1 mL) fra hver prøve og placeres i et separat 1,5 mL mikrocentrifuge glas.
- Prøverne tørres ved inkubation ved 38 °C for at fordampe methanol. Opbevar de ekstraherede cortisol prøver under en røg hætte natten for at tillade methanol at sprede.
Bemærk: det cortisol-holdige lag er normalt gullig i farve.
- Prøverne tørres ved inkubation ved 38 °C for at fordampe methanol. Opbevar de ekstraherede cortisol prøver under en røg hætte natten for at tillade methanol at sprede.
4. påvisning af finkortisol
- Den tørrede finne eller kæbe knogleprøverne tø ved stuetemperatur i 1,5 h, inden ELISA-kittet anvendes.
- Tilsæt 400 μL fosfatbuffer, vortex, og centrifuge ved 1.500 x g i 15 min.
- Kør hver prøve (25 μL) i duplikat for at forbedre analysens nøjagtighed og pålidelighed. Fjern alle data uden for standardkurven som afvigende værdier.
- Indstil en mikroplade læser til 450 Nm, og indstil derefter til μg dL-1 og Læs pladens optiske tæthed.
- Brug mikropladen software med en fire-parameter ikke-lineær regression kurve pasform. Konverter cortisol niveauer af prøver opnået fra softwaren i PG mg-1 ved hjælp af følgende ligning:
F = 10.000 E (A/B) (C/D),
hvor F = den endelige værdi af finkortisolniveauet i (PG mg-1), E = volumen (ml) af den analyse buffer, der anvendes til at rekonstruere det tørrede ekstrakt, A = den koncentration (μg DL-1), der leveres af analyse outputtet, B = vægten (mg) af finnen underkastet ekstra C = volumen (mL) methanol tilsat til pulver Finnen, og D = volumen (mL) methanol genvundet fra ekstrakten og efterfølgende tørret3.
- Brug mikropladen software med en fire-parameter ikke-lineær regression kurve pasform. Konverter cortisol niveauer af prøver opnået fra softwaren i PG mg-1 ved hjælp af følgende ligning:
5. statistisk analyse
- Hver prøve opdeles i to delprøver inden vaskeproceduren og derefter køres i duplikat under ELISA-kittesten (2 × 2 = 4 observationer pr. prøve) for at forbedre prøvens effekt og resultaternes pålidelighed.
- Sammenlign virkningerne af de to vaskemidler og deres interaktioner ved at anvende GLM-proceduren (General Linear Model) i SAS-software miljøet på måledataene18.
- Test forskelle mellem midler ved hjælp af Tukey's test på et signifikansniveau p < 0,05. Accepter 0,05 < p < 0,10 som tegn på en tendens snarere end som en signifikant forskel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den præsenterede fin cortisol ekstraktionsteknik blev udviklet og bekræftet i denne undersøgelse ved hjælp af tre stør arter. Cortisol-niveauer opnået ved hjælp af ultrarent vand og isopropanol som vaskemidler blev sammenlignet (figur 2). Cortisol fra H. Huso jawbones blev undersøgt for at afgøre, om Sturgeon jawbones kunne anvendes som en alternativ matrix til finner. Virkningerne af vaskemiddel, størarter og interaktion er vist i tabel 1. Cortisol-niveauerne havde en tendens til at være højere i finprøver, der blev vasket med isopropanol end hos dem, som blev vasket med vand (p = 0,089). Der var ingen signifikante forskelle i finkortisolniveauerne (p = 0,525) blandt størarter. Der var ingen signifikant interaktion mellem vaskemidler og stør arter (p = 0,947). Vaskemiddel havde ingen signifikant virkning på cortisol-niveauet i H. Huso stør (p = 0,45) (tabel 2). Intra-assay og Inter-assay Variationskoefficienter var henholdsvis 14,15 og 7,70. Dataene viste stor lighed blandt finnerne på de tre stør arter (tabel 1) og i H. Huso jawbones (tabel 2). Vi har ikke undersøge korrelationer mellem cortisol niveauer i kæbe knogler og dem i finner af forskellige stør arter, fordi vi opnåede Jawbone prøver kun fra H. Huso. Disse forhold bør udforskes i en fremtidig undersøgelse.
