Summary
Bu çalışmada mersin balığı türlerinin yüzgeci nden ve çene kemiğinden kortizol çıkarılması için bir protokol sunmuz. Fin ve çene kemiği kortizol düzeyleri, ELISA tahlilleri ile takip eden iki yıkama çözücüsi karşılaştırılarak daha fazla incelendi. Bu çalışma, yeni bir stres göstergesi olarak çene kemiği kortizol fizibilite pilot.
Abstract
Bu çalışmanın amacı, iki yıkama çözücüsi (su ve izopropanol) kullanarak mersin balığı yüzgeçlerinden kortizol çıkarılması için bir teknik geliştirmek ve üç ana mersin balığı türü arasında fin kortizol düzeylerindeki farklılıkları ölçmektir. Yüzgeçler yedi beluga(Huso huso),yedi Sibirya(Acipenser baerii)ve beş sevruga(A. stellatus)olmak üzere 19 kurban mersin balığından hasat edilmiştir. Mersin balıkları İran çiftliklerinde 2 yıl (2017-2018) yetiştirildi ve Güney Kore'de kortizol ekstraksiyon analizi yapıldı (Ocak-Şubat 2019). Beş H. huso çene kemikleri de kortizol ekstraksiyonu için kullanılmıştır. Veriler SAS ortamında genel doğrusal model (GLM) yordamı kullanılarak analiz edildi. Varyasyonun intra-ve inter-assay katsayıları sırasıyla 14.15 ve 7.70 idi. Kısaca kortizol ekstraksiyon tekniği, numunelerin (300 ± 10 mg) 3 mL çözücü (ultrasaf su ve izopropanol) ile iki kez yıkanması, 80 rpm'de 2,5 dakika boyunca döndürülmesi, yıkanmış numunelerin oda sıcaklığında (22-28 °C) 7 gün boyunca havayla kurutulması, daha fazla kuruma 32 dakika boyunca 50 Hz'de boncuk çırpıcı kullanan ve toz haline getirerek kurutulmuş totoya 1,5 mL metanol (75 ± 5 mg) ve oda sıcaklığında 18 saat boyunca yavaş döndürme (40 rpm) sürekli karıştırma ile. Ekstraksiyondan sonra numuneler santrifüj (10 dk için 9.500 x g) ve 1 mL supernatant yeni bir mikrosantrifüj tüpüne (1.5 mL) aktarıldı, metanolbuharlaştırmak için 38 °C'de inkübe edildi ve enzime bağlı immünosorbent analizi (ELISA) ile analiz edildi. . Yüzgeç kortizol düzeylerinde türler arasında veya yıkama çözücüleri arasında yüzgeç ve çene kemiği kortizol düzeylerinde fark gözlenmedi. Bu çalışmanın sonuçları mersin balığı çene kemiği matrisinin katı matrisler için umut verici bir alternatif stres göstergesi olduğunu göstermektedir.
Introduction
Kortizol hayvan stresinin güvenilir bir göstergesidir. Kortizol ekstraksiyon stres düzeyleri ve stres genel desenleri izlemek için araştırmacılar için geçerli bir çerçeve sağlar. Örneğin, önceki çalışmalarda insanlarda çeşitli yöntemler kullanarak saç kortizol ölçümleri metodolojik doğrulama yaptık1,2, maymunlar3,4, sığır5, koyun6, ve japon balığı7,8. Balık türlerinde pul, deri mukusu, dışkı ve kan9 gibi matrislerde kortizol ölçümlerinin balık sağlığı hakkında bilgi sağladığı gösterilmiştir. Kan örneklemesi sorunlu olduğunda veya pullar eksik olduğunda kortizol ekstraksiyonu için alternatif matrislere ihtiyaç vardır. Balıklarda, alternatif matrisler çene kemiği içerebilir, insan diş benzer sert bir doku10.
