Summary
I denna studie, vi presenterar ett protokoll för kortisol extraktion från fenan och käkbenet av stör arter. Och käkbenet kortisolnivåer granskades ytterligare genom att jämföra två tvättmedel följt av ELISA-analyser. Denna studie Lopar genomförbarheten av Jawbone kortisol som en roman stress indikator.
Abstract
Syftet med denna studie var att utveckla en teknik för utvinning av kortisol från stör fenor med hjälp av två tvättmedel (vatten och isopropanol) och kvantifiera eventuella skillnader i fenkortisolnivåer bland tre huvud stör arter. Fenor skördades från 19 offrade störer inklusive sju Beluga (och och), sju sibiriska (Acipenser baerii), och fem sevruga (A. stellatus). Den Sturgeons växte upp i iranska gårdar för 2 år (2017-2018), och kortisol extraktion analys genomfördes i Sydkorea (januari-februari 2019). Jawbones från fem H. och användes också för kortisol extraktion. Data analyserades med hjälp av den generella metoden för linjär modell (GLM) i SAS-miljön. Variationskoefficienterna för intra-och Inter-analysen var 14,15 respektive 7,70. Kort, kortisol utvinning teknik inblandade tvätta proverna (300 ± 10 mg) med 3 mL lösningsmedel (ultrapure vatten och isopropanol) två gånger, rotation vid 80 RPM för 2,5 min, lufttorka de tvättade proverna i rumstemperatur (22-28 ° c) för 7 dagar, ytterligare torkning proverna med en pärlvisp på 50 Hz för 32 min och slipning dem till pulver, tillämpa 1,5 mL metanol till det torkade pulvret (75 ± 5 mg), och långsam rotation (40 rpm) för 18 h vid rumstemperatur med kontinuerlig blandning. Efter extraktion centrifugerades proverna (9 500 x g i 10 min) och 1 ml supernatanten överfördes till ett nytt mikrocentrifugrör (1,5 ml), inkuberades vid 38 ° c för att avdunsta metanol och analyserades via enzymkopplad immunosorbent assay (Elisa) . Inga skillnader observerades i fenkortisolnivåer bland arter eller i fenben och käkbenet kortisolnivåer mellan tvättmedel. Resultaten av denna studie visar att stör Jawbone Matrix är en lovande alternativ stress indikator till solida matriser.
Introduction
Kortisol är en tillförlitlig indikator på djurens stress. Kortisol utvinning ger en giltig ram för forskare att övervaka stressnivåer och allmänna mönster i stressfaktorer. Till exempel, tidigare studier har genomfört metodvalidering av hår kortisol mätningar med hjälp av olika metoder i människor1,2, apor3,4, nötkreatur5, får6, och guldfisk7,8. I fiskarter, kortisol mätningar i matriser såsom skalor, hudslem, avföring, och blod9 har visat sig ge information om fisk hälsa. När blodprovstagning är problematiskt eller skalor saknas, alternativa matriser för kortisol extraktion behövs. I fisk kan alternativa matriser inkludera käkbenet, en hård vävnad som liknar den mänskliga tanden10.
Utvecklingen av nya matriser och validerade tekniker för att fastställa fisk stressnivåer är av särskilt intresse för kaviar industrin, där stör kan uppleva långvarig exponering för miljömässiga stressfaktorer11. Kön av stör kan inte bestämmas före 2 års ålder, och stör inte har skalor. Eftersom kortisol gradvis ackumuleras i fasta matriser under tillväxt Stadium2,7,12, långsiktiga kortisol ackumulation data från hårda matriser såsom fenor och käkben kan ge insikt i stress nivåer vid olika tillväxt stadier. I kontrast, kortisol nivåer i blodet ger en ögonblicksbild av stressnivåer vid tidpunkten för döden och kan inte exakt representera stress under långsiktiga uppfödningsförhållanden13,14. Med ökande konkurrens på marknaden för kaviar är nya metoder för att förbättra stress förhållandena för produktion av sundare ägg bland störarter under långtids uppfödning (8-12 år eller längre) ett allt viktigare forskningsområde. På grund av den höga kostnaden för stör, skördade prover är extremt dyra ($ 8000-15000 per mogen fisk beroende på art och tillväxtskede), en begränsande faktor för forskningsprojekt. Utvecklingen av en lämplig teknik för att utvinna kortisol från störfenor och käkben kan dock med fördel tillämpas både på fisk odlingssystem och i vild fisk för att förbättra kvaliteten och skörden av störägg för både konsumtion och Bevarande.
