Summary
이 연구에서는, 우리는 철갑상어 종의 지느러미와 턱뼈에서 코티솔 추출을 위한 프로토콜을 제시합니다. 지느러미와 턱뼈 코티솔 수준은 ELISA 검소에 선행된 2개의 세척 용매를 비교하여 더 조사되었습니다. 이 연구는 새로운 스트레스 지표로 턱뼈 코티솔의 타당성을 시험.
Abstract
이 연구의 목적은 두 개의 세척 용매 (물과 이소 프로판올)를 사용하여 철갑상어 지느러미에서 코티솔을 추출하는 기술을 개발하고 세 가지 주요 외과 의사 종 중 지느러미 코티솔 수준의 차이를 정량화하는 것입니다. 지느러미는 벨루가7개(후소후소),시베리아 7개(아시펜서바에리이),세브루가 5개(A.stellatus)등 19척의 희생된 철갑상어에서 수확되었다. 철갑상어는 이란 농장에서 2년(2017-2018년)에 자랐으며, 코티솔 추출 분석은 한국에서(2019년 1월~2월) 실시되었습니다. 5 H. 후소에서 턱뼈는 또한 코티솔 추출에 사용되었다. 데이터는 SAS 환경에서 의 일반 선형 모델(GLM) 프로시저를 사용하여 분석하였다. 변이의 인트라-및 인터-분석 계수는 각각 14.15 및 7.70이었다. 간단히, 코티솔 추출 기술은 용매 (초순수 및 이소프로판올)의 3 mL로 시료 (300 ± 10 mg)를 두 번 세척하고, 80rpm에서 2.5 분 동안 회전하고, 7 일 동안 실온 (22-28 °C)에서 세척 된 샘플을 공기 건조하고, 추가 건조를 포함했습니다. 50 Hz에서 비드 비터를 사용하여 32 분 동안 시료를 분말로 분쇄하고 건조 된 분말 (75 ± 5 mg)에 1.5 mL 메탄올을 적용하고, 연속 혼합으로 실온에서 18 시간 동안 느린 회전 (40 rpm)을 적용합니다. 추출 후, 샘플을 원심분리(10분 동안 9,500 x g)하고, 1 mL 상급제를 새로운 미세원심지 튜브(1.5 mL)로 옮겼고, 메탄올을 증발시키기 위해 38°C에서 배양하고, 효소 연계 면역흡착 분석(ELISA)을 통해 분석하였다. . 종 사이 핀 코 티 솔 수준에서 또는 세척 용매 사이 지 느 러 미와 턱뼈 코 티 솔 수준에서 차이가 관찰 되었다. 이 연구의 결과는 철갑상어 턱뼈 매트릭스가 단단한 행렬에 유망한 대체 응력 지표이다는 것을 보여줍니다.
Introduction
코티솔은 동물의 스트레스를 신뢰할 수 있는 지표입니다. 코 티 솔 추출 스트레스 수준에 스트레스 수준 및 일반적인 패턴을 모니터링 하는 연구원에 대 한 유효한 프레임 워크를 제공 합니다. 예를 들어, 이전 연구는 인간1,2,원숭이3,4,가축5,양6,및 다양한 방법을 사용하여 모발 코티솔 측정의 방법론적 검증을 수행하였다. 금붕어7,8. 물고기 종에서, 비늘 등 매트릭스에서 코 티 솔 측정, 피부 점액, 대변, 그리고 혈액9 물고기 건강에 대 한 정보를 제공 하기 위해 표시 되었습니다. 혈액 샘플링이 문제가 있거나 비늘이 부족할 때, 코티솔 추출을 위한 대체 매트릭스가 필요합니다. 물고기에서, 대체 행렬은 턱뼈, 인간의 치아와 유사한 단단한 조직을 포함할 수있다(10).