Balık stres düzeylerini belirlemek için yeni matrislerin ve doğrulanmış tekniklerin geliştirilmesi, mersin balığının çevresel stres faktörlerine uzun süre maruz kalarak karşılaşabileceği havyar endüstrisinin özellikle ilgisini çekiyor11. Mersin balığının cinsiyeti 2 yaşından önce belirlenemez ve mersin balığının pulu yoktur. Kortizol yavaş yavaş büyüme aşamasında katı matrisler birikir çünkü2,7,12, yüzgeçleri ve çene kemikleri gibi sert matrisler uzun vadeli kortizol birikimi verileri stres içine anlayış sağlayabilir farklı büyüme aşamalarında düzeyleri. Buna karşılık, kan kortizol düzeyleri ölüm sırasında stres düzeylerinin bir anlık sağlamak ve doğru uzun vadeli yetiştirme koşulları sırasında stres temsil edemez13,14. Havyar pazarında artan rekabet ile, uzun vadeli yetiştirme sırasında mersin balığı türleri arasında sağlıklı yumurta üretimi için stres koşullarını iyileştirmek için yeni yaklaşımlar (8-12 yıl veya daha uzun) araştırma giderek daha önemli bir alandır. Mersin balığının yüksek maliyeti nedeniyle, hasat edilen numuneler son derece pahalıdır (türlere ve büyüme aşamasına bağlı olarak olgun balık başına 8.000-15.000 $), araştırma projeleri için sınırlayıcı bir faktördür. Ancak, mersin balığı yüzgeçleri ve çene kemiklerinden kortizol ekstraksiyonu için uygun bir tekniğin geliştirilmesi, hem balık yetiştiriciliği sistemlerine hem de yabani balıklarda hem tüketim hem de tüketim için mersin balığı yumurtalarının kalitesini ve hasatını iyileştirmek için yararlı bir şekilde uygulanabilir. Koruma.
Güvenilir sonuçlar sağlamanın yanı sıra6,uygun bir kortizol ekstraksiyon tekniğinin seçilmesi, numune hazırlama sırasında matriste bulunan diğer bileşiklerin çıktıyı şaşırtmamasını sağlamak için kritik öneme sahiptir, bu da tutarsız sonuçlar. Yüzgeç ve çene kemiği kortizol düzeylerinin çevredeki sudaki hormon seviyelerinden etkilenip etkilenmediğini belirlemek de aynı derecede önemlidir. Heimbürge ve ark.15, yaş, cinsiyet, gebelik, mevsim, renk12ve kortizol16ayıklanır vücut bölgesi de dahil olmak üzere bir dizi faktör kortizol düzeylerini etkileyebilir önerdi . Ancak, balık vücut matris8 kortizol ekstraksiyon solventler yıkama etkileri hakkında çok az bilgi mevcuttur,ve mersin balığı bu etkileri üzerinde hiçbir, mersin balığı yumurta ları hariç17.
Mersin balığının yüzgeçlerinden ve çene kemiklerinden bazal kortizol düzeylerinin analiz edilmesi balıkların ötenaziye geçirilmelerini gerektirse de, bu yaklaşım canlı mersin balığında kan örneklemesi için gerekli invaziv teknikleri gerektirmez. Yüzgeç ve çene kemiği örnekleri kolayca toplanır ve bu dokulardan çıkarma işlemi hızla yapılabilir. Benzer şekilde, hormon ekstraksiyon ve analiz basit ve biraz özel ekipman gerektirir.
Bu çalışmada, balık yüzgeçlerinden ve çene kemiklerinden kortizol çıkarılması, yıkanması ve tayini için yeni ve kolay uygulanan bir teknik sunmaktayız, bu matrislerden ölçülen kortizol düzeylerinin stres olarak güvenilir bir şekilde kullanılıp kullanılamayacağı saptanmak amacıyla Gösterge. Bu tekniğin avantajları kolay ve non-invaziv8 yaklaşım, daha az veri varyasyonu ve güvenilir çıkış1,6,8,17; bu teknik mersin balığı gibi pulsuz balık türleri için geçerlidir. Bu teknik, balığın kesilmesini, uygun yıkama çözücülerinin seçimi2,4, numunelerin uygun şekilde öğütülmesi3,5, profesyonel enzime bağlı immünosorbent test (ELISA) gerektirir. uygulama5,7, ve katı matrisler içine kortizol kaynaklarının dahil geniş bilgi6.
Beluga (Huso huso), Sibirya (Acipenser baerii), ve sevruga (A. stellatus ), her tür için standart çevre koşulları altında. H. huso çene kemikleri de mersin balığı stresdeğerlendirmek için kullanılmıştır. Bu, mersin balığı çene kemiklerindeki kortizol düzeylerini ölçen ilk çalışmadır. Bu çalışmanın sonuçları, cinsiyet belirlemeden önce erken büyüme aşamasında (~1 yıl) mersin balığı türleri için karşılaştırmalı kortizol verileri sağlayacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Aşağıdaki deneysel prosedürler ve yöntemler Kangwon Ulusal Üniversitesi, Chuncheon, Kore Cumhuriyeti Hayvan Refahı ve Etik Kurumu tarafından onaylanmıştır.
