Summary
Komplekse sygdomme hos mennesker kan være udfordrende at modellere i traditionelle laboratoriemodel systemer. Her beskriver vi en kirurgisk tilgang til model af menneskelig muskelsygdom gennem transplantation af humane skeletmuskulatur biopsier i immundefekt mus.
Abstract
De behandlingseffekter, der er observeret i dyreforsøg, gentages ofte ikke i kliniske forsøg. Selv om dette problem er mangesidet, er en af grundene til denne fiasko brugen af utilstrækkelige laboratorie modeller. Det er udfordrende at modellere komplekse sygdomme hos mennesker i traditionelle laboratorie organismer, men dette problem kan omgås gennem studiet af humane xenografter. Den kirurgiske metode, vi beskriver her, giver mulighed for at oprette humane skeletmuskulatur xenografts, som kan bruges til at modellere muskelsygdomme og til at udføre præklinisk terapeutisk testning. Under en IRB-godkendt protokol, er skeletmuskulatur prøver erhvervet fra patienter og derefter transplanteret i NOD-Rag1NullIL2rγNull (NRG) Host mus. Disse mus er ideelle værter for transplantation undersøgelser på grund af deres manglende evne til at gøre modne lymfocytter og er derfor ude af stand til at udvikle celle-medierede og humorale adaptive immunrespons. Host mus er bedøvet med isofluran, og musen tibias forreste og extensor digitorum longus muskler fjernes. Et stykke menneskelig muskel placeres derefter i det tomme tibiale rum og sutureres til den proksimale og distale sener af peroneus longus muskel. Den xenograferede muskel er spontant vaskulariseret og innerveret af musen vært, hvilket resulterer i robust regenereret menneskelige muskler, der kan tjene som en model for prækliniske undersøgelser.
Introduction
Det er blevet rapporteret, at kun 13,8% af alle narkotika udviklingsprogrammer undergår kliniske forsøg er vellykket og føre til godkendte terapier1. Selv om denne succesrate er højere end de 10,4% tidligere rapporterede2, er der stadig betydelige plads til forbedringer. En metode til at øge succesraten for kliniske forsøg er at forbedre laboratorie modeller, der anvendes i præklinisk forskning. Food and Drug Administration (FDA) kræver dyreforsøg for at vise behandlingens virkning og vurdere toksicitet før fase 1 kliniske forsøg. Der er dog ofte begrænset overensstemmelse i behandlingsresultaterne mellem dyreforsøg og kliniske forsøg3. Desuden kan behovet for prækliniske dyreforsøg være en uovervindelig barriere for terapeutisk udvikling i sygdomme, der mangler en accepteret dyremodel, hvilket ofte er tilfældet for sjældne eller sporadiske sygdomme.
En måde at modellere sygdomme hos mennesker på er ved at Trans planterer humant væv til immundefekt mus for at generere xenografts. Der er tre vigtige fordele ved xenograft-modeller: for det første kan de rekapitulere de komplekse genetiske og epigenetiske abnormiteter, der findes i sygdomme hos mennesker, som aldrig kan reproducerbare i andre dyremodeller. For det andet kan xenografter bruges til at modellere sjældne eller sporadiske sygdomme, hvis der er tilgængelige patientprøver. For det tredje modellere xenografter sygdommen inden for et komplet in vivo-system. Af disse grunde har vi en hypotese om, at behandlingseffekt resultater i xenograft-modeller er mere tilbøjelige til at oversætte til forsøg hos patienter. Humane tumor xenografter er allerede blevet udnyttet med succes til at udvikle behandlinger for almindelige kræftformer, herunder multipelt Myeloma, samt personligt tilpassede terapier for individuelle patienter4,5,6, 7.