생선 스트레스 수준을 결정하는 새로운 행렬 및 검증 된 기술의 개발은 외과 의사가 환경 스트레스 요인에 장기간 노출을 경험할 수있는 캐비어 산업에 특히 관심이 있습니다11. 철갑상어의 성별은 2 세 이전에 결정 될 수 없으며 외과 의사는 비늘이 없습니다. 코티솔은 성장단계2, 7,12동안 고체 행렬에 점차 적으로 축적하기 때문에 지느러미와 턱뼈와 같은 단단한 매트릭스의 장기 코티솔 축적 데이터는 스트레스에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 다른 성장 단계에서 수준. 대조적으로, 혈액 코티솔 수준은 죽음의 시간에 긴장 수준의 스냅 샷을 제공하고 정확하게 장기 양육 조건 동안 스트레스를 나타낼 수 없습니다13,14. 캐비어 시장에서 경쟁이 치열해짐에 따라 장기 사육 기간(8-12년 이상)동안 철갑상어 종중 건강한 계란 생산을 위한 스트레스 조건을 개선하기 위한 새로운 접근법이 점점 더 중요한 연구 분야입니다. 철갑상어의 높은 비용으로 인해, 수확 된 샘플은 매우 비용이 많이 듭니다 (종과 성장 단계에 따라 성숙한 물고기 당 $ 8,000-15,000), 연구 프로젝트의 제한 요소. 그러나, 철갑상어 지느러미와 턱뼈에서 코티솔 추출을 위한 적절한 기술의 개발은 양식과 소비를 위한 철갑상어 계란의 수확을 향상시키기 위하여 어류 양식 시스템 및 야생 물고기에 둘 다 유용하게 적용될 수 있었습니다 보존.
신뢰할 수있는 결과6을제공 할뿐만 아니라 적절한 코티솔 추출 기술을 선택하는 것은 시료 준비 중에 매트릭스에 존재하는 다른 화합물이 출력을 혼동하지 않도록하는 것이 매우 중요합니다. 일치하지 않는 결과. 지느러미와 턱뼈 코티솔 수치가 주변 물의 호르몬 수치에 영향을 받는지 여부를 결정하는 것이 똑같이 중요합니다. Heimbürge 외15 요인의 숫자는 나이 포함 하 여 코 티 솔 수준에 영향을 미칠 수 있습니다 제안, 성별, 임신, 시즌, 색상12,그리고 코 티 솔 추출 되는 신체 영역16. 그러나, 생선 체내에서 코티솔 추출에 대한 용매 세척의 효과에 대한 정보는 거의없으며,철갑상어 계란17을제외하고는 철갑상어에서 이러한 효과에 대해서는 전혀 알 수 없다.
철갑상어의 지느러미와 턱뼈에서 기준선 코티솔 수준을 분석하는 것은 물고기를 안락사시켜야 하지만, 이 접근법은 살아있는 외과 의사에서 혈액 샘플링에 필요한 침습적 기술을 수반하지 않습니다. 지느러미 및 턱뼈 샘플은 쉽게 수집되며 이러한 조직에서 추출하면 신속하게 수행 할 수 있습니다. 마찬가지로, 호르몬 추출 및 분석간단 하 고 거의 전문된 장비를 필요로.
이 연구에서는, 우리는 이 행렬에서 측정된 코티솔 수준이 응력으로 안정적으로 사용될 수 있는지 여부를 결정하는 것을 목표로, 물고기 지느러미및 턱뼈에서 코티솔의 추출, 세척 및 측정을 위한 새롭고 쉽게 적용된 기술을 제시합니다. 지표. 이 기술의 장점은 쉽고 비 침습적인 8 접근 법, 적은 데이터 변화 및 신뢰할 수있는 출력1,6,8,17을포함한다; 이 기술은 철갑상어와 같은 비늘이없는 물고기 종에 적용 할 수 있습니다. 이 기술은 물고기의 도살, 적절한 세척용매의 선택2,4,샘플3, 5,전문 효소 연결 면역 흡착 분석 (ELISA)의 적절한 연삭을 필요로한다. 응용 프로그램5,7, 고체 행렬에 코티솔 소스의 통합의 광범위한 지식6.
두 개의 다른 세척 용매 (초순수 및 이소 프로판올)를 적용하여 세 가지 철갑상어 종에서 지느러미의 기저 코티솔 수준을 얻었습니다 : 벨루가(후소 후소),시베리아(Acipenser baerii),그리고 세브루가(A. stellatus) ), 각 종에 대한 표준 환경 조건하에서. H. huso의 턱뼈는 또한 외과 의사에 있는 응력 평가하기 위하여 이용되었습니다. 이것은 철갑상어 턱뼈에 있는 코티솔 수준을 측정하는 첫번째 연구 결과입니다. 이 연구의 결과는 초기 성장 단계에서 철갑상어 종에 대한 비교 코티솔 데이터를 제공 할 것입니다 (~ 1 년) 섹스 결정 하기 전에.