Figur 1. A) fotografi af Huso Huso stør (10 år gammel). B) morfologiske kendetegn for stør. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Infographic af fin cortisol analyse5,6 udført i laboratoriet. Alle fotografier præsenteret i infografik abstrakt blev taget i laboratoriet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Stør arter (SS) | Vaskemiddel (WS) | P-værdi | ||||||||
| Huso Huso | Acipenser Acipenser | Acipenser Acipenser | Sem | Vand | Isopropanol | Sem | Ss | Ws | SS × WS | |
| Cortisol (PG mg-1) | ||||||||||
| 3,46 | 2,85 | 3,34 | 0,41 | 2,86 | 3,69 | 0,33 | 0,52 | 0,08 | 0,95 | |
Tabel 1. Finkortisol i tre stør arter opnået ved hjælp af to forskellige vaskemidler.
| Vaskemiddel (WS) | Sem | P-værdi | ||
| Vand | Isopropanol | |||
| Cortisol (PG mg-1) | 1,11 | 1,43 | 0,31 | 0,45 |
Tabel 2. Jawbone cortisol niveauer i Beluga Sturgeon (Huso Huso) ved hjælp af to forskellige vaskemidler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sturgeon kaldes sommetider en "levende fossil", fordi det har udstillet nogle få tilpasninger i løbet af de sidste årtusinder. Sturgeon slægten Acipenser indeholder 27 arter, der producerer kaviar; imidlertid producerer tre arter (Beluga, Baerii og Sevruga) det meste af den globale kaviar forsyning. Stør er sårbar over for overfiskning og interferens i deres naturlige habitat og er derfor mere kritisk truet end nogen anden gruppe af arter. Sturgeon tilhører den ældste gruppe af levende hvirveldyr, som har eksisteret i 150.000.000 år. Acipenser arter modne og vokse langsomt; nogle (f. eks. H. Huso) kan leve i 100 år og overstige 2.000 kg i vægt. Stør er bruskfisk uden skalaer, og er karakteriseret ved fem rækker af store, knogleplader kaldet Skællene og taktile barbels placeret på forsiden af munden (figur 1). Fysiologiske forskelle mellem disse arter og andre fisk omfatter nedsat plasma (kortikosteroid) reaktioner på miljømæssige stressorer. Vores finkortisol målinger dokumenterer, at stør kæben akkumulerer cortisol i forhold til cirkulerende koncentrationer.
Fisk udviser talrige reaktioner på fysiske, kemiske og opfattede stressorer. Disse reaktioner er velkendte som adaptive mekanismer, der gør det muligt for fiskene at klare miljøforstyrrelser og opretholde en homeostatisk tilstand. Hvis en stressor er tilstrækkeligt langvarig eller alvorlig, at fiskene ikke er i stand til at genvinde homøostase ved hjælp af dens naturlige respons, så fiskene kan opleve skadelige virkninger, truer dens generelle sundhed og/eller liv19. Køn af stør kan bestemmes fra omkring 2 år af alder. Derfor, for at afgøre, om cortisol niveauer og Sturgeon sex er korreleret, er det nødvendigt at dokumentere langsigtede cortisol ophobning i finner og kæbe knogler (som en ny tilgang og alternative matrix) af stør. Denne undersøgelse er den første til at rapportere finner og kæbeknogle kortisolniveauer i stør.