For nylig, xenografter er blevet brugt til at udvikle en model af human muskelsygdom8. I denne model, humane muskel biopsiprøver er transplanteres i bagbenene af immunodedygtige NRG mus til dannelse af xenografts. De transplanterede humane myofibers dør, men humane muskel stamceller, der er til stede i xenograft, udvider og differentierer efterfølgende til nye humane myofibers, som genbefolker den enpodede humane basal lamina. Derfor er de regenererede myofibers i disse xenografter helt menneskelige og er spontant revaskulariseret og innerveret af musen vært. Vigtigere, fascioscapulohumeral muskuløs dystrofi (FSHD) patient muskelvæv transplanterede i mus rekapitulerer centrale elementer i den menneskelige sygdom, nemlig udtryk for DUX4 transkriptionen faktor8. Fshd er forårsaget af overekspression af DUX4, som er epigenetisk lyddæmpet i normale muskelvæv9,10. I FSHD xenograft-modellen har behandling med en DUX4-specifik morpholino vist sig at undertrykke DUX4 ekspression og funktion med succes og kan være en potentiel terapeutisk mulighed for fshd-patienter11. Disse resultater viser, at humane muskel xenografter er en ny tilgang til model Human muskelsygdom og teste potentielle terapier i mus. Her beskriver vi i detaljer den kirurgiske metode til at skabe humane skeletmuskulatur xenografter i immundefekt mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Al brug af forskningsenheder fra forsøgspersoner blev godkendt af Johns Hopkins institutions Review Board (IRB) for at beskytte deltagernes rettigheder og velfærd. Alle dyreforsøg blev godkendt af Johns Hopkins University institutionel Animal Care og brug Committee (IACUC) i overensstemmelse med National Institutes of Health (NIH) guide til pleje og brug af forsøgsdyr. Mandlige NOD-Rag1NullIL2rγNull (NRG) Host-mus (8-12 uger gamle) bruges til at udføre xenograft-eksperimenter. Disse mus er anbragt i ventilerede stativer og er givet HEPA-filtreret, hærdet, og befuret luft samt omvendt osmose filtreret hyperchloreret vand. Mus leveres vand og en bestrålet antibiotika diæt (tabel over materialer) ad libitum, og anlægget giver 14 timer af lys til 10 h mørke som styres af central timer.
1. klargøring af udstyr
- Erhverve NOD-Rag1NullIL2r γnull (NRG) mus, 8-12 uger af alder.
- Autoklave kirurgisk udstyr: saks, pincet, nåle holder, kirurgisk hæftemaskine (tabel over materialer), sårclips, kirurgiske servietter (tabel over materialer) og bægerglas (figur 1a).
- Forbered 50 mL muskel medier (20% føtal kvægserum, 2% chick embryo ekstrakt, 1% antibiotikum/antimykotisk i skinke F10 medium). Opbevar alle kemikalier/stoffer/opløsninger, der anvendes til kirurgi ved stuetemperatur, medmindre andet er angivet i protokollen.
- Forbered en 1 mL sprøjte med en 26 G nål, der er 3/8 inches lang indeholdende 2 mg/mL analgetikum (tabel over materialer), og sted på is. Den analgetiske kan fortyndes til den rette koncentration ved hjælp af steril fosfat bufferet saltvand (PBS).
2. kirurgisk forberedelse
- Få en human Muskel biopsi under en IRB-godkendt protokol fra patienter, hvis muskler viser styrke > 4-/5 på MRC (medicinsk Forskningsråd) skala12. Placer forsknings prøven i en 100 mm x 15 mm Petri skål indeholdende muskel medier.
Bemærk: MRC-skalaen anvendes i klinisk praksis som en vurdering af muskelstyrke med 0 viser ingen sammentrækning, 5 viser normal effekt, og 4 (4-til 4 +) viser bevægelse mod modstand12. Vi har konstateret, at muskler med mild til moderat svaghed (MRC > 4-/5) typisk udviser sygdoms patologi, men ikke i udstrakt grad erstattes af fedtvæv eller fibrose, som begge hæmmer xenograft regenerering. I tilfælde af obduktions vævet, hvor en nylig MRC-score ikke er tilgængelig, kan der opnås adgang til muskel kvalitet via brutto observation. Muskelbiopsier, der er bleg pink i udseende eller har store områder af fedtvæv er ikke tilbøjelige til at xenograft med succes. - Fjern eventuelle resterende fascia eller fedtvæv fra prøven med kirurgisk saks ved hjælp af et stereomikroskop og lyskilde til at hjælpe visualisering.
- Dissekere musklen biopsi i ca. 7 mm x 3 mm x 3 mm stykker med kirurgisk saks ved hjælp af stereomikroskop og en lyskilde. Sørg for, at fibrene er anbragt i længderetningen i prøven.
- Placer Petri skålen indeholdende dissekeret muskel på is. I gennemsnit holdes xenograferne i medierne i 4 timer, mens operationer udføres. Men, biopsier er blevet opbevaret i medierne for 24 h før xenografting, og denne forsinkelse ikke synes at negativt påvirke transplantation eller regenerering.
- Placer syntetiske, ikke-absorberbare suturer (tabel over materialer) i en 100 mm x 15 mm Petri skål indeholdende 70% ethanol.