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Protocol
다음 실험 절차와 방법은 강원대학교 춘천대학교 동물복지윤리청의 승인을 받았습니다.
1. 핀 컬렉션
- 그물을 사용하여 철갑상어를 부드럽게 캡처하여 부상과 스트레스를 최소화하십시오.
- 생선을 깨끗한 물로 조심스럽게 헹구고 안락사 전에 흡수성 수건으로 몸 표면을 닦아냅니다.
- 물고기가 기절하거나 의식을 잃게되도록 플라스틱 망치를 사용하여 물고기의 머리를 명중. 칼을 사용하여 머리를 제거합니다.
- 체중(g)과 길이(cm)를 측정합니다.
- 안락사 후, 멸균 수술 가위를 사용하여 가능한 한 몸에 가깝게 절단하여 지느러미 샘플을 수집합니다.
참고: 각 생선에 대해 재활용되지 않은 흡수성 수건을 사용해야 합니다. 본 연구에서 사용된 종에 대한 설명 통계는 다음과 같다: 벨루가 철갑상어(H. huso):연령 = 18±2.1 개월, 체중 = 2,700±300 g, 및 체길이 = 55±5 cm; 시베리아철갑상어(A. baerii):나이 = 9.6±2.4개월, 체중 = 1,750±250 g, 및 체길이 = 45±5 cm; 세브루가 철갑상어(A. 스텔라투스):나이 = 14 ± 1.3 개월, 체중 = 1,000 ± 100g, 몸 길이 = 65 ± 5 cm.
2. 코티솔 추출을위한 핀 준비
- 핀 샘플(티슈당 샘플 1개: ~3g)을 실험실 계량 용지(107mm × 210mm)에 놓고 건조될 때까지 며칠 동안 실온에서 건조시십시오.
- 샘플을 알루미늄 호일 시트에 싸서 라벨이 부착된 비닐 봉지에 담아 실험실로 옮김을 옮김을 합니다.
- 세척, 코티솔 추출, 건조 및 ELISA 분석을 포함하여 추가 사용을 위해 냉장고에 샘플을 저장합니다(그림2).
3. 핀 코티솔 분석
- 디지털 분석 스케일(정확도: 0.0001)을 교정하고 스케일 팬의 계량 용지로 300±10 mg 샘플을 계량합니다.
- 샘플을 씻으시다.
- 각 샘플을 15L 원엽 폴리프로필렌 튜브로 옮김. 5,000 μL 단일 채널 파이펫을 사용하여 각 튜브에 3 mL의 이소프로판올을 추가합니다.
- 코티솔을 씻어 내고 잠재적 인 외부 오염을 제거하기 위해 2.5 분 동안 80rpm에서 튜브를 돌십시오. 이 절차를 두 번 반복합니다.
- 세척된 시료를 실온(22-28°C)에서 7일 동안 공기 건조시켰다.
- 세척제로 초순수를 사용하여 세척 절차를 반복합니다.
- 뼈 절단 집게를 사용하여 신체 조직에서 턱뼈를 추출합니다. 턱뼈 샘플에 단계 1.5-3.2.4를 적용합니다.
- 32분 동안 50Hz에서 비드 비터를 사용하여 말린 지느러미 또는 턱뼈 샘플을 계량(75±5 mg)합니다.
- 100 μL 파이펫을 사용하여 분말 핀 또는 턱뼈를 함유한 각 튜브에 1.5 mL의 메탄올을 전달합니다. 샘플을 튜브 회전자(40rpm)에서 실온에서 18시간 동안 천천히 회전하여 코티솔을 추출하여 연속 혼합합니다.
- 코티솔 추출 후, 실온에서 10 분 동안 9,500 x g의 샘플을 원심 분리합니다. 원심 분리 후, 각 샘플에서 코티솔 (1 mL)을 함유 한 상부 유기 층을 수집하고 별도의 1.5 mL 마이크로 원심 분리튜브에 넣습니다.
- 메탄올을 증발시키기 위해 38°C에서 인큐베이션하여 시료를 건조시다. 추출된 코티솔 샘플을 하룻밤 동안 연기 후드 아래에 보관하여 메탄올이 소멸되도록 합니다.