1. Fin koleksiyonu
- Yaralanma ve stresi en aza indirmek için bir ağ kullanarak yavaşça mersin balığı yakalayın.
- Balığı tatlı suyla dikkatlice durulayın ve ötenaziden önce vücut yüzeyini emici bir havluyla silin.
- Balık sersemlemiş ya da bilincini kaybeder gibi plastik bir çekiç kullanarak balık kafasına vurmak. Bir bıçak kullanarak başını çıkarın.
- Vücut ağırlığını (g) ve uzunluğu (cm) ölçün.
- Ötenaziden sonra, sterilize cerrahi makas kullanarak vücuda mümkün olduğunca yakın keserek yüzgeç örnekleri toplayın.
NOT: Her balık için bireysel, geri dönüşümsüz emici havlular kullanılmalıdır. Bu çalışmada kullanılan türler için tanımlayıcı istatistikler aşağıdaki gibidir: beluga mersin balığı (H. huso): yaş = 18 ± 2.1 ay, vücut ağırlığı = 2.700 ± 300 g ve vücut uzunluğu = 55 ± 5 cm; Sibirya mersin balığı (A. baerii): yaş = 9.6 ± 2.4 ay, vücut ağırlığı = 1.750 ± 250 g ve vücut uzunluğu = 45 ± 5 cm; sevruga mersin balığı (A. stellatus): yaş = 14 ± 1.3 ay, vücut ağırlığı = 1.000 ± 100 g ve vücut uzunluğu = 65 ± 5 cm.
2. Kortizol ekstraksiyonu için fin hazırlığı
- Yüzgeç numunelerini (doku başına bir örnek: ~3 g) laboratuvar tartım kağıdına (107 mm × 210 mm) yerleştirin ve kuruyana kadar birkaç gün oda sıcaklığında kurulayın.
- Alüminyum folyo levhalar halinde sarın, etiketli plastik torbalar yerleştirin ve laboratuvara aktarın.
- Yıkama, kortizol ekstraksiyonu, kurutma ve ELISA analizi dahil olmak üzere numuneleri daha fazla kullanım için buzdolabında saklayın(Şekil 2).
3. Fin kortizol analizi
- Dijital analitik teraziyi (doğruluk: 0.0001) kalibre edin ve 300 ± 10 mg numuneyi ölçek tavasına tartım kağıdıyla tartın.
- Örnekleri yıkayın.
- Her numuneyi 15 L konik polipropilen tüpe aktarın. 5.000 μL tek kanallı pipet kullanarak her tüpe 3 mL isopropanol ekleyin.
- Kortizol yıkamak ve herhangi bir potansiyel dış kontaminasyon kaldırmak için 2,5 dakika için 80 rpm tüpleri döndürün. Bu yordamı iki kez tekrarlayın.
- Yıkanmış numuneleri 7 gün boyunca oda sıcaklığında (22-28 °C) hava kurutun.
- Yıkama maddesi olarak ultra saf su kullanarak yıkama işlemini tekrarlayın.
- Kemik kesme forceps kullanarak vücut dokusundan çene kemiği ayıklayın. Çene kemiği örneklerine 1.5-3.2.4 adımlarını uygulayın.
- Tartın (75 ± 5 mg) kurutulmuş yüzgeç veya çene kemiği örnekleri ve 32 dakika için 50 Hz bir boncuk çırpıcı kullanarak öğütün.
- 1000 μL'lik bir pipet kullanarak toz yüzgeç veya çene kemiği içeren her tüpe 1,5 mL metanol verin. Sürekli karıştırma ile kortizol ayıklamak için oda sıcaklığında 18 saat için yavaş rotasyon (40 rpm) bir tüp rotator üzerinde örnekleri yerleştirin.
- Kortizol ekstraksiyonundan sonra numuneleri oda sıcaklığında 10 dk boyunca 9.500 x g'de santrifüj edin. Santrifüjden sonra, her numuneden kortizol (1 mL) içeren üst organik katmanı toplayın ve ayrı bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin.
- Metanol buharlaştırmak için 38 °C'de kuluçka ile örnekleri kurutun. Metanol dağıtmak için izin vermek için bir gecede bir duman kaput altında çıkarılan kortizol örnekleri tutun.
NOT: Kortizol içeren tabaka genellikle sarımsı renklidir.
