Summary
Complexe menselijke ziekten kunnen lastig zijn om te modelleren in traditionele laboratoriummodel systemen. Hier beschrijven we een chirurgische benadering om de menselijke spierziekte te modelleren door de transplantatie van menselijke skeletspier biopsieën in immunodeficiënte muizen.
Abstract
De in dierstudies waargenomen behandelingseffecten worden vaak niet in klinisch onderzoek gerecapitculeerd. Hoewel dit probleem veelzijdig is, is een van de redenen voor deze mislukking het gebruik van inadequate laboratorium modellen. Het is een uitdaging om complexe menselijke ziekten in traditionele laboratorium organismen te modelleren, maar dit probleem kan worden omzeild door de studie van menselijke xenografts. De chirurgische methode die we hier beschrijven, zorgt voor de creatie van menselijke skeletspieren xenografts, die kunnen worden gebruikt om spierziekte te modelleren en om preklinische therapeutische testen uit te voeren. Onder een institutioneel Review Board (IRB)-goedgekeurd protocol, worden skeletspieren specimens verworven van patiënten en vervolgens getransplanteerd in NOD-Rag1NullIL2rγNull (NRG) host muizen. Deze muizen zijn ideale gastheren voor transplantatie studies als gevolg van hun onvermogen om volwassen lymfocyten te maken en zijn dus niet in staat om cel-gemedieerde en humorale adaptieve immuunresponsen te ontwikkelen. Hostmuizen worden verdoofd met Isofluraan en de muis tibialis voorste en extensor digitorum Longus spieren worden verwijderd. Vervolgens wordt een stukje menselijke spier in het lege tibiale compartiment geplaatst en gehecht aan de proximale en distale pezen van de peroneus longus spier. De xenografted spier is spontaan gevasculariseerde en geïncubeerd door de muis gastheer, resulterend in robuust geregenereerde menselijke spier die kan dienen als een model voor preklinische studies.
Introduction
Er is gemeld dat slechts 13,8% van alle Programma's voor Geneesmiddelenontwikkeling die klinische proeven ondergaan succesvol zijn en leiden tot goedgekeurde therapieën1. Hoewel dit succespercentage hoger is dan de 10,4% eerder gerapporteerde2, is er nog steeds aanzienlijke ruimte voor verbetering. Een benadering om het succespercentage van klinische proeven te verhogen is het verbeteren van laboratorium modellen die worden gebruikt in preklinisch onderzoek. De Food and Drug Administration (FDA) vereist dierstudies om de werkzaamheid van de behandeling te tonen en de toxiciteit te beoordelen voorafgaand aan fase 1 klinische onderzoeken. Er is echter vaak een beperkte concordantie in behandelingsresultaten tussen dierstudies en klinische proeven3. Bovendien kan de noodzaak van preklinische dierproeven een onoverkomelijke barrière zijn voor therapeutische ontwikkeling bij ziekten die geen geaccepteerd diermodel hebben, wat vaak het geval is bij zeldzame of sporadische ziekten.
Een manier om het model van menselijke ziekte is door het transplanteren van menselijk weefsel in immunodeficiënte muizen om xenografts te genereren. Er zijn drie belangrijke voordelen voor xenotransplantaatmodellen is-modellen: ten eerste kunnen ze de complexe genetische en epigenetische afwijkingen die in een menselijke ziekte voorkomen, die nooit reproduceerbaar zijn in andere diermodellen, recapituleren. Ten tweede kunnen xenotransplantaten worden gebruikt om zeldzame of sporadische ziekten te modelleren als er patiënt monsters beschikbaar zijn. Ten derde modelleren xenotransplantaten de ziekte binnen een compleet in vivo systeem. Om deze redenen veronderstellen we dat de werkzaamheidsresultaten van de behandeling in xenotransplantaatmodellen is-modellen meer kans maken om te vertalen naar proeven bij patiënten. Menselijke tumor xenotransplantaten zijn al met succes gebruikt voor het ontwikkelen van behandelingen voor veelvoorkomende kankers, met inbegrip van multipel myeloom, evenals gepersonaliseerde therapieën voor individuele patiënten4,5,6, 7.