참고 : 코티솔 함유 층은 일반적으로 색상이 황색입니다.
- 메탄올을 증발시키기 위해 38°C에서 인큐베이션하여 시료를 건조시다. 추출된 코티솔 샘플을 하룻밤 동안 연기 후드 아래에 보관하여 메탄올이 소멸되도록 합니다.
4. 핀 코티솔 검출
- ELISA 키트를 사용하기 전에 건조된 지느러미 또는 턱뼈 샘플을 실온에서 1.5시간 동안 해동합니다.
- 15분 동안 1,500 x g에 인산염 완충제, 소용돌이 및 원심분리기를 400 μL 추가합니다.
- 분석 정확도와 신뢰성을 향상시키기 위해 중복으로 각 샘플 (25 μL)을 실행합니다. 표준 곡선 외부의 데이터를 이상값으로 제거합니다.
- 마이크로플레이트 리더를 450 nm로 설정한 다음, μgdL-1로 설정하고 플레이트의 광학 밀도를 판독한다.
- 4매개변수 비선형 회귀 곡선 맞춤이 있는 마이크로플레이트 소프트웨어를 사용합니다. 다음 방정식을 사용하여 소프트웨어에서 얻은 샘플의 코티솔 수준을 pg mg-1로 변환합니다.
F = 10,000E(A/B) (C/D),
여기서 F=핀 코티솔 수준의 최종 값(pgmg-1),E=건조 추출물을 재구성하는 데 사용되는 분석 버퍼의 부피(mL), A=분석 출력에 의해 제공되는 농도(μgdL-1),B=추가 를 실시한 핀의 중량(mg)을 ction, C =분말 핀에 첨가된 메탄올의 부피(mL)를, D=메탄올의 부피(mL)를 추출물로부터 회수한 후이어서 건조시켰다 3.
- 4매개변수 비선형 회귀 곡선 맞춤이 있는 마이크로플레이트 소프트웨어를 사용합니다. 다음 방정식을 사용하여 소프트웨어에서 얻은 샘플의 코티솔 수준을 pg mg-1로 변환합니다.
5.통계분석
- 세척 절차 전에 각 샘플을 두 개의 하위 샘플로 나눈 다음 ELISA 키트 분석(샘플당 2 × 2 = 4 관측값) 동안 중복으로 실행하여 테스트의 힘과 결과의 신뢰성을 향상시킵니다.
- SAS 소프트웨어 환경에서 일반 선형 모델(GLM) 절차를 측정데이터(18)에적용하여 두 세척 용매와 이들의 상호작용의 효과를 비교한다.
- p & 0.05의 유의 수준에서 Tukey의 테스트를 사용하는 수단 간의 테스트 차이. 0.05
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Representative Results
제시된 지느러미 코티솔 추출 기술은 3개의 철갑상어 종을 사용하여 이 연구에서 개발되고 확인되었습니다. 세척 용매로서 초순수 및 이소프로판올을 사용하여 얻은 코티솔 수준을 비교하였다(도2). H. huso 턱뼈에서 코티솔은 철갑상어 턱뼈가 지느러미에 대한 대체 매트릭스로 사용될 수 있는지 여부를 결정하기 위해 검사되었습니다. 세척 용매, 철갑상어 종 및 이들의 상호 작용의 효과는 표 1에나타내있습니다. 코티솔 수준은 물로 세척한 것보다 이소프로판올로 세척된 핀 샘플에서 더 높은 경향이 있었다(p = 0.089). 철갑상어 종 중 지느러미 코티솔 수준 (p = 0.525)에는 유의한 차이가 없었습니다. 세척 용매와 철갑상어 종 사이에 유의한 상호 작용이 없었다 (p = 0.947). 세척 용매는 H. 후소 외과 (p = 0.45)에서 코티솔 수준에 유의한 영향을 미치지 않았다(표 2). 변이의 인트라 분석 및 상호 분석 계수는 각각 14.15 및 7.70이었다. 이 데이터는 3종의 철갑상어종(표 1)과 H. 후소턱뼈(표 2)의 지느러미 사이에서 높은유사성을보였다. 우리는 단지 H. huso에서턱뼈 견본을 장악했기 때문에 턱뼈에 있는 코티솔 수준 과 다른 철갑상어 종의 지느러미에 있는 그들 사이 상관관계를 조사하지 않았습니다. 이러한 관계는 향후 연구에서 탐구되어야 합니다.