- Metanol buharlaştırmak için 38 °C'de kuluçka ile örnekleri kurutun. Metanol dağıtmak için izin vermek için bir gecede bir duman kaput altında çıkarılan kortizol örnekleri tutun.
4. Fin kortizol tespiti
- ELISA kitini kullanmadan önce kurutulmuş yüzgeç veya çene kemiği örneklerini oda sıcaklığında 1,5 saat eritin.
- 15 dakika boyunca 1.500 x g'de 400 μL fosfat tamponu, girdap ve santrifüj ekleyin.
- Test doğruluğunu ve güvenilirliğini artırmak için her numuneyi (25°L) yinelenen olarak çalıştırın. Standart eğrinin dışındaki verileri aykırı olarak kaldırın.
- Bir mikroplaka okuyucuyu 450 nm'ye ayarlayın, ardından μg dL-1 olarak ayarlayın ve plakanın optik yoğunluğunu okuyun.
- Dört parametreli doğrusal olmayan regresyon eğrisine uyan mikroplaka yazılımını kullanın. Yazılımdan elde edilen örneklerin kortizol düzeylerini aşağıdaki denklemi kullanarak pg-1'e dönüştürün:
F = 10.000E (A/B) (C/D),
nerede F = fin kortizol seviyesinin nihai değeri (pg mg-1), E = kurutulmuş ekstresi yeniden oluşturmak için kullanılan tahlil arabelleğinin hacmi (mL), A = konsantrasyon (μg dL-1) tahlil çıkışı tarafından sağlanan, B = ekstra tabi fin ağırlığı (mg) ction, C = metanol hacmi (mL) toz yüzgeç eklendi ve D = metanol hacmi (mL) ekstresi kurtarıldı ve daha sonra aşağı kurudu3.
- Dört parametreli doğrusal olmayan regresyon eğrisine uyan mikroplaka yazılımını kullanın. Yazılımdan elde edilen örneklerin kortizol düzeylerini aşağıdaki denklemi kullanarak pg-1'e dönüştürün:
5.İstatistiksel analiz
- Testin gücünü ve sonuçların güvenilirliğini artırmak için her numuneyi yıkama işleminden önce iki alt örneğe bölün ve elisa kiti testi (numune başına 2 × 2 = 4 gözlem) sırasında yinelenen olarak çalıştırın.
- SAS yazılım ortamındaki genel doğrusal model (GLM) prosedürünü ölçüm verileri18ile uygulayarak iki yıkama çözücüsünün etkilerini ve etkileşimlerini karşılaştırın.
- Tukey'in testini p < 0,05 anlamlı bir düzeyde kullanma araçları arasındaki farkları test edin. 0.05 < p < 0.10'u önemli bir fark olarak değil, bir eğilimin kanıtı olarak kabul edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sunulan fin kortizol çıkarma tekniği geliştirildi ve bu çalışmada üç mersin balığı türü kullanılarak doğrulandı. Yıkama çözücüleri olarak ultrasaf su ve izopropanol kullanılarak elde edilen kortizol düzeyleri karşılaştırıldı(Şekil 2). H. huso çene kemiklerinden kortizol, mersin balığı çene kemiklerinin yüzgeçlere alternatif bir matris olarak kullanılıp kullanılamayacağı incelendi. Çözücü, mersin balığı türleri ve etkileşimlerinin etkileri Tablo 1'degösterilmiştir. Kortizol düzeyleri izopropanol ile yıkanmış yüzgeç örneklerinde su ile yıkananlardan daha yüksek olma eğilimindedir (p = 0.089). Mersin balığı türleri arasında fin kortizol düzeylerinde (p = 0.525) anlamlı bir fark yoktu. Yıkama çözücüleri ile mersin balığı türleri arasında anlamlı bir etkileşim yoktu (p = 0.947). Yıkama solventinin H. huso mersin balığında kortizol düzeyi üzerinde anlamlı bir etkisi yoktur (p = 0.45)(Tablo 2). Varyasyonintra-asa ve inter-assay katsayıları sırasıyla 14.15 ve 7.70 idi. Veriler, üç mersin balığı türünün yüzgeçleri(Tablo 1)ve H. huso çene kemikleri(Tablo 2)arasında yüksek benzerlik gösterdi. Çene kemiklerindeki kortizol düzeyleri ile farklı mersin balığı türlerinin yüzgeçleri arasındaki korelasyonları araştırmadık çünkü sadece H. huso'dançene kemiği örnekleri aldık. Bu ilişkiler gelecekteki bir çalışmada araştırılmalıdır.