Onlangs zijn xenotransplantaten gebruikt voor de ontwikkeling van een model van de menselijke spierziekte8. In dit model worden menselijke spier biopsie specimens in de achterbenen van immunodeficiënte NRG muizen getransplanteerd om xenografts te vormen. De getransplanteerde humane myofibers sterven, maar menselijke spier stamcellen aanwezig in de xenotransplantaatmodellen is vervolgens uit te breiden en te differentiëren in nieuwe menselijke myofibers die herbevolken de geënt menselijke basale lamina. Daarom zijn de geregenereerde myovezels in deze xenotransplantaten volledig menselijk en worden ze spontaan revasculariseerd en geïnnerveerd door de muis gastheer. Belangrijker, fascioscapulohumeral spierdystrofie (FSHD) patiënt spierweefsel getransplanteerd in muizen aan belangrijkste kenmerken van de menselijke ziekte, namelijk de uitdrukking van de Dux4 transcriptiefactor8. FSHD wordt veroorzaakt door overexpressie van Dux4, wat epigenetisch wordt onderdrukt in normaal spierweefsel9,10. In het FSHD xenotransplantaatmodellen is-model is aangetoond dat behandeling met een Dux4-specifieke morpholino met succes Dux4 expressie en functie te onderdrukken en mogelijk een mogelijke therapeutische optie is voor FSHD-patiënten11. Deze resultaten tonen aan dat menselijke spier xenotransplantaten een nieuwe benadering zijn om de menselijke spierziekte te modelleren en mogelijke therapieën bij muizen te testen. Hier beschrijven we in detail de chirurgische methode voor het maken van menselijke skeletspieren xenotransplantaten in immunodeficiënte muizen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle gebruik van onderzoeksspecimens van menselijke proefpersonen werd goedgekeurd door de Johns Hopkins institutioneel Review Board (IRB) om de rechten en het welzijn van de deelnemers te beschermen. Alle dier experimenten werden goedgekeurd door het Comité voor de instelling van het Instituut voor dierenverzorging en-gebruik (IACUC) van de Johns Hopkins University in overeenstemming met de gids van de National Institutes of Health (NIH) voor de verzorging en het gebruik van proefdieren. Mannelijke NOD-Rag1NullIL2rγNull (NRG) host muizen (8-12 weken oud) worden gebruikt om xenotransplantaatmodellen is experimenten uit te voeren. Deze muizen zijn ondergebracht in geventileerde racks en krijgen HEPA-gefilterd, getemperd en bevoficeerde lucht evenals omgekeerde osmose gefilterd hyperchloorwater. Muizen zijn voorzien van water en een bestraald antibioticum dieet (tabel van materialen) ad libitum, en de faciliteit biedt 14 h van licht tot 10 h van donker, zoals bepaald door de centrale timer.
1. voorbereiding van de apparatuur
- Verwerven NOD-Rag1NullIL2r γNull (NRG) muizen, 8-12 weken oud.
- Autoclaaf chirurgische uitrusting: schaar, Tang, naald houder, chirurgische nietmachine (tabel van materialen), wond klemmen, chirurgische doekjes (tabel van materialen) en bekerglas (Figuur 1a).
- Bereid 50 mL spier media (20% foetaal runderserum, 2% kuiken embryo extract, 1% antibioticum/antimycotic in Hams F10 medium). Houd alle chemicaliën/geneesmiddelen/oplossingen die worden gebruikt voor chirurgie bij kamertemperatuur, tenzij anders vermeld in het protocol.
- Bereid een 1 mL spuit met een 26 G naald die 3/8 inches lang met 2 mg/mL analgetische (tabel van materialen), en plaats op ijs. Het analgeticum kan worden verdund tot de juiste concentratie met behulp van steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
2. chirurgische voorbereiding
- Verkrijgen van een menselijke spier biopsie onder een IRB-goedgekeurd Protocol van patiënten wier spieren sterkte weergeven > 4-/5 op de MRC (Medical Research Council) schaal12. Plaats het onderzoeksmodel in een 100 mm x 15 mm Petri schaaltje met spier media.
Opmerking: De MRC schaal wordt gebruikt in de klinische praktijk als een beoordeling van spierkracht met 0 tonen geen contractie, 5 tonen normale kracht, en 4 (4-tot 4 +) tonen beweging tegen weerstand12. We hebben geconstateerd dat spieren met milde tot matige zwakte (MRC > 4-/5) meestal ziekte pathologie vertonen maar niet uitgebreid worden vervangen door vetweefsel of fibrose, die beide xenotransplantaat regeneratie belemmeren. In het geval van autopsie weefsel waar een recente MRC-score niet beschikbaar is, kan de spier kwaliteit worden benaderd via bruto observatie. Spier biopsieën die lichtroze in het uiterlijk of hebben grote gebieden van vetweefsel zijn niet waarschijnlijk xenotransplantaatmodellen is met succes. - Verwijder eventueel overgebleven fascia-of vetweefsel uit het preparaat met chirurgische schaar met behulp van een stereomicroscoop en lichtbron om visualisatie te helpen.
- Ontleden de spier biopsie in ongeveer 7 mm x 3 mm x 3 mm stukken met chirurgische schaar met behulp van de stereomicroscoop en een lichtbron. Zorg ervoor dat de vezels in de lengterichting binnen het preparaat zijn gerangschikt.
- Plaats de Petri schaal met ontleed spier op ijs. Gemiddeld worden de xenotransplantaten gedurende 4 uur in de media bewaard terwijl er operaties worden uitgevoerd. Echter, biopsieën zijn opgeslagen in de media voor 24 h voorafgaand aan xenografting, en deze vertraging leek niet te negatief beïnvloeden transplantatie of regeneratie.
- Plaats synthetische, niet-absorbabele hechtingen (tabel met materialen) in een 100 mm x 15 mm Petri schaaltje met 70% ethanol.