Förutom att ge tillförlitliga resultat6, är valet av en lämplig kortisol utvinning teknik av avgörande betydelse för att säkerställa att andra föreningar som finns i matrisen under provberedning inte blanda ihop produktionen, vilket kan leda till inkonsekvent resultat. Det är lika viktigt att avgöra om fenan och käkbenet kortisolnivåer påverkas av hormonnivåer i det omgivande vattnet. Heimbürge et al.15 föreslog att ett antal faktorer kan påverka kortisolnivåer inklusive ålder, kön, graviditet, säsong, färg12, och kroppen region från vilken kortisol utvinns16. Emellertid, lite information är tillgänglig om effekterna av tvättmedel på kortisol utvinning i fisk kroppen matriser8, och ingen på dessa effekter i stör, med undantag för stör ägg17.
Även om analys av baslinjen kortisolnivåer från fenor och käkben av stör kräver att fisken euthanized, detta tillvägagångssätt innebär inte de invasiva metoder som krävs för blodprovstagning i levande stör. Fin och käkbenet prover är lätt samlas in, och extraktion från dessa vävnader kan utföras snabbt. Likaså, hormon utvinning och analys är enkla och kräver lite specialiserad utrustning.
I denna studie presenterar vi en ny och lätt tillämpad teknik för utvinning, tvättning, och bestämning av kortisol från fisk fenor och käkben, i syfte att avgöra om kortisolnivåer mätt från dessa matriser kan tillförlitligt användas som stress Indikatorer. Fördelarna med denna teknik inkluderar en enkel och icke-invasiv8 tillvägagångssätt, mindre data variation, och tillförlitlig utgång1,6,8,17; tekniken är tillämplig på fiskarter utan fjäll som stör. Tekniken kräver slakt av fisken, val av lämpliga tvättmedel2,4, korrekt slipning av proverna3,5, professionell enzymkopplad immunosorbent assay (Elisa) ansökan5,7, och omfattande kunskap om införlivandet av kortisol källor i fasta matriser6.
Vi tillämpade två olika tvättmedel (ultrarent vatten och isopropanol) för att få basala kortisolnivåer i fenor från tre stör arter : Beluga (och och), sibiriska (Acipenser baerii), och sevruga (A. stellatus ), under standardmiljö förhållanden för varje art. Jawbones av H. och användes också för att utvärdera stress i stör. Detta är den första studien att mäta kortisolnivåer i stör käkben. Resultaten av denna studie kommer att ge jämförande kortisoldata för stör arter i den tidiga tillväxtfasen (~ 1 år) före kön bestämning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Följande experimentella procedurer och metoder godkändes av djurskydds-och etik myndigheten i Kangwon National University, Chuncheon, Republiken Korea.
1. fin samling
- Fånga stör försiktigt med ett nät för att minimera skador och stress.
- Skölj fisken noggrant med friskt vatten och torka sedan av kroppsytan med en absorberande handduk före dödshjälp.
- Slå huvudet av fisken med hjälp av en plasthammare så att fisken är bedövade eller förlorar medvetandet. Ta bort huvudet med en kniv.
- Mät kroppsvikten (g) och längd (cm).
- Efter eutanasi, samla fin prover genom att skära så nära kroppen som möjligt med hjälp av steriliserad kirurgisk sax.
Obs: enskilda, icke-återvunna absorberande handdukar måste användas för varje fisk. Beskrivande statistik för de arter som används i denna studie var följande: Beluga stör (H. och): ålder = 18 ± 2,1 månader, kroppsvikt = 2 700 ± 300 g, och kroppslängd = 55 ± 5 cm; Sibirisk stör (a. baerii): ålder = 9,6 ± 2,4 månader, kroppsvikt = 1 750 ± 250 g, och kroppslängd = 45 ± 5 cm; sevruga stör (a. stellatus): Ålder = 14 ± 1,3 månader, kroppsvikt = 1 000 ± 100 g, och kroppslängd = 65 ± 5 cm.