- Konfigurer en dobbelt procedure anæstesi kredsløb: Arranger Mapleson E vejrtrækning kredsløb på stereomikroskopet og placere induktions kammeret i en biosikkerhed kabinet (figur 1a,B).
- Opnå vægten af NRG-musen ved at anbringe det i et autoclaveret bægerglas på en skala og overføre det til induktions kammeret. Inducerer anæstesi under 3% isofluran. Når den passende anæstesidybde er opnået-som vurderet ved observation af respiratorisk hastighed, muskel afslapning, og mangel på frivillig bevægelse-reducere vaporizer indstilling til 1,5% for resten af operationen.
- Overfør musen fra induktions kammeret til Mapleson E vejrtrækning kredsløb og anvende oftalmologiske salve til øjne.
- Fjern håret overliggende tibias forreste (Ta) fra ankel til knæ med en trimmer, efterfulgt af en 1 min behandling med hårfjerning lotion (tabel over materialer) (figur 2a).
- Desinficer det kirurgiske sted ved at svinge benet med povidon-jod-opløsning. Derefter vaskes den resterende povidon-jod med 70% ethanol.
- Injicer musen subkutant med analgetikum, såsom carprofen, (tabel over materialer) i en dosis på 5 mg/kg.
3. xenograft kirurgi
- Tape ned benet og foretage et lige snit over tibilalis forreste (Ta) muskel med saks og iris pincet med oprindelse i de distale sener og slutter under knæet (figur 2b).
- Separat hud fra muskler ved hjælp af stump dissektion med kirurgisk saks.
- Skær gennem epimysium af TA-musklen med en saks, som starter ved senen og slutter ved knæet.
Bemærk: Dette er en meget overfladisk snit (mindre end 0,5 mm; Figur 2b, sort stiplet linje), og den underliggende ta bør ikke beskadiges i processen, da dette ville gøre fjernelsen mere udfordrende. Når de udføres korrekt, vil muskelfibrene synligt slappe af. - Skær den distale sene af TA med en saks, Grib senen med iris tang, og træk TA op mod knæet (figur 2c).
- Skær den distale sene af extensor digitorum longus (EDL) med en saks og træk EDL op mod knæet (figur 2D). Når den proksimale sene af peroneus longus (PL) musklen er synlig, fjerne EDL med saks (figur 2D, grøn stiplede linje).
- Fjern TA med en saks (figur 2D, blå stiplet linje) og brug en kirurgisk serviet med PBS og let tryk for at opnå hæmostase (figur 2E).
- Tråd en sutur gennem proksimale peroneus longus (pl) sene og trim, efterlader ca 1,5 tommer tråd på hver side af senen (figur 2F).
- Udfør den første halvdel af en to-hånds kirurgisk firkantet knude, men stram ikke: Dette vil danne en cirkel. Placer et xenograft i denne cirkel, og stram løkken for at sikre xenograft. Gennemfør den anden halvdel af den firkantede knude (figur 2g,H). Dette vil sutur xenograft til den proksimale sene af PL.
- Trådsutur gennem distale pl senen og Gentag den firkantede knude teknik fra trin 3,8 for at binde xenograft til den distale sene (figur 2H,i).
Bemærk: Den mediale haseleddet arterie og vene kan ligge tæt på eller på toppen af den distale sene af pl. Placer ikke suturer gennem eller omkring disse fartøjer. Det er let at se, om en sutur er blevet forkert placeret, da skibene vil Blanch eller bløde. Hvis dette sker, fjernes suturen og placeres et andet sted. - Træk huden over den xenografede muskel, Forsegl med kirurgisk lim, og Placer 2-3 kirurgiske hæfteklammer over snittet (figur 2J).
- Placer musen i et rent bur på en opvarmet pude til at komme sig. Overvåg musen indtil fuldt bevidst og periodisk i løbet af de næste par dage for tegn på lokal systemisk infektion og for at sikre, at operationsstedet ikke åbnes igen.
Bemærk: En enkelt dosis analgetikum som beskrevet i trin 2,11 er typisk tilstrækkelig til smertelindring. Musene bør dog også overvåges for vedvarende smerter (f. eks. halthed, pjusket pels, krumrygget kropsholdning) og om nødvendigt gendoseres med analgetikum ved 24 timer efter operationen.