- Opzetten van een dubbele procedure anesthesie circuit: regelen de mapleson E ademhaling circuit op de stereomicroscoop en plaats de inductie kamer in een bioveiligheid Cabinet (Figuur 1a,B).
- Haal het gewicht van de NRG-muis door in een autoclaaf bekerglas op een weegschaal te plaatsen en over te brengen naar de inductie kamer. Induceren van anesthesie onder 3% isoflurane. Zodra de juiste verdoving diepte wordt bereikt-zoals beoordeeld door observatie van de ademhalingsfrequentie, spierontspanning, en gebrek aan vrijwillige beweging-verminderen van de instelling van de verdamper 1,5% voor de rest van de operatie.
- Breng de muis van de inductie kamer naar de Mapleson E ademhaling circuit en breng oogheelkundige zalf op de ogen.
- Verwijder het haar boven de tibialis voorste (TA) van enkel naar knie met een trimmer, gevolgd door een 1 min behandeling met ontharing lotion (tabel van materialen) (Figuur 2a).
- Desinfecteer de operatieplaats door de poot met Povidon-jodiumoplossing te Zwaben. Spoel dan de overgebleven Povidon-jodium weg met 70% ethanol.
- Injecteer de muis subcutaan met analgeticum, zoals carprofen (tabel met materialen) in een dosis van 5 mg/kg.
3. xenotransplantaat chirurgie
- Tape langs het been en maak een rechte incisie over de tibilalis voorste (TA) spier met een schaar en Iris Tang van oorsprong uit de distale pezen en eindigen onder de knie (Figuur 2b).
- Scheid de huid van de spier met behulp van botte dissectie met chirurgische schaar.
- Snijd door de epimysium van de TA-spier met een schaar beginnend bij de pees en eindigend bij de knie.
Opmerking: Dit is een zeer oppervlakkige snede (minder dan 0,5 mm; Figuur 2b, zwarte onderbroken lijn), en de onderliggende ta mag niet worden beschadigd in het proces, omdat dit zou verwijdering moeilijker te maken. Wanneer correct uitgevoerd, de spiervezels zal zichtbaar ontspannen. - Snijd de distale pees van de TA met een schaar, pak de pees met de Iris Tang en trek de TA omhoog naar de knie (figuur 2c).
- Snijd de distale pees van de extensor digitorum Longus (EDL) met een schaar en trek de EDL omhoog naar de knie (figuur 2D). Zodra de proximale pees van de peroneus longus (PL) spier zichtbaar is, verwijder de EDL met een schaar (figuur 2D, groene stippellijn).
- Verwijder de TA met een schaar (figuur 2D, blauwe stippellijn) en gebruik een chirurgische veeg BEVOCHTIGD met PBS en lichte druk om hemostase te bereiken (figuur 2e).
- Rijg een hechtdraad door proximale peroneus longus (PL) pees en trim, waardoor ongeveer 1,5 inch draad aan weerszijden van de pees (figuur 2F).
- Voer de eerste helft van een twee-hand chirurgische vierkante knoop, maar niet aan te scherpen: dit zal een cirkel vormen. Plaats een xenotransplantaatmodellen is in deze cirkel en draai de lus aan om de xenotransplantaatmodellen is te beveiligen. Voltooi de andere helft van de vierkante knoop (figuur 2g,H). Dit zal de xenotransplantaatmodellen is aan de proximale pees van de PL hecht.
- Draad hechting door distale pl pees en herhaal de vierkante knoop techniek uit stap 3,8 om de xenotransplantaatmodellen is aan de distale pees te binden (figuur 2H,I).
Opmerking: De mediale tarsale slagader en ader kunnen dicht bij of bovenop de distale pees van de PL liggen. Plaats geen hechtingen door of rond deze vaten. Het is gemakkelijk te zien of een hechtdraad verkeerd is geplaatst als schepen zullen blancheer of bloeden. Als dit gebeurt, verwijdert u de hechting en plaatst u deze op een andere locatie. - Trek de huid over xenografted spier, Seal met chirurgische lijm, en plaats 2-3 chirurgische nieten over de incisie (figuur 2J).
- Plaats de muis in een schone kooi op een verwarmde pad om te herstellen. Monitor de muis tot volledig bewust en periodiek in de komende dagen op tekenen van lokale systemische infectie en om ervoor te zorgen dat de operatieplaats niet heropend is.
Opmerking: Een enkelvoudige dosis analgeticum zoals beschreven in stap 2,11 is meestal voldoende voor pijnbestrijding. Echter, de muizen moeten ook worden gecontroleerd op aanhoudende pijn (bijvoorbeeld kreupelheid, gegolfde vacht, gejakte houding), en, indien nodig, opnieuw gedoseerd met analgeticum bij 24 h post-operatief.
4. xenograft collectie
Opmerking: Xenografts worden meestal verzameld tussen 4 tot 6 maanden na de operatie. Echter, collecties zijn uitgevoerd tot 12 maanden na de operatie.