2. fin förberedelse för kortisol extraktion
- Placera fin proven (ett prov per vävnad: ~ 3 g) på laboratorie vägnings papper (107 mm × 210 mm) och torka i rumstemperatur under några dagar tills det är torrt.
- Wrap prover i ark av aluminiumfolie, plats i märkta plastpåsar, och överföring till laboratoriet.
- Förvara proverna i kylskåp för vidare användning, inklusive tvättning, kortisolextraktion, torkning och ELISA-analys (figur 2).
3. fin kortisol analys
- Kalibrera den digitala analytiska skalan (noggrannhet: 0,0001) och väg ut 300 ± 10 mg prover med vägnings papper på skalan pannan.
- Tvätta proverna.
- Överför varje prov till ett 15 L koniskt Polypropenrör. Tillsätt 3 mL isopropanol till varje tub med en 5 000 μL enkelkanalspipett.
- Rotera rören vid 80 RPM för 2,5 min att tvätta ut kortisol och ta bort eventuella yttre föroreningar. Upprepa proceduren två gånger.
- Lufttorka de tvättade proverna i rumstemperatur (22-28 ° c) i 7 dagar.
- Upprepa tvättproceduren med ultrarent vatten som tvättmedel.
- Extrahera käkbenet från kroppens vävnad med hjälp av ben-Cutting pinps. Applicera steg 1.5-3.2.4 till käkbenet prover.
- Väg ut (75 ± 5 mg) torkade fin-eller käkbenprover och slipa med en pärlvisp på 50 Hz för 32 min.
- Leverera 1,5 mL metanol i varje tub som innehåller pulver fin eller käkben med en 1000 μL pipett. Placera proverna på en rör rotator vid långsam rotation (40 rpm) för 18 h vid rumstemperatur för att extrahera kortisol med kontinuerlig blandning.
- Efter kortisol extraktion, Centrifugera proverna vid 9 500 x g i 10 min vid rumstemperatur. Efter centrifugering, samla upp det översta organiska skiktet som innehåller kortisol (1 mL) från varje prov och placera det i ett separat 1,5 mL microcentrifugerör.
- Torka proverna genom inkubation vid 38 ° c för att avdunta metanol. Håll de extraherade kortisolproverna under en draghuv över natten för att låta metanol försvinna.
Obs: kortisol-innehållande skiktet är oftast gulaktigt i färgen.
- Torka proverna genom inkubation vid 38 ° c för att avdunta metanol. Håll de extraherade kortisolproverna under en draghuv över natten för att låta metanol försvinna.
4. fin kortisol detektion
- Tina de torkade fin-eller käkbenproverna i rumstemperatur under 1,5 timmar före användning av ELISA-kitet.
- Tillsätt 400 μL fosfatbuffert, Vortex och centrifugera vid 1 500 x g i 15 minuter.
- Kör varje prov (25 μL) i två exemplar för att förbättra analysens noggrannhet och tillförlitlighet. Ta bort alla data utanför standardkurvan som avvikare.
- Ställ en mikrotiterplattor läsare till 450 nm, sedan inställd på μg dl-1 och Läs den optiska densiteten av plattan.
- Använd mikrotiterplattor programvara med en fyra-parameter icke-linjär Regressions kurva passform. Omvandla kortisolnivåerna av de prover som erhållits från programvaran till PG mg-1 med hjälp av följande ekvation:
F = 10 000 E (A/B) (C/D),
där F = det slutliga värdet av fenkortisolnivån (PG mg-1), E = volymen (ml) av analysbufferten som används för beredning av det torkade extraktet, A = koncentrationen (μg dl-1) som tillhandahålls av analysens utgång, B = vikten (mg) av fenan som utsätts för extra C = den volym (mL) av metanol som tillsätts i pulver fenan och D = den volym (mL) metanol som återvunnits från extraktet och därefter torkat ner3.
- Använd mikrotiterplattor programvara med en fyra-parameter icke-linjär Regressions kurva passform. Omvandla kortisolnivåerna av de prover som erhållits från programvaran till PG mg-1 med hjälp av följande ekvation:
5. statistisk analys
- Dela upp varje prov i två delprover före tvättproceduren och kör sedan i duplikat under ELISA-kit-analysen (2 × 2 = 4 observationer per prov) för att förbättra testets effekt och tillförlitligheten hos resultaten.