4. xenograft-opsamling
Bemærk: Xenografts opsamles typisk mellem 4 og 6 måneder efter operationen. Men, samlinger er blevet udført op til 12 måneder efter operationen.
- Der anbringes et overdækket bægerglas med 200 mL 2-methylbutan i en æske med tøris i mindst 30 minutter før xenograft-samlingen.
- Inducerer anæstesi under 3% isofluran i induktions kammeret. Når den passende anæstesidybde er opnået, reducere vaporizer indstilling til 1,5% for resten af operationen.
- Overfør musen fra induktions kammeret til Mapleson E vejrtrækning kredsløb arrangeret på et stereomikroskop.
- Fjern håret overliggende tibias forreste fra ankel til knæ med en trimmer og hårfjerning lotion. Suturerne, der holder xenograft på plads, kan ses gennem huden (figur 3a).
- Tape ned benet og bruge saks og iris tang til at åbne huden over xenograft indtil begge suturer er synlige (figur 3b). Hud overliggende xenograft kan fjernes som vist for at gøre fjernelse af xenograft lettere.
- Brug en skalpel til at skære mellem xenograft og skinneben (figur 3b, pilen betegner det oprindelige sted og retningen af incision). Dette vil frigøre den ene side af xenograft.
- Brug en skalpel til at skære mellem PL musklen og gastrocnemius muskel (figur 3c, jegncision langs epimysium mærket med pil). PL vil blive fjernet med xenograft.
- Skær under den distale sutur og gennem den distale sene af PL (figur 3D, skåret langs stiplede linje).
- Fjern xenograft og PL ved at snuppe suturen med iris tang og afbøjning den mod knæet, mens du bruger en saks til at klippe den væk fra den underliggende muskel (figur 3E).
- Skær over den proksimale sutur med en saks for at fjerne xenograft og PL (figur 3F, skåret langs stiplede linje i 3e).
- Placer prøven på et lille stykke pap eller plastik, og fastgør så tæt på suturerne som muligt. Mens fastgørelse af præparatet, forsigtigt strække musklen for at sikre, at fiberorientering vedligeholdes under snap frysning proces. Efter benene er sikkert på plads, skubbe musklen op benene, så det hviler lige over pap.
Bemærk: Alternativt kan den ene ende af xenograft monteres i traganth på en kork, eller den kan nedsænkes helt i optimal skære temperatur (O.C.T.) sammensatte i en cryomold. Med omhu, muskel konstellation kan bevares med begge metoder. - Snap fryse xenograft i forkølet 2-methylbutan.
- Opbevar xenograft ved-80 °C.
- Umiddelbart efter xenograft Collection, aflive mus i overensstemmelse med amerikanske veterinærmedicinske Association retningslinjer:
- Placer mus i et forseglet kammer med et passende røggas skyllesystem. Brug isofluran i en koncentration på 3-4% for at inducere anæstesi.
- Når den passende anæstesidybde er opnået-som vurderet ved observation af respiratorisk hastighed, muskel afslapning, og mangel på frivillig bevægelse-øge vaporizer indstilling til 5% at inducere døden. Efterlad musene i kammeret i yderligere 2 min efter vejrtrækningen er ophørt. Døden verificeres ved at observere, at musene undlader at inddrive inden for 10 min efter overdosis af isofluran.
- Endelig udføre cervikal dislokation på musene.
Bemærk: I tilfælde af bilateralt xenograferet mus kan det kontralaterale xenograft gemmes til en senere samling. For at udføre en overlevelse samling, åbne huden overliggende xenograft med en enkelt lige skåret med kirurgisk saks, og fjerne xenograft som beskrevet i trin 4,6 til 4,10. Luk derefter huden over det tomme tibiale rum ved hjælp af kirurgisk lim og hæfteklammer. Behandl musen med analgetikum som beskrevet i trin 2,11 og Placer musen i rent bur på opvarmet pad til at komme sig. Overvåg musen indtil fuldt bevidst og periodisk i løbet af de næste par dage for tegn på lokal systemisk infektion og for at sikre, at operationsstedet ikke åbnes igen.
5. xenograft Immunhistochemistry
- Brug en kryostat til at skære 10 til 12 μm sektioner fra det indsamlede xenograft på positivt ladede slides (tabel over materialer).
- Fyld farvning krukken med methanol og pre-cool ved-20 °C i 30 min.
- Placer slides i iskold methanol i 10 minutter for at fastsætte og permeabilisere xenograft-sektionerne.
- Placer slides i farvnings krukke og vask 3x med fosfat bufferet saltvand (PBS) i 5 min.