- Plaats een afgedekt bekerglas met 200 ml 2-methylbutaan in een doos met droogijs gedurende minimaal 30 minuten voor de verzameling van xenotransplantaatmodellen is.
- Induceren van anesthesie onder 3% Isofluraan in inductie kamer. Zodra de juiste verdovings diepte is bereikt, verlaagt u de instelling van de verdamper tot 1,5% voor de rest van de operatie.
- Breng de muis over van de inductie kamer naar het Ademhalings circuit Mapleson E, gerangschikt op een stereomicroscoop.
- Verwijder het haar boven de tibialis voorste van enkel naar knie met een trimmer en ontharing lotion. De hechtingen die de xenotransplantaatmodellen is op zijn plaats houden, kunnen door de huid worden gezien (Figuur 3a).
- Plak het been omlaag en gebruik de schaar en de Iris tang om de huid over de xenotransplantaatmodellen is te openen totdat beide hechtingen zichtbaar zijn (Figuur 3b). De huid boven de xenotransplantaatmodellen is kan worden verwijderd, zoals getoond om het verwijderen van de xenotransplantaatmodellen is gemakkelijker te maken.
- Gebruik een scalpel om te snijden tussen de xenotransplantaatmodellen is en de tibia (Figuur 3b, pijl geeft de eerste plaats en richting van incisie). Dit zal een kant van de xenograft vrij te krijgen.
- Gebruik een scalpel te snijden tussen de PL spier en de gastrocnemius spier (figuur 3c, Ikncision langs epimysium gelabeld met pijl). De PL wordt verwijderd met de xenograft.
- Snijd onder de distale hechting en door de distale pees van de PL (figuur 3D, snijd langs stippellijn).
- Verwijder de xenotransplantaatmodellen is en pl door de hechting met de Iris Tang te grijpen en het naar de knie te buigen terwijl u een schaar gebruikt om het af te snijden van de onderliggende spier (figuur 3e).
- Snijd boven de proximale hechting met een schaar om de xenotransplantaatmodellen is en pl te verwijderen (figuur 3F, snijd langs stippellijn in 3e).
- Plaats het preparaat op een klein stukje karton of plastic en speld zo dicht mogelijk bij de hechtingen. Tijdens het vastmaken van het preparaat, strek de spier voorzichtig om ervoor te zorgen dat de vezel oriëntatie wordt gehandhaafd tijdens het snap vriesproces. Nadat de pinnen zijn stevig op zijn plaats, schuif de spier omhoog de pinnen zodat het ligt net boven het karton.
Opmerking: Als alternatief kan een uiteinde van de xenotransplantaatmodellen is worden gemonteerd in Tragacanth op een kurk, of het kan volledig worden ondergedompeld in optimale snijtemperatuur (O.C.T.) verbinding in een cryomold. Met zorg, spier conformatie kan worden gehandhaafd met beide methoden. - Snap Freeze de xenotransplantaatmodellen is in voorgekoelde 2-methylbutaan.
- Store xenotransplantaatmodellen is bij-80 °c.
- Onmiddellijk na xenotransplantaatmodellen is collectie, euthaniëren muizen in overeenstemming met de richtlijnen van de Amerikaanse veterinaire medische vereniging:
- Plaats muizen in een verzegelde kamer met een geschikt afvalgas opruimingssysteem. Gebruik Isofluraan bij een concentratie van 3-4% voor het opwekken van anesthesie.
- Zodra de juiste verdoving diepte wordt bereikt-zoals beoordeeld door observatie van de ademhalingsfrequentie, spierontspanning, en gebrek aan vrijwillige beweging-verhogen van de instelling van de verdamper 5% voor het opwekken van de dood. Laat de muizen nog 2 minuten in de kamer staan nadat de ademhaling is gestaakt. De dood wordt geverifieerd door te observeren dat de muizen niet binnen 10 minuten na overdosering van isoflurane herstellen.
- Ten slotte, uitvoeren cervicale dislocatie op de muizen.
Opmerking: In het geval van bilateraal xenografted muizen, kan de contralaterale xenotransplantaatmodellen is worden opgeslagen voor een latere verzameling. Om een overlevings collectie uit te voeren, open je de huid boven de xenotransplantaatmodellen is met een enkele rechte snede met een chirurgische schaar en verwijder je de xenotransplantaatmodellen is zoals beschreven in de stappen 4,6 tot en met 4,10. Sluit vervolgens de huid over het lege tibiale compartiment met behulp van chirurgische lijm en nieten. Behandel de muis met analgeticum zoals beschreven in stap 2,11 en plaats de muis in een schone kooi op een verwarmde pad om te herstellen. Monitor de muis tot volledig bewust en periodiek in de komende dagen op tekenen van lokale systemische infectie en om ervoor te zorgen dat de operatieplaats niet heropend is.
5. xenotransplantaat immunohistochemie
- Gebruik een cryostaat om 10 tot 12 μm secties van de verzamelde xenotransplantaatmodellen is te snijden op positief geladen glijbanen (tabel van materialen).
- Vul de kleurpot met methanol en pre-cool bij-20 °C gedurende 30 minuten.