Şekil 1. (A) Huso huso mersin balığı fotoğrafı (10 yaşında). (B) Mersin balığının morfolojik özellikleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2. Fin kortizolanalizinininfografik 5,6 laboratuvarda yapıldı. Bilgi grafiği özetinde sunulan tüm fotoğraflar laboratuvarda çekilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Mersin balığı türleri (SS) | Yıkama solventi (WS) | P değeri | ||||||||
| Huso huso | Acipenser baerii | Acipenser stellatus | Sem | Su | İopropanol | Sem | Ss | Ws | SS×WS | |
| Kortizol (pg mg-1) | ||||||||||
| 3.46 | 2.85 | 3.34 | 0.41 | 2.86 | 3.69 | 0.33 | 0.52 | 0.08 | 0.95 | |
Tablo 1. İki farklı yıkama solventi kullanılarak elde edilen üç mersin balığı türünde fin kortizol düzeyleri.
| Yıkama solventi (WS) | Sem | P değeri | ||
| Su | İopropanol | |||
| Kortizol (pg mg-1) | 1.11 | 1.43 | 0.31 | 0.45 |
Tablo 2. Beluga mersin balığında çene kemiği kortizol düzeyleri(Huso huso) iki farklı yıkama çözücüsi kullanılarak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mersin balığı bazen "yaşayan fosil" olarak adlandırılır, çünkü geçmiş bin yıl boyunca birkaç adaptasyon sergilemiştir. Mersin balığı cinsi Acipenser havyar üreten 27 tür içerir; ancak, üç tür (beluga, baerii ve sevruga) küresel havyar kaynağının çoğunu üretir. Mersin balığı aşırı avlanmaya ve doğal yaşam alanlarına müdahaleye karşı savunmasızdır ve bu nedenle diğer türlere göre daha kritik tehlike altındadır. Mersin balığı, 150 milyon yıldır var olan en eski yaşayan omurgalı grubuna aittir. Acipenser türleri olgunlaşır ve yavaş büyür; bazıları (örneğin, H. huso)100 yıl yaşayabilir ve 2.000 kg'ı aşabilir. Mersin balığı pulsuz kıkırdak balıklardır ve ağzın ön cephesinde bulunan scutes ve dokunsal barbeller olarak adlandırılan beş sıra büyük, kemikli plakalarla karakterizedir(Şekil 1). Bu türler ve diğer balıklar arasındaki fizyolojik farklılıklar arasında çevresel strese azalmış plazma (kortikosteroid) yanıtları sayılabilir. Fin kortizol ölçümlerimiz mersin balığı çene kemiğinin dolaşımdaki konsantrasyonlarla orantılı olarak kortizol biriktirdiğini kanıtlamaktadır.
Balıklar fiziksel, kimyasal ve algılanan strese çok sayıda yanıt gösterirler. Bu reaksiyonlar iyi balık çevresel rahatsızlıkları ile başa çıkmak ve homeostatik bir devlet korumak için izin adaptif mekanizmalar olarak bilinir. Bir stres kaynağı, balığın doğal tepkilerini kullanarak homeostazı geri kazanamadığı kadar uzun veya ciddi yse, balık genel sağlığını ve/veyayaşamınıtehlikeye atarak olumsuz etkileryaşayabilir. Mersin balığının cinsiyeti yaklaşık 2 yaşından itibaren belirlenebilir. Bu nedenle, kortizol düzeyleri ve mersin balığı cinsiyetkorece olup olmadığını belirlemek için, yüzgeçleri ve çene kemikleri (yeni bir yaklaşım ve alternatif matris olarak) mersin balığı uzun vadeli kortizol birikimi belgelemek için gereklidir. Bu çalışma mersin balığında yüzgeç ve çene kemiği kortizol düzeylerini bildiren ilk çalışmadır.