- Blok med anti-mus IgG (tabel over materialer) for 2 h ved 4 °c.
- Blot med primære antistoffer, såsom spectrin, Lamin A/C, og embryonale myosin (tabel over materialer) i PBS suppleret med 2% ged serum natten over ved 4 °c.
- Placer slides i en farvnings krukke og vask 3x med fosfat bufferet saltvand (PBS) i 5 min.
- Blot med fluorescerende-farvestoffer konjugeret sekundære antistoffer (tabel over materialer) i PBS suppleret med 2% ged serum for 1 h ved stuetemperatur.
- Placer slides i farvnings krukke og vask 3x med fosfat bufferet saltvand (PBS) i 5 min.
- Placer monterings medium (tabel over materialer) over xenografter sektioner, Placer dækglas på toppen, og brug neglelak til at forsegle dæksedlen.
Figur 2: xenograft kirurgi. (A) håret fjernes fra operationsstedet. (B) et snit er lavet over tibias forreste (Ta). De distale sener af TA og extensor digitorum longus (EDL) er markeret med pile. Den sorte stiplede linje angiver, hvor epimysium vil blive skåret i trin 3,3. C) den distale SENE af ta skæres, og musklen trækkes op til knæet. (D) senen af EDL er skåret og EDL trækkes op til knæet. Dette udsætter den proksimale sene af peroneus longus (PL) markeret med en pil. Stiplede linjer angiver, hvor de skal skæres med en saks for at fjerne EDL (grøn) og PL (blå). E) EDL og ta fjernes. F) en sutur anbringes gennem den proksimale SENE af pl.G) xenograft anbringes i det tomme tibiale rum og suses til den proksimale pl-sene ved hjælp af en tohånds kirurgisk firkantet knude. H) en sutur anbringes gennem den distale sene af pl, markeret med en pil, og en anden to-hånds kirurgisk firkantet knude anvendes til at sutur xenograft til den distale sene. I) xenograft er fuldt transplanteret og sutureret til pl.J) huden lukkes med kirurgisk lim. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3:4 måned xenograft-samling. (A) håret fjernes fra operationsstedet. Suturer er synlige under huden. B) huden, der over ligger xenograft, fjernes. Derefter er xenograft grebet med iris pincet ved den distale sutur og forsigtigt trukket opad. Start ved anklen, en skalpel bruges til at skære langs skinneben og frigøre xenograft. Pilen viser begyndelsen af snittet langs skinneben. (C) ved at trække gastrocnemius musklen til siden, en svag hvid linje af epimysium adskille peroneus LONGUS (pl) muskel og gastrocnemius (vist ved pilen) bliver synlig. Brug skalpel til at skære langs denne linje for at adskille PL fra de andre benmuskler. D) den højre side af xenograft, og pl er nu fri for de andre muskler i benet og er klar til fjernelse. Den stiplede linje angiver, hvor man skal skære med kirurgisk saks for at begynde at fjerne xenograft og PL. (E) efter skæring under den distale sutur, afbøje xenograft mod knæet. Den stiplede linje angiver, hvor den skal skæres med kirurgisk saks for at fjerne xenograft og PL fra tibiale-rummet. F) det tomme tibiale rum med xenograft og pl fjernet med succes. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som påvist af yuanfan Zhang et al., denne kirurgiske protokol er en ligetil metode til at producere menneskelige skeletmuskulatur xenografter8. Regenereret xenografter bliver spontant innerveret og udviser funktionel kontraktilitet. Desuden sammenfattende muskel xenograferet fra FSHD patienter ændringer i genekspression observeret i FSHD patienter8.
I vores erfaring, vil ca 7 ud af 8 xenografter udført fra kontrol patientprøver vise vellykket muskel engraftment. Et vellykket xenograft viser robust regenerering af humane myofibers som identificeret med humane specifikke antistoffer (figur 4). Positive embryonale myosin farvning inden for en del af myofibers indikerer, at regenereringsprocessen er stadig i gang. I modsætning hertil kan dårlig kirurgisk teknik eller et utilstrækkeligt præparat føre til dårlig regenerering af muskelfibre (figur 4).