- Plaats dia's in ijskoude methanol gedurende 10 minuten om de xenotransplantaatmodellen is-secties op te lossen en te permeabiliseren.
- Plaats dia's in kleurenpot en was 3x met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) gedurende 5 minuten.
- Blok met anti-muis IgG (tafel van de materialen) voor 2 uur bij 4 °c.
- DEP met primaire antilichamen, zoals spectrine, Lamine A/C, en embryonale myosine (tabel met materialen) in PBS, aangevuld met 2% geit serum, 's nachts bij 4 °c.
- Plaats dia's in een kleurings potje en was 3x met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) gedurende 5 minuten.
- Blot met TL-kleurstof geconjugeerde secundaire antilichamen (tabel van materialen) in PBS aangevuld met 2% geit serum voor 1 uur bij kamertemperatuur.
- Plaats dia's in kleurenpot en was 3x met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) gedurende 5 minuten.
- Plaats het afdekmedium (Inhoudsopgave) over xenotransplantaten secties, plaats de Afdeklijst bovenop en gebruik nagellak om de dekslip te verzegelen.
Figuur 2: xenotransplantaat chirurgie. A) het haar wordt uit de operatieplaats verwijderd. B) er wordt een incisie gemaakt over het tibialis voorste (TA). De distale pezen van de TA en extensor digitorum Longus (EDL) zijn gemarkeerd met pijlen. De zwarte onderbroken lijn geeft aan waar de epimysium wordt geknipt in stap 3,3. (C) de distale pees van de TA wordt gesneden en de spier wordt naar de knie getrokken. D) de pees van de EDL wordt afgesneden en de EDL wordt naar de knie getrokken. Dit onthult de proximale pees van de peroneus longus (PL) gemarkeerd met een pijl. Onderbroken lijnen geven aan waar u met een schaar moet snijden om de EDL (groen) en PL (blauw) te verwijderen. E) de EDL en de ta worden verwijderd. F) een hechtmiddel wordt geplaatst door de proximale pees van de pl.G) de xenotransplantaatmodellen is wordt in het lege tibiale compartiment geplaatst en gehecht aan de proximale pl pees met behulp van een twee-handen chirurgische vierkante knoop. H) een hechtmiddel wordt geplaatst door de distale pees van de PL, gemarkeerd met een pijl, en een andere twee-hand chirurgische vierkante knoop wordt gebruikt om de xenotransplantaatmodellen is aan de distale pees te hecht. I) de xenotransplantaatmodellen is is volledig getransplanteerd en gehecht aan de pl. (J) de huid is gesloten met chirurgische lijm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Afbeelding 3:4 maand xenograft collectie. A) het haar wordt uit de operatieplaats verwijderd. Hechtingen zijn zichtbaar onder de huid. B) de huid boven de xenotransplantaatmodellen is wordt verwijderd. Vervolgens wordt de xenotransplantaatmodellen is gegrepen met de Iris Tang bij de distale hechting en zachtjes naar boven getrokken. Beginnend bij de enkel, wordt een scalpel gebruikt om langs de Tibia te snijden en de xenograft vrij te maken. De pijl toont het begin van de incisie langs de Tibia. (C) door de gastrocnemius-spier aan de zijkant te trekken, wordt een zwakke witte lijn van epimysium die de peroneus LONGUS (PL)-spier scheidt en het gastrocnemius (getoond door de pijl) zichtbaar. Gebruik de scalpel om langs deze lijn te snijden om de PL van de andere beenspieren te scheiden. D) de rechterkant van de xenograft, en de PL zijn nu vrij van de andere spieren in het been en zijn klaar voor verwijdering. De onderbroken lijn geeft aan waar te snijden met een chirurgische schaar om te beginnen met het verwijderen van de xenotransplantaatmodellen is en pl. (E) na het snijden onder de distale hechting, afbuigen de xenotransplantaatmodellen is naar de knie. De onderbroken lijn geeft aan waar te snijden met een chirurgische schaar om de xenotransplantaatmodellen is en pl uit het tibiale compartiment te verwijderen. F) het lege tibiale compartiment met de xenotransplantaatmodellen is en pl met succes verwijderd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Zoals gedemonstreerd door yuanfan Zhang et al., dit chirurgische protocol is een eenvoudige methode voor de productie van menselijke skeletspieren xenotransplantaten8. Geregenereerde xenotransplantaten worden spontaan geïnnerveerd en vertonen een functionele contractiliteit. Bovendien, spier xenografted van FSHD patiënten aan veranderingen in genexpressie waargenomen bij FSHD patiënten8.
In onze ervaring, ongeveer 7 van de 8 xenotransplantaten uitgevoerd van controle patiënt specimens zal succesvolle spier engraftment tonen. Een succesvolle xenotransplantaatmodellen is vertoont een robuuste regeneratie van menselijke myovezels zoals geïdentificeerd met humane specifieke antilichamen (Figuur 4). Positieve embryonale myosine kleuring binnen een deel van myofibers geeft aan dat het regeneratieproces nog gaande is. Een slechte chirurgische techniek of een ontoereikend preparaat kan daarentegen leiden tot een slechte regeneratie van spiervezels (Figuur 4).