- Jämför effekterna av de två tvätt lösningsmedel och deras interaktioner genom att tillämpa den allmänna linjära modellen (GLM) förfarande i SAS Software Environment till mätdata18.
- Test skillnader mellan olika sätt att använda Tukey ' s test på en signifikansnivå av p < 0,05. Acceptera 0,05 < p < 0,10 som bevis på en tendens snarare än som en betydande skillnad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den presenterade fin kortisol extraktionsteknik utvecklades och bekräftades i denna studie med tre stör arter. Kortisolnivåer som erhållits med ultrarent vatten och isopropanol som tvättmedel jämfördes (figur 2). Kortisol från H. och käkben undersöktes för att avgöra om stör käkben kan användas som en alternativ matris till fenor. Effekterna av tvättmedel, stör arter, och deras interaktion visas i tabell 1. Nivåerna av kortisol tenderade att vara högre i fin prover som tvättades med isopropanol än hos de som tvättades med vatten (p = 0,089). Det fanns inga signifikanta skillnader i fenkortisolnivåer (p = 0,525) bland störarter. Det fanns ingen signifikant interaktion mellan tvättmedel och stör arter (p = 0,947). Tvättvätskan hade ingen signifikant effekt på kortisolnivån i H. och stör (p = 0,45) (tabell 2). Variationskoefficienterna för intra-analys och Inter-assay var 14,15 respektive 7,70. Uppgifterna visade på en hög likhet mellan fenor av de tre störarterna (tabell 1) och i H. och käkben (tabell 2). Vi har inte undersöka korrelationer mellan kortisolnivåer i käkben och de i fenor av olika stör arter eftersom vi fick Jawbone prover endast från H. och. Dessa relationer bör utforskas i en framtida studie.
Figur 1. (A) fotografi av och-och stör (10 år). B) störens morfologiska egenskaper. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Infographic av fin kortisol analys5,6 utförs i laboratoriet. Alla fotografier som presenteras i den grafiska sammanfattningen togs i laboratoriet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Störarter (SS) | Tvättmedel (WS) | P-värde | ||||||||
| Och och | Acipenser baerii | Auktor | Sem | Vatten | Isopropanol | Sem | Ss | Ws | SS × WS | |
| Kortisol (PG mg-1) | ||||||||||
| 3,46 | 2,85 | 3,34 | 0,41 | 2,86 | 3,69 | 0,33 | 0,52 | 0,08 | 0,95 | |
Tabell 1. Fenkortisolnivåer i tre stör arter som erhålls med två olika tvättmedel.
| Tvättmedel (WS) | Sem | P-värde | ||
| Vatten | Isopropanol | |||
| Kortisol (PG mg-1) | 1,11 | 1,43 | 0,31 | 0,45 |
Tabell 2. Jawbone kortisolnivåer i Beluga stör (och och) med hjälp av två olika tvättmedel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sturgeon kallas ibland för "levande fossil" eftersom det har uppvisat få anpassningar under de gångna årtusendena. Den stör släktet Acipenser innehåller 27 arter som producerar kaviar; emellertid, tre arter (Beluga, baerii, och sevruga) producerar de flesta av de globala kaviar utbudet. Stör är sårbara för överfiske och inblandning i deras naturliga livsmiljö och är därför mer akut hotade än någon annan grupp av arter. Sturgeon tillhör den äldsta gruppen av levande ryggradsdjur, som har funnits i 150 000 000 år. Acipenser arter mogna och växa långsamt; vissa (t. ex. H. och) kan leva i 100 år och överstiga 2 000 kg i vikt. Stör är broskfisk utan skalor, och kännetecknas av fem rader av stora, beniga plattor kallas fåglar och taktila skäggtömmar ligger på framsidan av munnen (figur 1). Fysiologiska skillnader mellan dessa arter och annan fisk inkluderar minskade plasma (kortikosteroid) svar på miljömässiga stressfaktorer. Våra mätningar av fenkortisol ger belägg för att käkbenet störar kortisol i proportion till cirkulerande koncentrationer.