Xenografts udført fra en patient diagnosticeret med en idiopatisk inflammatorisk myopati (IIM) viser moderat antal regenererede humane myofibers ved 4-og 6-måneders samlinger, og embryonale myosin farvning fortsætter efter 6 måneder (figur 5a). Inflammatoriske celler er til stede i xenograft som vist ved H & E farvning (figur 5a), og er blevet bekræftet med CD3, CD68 og andre immunologiske markører (data ikke vist). Xenografts er stabile i musen, og op til 12-måneders samlinger er blevet udført. Individuel myofiber størrelse er sammenlignelig mellem 4-og 6-måneders IIM xenografter og den oprindelige IIM patient biopsi (figur 5b). Sjældne fibre, der viser et tværsnitsareal (CSA) større end 3500 μm2 , observeres i xenografter, men ikke i IIM biopsi, hvilket indikerer, at nogle myofibers i xenografter kan regenerere til en CSA sammenlignelig i størrelse til sunde myofibers (figur 5b ).
Figur 1: kirurgisk opsætning.
A) standard orientering af stereomikroskop, Mapleson E vejrtrækning kredsløb, og kirurgiske værktøjer under xenograft kirurgi. B) placering af induktions kammeret i biosikkerhedskabinettet.
Figur 4: forventede positive og negative resultater.
Xenografts indsamlet 4-måneders post-kirurgi viser god eller dårlig regenerering er plettet med human-specifikke Lamin A/C (1:50) og human-specifikke spectrin (1:20) og embryonale myosin (1:10) (tabel over materialer). De områder, der er angivet med de hvide stiplede felter, vises som højere forstørrelses skær. Skala bjælke: 200 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: repræsentativ xenograft-regenerering.
A) xenografts (skitseret med stiplede linjer) udført fra en patient diagnosticeret med en idiopatisk inflammatorisk myopati (IIM) plettet med Hematoxylin og eosin (H & E), Human specifikke Lamin A/C, og humane specifikke spectrin, show myofiber formation inden for NRG-mus på både 4-og 6-måneders tidspunkter. Embryonale myosin farvning viser, at regenerering stadig er i gang på begge tidspunkter. Scale bar: 200 μm. B) histogrammer skildrer tværsnitsareal (CSA) af myofibers fra 4-og 6-måneders xenografter og humane biopsier fra en patient diagnosticeret med en idiopatisk inflammatorisk myopati (IIM) og en sund kontrol patient. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Patient afledte xenografter er en innovativ måde at modellere muskelsygdomme og udføre prækliniske undersøgelser. Den beskrevne metode til at skabe skeletmuskulatur xenografter er hurtig, ligetil og reproducerbar. Ensidige operationer kan udføres i 15 til 25 minutter, eller bilateralt i 30 til 40 minutter. Bilaterale xenografter kan give yderligere eksperimentel fleksibilitet. For eksempel, forskere kan udføre lokaliseret behandling af en xenograft, med den anden venstre som en kontrol. NRG-musene er modstandsdygtige over for infektion på operationsstedet, når de huses i et patogen frit anlæg; i vores erfaring med at udføre mere end 200 xenografts, har vi aldrig haft en mus erhverve en kirurgisk infektion. Desuden, Host mus tolerere fjernelse af TA og EDL meget godt. Inden for en time efter operationen vil ensidigt og bilateralt xenograferet mus være aktive og gå rundt om deres bur, og endda stå op på deres baglemmer. Lejlighedsvis vi observere nogle fodfald i Host mus, men normalt kun efter en periode med inaktivitet, som hvis for nylig Awoken, og inden for minutter af vågne ben brug vil være normal.
Der er flere kritiske trin i protokollen. Første, under fjernelse af EDL og TA, det er meget vigtigt at ikke skade den tilstødende PL muskel eller dens sener. Dette kan undgås ved omhyggeligt og korrekt at identificere placeringen af alle distale sener efter den indledende indsnit over ta udføres. Desuden skal den proksimale sene af PL identificeres og klart synlig før fjernelse af EDL (figur 2D). For det andet skal suturer placeres gennem sener og strammes fuldt i en ordentlig to-hånds kirurgisk firkantet knude. Xenografts regenererer mere robust under spænding, og dette kan kun opnås, hvis xenograft bindes til PL-sener, og hvis suturerne ikke løsner postoperativt. Endelig er det vigtigt ikke at beskadige eller afskære nogen større blodkar, der forsyner foden. Især kan den mediale haseleddet arterie og vene ligge tæt på eller på toppen af den distale sene af pl. Placer ikke suturer gennem eller omkring disse fartøjer. Det er let at se, om en sutur er blevet forkert placeret, da skibene vil Blanch eller bløde. Hvis dette sker, fjernes suturen og placeres et andet sted.