Xenografts trad op bij een patiënt gediagnosticeerd met een idiopathische inflammatoire myopathie (IIM) vertonen matige aantallen geregenereerde humane myovezels bij verzamelingen van 4 en 6 maanden, en embryonale myosine-kleuring blijft bestaan na een 6-maand (figuur 5a). Inflammatoire cellen zijn aanwezig in de xenotransplantaatmodellen is zoals aangegeven door H & E kleuring (figuur 5a), en zijn bevestigd met CD3, CD68, en andere immunologische markers (gegevens niet weergegeven). Xenografts zijn stabiel binnen de muis, en tot 12 maanden collecties zijn uitgevoerd. Individuele myofiber grootte is vergelijkbaar tussen de 4-en 6-maand IIM xenotransplantaten en de oorspronkelijke IIM patiënt biopsie (Figuur 5b). Zeldzame vezels met een dwarsdoorsnede (CSA) groter dan 3500 μm2 worden waargenomen in xenotransplantaten maar niet in de IIM-biopsie, wat aangeeft dat sommige myovezels in de xenotransplantaten kunnen regenereren tot een CSA die vergelijkbaar is met de grootte van gezonde myovezels (Figuur 5b ).
Figuur 1: chirurgische opstelling.
A) standaardoriëntatie van de stereomicroscoop, Mapleson E adem circuit, en chirurgische instrumenten tijdens xenotransplantaat chirurgie. B) plaatsing van de inductie kamer in de bioveiligheidskast.
Figuur 4: verwachte positieve en negatieve resultaten.
Xenografts verzamelde 4-maanden na de operatie met een goede of slechte regeneratie worden bevlekt met humaan-specifieke Lamine A/C (1:50) en humaan-specifieke spectrine (1:20) en embryonale myosine (1:10) (tabel van de materialen). De door de witte onderbroken vakken aangegeven gebieden worden weergegeven als grotere vergrotings elementen. Schaalbalk: 200 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: representatieve xenotransplantaat regeneratie.
A) xenografts (geschetst met onderbroken lijnen) uitgevoerd van een patiënt gediagnosticeerd met een idiopathische inflammatoire myopathie (IIM) bevlekt met hematoxyline en eosine (H & E), humane specifieke Lamin A/C, en menselijke specifieke spectrine, tonen myofiber vorming binnen NRG muizen op zowel 4-als 6-maand tijdpunten. Embryonale myosine kleuring toont aan dat de regeneratie op beide tijdspunten nog loopt. Schaalbalk: 200 μm. B) histogrammen van het dwarsdoorsnede gebied (CSA) van myovezels van 4-en 6-maanden xenotransplantaten en menselijke biopsieën van één patiënt gediagnosticeerd met een idiopathische inflammatoire myopathie (IIM) en een gezonde controle patiënt. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Patiënt-afgeleide xenotransplantaten zijn een innovatieve manier om te modelleren spierziekte en preklinische studies uitvoeren. De hier beschreven methode om skeletspieren xenotransplantaten maken is snel, ongecompliceerd, en reproduceerbaar. Eenzijdige operaties kunnen worden uitgevoerd in 15 tot 25 minuten, of bilateraal in 30 tot 40 minuten. Bilaterale xenotransplantaten kunnen extra experimentele flexibiliteit bieden. Onderzoekers kunnen bijvoorbeeld een gelokaliseerde behandeling van een xenograft uitvoeren, met de andere links als een controle. De NRG-muizen zijn bestand tegen infectie van de chirurgische locatie wanneer ze in een pathogeen-vrije faciliteit worden ondergebracht; in onze ervaring met het uitvoeren van meer dan 200 xenografts, hebben we nog nooit een muis gehad een chirurgische infectie te verwerven. Bovendien tolereren gastheer muizen de verwijdering van de TA en EDL zeer goed. Binnen een uur na de operatie, eenzijdig en bilateraal xenografted muizen zullen actief zijn en lopen rond hun kooi, en zelfs opstaan op hun achterpoten. Af en toe observeren we wat Foot drop in hostmuizen, maar meestal pas na een periode van inactiviteit, zoals als het onlangs is ontwaakt, en binnen enkele minuten van het gebruik van de waak poot zal normaal zijn.