Rollen som en cortisol vask opløsningsmiddel er at fjerne eksterne cortisol kilder fra huden Slim9. Aerts et al.14 brugt destilleret vand til at fjerne ekstern cortisol forurening fra fisk hud; i tidligere undersøgelser2,5,12,17, vi sammenlignede virkningerne af at bruge isopropanol og vand som et opløsningsmiddel til at undersøge hår cortisol indhold. Virkningerne af vaske opløsningsmiddel kan variere blandt prøverne på grund af forskelle i egenskaberne af stør æg13, hud15, finner og kæbe knogler. Brossa7 rapporterede, at cortisol niveau i skalaer af guldfisk (Carassius auratus) forblev konstant, når isopropanol blev anvendt som opløsningsmiddel uanset antallet af skyller, mens cortisol niveauer varierede, når vand blev brugt. Vores resultater viste, at vaskemiddel ikke havde nogen effekt på kæbe cortisol niveauer. Forskelle mellem disse undersøgelser omfatter antallet af skyller, ryste vs. vortexing, isopropanol renhed, og vigtigere, følsomhed eller modstand af skalaer/hud til ekstern væske penetration. Ghassemi Nejad et al.20 har påvist, at anvendelsen af forskellige assays, såsom RIA og ELISA, kan føre til forskelle i produktionen. Steroider er mere opløselige i lavere molekylmasse alkoholer (f. eks, methanol) end i alkoholer af højere molekylvægt såsom isopropanol4. Methanol ekstraktion denaturerede protein ved at bryde ikke-kovalente bindinger, hvilket giver mulighed for at frigive hår cortisol. Methanol også modificerer hormon struktur ved at bryde ikke-kovalente bindinger, hvilket resulterer i frigivelsen af cortisol fra væv. For effektivt at homogenisere stør finner og kæbe knogler før methanol ekstraktion kan en perle beater bruges til effektivt at nedbryde vævs strukturen. Denne procedure kræver tid til helt at male fin og kæbe prøver; Derfor skal processen gentages for at sikre fuldstændig pulverisering og homogenisering forud for cortisol ekstraktion. Langsom rotation for 18 h tillader gradvis fjernelse af cortisol ved vask.
Som foreslået i tidligere undersøgelser af pattedyr hår4,5,6, eksterne eller interne kilder af cortisol indhold i finner og kæber, bortset fra blod, bør ikke forsømmes. Selv om denne undersøgelse ikke var specifikt designet til at undersøge, hvordan cortisol diffuserer fra blod til finner eller kæber, det fremhæver behovet for at udvide vores viden om denne proces for bedre at fortolke udsving i cortisol fra disse matricer. Egenskaberne af finner og kæbe knogler adskiller sig fra skalaer og hud. Bussy et al.17 kvantificerede cortisol niveauer i søen Sturgeon (A. fulvescens) æg til at undersøge miljømæssige virkninger på maternel fysiologiske tilstand og ægkvalitet. De anvendte methyltert-butylether (MTBE), ethylacetat (AcOEt) MTBE og diethylether (et2O) som vaskemidler og konkluderede, at ethylacetat var det bedste ekstraktionsmiddel med hensyn til nyttiggørelse og matrix effekt. I denne undersøgelse fjernede isopropanol større mængder af eksternt cortisol fra hudslim under vask, hvilket førte til en let overvurdering af cortisol fra stør finner, som skal overvejes nøje ved tolkning af ekstraktionsresultater. Det er muligt, at isopropanol var i stand til at skylle huden af Finnen, som det er blevet rapporteret i en tidligere undersøgelse7. Isopropanol er kendt for at trænge ind hårsækkene og fiske skalaer4,7. Resultaterne af denne undersøgelse indikerer, at valget af opløsningsmiddel ikke havde nogen signifikant effekt på cortisol niveauer, hvilket tyder på, at cortisol ekstraktion kan være vanskeligere i nogle dele af finnen end i andre ved hjælp af ultrarent vand; i sådanne tilfælde kan isopropanol anvendes som et alternativ.
Denne undersøgelse viste anvendeligheden af kæbeknoglen som en ny matrix for pålidelig indikation af stress i stør. H. Huso Jawbone cortisol-værdier var de samme som dem, der udvindes af finner af samme art; fremtidige undersøgelser bør bekræfte dette resultat blandt forskellige arter, aldre og køn via korrelationsanalyse. Et lavt antal fisk blev anvendt i den nuværende undersøgelse på grund af de høje omkostninger ved stør; Vi forsøgte at overvinde denne begrænsning ved at teste hver prøve to gange og også dupligere methanol ekstraktion for ELISA. Ved hjælp af Quadruple multiplikation kunne øge kraften i testen til at dække det lave antal prøver.