Denne metode har flere begrænsninger. Det er ikke modtagelig for standard funktionelle assays anvendes i musemodeller af muskelsygdom, såsom Grip styrke eller løbebånd udholdenhed. Der kan dog stadig udføres elektrofysiologiske vurderinger af xenograft-funktionen. Fremkaldte kraft målinger kan optages fra xenograft-explants, og enkelt enzymatisk isolerede myofibre fra xenografter lastet med ratiometriske calcium farvestoffer og elektrisk stimuleret kan bruges til at studere calcium dynamik8. En anden iboende udfordring i denne model er, at erhverve og arbejde med humant væv kan være svært. Ikke alle laboratorier vil have let adgang til friske muskelbiopsier, men det har vist sig, at xenografter udført fra obduktions vævet ca. 48 timer efter slagtning kan med held være forankret, og dette væv kan være lettere at opnå for nogle laboratorier8. Det er også udfordrende at manipulere genekspression i humant væv, hvorimod forskere, der bruger standard musemodeller af sygdom, let kan bruge den overflod af mus genetiske værktøjer til rådighed.
En styrke af denne xenograft model er, at det giver forskerne mulighed for at studere menneskelige muskler in vivo. Vævskultur har været anvendt i udstrakt grad til at studere celle og molekylær biologi af menneskelige muskler. Men disse kortvarige, ex vivo undersøgelser ikke altid tilnærmelsesvis funktionelle muskler in vivo. Men en advarsel er, at er det udfordrende at afgøre, hvor tæt xenograft biologi og funktion tilnærmere menneskelig muskel på grund af bidraget fra Host Mouse komponenter under den regenerativ proces. For eksempel, menneskelige og mus neuromuskulære kryds (nmjs) er morfologisk adskilte, og der er betydelig divergens mellem den synaptiske proteom af menneske og mus nmjs13. Da xenografter er innerveret af muse værten, kan dette resultere i biologiske ændringer, der er unikke for de humane xenografter.
I fremtidige undersøgelser, denne skeletmuskulatur xenograft metode kunne bruges til bedre at forstå menneskelige muskel cellebiologi og til at udvikle nye modeller for sjældne eller erhvervede muskelsygdomme, der i øjeblikket mangler dyremodeller. Vi forventer, at dette vil have en betydelig gavnlig indvirkning på den terapeutiske udvikling for disse sygdomme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Myositis Association og Peter Buck Foundation. Vi vil gerne takke Dr. Yuanfan Zhang for at dele sin ekspertise og træning i xenograft Operations teknik.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm x 15 mm Petri dish | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| 2-Methylbutane | Fisher | O3551-4 | |
| 20 mm x 30 mm micro cover glass | VWR | 48393-151 | |
| Animal Weighing Scale | Kent Scientific | SCL- 1015 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution | Corning, Cellgro | 30-004-CI | |
| AutoClip System | F.S.T | 12020-00 | |
| Castroviejo Needle Holder | F.S.T | 12565-14 | |
| Chick embryo extract | Accurate | CE650TL | |
| CM1860 UV cryostat | Leica Biosystems | CM1860UV | |
| Coplin staining jar | Thermo Scientific | 19-4 | |
| Dissection Pins | Fisher Scientific | S13976 | |
| Dry Ice - pellet | Fisher Scientific | NC9584462 | |
| Embryonic Myosin antibody | DSHB | F1.652 | recommended concentration 1:10 |
| Ethanol | Fisher Scientific | 459836 | |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30071.01 | |
| Fiber-Lite MI-150 | Dolan-Jenner | Mi-150 | |
| Forceps | F.S.T | 11295-20 | |
| Goat anti-mouse IgG1, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21121 | recommended concentration 1:500 |
| Goat anti-mouse IgG2b, AlexaFluor 594 | Invitrogen | A-21145 | recommended concentration 1:500 |
| Gum tragacanth | Sigma | G1128 | |
| Hams F-10 Medium | Corning | 10-070-CV | |
| Histoacryl Blue Topical Skin Adhesive | Tissue seal | TS1050044FP | |
| Human specific lamin A/C antibody | Abcam | ab40567 | recommended concentration 1:50-1:100 |