Fish Visa många svar på fysiska, kemiska, och upplevda stressorer. Dessa reaktioner är välkända som adaptiva mekanismer som gör det möjligt för fisken att hantera miljöstörningar och upprätthålla en homeostatiska tillstånd. Om en stressfaktor är tillräckligt långvarig eller allvarlig att fisken är oförmögen att återfå homeostas med hjälp av dess naturliga reaktioner, då fisken kan uppleva negativa effekter, äventyrar dess allmänna hälsa och/eller liv19. Kön av stör kan bestämmas från cirka 2 års ålder. Därför, för att avgöra om kortisolnivåer och stör kön är korrelerade, är det nödvändigt att dokumentera långsiktig kortisol ackumulering i fenor och käkben (som en ny metod och alternativ matris) av stör. Denna studie är den första att rapportera fenan och käkbenet kortisolnivåer i stör.
Rollen av en kortisol tvätta lösningsmedel är att ta bort externa kortisolkällor från huden slem9. Aerts et al.14 används destillerat vatten för att avlägsna yttre kortisolkontaminering från fiskskinn; i tidigare studier2,5,12,17, jämförde vi effekterna av att använda isopropanol och vatten som ett lösningsmedel för att undersöka hårets kortisol innehåll. Effekterna av tvätta lösningsmedel kan variera mellan proverna på grund av skillnader i egenskaperna hos stör ägg13, hud15, fenor, och käkben. Brossa7 rapporterade att kortisolnivån i skalor av guldfisk (Carassius auratus) förblev konstant när isopropanol användes som lösningsmedel oavsett antalet tvättar, medan kortisolnivåerna varierade när vatten användes. Våra resultat visade att tvättvätskan inte hade någon effekt på käken kortisolnivåer. Skillnader mellan dessa studier inkluderar antalet tvättar, skakar vs vortexing, isopropanol renhet, och viktigt, känslighet eller motstånd av skalor/hud till yttre vätskeinträngning. Ghassemi Nejad et al.20 visade att tillämpningen av olika analyser som Ria och ELISA kan leda till skillnader i produktionen. Steroider är mer lösliga i lägre molekylmassa alkoholer (t. ex. metanol) än i alkoholer med högre molekylvikt såsom isopropanol4. Metanol extraktion denaturerar protein genom att bryta icke-kovalenta obligationer, vilket gör att håret kortisol release. Metanol ändrar också hormon struktur genom att bryta icke-kovalenta obligationer, vilket resulterar i frisläppandet av kortisol från vävnader. För att effektivt homogenisera stör fenor och käkben före metanol utvinning, en pärla visp kan användas för att effektivt bryta ner vävnadsstrukturen. Detta förfarande kräver tid för att helt mala fin och käkbenet prover; Därför måste processen upprepas för att säkerställa fullständig pulverisering och homogenisering före kortisol utvinning. Långsam rotation för 18 h tillåter gradvis avlägsnande av kortisol genom tvättning.
Som föreslagits i tidigare studier av däggdjurs hår4,5,6, externa eller interna källor av kortisol innehåll i fenor och käkar, andra än blod, bör inte försummas. Även om denna studie inte var särskilt utformad för att undersöka hur kortisol sprider sig från blod till fenor eller käkar, det belyser behovet av att utöka vår kunskap om denna process för att bättre tolka fluktuationer i kortisol från dessa matriser. Egenskaperna hos fenor och käkben skiljer sig från de i skalor och hud. Bussy et al.17 kvantifierade kortisolnivåer i Lake stör (A. fulvescens) ägg för att undersöka miljöpåverkan på moderns fysiologiska tillstånd och ägg kvalitet. De använde metyltert-butylether (MTBE), etylacetat (AcOEt) MTBE och dietyleter (et2O) som tvättmedel och drog slutsatsen att etylacetat var det bästa extraktionsmedel i form av återhämtning och mat ris effekt. I den nuvarande studien, isopropanol bort större mängder av yttre kortisol från hudslem under tvättning, vilket leder till en liten överskattning av kortisol från stör fenor, som måste noga övervägas vid tolkning av extraktionsresultat. Det är möjligt att isopropanol kunde tvätta huden från fenan, vilket har rapporterats i en tidigare studie7. Isopropanol är känt för att penetrera hårsäckarna och fisk skalor4,7. Resultaten av den aktuella studien tyder på att valet av lösningsmedel inte hade någon signifikant effekt på kortisolnivåerna, vilket tyder på att kortisolextraktion kan vara svårare i vissa delar av fenan än i andra som använder ultrarent vatten; i sådana fall kan isopropanol användas som ett alternativ.