Vi konkluderer, at typen af vaskemiddel i moderat grad påvirkede cortisol ekstraktion fra finner, men ikke kæber, af stør. Før man generaliserer konklusionen af denne undersøgelse og validerer disse resultater, bør der foretages yderligere forskning ved hjælp af forskellige arter og opløsningsmidler. Det foreliggende arbejde dokumenterer, at stør-kæben kan anvendes som en alternativ matrix i fremtidige studier med cortisol som et indeks for stress i stør. Det fremgik også af undersøgelsen, om ELISA var egnet til måling af kortisol af fin-og kæbeknogle. Fremtidig forskning bør fokusere på to aspekter: 1) bestemmelse af sammenhængen mellem cortisol niveauer i kæbe knogler og dem i finner af stør og 2) høst matrix prøver for cortisol måling fra ældre fisk og deres kaviar til at bestemme langsigtet stress niveauer i forskellige stør arter i løbet af levetiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev udført med støtte fra det kooperative forsknings program for landbrug videnskab & teknologiudvikling (Projekttitel: husdyr produktivitet ændring analyse med klimaændringer, projekt nr. PJ012771), administration af udvikling af landdistrikter, Republikken Korea. Denne undersøgelse blev også støttet af et tilskud (nr. PJ01344604) fra Animal Nutrition & Physiology-teamet, National Institute of Animal Science, RDA, Seoul, Republikken Korea. Forfatterne anerkender taknemmeligt Persisk gestus CEO Mohammad Hassan Salmanzadeh og hans team, der leverede fisk fra de tre stør arter undersøgt i denne undersøgelse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Disposal latex surgical gloves | Ansell | 63754090 | |
| Platform scale-electronic weighing 100kg | Baskoolnikoo | 101 EM | |
| Serological pipette to deliver up to 24 mL | Becton Dickinson Falcon | 35-7550 | |
| Micro plate reader with 450 nm and 490 to 492 nm reference filters | BioTek | 8041000 | |
| Reagent reservoirs | BrandTech | 703459 | |
| Zipper storage plastic bag | Cleanwrap | 30cm x100m | |
| Isopropyl alcohol | Daejung chemicals & Metals | 5035-4400 | |
| Methyl alcohol | Daejung chemicals & Metals | 5558-4100 | |
| Tube rotator- MX-RL-Pro | DLAB Scientific | 824-222217777 | |
| Precision pipette to deliver 1.5 and 10 mL | Eppendorf Research Plus | M21518D | |
| Precision pipette to deliver 15 and 25 μL | Eppendorf Research Plus | R25623C | |
| Weighing paper (107 x 210 mm) | Fisherbrand | 09-898-12B | |
| Bead beater, 50/60 Hz 2A | GeneReach Biotechnology Corp | tp0088 | |
| Plate rotator with orbit capable of 500 rpm | Hangzhou Miu Instrument | MU-E30-1044 | |
| Disposable polypropylene tubes to hold at least 24 mL | Hyundai Micro | H20050 | |
| Fume hood | Kwang Dong Industrial | KD 901-22128175 | |
| Micro-centrifuge capable of 1500 x g | Labo Gene | 9.900.900.729 | |
| Mini vortex mixer | LMS | VTX-3000L | |
| Lotte aluminum foil roll | Lotte Aluminum | B0722X5FK5 | |
| Digital scale | Mettler Toledo | ME204 | |
| Ultrapure water | MDM | MDM-0110 | |
| Pipette tips | Neptune Scientific | REF 2100.N | |
| Large fish net | Pond H2O | Hoz135 | |
| Salivary cortisol kit | Salimetrics | 1-3002-4 | |
| Bone cutting forceps | Sankyo | 26-188A | |
| Precision multichannel pipette to deliver 50 μL and 200 μL | VITLAB | 18A68756 | |
| Towel | Yuhan Kimberly | 1707921546 | |
| Tissue paper (107 × 210) | Yuhan Kimberly | 41117 |
References
- Meyer, J. S., Novak, M. A. Hair cortisol: a novel biomarker of hypothalamic-pituitary- adrenocortical activity. Endocrinology. 153, 4120-4127 (2012).