| Human specific spectrin antibody | Leica Biosystems | NCLSPEC1 | recommended concentration 1:20-1:100 |
| Induction Chamber | VetEquip | 941444 | |
| Iris Forceps | F.S.T | 11066-07 | |
| Irradiated Global 2018 (Uniprim 4100 ppm) | Envigo | TD.06596 | Antibiotic rodent diet to protect again respiratory infections |
| Isoflurane | MWI Veterinary Supply | 502017 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | surgical wipes |
| Mapleson E Breathing Circuit | VetEquip | 921412 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412 | |
| Mobile Anesthesia Machine | VetEquip | 901805 | |
| Mouse on Mouse Basic Kit | Vector Laboratories | BMK-2202 | mouse IgG blocking reagent |
| Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| NAIR Hair remover lotion/oil | Fisher Scientific | NC0132811 | |
| NOD-Rag1null IL2rg null (NRG) mice | The Jackson Laboratory | 007799 | 2 to 3 months old |
| O.C.T. Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| Oxygen | Airgas | OX USPEA | |
| PBS (phosphate buffered saline) buffer | Fisher Scientific | 4870500 | |
| Povidone Iodine Prep Solution | Dynarex | 1415 | |
| ProLong™ Gold Antifade Mountant | Fisher Scientific | P10144 (no DAPI); P36935 (with DAPI) | |
| Puralube Ophthalmic Ointment | Dechra | 17033-211-38 | |
| Rimadyl (carprofen) injectable | Patterson Veterinary | 10000319 | surgical analgesic, administered subcutaneously at a dose of 5 mg/kg |
| Scalpel Blades - #11 | F.S.T | 10011-00 | |
| Scalpel Handle - #3 | F.S.T | 10003-12 | |
| Stereo Microscope | Accu-scope | 3075 | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Suture, Synthetic, Non-Absorbable, 30 inches long, CV-11 needle | Covidien | VP-706-X | |
| 1ml Syringe (26 gauge, 3/8 inch needle) | BD Biosciences | 329412 | |
| Trimmer | Kent Scientific | CL9990-KIT | |
| Vannas Spring Scissors, 8.0 mm cutting edge | F.S.T | 15009-08 | |
| VaporGaurd Activated Charcoal Filter | VetEquip | 931401 | |
| Wound clips, 9 mm | F.S.T | 12022-09 |
References
- Wong, C. H., Siah, K. W., Lo, A. W. Estimation of clinical trial success rates and related parameters. Biostatistics. 0, 1-14 (2018).
- Hay, M., Thomas, D. W., Craighead, J. L., Economides, C., Rosenthal, J. Clinical development success rates for investigational drugs. Nature Biotechnology. 32, 40-51 (2014).
- Perel, P., et al. Comparison of treatment effects between animal experiments and clinical trials: systematic review. BMJ. 334, 1-6 (2007).
- Rubio-Viqueira, B., Hidalgo, M. Direct in vivo xenograft tumor model for predicting chemotherapeutic drug response in cancer patients. Clinical Pharmacology Therapeutics. 85, 217-221 (2009).
- Roberts, K. G., et al. Targetable Kinase-Activating Lesions in Ph-like Acute Lymphoblastic Leukemia. New England Journal of Medicine. 371, 1005-1015 (2014).
- Kim, J., et al. GDF11 Controls the Timing of Progenitor Cell Competence in Developing Retina. Science. 308, 1927-1930 (2005).
- Sako, D., et al. Characterization of the ligand binding functionality of the extracellular domain of activin receptor type IIB. Journal of Biological Chemisty. 285, 21037-21048 (2010).
- Zhang, Y., et al. Human skeletal muscle xenograft as a new preclinical model for muscle disorders. Human Molecular Genetics. 23, 3180-3188 (2014).
- Gabellini, D., Green, M. R., Tupler, R. Inappropriate Gene Activation in FSHD : A Repressor Complex Binds a Chromosomal Repeat Deleted in Dystrophic Muscle. Cell. 110, 339-348 (2002).
- Lemmers, R. J. L. F., et al. A Unifying Genetic Model for Facioscapulohumeral Muscular Dystrophy. Science. 329, 1650-1654 (2010).
- Chen, J. C. J., et al. Morpholino-mediated Knockdown of DUX4 Toward Facioscapulohumeral Muscular Dystrophy Therapeutics. Molecular Therapy. 24, 1405-1411 (2016).
- Medical Research Council. Aids to the investigation of the peripheral nervous system. , Her Majesty’s Stationary Office. London. (1943).
- Jones, R. A., et al. Cellular and Molecular Anatomy of the Human Neuromuscular Junction. Cell Reports. 21, 2348-2356 (2017).