Denna studie visade tillämpligheten av käkbenet som en ny matris för tillförlitlig indikation på stress i stör. H. och käkbenet kortisolvärden liknade dem som utvinns ur fenor av samma art; framtida studier bör bekräfta detta resultat bland olika arter, åldrar och kön via korrelationsanalys. Ett lågt antal fiskar användes i den aktuella studien på grund av den höga kostnaden för stör; Vi försökte övervinna denna begränsning genom att testa varje prov två gånger och även duplicera metanol utvinning för ELISA. Använda fyrdubbla multiplikation kan öka kraften i testet för att täcka det låga antalet prover.
Vi drar slutsatsen att den typ av tvättvätska måttligt påverkat kortisol utvinning från fenor, men inte käkar, av stör. Innan man generaliserar slutsatsen av denna studie och för att validera dessa resultat, bör ytterligare forskning med hjälp av olika arter och lösningsmedel genomföras. Det nuvarande arbetet ger belägg för att stör käkbenet kan användas som en alternativ matris i framtida studier med kortisol som ett index för stress i stör. Lämpligheten av ELISA för mätning av fenben och käkbenet kortisol visades också i den aktuella studien. Framtida forskning bör inriktas på två aspekter: 1) fastställa sambandet mellan kortisolnivåer i käkbenet och de i fenor av stör och 2) skörd Matrix prover för kortisol mätning från äldre fisk och deras kaviar för att bestämma långsiktig stress nivåer i olika stör arter under livslängden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete genomfördes med stöd av kooperativa forskningsprogrammet för jordbruksvetenskap & teknikutveckling (Projekttitel: boskap produktivitets förändringar analys med klimatförändringar, projekt nr. PJ012771), landsbygdsutvecklings förvaltningen, Republiken Korea. Också, denna studie stöddes av ett bidrag (nej. PJ01344604) från Animal Nutrition & fysiologi team, National Institute of Animal Science, RDA, Seoul, Republiken Korea. Författarna erkänner tacksamt Persiska gest VD Mohammad Hassan Salmanzadeh och hans team, som gav fisk från de tre stör arter som undersökts i denna studie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Disposal latex surgical gloves | Ansell | 63754090 | |
| Platform scale-electronic weighing 100kg | Baskoolnikoo | 101 EM | |
| Serological pipette to deliver up to 24 mL | Becton Dickinson Falcon | 35-7550 | |
| Micro plate reader with 450 nm and 490 to 492 nm reference filters | BioTek | 8041000 | |
| Reagent reservoirs | BrandTech | 703459 | |
| Zipper storage plastic bag | Cleanwrap | 30cm x100m | |
| Isopropyl alcohol | Daejung chemicals & Metals | 5035-4400 | |
| Methyl alcohol | Daejung chemicals & Metals | 5558-4100 | |
| Tube rotator- MX-RL-Pro | DLAB Scientific | 824-222217777 | |
| Precision pipette to deliver 1.5 and 10 mL | Eppendorf Research Plus | M21518D | |
| Precision pipette to deliver 15 and 25 μL | Eppendorf Research Plus | R25623C | |
| Weighing paper (107 x 210 mm) | Fisherbrand | 09-898-12B | |
| Bead beater, 50/60 Hz 2A | GeneReach Biotechnology Corp | tp0088 | |
| Plate rotator with orbit capable of 500 rpm | Hangzhou Miu Instrument | MU-E30-1044 | |
| Disposable polypropylene tubes to hold at least 24 mL | Hyundai Micro | H20050 | |
| Fume hood | Kwang Dong Industrial | KD 901-22128175 | |
| Micro-centrifuge capable of 1500 x g | Labo Gene | 9.900.900.729 | |
| Mini vortex mixer | LMS | VTX-3000L | |
| Lotte aluminum foil roll | Lotte Aluminum | B0722X5FK5 | |
| Digital scale | Mettler Toledo | ME204 | |
| Ultrapure water | MDM | MDM-0110 | |
| Pipette tips | Neptune Scientific | REF 2100.N | |
| Large fish net | Pond H2O | Hoz135 | |
| Salivary cortisol kit | Salimetrics | 1-3002-4 | |
| Bone cutting forceps | Sankyo | 26-188A | |
| Precision multichannel pipette to deliver 50 μL and 200 μL | VITLAB | 18A68756 | |
| Towel | Yuhan Kimberly | 1707921546 | |
| Tissue paper (107 × 210) | Yuhan Kimberly | 41117 |
References
- Meyer, J. S., Novak, M. A. Hair cortisol: a novel biomarker of hypothalamic-pituitary- adrenocortical activity. Endocrinology. 153, 4120-4127 (2012).