그림 1. (A) 후소 후소 철갑상어 (10 세)의 사진. (B)외과 의 형태학적 특성. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 핀 코티솔 분석의 인포 그래픽5,6 실험실에서 수행. 인포그래픽 추상화에 제시된 모든 사진은 실험실에서 찍은 것입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 철갑상어 종 (SS) | 세탁 용매 (WS) | P 값 | ||||||||
| 후소 후소 | 아시펜서 바에리이 | 아시펜저 스텔라투스 | Sem | 물 | 이소프로판올 | Sem | Ss | Ws | SS×WS | |
| 코 티 솔 (pgmg-1) | ||||||||||
| 3.46 | 2.85 | 3.34 | 0.41 | 2.86 | 3.69 | 0.33 | 0.52 | 0.08 | 0.95 | |
표 1. 2개의 상이한 세척 용매를 사용하여 얻은 3개의 철갑상어 종에 있는 지느러미 코티솔 수준.
| 세탁 용매 (WS) | Sem | P 값 | ||
| 물 | 이소프로판올 | |||
| 코 티 솔 (pgmg-1) | 1.11 | 1.43 | 0.31 | 0.45 |
표 2. 두 개의 다른 세척 용매를 사용 하 여 beluga 외과 의사(후소 후소)에서턱뼈 코 티 솔 수준.
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Discussion
철갑상어는 지난 천년 동안 몇 가지 적응을 전시했기 때문에 때때로 "살아있는 화석"이라고합니다. 철갑상어 속 Acipenser는 캐비어를 생산하는 27 종을 포함; 그러나, 세 종 (벨루가, baerii, 세브루가) 글로벌 캐비어 공급의 대부분을 생산하고 있습니다. 철갑상어는 자연 서식지에서 의 외낚시와 간섭에 취약하기 때문에 다른 어떤 종보다도 더 심각한 멸종 위기에 처해 있습니다. 철갑상어는 1억 5천만 년 동안 존재해 온 가장 오래된 살아있는 척추동물 그룹에 속합니다. Acipenser 종 성숙 하 고 천천히 성장; 일부 (예를 들어, H. huso)100 년 동안 살 수 있고 무게2,000kg을 초과할 수 있습니다. 철갑상어는 비늘이 없는 연골 물고기이며, 입 앞에 있는 스큐와 촉각 바벨이라고 불리는 5열의 큰 뼈판이특징입니다(그림 1). 이 종과 그밖 물고기 사이 생리적인 다름은 환경 스트레스에 감소된 플라즈마 (코르티코스테로이드) 반응을 포함합니다. 우리의 지느러미 코티솔 측정은 철갑상어 턱뼈가 순환 농도에 비례하여 코티솔을 축적한다는 증거를 제공합니다.
물고기는 물리적, 화학적, 그리고 인식된 스트레스에 대한 수많은 반응을 표시합니다. 이러한 반응은 물고기가 환경 장애에 대처하고 항상성 상태를 유지할 수 있도록 적응 메커니즘으로 잘 알려져 있습니다. 스트레스는 충분히 장기간 또는 물고기의 자연적인 응답을 사용 하 여 항상성을 회복 할 수 없습니다 심각한 경우, 다음 물고기 부작용을 발생할 수 있습니다., 전반적인 건강 및/또는 생활 을 위태롭게19. 철갑상어의 성별은 약 2 세에서 결정될 수 있습니다. 따라서 코티솔 수준과 철갑상어 섹스가 상관 관계가 있는지 여부를 결정하기 위해 외과 의사는 지느러미와 턱뼈 (새로운 접근법 및 대체 매트릭스)에서 장기 코티솔 축적을 문서화해야합니다. 이 연구는 철갑상어에 있는 지느러미와 턱뼈 코티솔 수준을 보고하는 첫번째입니다.