Kortizol yıkama çözücünün rolü, cilt mukus9'danharici kortizol kaynaklarını çıkarmaktır. Aerts ve ark.14 balık derisinden dış kortizol kontaminasyonu kaldırmak için distile su kullanılır; Önceki çalışmalarda2,5,12,17, biz saç kortizol içeriğini incelemek için bir çözücü olarak izopropanol ve su kullanarak etkilerini karşılaştırıldı. Yıkama solvent etkileri mersin balığı yumurta13, cilt15, yüzgeçleri ve çene kemikleri özellikleri farklılıkları nedeniyle örnekler arasında değişebilir. Brossa7, japon balığı pullarında kortizol seviyesinin(Carassius auratus)isopropanol'un yıkama sayısına bakılmaksızın çözücü olarak kullanıldığında sabit kaldığını, su kullanıldığında kortizol düzeylerinin ise değiştiğini bildirdi. Sonuçlarımız, yıkama solventinin çene kortizol düzeyleri üzerinde hiçbir etkisi olmadığını gösterdi. Bu çalışmalar arasındaki farklar arasında yıkar sayısı, titreme ve girdap, izopropanol saflığı ve daha da önemlisi, ölçeklerin/derinin dış sıvı penetrasyonuna karşı hassasiyet ivediliği veya direnci sayılabilir. Ghassemi Nejad ve ark.20, RIA ve ELISA gibi farklı denemelerin uygulanmasının çıktıfarklılıklarına yol açabileceğini göstermiştir. Steroidler daha düşük moleküler kütleli alkollerde çözünür (örneğin, metanol) izopropanol gibi yüksek molekülağırlıklı alkollerde daha 4 . Metanol ekstraksiyonu kovalent olmayan bağları kırarak proteinden arındırArak proteini denatüre eder, böylece saç kortizol salınımına izin verir. Metanol ayrıca kovalent olmayan bağları kırarak hormon yapısını değiştirir, dokulardan kortizol salınımı ile sonuçlanan. Metanol ekstraksiyonundan önce mersin balığı yüzgeçlerini ve çene kemiklerini etkili bir şekilde homojenize etmek için, bir boncuk çırpıcı verimli doku yapısını yıkmak için kullanılabilir. Bu işlem tamamen yüzgeç ve çene kemiği örnekleri öğütmek için zaman gerektirir; bu nedenle, kortizol ekstraksiyonu öncesinde tam pulverizasyon ve homojenizasyon sağlamak için işlem tekrarlanmalıdır. 18 saat boyunca yavaş rotasyon kortizolün yıkanarak kademeli olarak çıkarılmasına izin verir.
Memeli saç önceki çalışmalarda önerildiği gibi4,5,6, yüzgeçleri ve çenelerde kortizol içeriği dış veya iç kaynaklar, kan dışında, ihmal edilmemelidir. Bu çalışma özellikle kortizolun kandan yüzgeçlere veya çenelere nasıl yayıldığını araştırmak için tasarlanmasa da, bu matrislerden kortizoldeki dalgalanmaları daha iyi yorumlamak için bu süreç hakkındaki bilgimizi genişletme ihtiyacını vurgulamaktadır. Yüzgeçlerin ve çene kemiklerinin özellikleri pul ve deriden farklıdır. Bussy ve ark.17 göl mersin balığı nda ölçülen kortizol düzeyleri(A. fulvescens) yumurta anne fizyolojik durumu ve yumurta kalitesi üzerinde çevresel etkileri araştırmak için. Metil tert-butylether (MTBE), etil asetat (AcOEt) MTBE ve diethyl eter (Et2O) çamaşır çözücüleri olarak kullandılar ve etil asetat'ın geri kazanım ve matris etkisi açısından en iyi ekstraksiyon çözücüsü olduğu sonucuna vardılar. Bu çalışmada, izopropanol yıkama sırasında cilt mukus dış kortizol büyük miktarlarda kaldırıldı, mersin balığı yüzgeçleri kortizol hafif bir aşırı tahmin yol, hangi dikkatle çıkarma sonuçları yorumlarken düşünülmelidir. Bu isopropanol yüzgeç deri yıkamak mümkün, bir önceki çalışmada bildirilmiştir7. Izopropanol saç köklerinin nüfuz ve balık pulları4bilinmektedir4 ,7. Bu çalışmanın sonuçları solvent seçiminin kortizol düzeyleri üzerinde önemli bir etkisi olmadığını göstermektedir, kortizol ekstraksiyonu ultrasaf su kullanan diğerlerine göre yüzgeç bazı bölgelerinde daha zor olabileceğini düşündürmektedir; bu gibi durumlarda, isopropanol alternatif olarak kullanılabilir.