- Ghassemi Nejad, J., et al. A cortisol study: facial hair and nails. Journal of Steroids Hormonal Sciences. 7, 1-5 (2016).
- Meyer, J. S., Novak, M. A., Hamel, A., Rosenberg, K. Extraction and analysis of cortisol from human and monkey hair. Journal of Visualized Experiments. (83), e50882 (2014).
- Davenport, M. D., Tiefenbacher, S., Lutz, C. K., Novak, M. A., Meyer, J. S. Analysis of endogenous cortisol concentrations in the hair of rhesus macaques. General and Comparative Endocrinology. 147, 255-261 (2006).
- Ghassemi Nejad, J., Ataallahi, M., Park, H. K. Methodological validation of measuring Hanwoo hair cortisol concentration using bead beater and surgical scissors. Journal of Animal Science and Technology. 61, 41-46 (2019).
- Ghassemi Nejad, J., et al. Wool cortisol is a better indicator of stress than blood cortisol in ewes exposed to heat stress and water restriction. Animal. 8, 128-132 (2014).
- Brossa, A. C. Cortisol in skin mucus and scales as a measure of fish stress and habitat quality. Ph.D. dissertation. , Faculty of Veterinary Medicine, Universitat Autonoma de Barcelona. Ph.D. dissertation (2018).
- Carbajal, A., et al. Cortisol detection in fish scales by enzyme immunoassay: biochemical and methodological validation. Journal of Applied Ichthyology. 34, 1-4 (2018).
- Bertotto, D., et al. Alternative matrices for cortisol measurement in fish. Aquaculture Research. 41, 1261-1267 (2010).
- Ghassemi Nejad, J., Jeong, C., Shahsavarani, H., Sung, I. K., Lee, J. Embedded dental cortisol content: a pilot study. Endocrinology & Metabolic Syndrome. 5, 240 (2016).
- Pankhurst, N. W. The endocrinology of stress in fish: an environmental perspective. General and Comparative Endocrinology. 170, 265-275 (2011).
- Ghassemi Nejad, J., Kim, W. B., Lee, B. H., Sung, K. I. Coat and hair color: hair cortisol and serotonin levels in lactating Holstein cows under heat stress conditions. Animal Science Journal. 88, 190-194 (2017).
- Baker, M. R., Gobush, K. S., Vynne, C. H. Review of factors influencing stress hormones in fish and wildlife. Journal of Nature Conservation. 21, 309-318 (2013).
- Aerts, J., et al. Scales tell a story on the stress history of fish. PLoS One. 10, e0123411 (2015).
- Heimbürge, S., Kanitz, E., Otten, W. The use of hair cortisol for the assessment of stress in animals. General and Comparative Endocrinology. , 10-17 (2019).
- Ghassemi Nejad, J., et al. Comparing hair cortisol concentrations from various body sites and serum cortisol in Holstein lactating cows and heifers during thermal comfort zone. Journal of Veterinary Behavior: Clinical and Application Research. 30, 92-95 (2019).
- Bussy, U., Wassink, L., Scribner, K. T., Li, W. Determination of cortisol in lake sturgeon (Acipenser fulvescens) eggs by liquid chromatography tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography B. 1040, 162-168 (2017).
- SAS. 1999. SAS. User's Guide (Version 8.01 Edition). , SAS Inst. Inc. Cary, NC, USA. (1999).
- Barton, B. A. Stress in fishes: a diversity of responses with particular reference to changes in circulating corticosteroids. Integrative and Comparative Biology. 42, 517-525 (2002).
- Ghassemi Nejad, J., et al. Measuring hair and blood cortisol in sheep and dairy cattle using RIA and ELISA assay: a comparison. Biological Rhythm Research. Accepted. , (2019).