코티솔 워시 용매의 역할은 피부 점액9에서외부 코티솔 소스를 제거하는 것입니다. Aerts 외.14 물고기 피부에서 외부 코 티 솔 오염을 제거 하기 위해 증류수를 사용; 이전 연구에서2,5,12,17, 우리는 모발 코티솔 함량을 검사하기 위해 용매로 이소프로판올과 물을 사용하는 효과를 비교했습니다. 세척 용매의 효과는 철갑상어 계란13,피부15,지느러미 및 턱뼈의 특성의 차이로 인해 샘플마다 다를 수 있습니다. Brossa7은 금붕어(카라시우스 오라투스)의비늘에서 코티솔 수준이 이소프로판올이 세차 수에 관계없이 용매로 사용되었을 때 일정하게 유지되었다고 보고한 반면, 코티솔 수준은 물을 사용할 때 다양했습니다. 우리의 결과는 세척 용매가 턱 코티솔 수준에 아무런 영향을 미치지 않았다는 것을 보여주었습니다. 이러한 연구 간의 차이 포함 서 스의 수, 흔들 기 대 소용돌이, 이소 프로판 골 순도, 그리고 중요 한 것은, 감도 또는 외부 액체 침투에 비늘/피부의 저항. Ghassemi Nejad외 20은 RIA 및 ELISA와 같은 다른 실험의 적용이 출력의 차이로 이어질 수 있음을 입증했다. 스테로이드는 이소프로판올4와같은 분자량이 높은 알코올보다 낮은 분자량 알코올(예를 들어, 메탄올)에서 더 용해된다. 메탄올 추출은 비공유 결합을 파괴하여 단백질을 변성시켜 모발 코티솔 방출을 허용합니다. 메탄올은 또한 비 공유 결합을 파괴하여 호르몬 구조를 수정, 조직에서 코티솔의 방출의 결과. 메탄올 추출 전에 철갑상어 지느러미와 턱뼈를 효과적으로 균질화하기 위해 비드 비터를 사용하여 조직 구조를 효율적으로 분해할 수 있습니다. 이 절차는 완전히 지느러미와 턱뼈 샘플을 분쇄하는 시간이 필요합니다; 따라서 코티솔 추출 전에 완전한 분쇄 및 균질화를 보장하기 위해 공정을 반복해야합니다. 18 h에 대 한 느린 회전 세척 하 여 코 티 솔의 점진적인 제거를 허용.
포유류 모발의 이전 연구에서 제안 된 바와 같이4,5,6, 혈액 이외의 지느러미와 턱의 코티솔 함량의 외부 또는 내부 공급원은 무시해서는 안됩니다. 이 연구는 코티솔이 혈액에서 지느러미 또는 턱으로 어떻게 확산되는지 조사하기 위해 특별히 고안되지는 않았지만, 이러한 행렬에서 코티솔의 변동을 더 잘 해석하기 위해이 과정에 대한 지식을 확장 할 필요성을 강조합니다. 지느러미와 턱뼈의 특성은 비늘과 피부의 특성과 다릅니다. Bussy외. 17 호수 철갑상어에 있는 정량화된 코티솔 수준(A. fulvescens)계란은 모계 생리적 상태 및 계란 질에 환경 효력을 조사하기 위하여. 그들은 메틸 테르트 부틸레테르 (MTBE), 에틸 아세테이트 (AcOEt) MTBE 및 디에틸 에테르(Et2O)를 세척 용매로 사용하고 에틸 아세테이트가 회수 및 매트릭스 효과 면에서 최고의 추출 용매라는 결론을 내렸습니다. 본 연구에서, 이소프로판올은 세척 하는 동안 피부 점액에서 외부 코 티 솔의 더 많은 금액을 제거, 철갑 지 느 러 미에서 코 티 솔의 약간의 과대 평가로 이어지는, 추출 결과 해석 할 때 신중 하 게 고려해 야 한다. 이전 연구에서 보고된 바와 같이 이소프로판올이 지느러미의 피부를 씻어낼 수 있었을 수도있습니다 7. 이소프로판올은 모낭과 생선비늘을관통하는 것으로 알려져 있으며4,7. 본 연구의 결과는 용매의 선택이 코티솔 수준에 유의한 영향을 미치지 않았다는 것을 나타냅니다, 코티솔 추출은 초순수를 사용하는 다른 부분에서 보다 지느러미의 일부에서 더 어려울 수 있음을 시사; 이러한 경우에, 이소프로판올은 대안으로 사용될 수 있다.