Bu çalışma, mersin balığında stresin güvenilir göstergesi için yeni bir matris olarak çene kemiğinin uygulanabilirliğini göstermiştir. H. huso çene kemiği kortizol değerleri aynı türün yüzgeçlerinden çıkarılanlara benzerdi; gelecekteki çalışmalar korelasyon analizi ile farklı türler, yaşlar ve cinsiyetler arasında bu sonucu doğrulamalıdır. Mevcut çalışmada mersin balığının yüksek maliyeti nedeniyle az sayıda balık kullanılmıştır; her numuneyi iki kez test ederek ve ELISA için metanol ekstraksiyonu kopyalayarak bu sınırlamayı aşmaya çalıştık. Dörtlü çarpma nın kullanılması, testin düşük sayıdaki numuneyi kapsayacak şekilde gücünü artırabilir.
Çamaşır çözücünün tipinin mersin balığının çenelerinden değil, yüzgeçlerden kortizol çıkarılmasını orta derecede etkilediği sonucuna vardık. Bu çalışmanın sonucunu genellemeden ve bu sonuçları doğrulamadan önce, farklı türler ve çözücüler kullanılarak daha fazla araştırma yapılmalıdır. Bu çalışma, mersin balığı çene kemiğinin ileride yapılacak çalışmalarda alternatif bir matris olarak uygulanabildiği kanıtlarını sağlamaktadır. ELISA'nın yüzgeç ve çene kemiği kortizol ölçümüne uygunluğu da bu çalışmada gösterilmiştir. Gelecekteki araştırmalar iki unsura odaklanmalıdır: 1) çene kemiklerindeki kortizol düzeyleri ile mersin balığı yüzgeçlerindekiler arasındaki korelasyonun belirlenmesi ve 2) uzun süreli stresi belirlemek için yaşlı balıklardan kortizol ölçümü için matris örnekleri nin toplanması ve havyarlarının ömrü boyunca farklı mersin balığı türlerinde düzeyleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa etmesi gereken çıkar çatışmaları yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Tarım Bilimleri ve Teknoloji Geliştirme Kooperatif Araştırma Programı desteği ile yapılmıştır (Proje başlığı: İklim değişikliği ile hayvancılık verimlilik değişikliği analizi, Proje No. PJ012771), Kırsal Kalkınma İdaresi, Kore Cumhuriyeti. Ayrıca, bu çalışma bir hibe tarafından desteklenmiştir (Hayır. PJ01344604) Hayvan Beslenme ve Fizyoloji Ekibi, Ulusal Hayvan Bilimleri Enstitüsü, RDA, Seul, Kore Cumhuriyeti. Yazarlar, bu çalışmada incelenen üç mersin balığı türünden balık sağlayan Farsça Jest CEO'su Mohammad Hassan Salmanzadeh ve ekibini minnetle kabul ediyorlar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Disposal latex surgical gloves | Ansell | 63754090 | |
| Platform scale-electronic weighing 100kg | Baskoolnikoo | 101 EM | |
| Serological pipette to deliver up to 24 mL | Becton Dickinson Falcon | 35-7550 | |
| Micro plate reader with 450 nm and 490 to 492 nm reference filters | BioTek | 8041000 | |
| Reagent reservoirs | BrandTech | 703459 | |
| Zipper storage plastic bag | Cleanwrap | 30cm x100m | |
| Isopropyl alcohol | Daejung chemicals & Metals | 5035-4400 | |
| Methyl alcohol | Daejung chemicals & Metals | 5558-4100 | |
| Tube rotator- MX-RL-Pro | DLAB Scientific | 824-222217777 | |
| Precision pipette to deliver 1.5 and 10 mL | Eppendorf Research Plus | M21518D | |
| Precision pipette to deliver 15 and 25 μL | Eppendorf Research Plus | R25623C | |
| Weighing paper (107 x 210 mm) | Fisherbrand | 09-898-12B | |
| Bead beater, 50/60 Hz 2A | GeneReach Biotechnology Corp | tp0088 | |
| Plate rotator with orbit capable of 500 rpm | Hangzhou Miu Instrument | MU-E30-1044 | |
| Disposable polypropylene tubes to hold at least 24 mL | Hyundai Micro | H20050 | |
| Fume hood | Kwang Dong Industrial | KD 901-22128175 | |
| Micro-centrifuge capable of 1500 x g | Labo Gene | 9.900.900.729 | |
| Mini vortex mixer | LMS | VTX-3000L | |
| Lotte aluminum foil roll | Lotte Aluminum | B0722X5FK5 | |
| Digital scale | Mettler Toledo | ME204 | |
| Ultrapure water | MDM | MDM-0110 | |
| Pipette tips | Neptune Scientific | REF 2100.N | |
| Large fish net | Pond H2O | Hoz135 | |
| Salivary cortisol kit | Salimetrics | 1-3002-4 | |
| Bone cutting forceps | Sankyo | 26-188A | |
| Precision multichannel pipette to deliver 50 μL and 200 μL | VITLAB | 18A68756 | |
| Towel | Yuhan Kimberly | 1707921546 | |
| Tissue paper (107 × 210) | Yuhan Kimberly | 41117 |
References
- Meyer, J. S., Novak, M. A. Hair cortisol: a novel biomarker of hypothalamic-pituitary- adrenocortical activity. Endocrinology. 153, 4120-4127 (2012).