- Ghassemi Nejad, J., et al. A cortisol study: facial hair and nails. Journal of Steroids Hormonal Sciences. 7, 1-5 (2016).
- Meyer, J. S., Novak, M. A., Hamel, A., Rosenberg, K. Extraction and analysis of cortisol from human and monkey hair. Journal of Visualized Experiments. (83), e50882 (2014).
- Davenport, M. D., Tiefenbacher, S., Lutz, C. K., Novak, M. A., Meyer, J. S. Analysis of endogenous cortisol concentrations in the hair of rhesus macaques. General and Comparative Endocrinology. 147, 255-261 (2006).
- Ghassemi Nejad, J., Ataallahi, M., Park, H. K. Methodological validation of measuring Hanwoo hair cortisol concentration using bead beater and surgical scissors. Journal of Animal Science and Technology. 61, 41-46 (2019).
- Ghassemi Nejad, J., et al. Wool cortisol is a better indicator of stress than blood cortisol in ewes exposed to heat stress and water restriction. Animal. 8, 128-132 (2014).
- Brossa, A. C. Cortisol in skin mucus and scales as a measure of fish stress and habitat quality. Ph.D. dissertation. , Faculty of Veterinary Medicine, Universitat Autonoma de Barcelona. Ph.D. dissertation (2018).
- Carbajal, A., et al. Cortisol detection in fish scales by enzyme immunoassay: biochemical and methodological validation. Journal of Applied Ichthyology. 34, 1-4 (2018).
- Bertotto, D., et al. Alternative matrices for cortisol measurement in fish. Aquaculture Research. 41, 1261-1267 (2010).
- Ghassemi Nejad, J., Jeong, C., Shahsavarani, H., Sung, I. K., Lee, J. Embedded dental cortisol content: a pilot study. Endocrinology & Metabolic Syndrome. 5, 240 (2016).
- Pankhurst, N. W. The endocrinology of stress in fish: an environmental perspective. General and Comparative Endocrinology. 170, 265-275 (2011).
- Ghassemi Nejad, J., Kim, W. B., Lee, B. H., Sung, K. I. Coat and hair color: hair cortisol and serotonin levels in lactating Holstein cows under heat stress conditions. Animal Science Journal. 88, 190-194 (2017).
- Baker, M. R., Gobush, K. S., Vynne, C. H. Review of factors influencing stress hormones in fish and wildlife. Journal of Nature Conservation. 21, 309-318 (2013).
- Aerts, J., et al. Scales tell a story on the stress history of fish. PLoS One. 10, e0123411 (2015).
- Heimbürge, S., Kanitz, E., Otten, W. The use of hair cortisol for the assessment of stress in animals. General and Comparative Endocrinology. , 10-17 (2019).
- Ghassemi Nejad, J., et al. Comparing hair cortisol concentrations from various body sites and serum cortisol in Holstein lactating cows and heifers during thermal comfort zone. Journal of Veterinary Behavior: Clinical and Application Research. 30, 92-95 (2019).
- Bussy, U., Wassink, L., Scribner, K. T., Li, W. Determination of cortisol in lake sturgeon (Acipenser fulvescens) eggs by liquid chromatography tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography B. 1040, 162-168 (2017).
- SAS. 1999. SAS. User's Guide (Version 8.01 Edition). , SAS Inst. Inc. Cary, NC, USA. (1999).
- Barton, B. A. Stress in fishes: a diversity of responses with particular reference to changes in circulating corticosteroids. Integrative and Comparative Biology. 42, 517-525 (2002).
- Ghassemi Nejad, J., et al. Measuring hair and blood cortisol in sheep and dairy cattle using RIA and ELISA assay: a comparison. Biological Rhythm Research. Accepted. , (2019).