이 연구는 외과 의사에 스트레스의 신뢰할 수있는 표시에 대한 새로운 매트릭스로 턱뼈의 적용가능성을 입증했다. H. huso 턱뼈 코티솔 값은 동일한 종의 지느러미로부터 추출된 값과 유사했습니다. 향후 연구는 상관 관계 분석을 통해 다른 종, 연령 및 남녀 간에 이 결과를 확인해야 합니다. 생선의 낮은 수 때문에 외과 의 높은 비용으로 현재 연구에서 사용되었다; 우리는 각 샘플을 두 번 테스트하고 ELISA에 대한 메탄올 추출을 복제하여 이러한 한계를 극복하려고 시도했습니다. 4중 곱셈을 사용하면 낮은 수의 샘플을 커버하기 위해 테스트의 힘을 증가시킬 수 있습니다.
우리는 세척 용매의 유형이 적당히 영향을받는 코티솔 추출에 영향을 미치지만 턱은 아닌 외과 의사라고 결론지을 수 있습니다. 이 연구의 결론을 일반화하고 이러한 결과를 검증하기 전에 다른 종과 용매를 사용하여 추가 연구가 수행되어야합니다. 본 작품은 철갑상어턱뼈가 외과 의사에 스트레스의 인덱스로 코티솔을 사용하여 미래 연구에서 대체 매트릭스로 적용 될 수 있다는 증거를 제공합니다. 지느러미 및 턱뼈 코티솔 측정을 위한 ELISA의 적합성은 또한 본 연구에서 입증되었다. 미래 연구는 두 가지 측면에 초점을 맞추어야한다: 1) 턱뼈의 코티솔 수준과 철갑상어의 지느러미에 있는 것과 2) 오래된 물고기와 그들의 캐비어에서 코티솔 측정을 위한 매트릭스 견본을 수확하는 그 사이에서 상관관계를 결정하는 것은 장기적인 스트레스를 결정하기 위하여 수명 동안 다른 철갑상어 종의 수준.
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Disclosures
저자는 공개할 이해상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 사업은 농업과학기술개발협력연구프로그램(프로젝트제목: 기후변화에 의한 축산생산성변화분석, 프로젝트번호)의 지원으로 진행되었다. PJ012771), 한국 농촌진흥청. 또한, 이 연구는 보조금에 의해 지원되었다 (아니오. PJ01344604) 동물영양생리학과, 국립동물과학원, RDA, 서울, 대한민국. 저자는 감사페르시아 제스처 CEO 모하마드 하산 살만자데와 그의 팀을 인정, 누가이 연구에서 검사 세 철갑상어 종에서 물고기를 제공.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Disposal latex surgical gloves | Ansell | 63754090 | |
| Platform scale-electronic weighing 100kg | Baskoolnikoo | 101 EM | |
| Serological pipette to deliver up to 24 mL | Becton Dickinson Falcon | 35-7550 | |
| Micro plate reader with 450 nm and 490 to 492 nm reference filters | BioTek | 8041000 | |
| Reagent reservoirs | BrandTech | 703459 | |
| Zipper storage plastic bag | Cleanwrap | 30cm x100m | |
| Isopropyl alcohol | Daejung chemicals & Metals | 5035-4400 | |
| Methyl alcohol | Daejung chemicals & Metals | 5558-4100 | |
| Tube rotator- MX-RL-Pro | DLAB Scientific | 824-222217777 | |
| Precision pipette to deliver 1.5 and 10 mL | Eppendorf Research Plus | M21518D | |
| Precision pipette to deliver 15 and 25 μL | Eppendorf Research Plus | R25623C | |
| Weighing paper (107 x 210 mm) | Fisherbrand | 09-898-12B | |
| Bead beater, 50/60 Hz 2A | GeneReach Biotechnology Corp | tp0088 | |
| Plate rotator with orbit capable of 500 rpm | Hangzhou Miu Instrument | MU-E30-1044 | |
| Disposable polypropylene tubes to hold at least 24 mL | Hyundai Micro | H20050 | |
| Fume hood | Kwang Dong Industrial | KD 901-22128175 | |
| Micro-centrifuge capable of 1500 x g | Labo Gene | 9.900.900.729 | |
| Mini vortex mixer | LMS | VTX-3000L | |
| Lotte aluminum foil roll | Lotte Aluminum | B0722X5FK5 | |
| Digital scale | Mettler Toledo | ME204 | |
| Ultrapure water | MDM | MDM-0110 | |
| Pipette tips | Neptune Scientific | REF 2100.N | |
| Large fish net | Pond H2O | Hoz135 | |
| Salivary cortisol kit | Salimetrics | 1-3002-4 | |
| Bone cutting forceps | Sankyo | 26-188A | |
| Precision multichannel pipette to deliver 50 μL and 200 μL | VITLAB | 18A68756 | |
| Towel | Yuhan Kimberly | 1707921546 | |
| Tissue paper (107 × 210) | Yuhan Kimberly | 41117 |
References
- Meyer, J. S., Novak, M. A. Hair cortisol: a novel biomarker of hypothalamic-pituitary- adrenocortical activity. Endocrinology. 153, 4120-4127 (2012).