- Ghassemi Nejad, J., et al. A cortisol study: facial hair and nails. Journal of Steroids Hormonal Sciences. 7, 1-5 (2016).
- Meyer, J. S., Novak, M. A., Hamel, A., Rosenberg, K. Extraction and analysis of cortisol from human and monkey hair. Journal of Visualized Experiments. (83), e50882 (2014).
- Davenport, M. D., Tiefenbacher, S., Lutz, C. K., Novak, M. A., Meyer, J. S. Analysis of endogenous cortisol concentrations in the hair of rhesus macaques. General and Comparative Endocrinology. 147, 255-261 (2006).
- Ghassemi Nejad, J., Ataallahi, M., Park, H. K. Methodological validation of measuring Hanwoo hair cortisol concentration using bead beater and surgical scissors. Journal of Animal Science and Technology. 61, 41-46 (2019).
- Ghassemi Nejad, J., et al. Wool cortisol is a better indicator of stress than blood cortisol in ewes exposed to heat stress and water restriction. Animal. 8, 128-132 (2014).
- Brossa, A. C. Cortisol in skin mucus and scales as a measure of fish stress and habitat quality. Ph.D. dissertation. , Faculty of Veterinary Medicine, Universitat Autonoma de Barcelona. Ph.D. dissertation (2018).
- Carbajal, A., et al. Cortisol detection in fish scales by enzyme immunoassay: biochemical and methodological validation. Journal of Applied Ichthyology. 34, 1-4 (2018).
- Bertotto, D., et al. Alternative matrices for cortisol measurement in fish. Aquaculture Research. 41, 1261-1267 (2010).
- Ghassemi Nejad, J., Jeong, C., Shahsavarani, H., Sung, I. K., Lee, J. Embedded dental cortisol content: a pilot study. Endocrinology & Metabolic Syndrome. 5, 240 (2016).
- Pankhurst, N. W. The endocrinology of stress in fish: an environmental perspective. General and Comparative Endocrinology. 170, 265-275 (2011).
- Ghassemi Nejad, J., Kim, W. B., Lee, B. H., Sung, K. I. Coat and hair color: hair cortisol and serotonin levels in lactating Holstein cows under heat stress conditions. Animal Science Journal. 88, 190-194 (2017).
- Baker, M. R., Gobush, K. S., Vynne, C. H. Review of factors influencing stress hormones in fish and wildlife. Journal of Nature Conservation. 21, 309-318 (2013).
- Aerts, J., et al. Scales tell a story on the stress history of fish. PLoS One. 10, e0123411 (2015).
- Heimbürge, S., Kanitz, E., Otten, W. The use of hair cortisol for the assessment of stress in animals. General and Comparative Endocrinology. , 10-17 (2019).
- Ghassemi Nejad, J., et al. Comparing hair cortisol concentrations from various body sites and serum cortisol in Holstein lactating cows and heifers during thermal comfort zone. Journal of Veterinary Behavior: Clinical and Application Research. 30, 92-95 (2019).
- Bussy, U., Wassink, L., Scribner, K. T., Li, W. Determination of cortisol in lake sturgeon (Acipenser fulvescens) eggs by liquid chromatography tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography B. 1040, 162-168 (2017).
- SAS. 1999. SAS. User's Guide (Version 8.01 Edition). , SAS Inst. Inc. Cary, NC, USA. (1999).
- Barton, B. A. Stress in fishes: a diversity of responses with particular reference to changes in circulating corticosteroids. Integrative and Comparative Biology. 42, 517-525 (2002).
- Ghassemi Nejad, J., et al. Measuring hair and blood cortisol in sheep and dairy cattle using RIA and ELISA assay: a comparison. Biological Rhythm Research. Accepted. , (2019).