Er zijn verschillende kritieke stappen in het protocol. Ten eerste, tijdens het verwijderen van de EDL en TA, is het erg belangrijk om de aangrenzende PL-spier of de pezen niet te verwonden. Dit kan worden vermeden door zorgvuldig en correct identificeren van de plaatsing van alle distale pezen na de initiële incisie over de TA wordt uitgevoerd. Bovendien moet de proximale pees van de PL worden geïdentificeerd en duidelijk zichtbaar zijn voordat de EDL wordt verwijderd (figuur 2D). Ten tweede moeten hechtingen door pezen worden geplaatst en volledig worden vastgezet in een goede twee-hand chirurgische vierkante knoop. Xenografts regenereren krachtiger onder spanning, en dit is alleen haalbaar als de xenotransplantaatmodellen is wordt vastgebonden aan de PL-pezen en als de hechtingen post-operatief niet losmaken. Ten slotte is het belangrijk om geen grote bloedvaten die de voet leveren te beschadigen of te verbreken. In het bijzonder kan de mediale tarsale slagader en ader dicht bij of bovenop de distale pees van de PL liggen. Plaats geen hechtingen door of rond deze vaten. Het is gemakkelijk te zien of een hechtdraad verkeerd is geplaatst als schepen zullen blancheer of bloeden. Als dit gebeurt, verwijdert u de hechting en plaatst u deze op een andere locatie.
Deze methode heeft verschillende beperkingen. Het is niet vatbaar voor standaard Functionele assays gebruikt in muismodellen van spierziekte, zoals gripsterkte of loopband uithoudingsvermogen. Elektrofysiologische evaluaties van de xenotransplantaatmodellen is-functie kunnen echter nog steeds worden uitgevoerd. Evoked Force metingen kunnen worden opgenomen uit xenotransplantaatmodellen is Explants, en enkelvoudige enzymatisch geïsoleerde myovezels van xenotransplantaten geladen met ratiometrische calcium kleurstoffen en elektrisch gestimuleerd kunnen worden gebruikt om calcium Dynamics8te bestuderen. Een andere inherente uitdaging in dit model is dat het verwerven en werken met menselijk weefsel moeilijk kan zijn. Niet alle laboratoria zullen gemakkelijk toegang hebben tot verse spier biopsies, maar het is aangetoond dat xenotransplantaten uitgevoerd vanuit autopsie weefsel ongeveer 48 uur post mortem kan met succes graveren, en dit weefsel kan gemakkelijker te verkrijgen voor sommige laboratoria8. Het is ook een uitdaging om genexpressie in menselijk weefsel te manipuleren, terwijl onderzoekers die standaard muizen modellen gebruiken, gemakkelijk gebruik kunnen maken van de overvloed aan muis genetische hulpmiddelen die beschikbaar zijn.
Een kracht van dit xenotransplantaatmodellen is-model is dat het onderzoekers in staat stelt om menselijke spieren in vivo te bestuderen. Weefselcultuur is uitgebreid gebruikt om de cel en moleculaire biologie van menselijke spieren te bestuderen. Toch benaderen deze kortdurende, ex vivo-studies niet altijd de functionele spier in vivo. Echter, een nadeel is dat is het uitdagend om te bepalen hoe nauw xenotransplantaatmodellen is biologie en functie benadert menselijke spier als gevolg van de bijdrage van gastheer muis componenten tijdens het regeneratieve proces. Bijvoorbeeld, menselijke en muis neuromusculaire kruispunten (NMJs) zijn morfologisch verschillend, en er is significante divergentie tussen het synaptische proteoom van menselijke en muis NMJs13. Omdat xenotransplantaten worden geïnfiltreerd door de muis gastheer, kan dit resulteren in biologische veranderingen die uniek zijn voor de menselijke xenotransplantaten.
In toekomstige studies, deze skeletspier xenotransplantaatmodellen is methode kan worden gebruikt om beter te begrijpen menselijke spier celbiologie en voor het ontwikkelen van nieuwe modellen voor zeldzame of verworven spierziekten die momenteel gebrek aan dierlijke modellen. Wij verwachten dat dit een aanzienlijke positieve invloed zal hebben op de therapeutische ontwikkeling van deze ziekten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de myositis Association en de Peter Buck Foundation. We willen Dr. yuanfan Zhang graag bedanken voor het delen van haar expertise en training in de xenotransplantaatmodellen is chirurgische techniek.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm x 15 mm Petri dish | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| 2-Methylbutane | Fisher | O3551-4 | |
| 20 mm x 30 mm micro cover glass | VWR | 48393-151 | |
| Animal Weighing Scale | Kent Scientific | SCL- 1015 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution | Corning, Cellgro | 30-004-CI | |
| AutoClip System | F.S.T | 12020-00 | |
| Castroviejo Needle Holder | F.S.T | 12565-14 | |
| Chick embryo extract | Accurate | CE650TL | |
| CM1860 UV cryostat | Leica Biosystems | CM1860UV | |
| Coplin staining jar | Thermo Scientific | 19-4 | |
| Dissection Pins | Fisher Scientific | S13976 | |