- Ghassemi Nejad, J., et al. A cortisol study: facial hair and nails. Journal of Steroids Hormonal Sciences. 7, 1-5 (2016).
- Meyer, J. S., Novak, M. A., Hamel, A., Rosenberg, K. Extraction and analysis of cortisol from human and monkey hair. Journal of Visualized Experiments. (83), e50882 (2014).
- Davenport, M. D., Tiefenbacher, S., Lutz, C. K., Novak, M. A., Meyer, J. S. Analysis of endogenous cortisol concentrations in the hair of rhesus macaques. General and Comparative Endocrinology. 147, 255-261 (2006).
- Ghassemi Nejad, J., Ataallahi, M., Park, H. K. Methodological validation of measuring Hanwoo hair cortisol concentration using bead beater and surgical scissors. Journal of Animal Science and Technology. 61, 41-46 (2019).
- Ghassemi Nejad, J., et al. Wool cortisol is a better indicator of stress than blood cortisol in ewes exposed to heat stress and water restriction. Animal. 8, 128-132 (2014).
- Brossa, A. C. Cortisol in skin mucus and scales as a measure of fish stress and habitat quality. Ph.D. dissertation. , Faculty of Veterinary Medicine, Universitat Autonoma de Barcelona. Ph.D. dissertation (2018).
- Carbajal, A., et al. Cortisol detection in fish scales by enzyme immunoassay: biochemical and methodological validation. Journal of Applied Ichthyology. 34, 1-4 (2018).
- Bertotto, D., et al. Alternative matrices for cortisol measurement in fish. Aquaculture Research. 41, 1261-1267 (2010).
- Ghassemi Nejad, J., Jeong, C., Shahsavarani, H., Sung, I. K., Lee, J. Embedded dental cortisol content: a pilot study. Endocrinology & Metabolic Syndrome. 5, 240 (2016).
- Pankhurst, N. W. The endocrinology of stress in fish: an environmental perspective. General and Comparative Endocrinology. 170, 265-275 (2011).
- Ghassemi Nejad, J., Kim, W. B., Lee, B. H., Sung, K. I. Coat and hair color: hair cortisol and serotonin levels in lactating Holstein cows under heat stress conditions. Animal Science Journal. 88, 190-194 (2017).
- Baker, M. R., Gobush, K. S., Vynne, C. H. Review of factors influencing stress hormones in fish and wildlife. Journal of Nature Conservation. 21, 309-318 (2013).
- Aerts, J., et al. Scales tell a story on the stress history of fish. PLoS One. 10, e0123411 (2015).
- Heimbürge, S., Kanitz, E., Otten, W. The use of hair cortisol for the assessment of stress in animals. General and Comparative Endocrinology. , 10-17 (2019).
- Ghassemi Nejad, J., et al. Comparing hair cortisol concentrations from various body sites and serum cortisol in Holstein lactating cows and heifers during thermal comfort zone. Journal of Veterinary Behavior: Clinical and Application Research. 30, 92-95 (2019).
- Bussy, U., Wassink, L., Scribner, K. T., Li, W. Determination of cortisol in lake sturgeon (Acipenser fulvescens) eggs by liquid chromatography tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography B. 1040, 162-168 (2017).
- SAS. 1999. SAS. User's Guide (Version 8.01 Edition). , SAS Inst. Inc. Cary, NC, USA. (1999).
- Barton, B. A. Stress in fishes: a diversity of responses with particular reference to changes in circulating corticosteroids. Integrative and Comparative Biology. 42, 517-525 (2002).
- Ghassemi Nejad, J., et al. Measuring hair and blood cortisol in sheep and dairy cattle using RIA and ELISA assay: a comparison. Biological Rhythm Research. Accepted. , (2019).