| Dry Ice - pellet | Fisher Scientific | NC9584462 | |
| Embryonic Myosin antibody | DSHB | F1.652 | recommended concentration 1:10 |
| Ethanol | Fisher Scientific | 459836 | |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30071.01 | |
| Fiber-Lite MI-150 | Dolan-Jenner | Mi-150 | |
| Forceps | F.S.T | 11295-20 | |
| Goat anti-mouse IgG1, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21121 | recommended concentration 1:500 |
| Goat anti-mouse IgG2b, AlexaFluor 594 | Invitrogen | A-21145 | recommended concentration 1:500 |
| Gum tragacanth | Sigma | G1128 | |
| Hams F-10 Medium | Corning | 10-070-CV | |
| Histoacryl Blue Topical Skin Adhesive | Tissue seal | TS1050044FP | |
| Human specific lamin A/C antibody | Abcam | ab40567 | recommended concentration 1:50-1:100 |
| Human specific spectrin antibody | Leica Biosystems | NCLSPEC1 | recommended concentration 1:20-1:100 |
| Induction Chamber | VetEquip | 941444 | |
| Iris Forceps | F.S.T | 11066-07 | |
| Irradiated Global 2018 (Uniprim 4100 ppm) | Envigo | TD.06596 | Antibiotic rodent diet to protect again respiratory infections |
| Isoflurane | MWI Veterinary Supply | 502017 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | surgical wipes |
| Mapleson E Breathing Circuit | VetEquip | 921412 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412 | |
| Mobile Anesthesia Machine | VetEquip | 901805 | |
| Mouse on Mouse Basic Kit | Vector Laboratories | BMK-2202 | mouse IgG blocking reagent |
| Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| NAIR Hair remover lotion/oil | Fisher Scientific | NC0132811 | |
| NOD-Rag1null IL2rg null (NRG) mice | The Jackson Laboratory | 007799 | 2 to 3 months old |
| O.C.T. Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| Oxygen | Airgas | OX USPEA | |
| PBS (phosphate buffered saline) buffer | Fisher Scientific | 4870500 | |
| Povidone Iodine Prep Solution | Dynarex | 1415 | |
| ProLong™ Gold Antifade Mountant | Fisher Scientific | P10144 (no DAPI); P36935 (with DAPI) | |
| Puralube Ophthalmic Ointment | Dechra | 17033-211-38 | |
| Rimadyl (carprofen) injectable | Patterson Veterinary | 10000319 | surgical analgesic, administered subcutaneously at a dose of 5 mg/kg |
| Scalpel Blades - #11 | F.S.T | 10011-00 | |
| Scalpel Handle - #3 | F.S.T | 10003-12 | |
| Stereo Microscope | Accu-scope | 3075 | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Suture, Synthetic, Non-Absorbable, 30 inches long, CV-11 needle | Covidien | VP-706-X | |
| 1ml Syringe (26 gauge, 3/8 inch needle) | BD Biosciences | 329412 | |
| Trimmer | Kent Scientific | CL9990-KIT | |
| Vannas Spring Scissors, 8.0 mm cutting edge | F.S.T | 15009-08 | |
| VaporGaurd Activated Charcoal Filter | VetEquip | 931401 | |
| Wound clips, 9 mm | F.S.T | 12022-09 |
References
- Wong, C. H., Siah, K. W., Lo, A. W. Estimation of clinical trial success rates and related parameters. Biostatistics. 0, 1-14 (2018).
- Hay, M., Thomas, D. W., Craighead, J. L., Economides, C., Rosenthal, J. Clinical development success rates for investigational drugs. Nature Biotechnology. 32, 40-51 (2014).
- Perel, P., et al. Comparison of treatment effects between animal experiments and clinical trials: systematic review. BMJ. 334, 1-6 (2007).
- Rubio-Viqueira, B., Hidalgo, M. Direct in vivo xenograft tumor model for predicting chemotherapeutic drug response in cancer patients. Clinical Pharmacology Therapeutics. 85, 217-221 (2009).
- Roberts, K. G., et al. Targetable Kinase-Activating Lesions in Ph-like Acute Lymphoblastic Leukemia. New England Journal of Medicine. 371, 1005-1015 (2014).
- Kim, J., et al. GDF11 Controls the Timing of Progenitor Cell Competence in Developing Retina. Science. 308, 1927-1930 (2005).
- Sako, D., et al. Characterization of the ligand binding functionality of the extracellular domain of activin receptor type IIB. Journal of Biological Chemisty. 285, 21037-21048 (2010).
- Zhang, Y., et al. Human skeletal muscle xenograft as a new preclinical model for muscle disorders. Human Molecular Genetics. 23, 3180-3188 (2014).
- Gabellini, D., Green, M. R., Tupler, R. Inappropriate Gene Activation in FSHD : A Repressor Complex Binds a Chromosomal Repeat Deleted in Dystrophic Muscle. Cell. 110, 339-348 (2002).
- Lemmers, R. J. L. F., et al. A Unifying Genetic Model for Facioscapulohumeral Muscular Dystrophy. Science. 329, 1650-1654 (2010).
- Chen, J. C. J., et al. Morpholino-mediated Knockdown of DUX4 Toward Facioscapulohumeral Muscular Dystrophy Therapeutics. Molecular Therapy. 24, 1405-1411 (2016).
- Medical Research Council. Aids to the investigation of the peripheral nervous system. , Her Majesty’s Stationary Office. London. (1943).
- Jones, R. A., et al. Cellular and Molecular Anatomy of the Human Neuromuscular Junction. Cell Reports. 21, 2348-2356 (2017).
