Summary
जटिल मानव रोगों पारंपरिक प्रयोगशाला मॉडल प्रणालियों में मॉडल के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है. यहाँ, हम प्रतिरक्षा की कमी चूहों में मानव कंकाल मांसपेशी बायोप्सी के प्रत्यारोपण के माध्यम से मानव मांसपेशियों की बीमारी मॉडल के लिए एक शल्य चिकित्सा दृष्टिकोण का वर्णन.
Abstract
पशु अध्ययन में मनाया उपचार प्रभाव अक्सर नैदानिक परीक्षणों में recapitulated किया जा करने के लिए असफल. हालांकि इस समस्या बहुमुखी है, इस विफलता के लिए एक कारण अपर्याप्त प्रयोगशाला मॉडल का उपयोग है. यह पारंपरिक प्रयोगशाला जीवों में जटिल मानव रोगों मॉडल के लिए चुनौतीपूर्ण है, लेकिन इस मुद्दे को मानव xenografts के अध्ययन के माध्यम से दरकिनार किया जा सकता है. शल्य चिकित्सा विधि हम यहाँ का वर्णन मानव कंकाल मांसपेशी xenografts के निर्माण के लिए अनुमति देता है, जो मॉडल मांसपेशियों की बीमारी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और पूर्व नैदानिक चिकित्सीय परीक्षण बाहर ले जाने के लिए. एक संस्थागत समीक्षा बोर्ड (आईआरबी) अनुमोदित प्रोटोकॉल के तहत, कंकाल की मांसपेशी नमूने रोगियों से प्राप्त कर रहे हैं और फिर NOD-Rag1नलआईएल2आरजेडनल (एनआरजी) मेजबान चूहों में प्रत्यारोपित. इन चूहों परिपक्व लिम्फोसाइटों बनाने के लिए अपनी असमर्थता के कारण प्रत्यारोपण अध्ययन के लिए आदर्श मेजबान हैं और इस प्रकार सेल मध्यस्थता और हास्य अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को विकसित करने में असमर्थ हैं. मेजबान चूहों आइसोफ्लुरेन के साथ anaesthetized कर रहे हैं, और माउस tibialis पूर्वकाल और एक्स्टेंजर digitorum longus मांसपेशियों को हटा रहे हैं. मानव मांसपेशियों का एक टुकड़ा तो खाली tibial डिब्बे में रखा जाता है और peroneus longus मांसपेशियों के निकट और दूर tendons के लिए सीवन. xenografted मांसपेशी स्वतः संवहनी और माउस मेजबान द्वारा innervated है, मजबूत पुनर्जीवित मानव मांसपेशियों है कि पूर्व नैदानिक अध्ययन के लिए एक मॉडल के रूप में सेवा कर सकते हैं में जिसके परिणामस्वरूप.
Introduction
यह सूचित किया गया है कि नैदानिक परीक्षणों से गुजरने वाले सभी औषध विकास कार्यक्रमों में से केवल 13.8% ही सफल रहे हैं और अनुमोदित चिकित्सा1के लिए नेतृत्व कर रहे हैं . हालांकि इस सफलता की दर 10.4% पहले2की सूचना से अधिक है, वहाँ अभी भी सुधार के लिए महत्वपूर्ण जगह है. नैदानिक परीक्षणों की सफलता दर को बढ़ाने के लिए एक दृष्टिकोण पूर्व नैदानिक अनुसंधान में इस्तेमाल प्रयोगशाला मॉडल में सुधार करने के लिए है। खाद्य एवं औषधि प्रशासन (एफडीए) पशु अध्ययन उपचार प्रभावकारिता दिखाने के लिए और चरण 1 नैदानिक परीक्षणों से पहले विषाक्तता का आकलन करने की आवश्यकता है. तथापि, पशु अध्ययन और नैदानिकपरीक्षणों केबीच उपचार परिणामों में अक्सर सीमित सामंजस्य होता है 3 . इसके अलावा, पूर्व नैदानिक पशु अध्ययन के लिए की जरूरत रोगों है कि एक स्वीकार किए जाते हैं पशु मॉडल है, जो अक्सर दुर्लभ या छिटपुट रोगों के लिए मामला है की कमी में चिकित्सीय विकास के लिए एक दुर्गम बाधा हो सकता है.
मानव रोग के मॉडल के लिए एक तरीका है मानव ऊतक इम्यूनोन्यूमेंड चूहों में प्रत्यारोपण के लिए exografts उत्पन्न करने के लिए है. वहाँ xenograft मॉडल के लिए तीन प्रमुख लाभ कर रहे हैं: सबसे पहले, वे जटिल आनुवंशिक और epigenetic असामान्यताएं है कि मानव रोग है कि अन्य पशु मॉडल में reproduible कभी नहीं हो सकता है में मौजूद recapitulate कर सकते हैं. दूसरा, यदि रोगी के नमूने उपलब्ध हैं तो दुर्लभ या छिटपुट रोगों को मॉडल करने के लिए विदेशी खाद्य पदार्थों का उपयोग किया जा सकता है। तीसरा, xenografts विवो प्रणाली में एक पूर्ण भीतर रोग मॉडल. इन कारणों के लिए, हम hypothesize कि उपचार प्रभावकारिता exeograft मॉडल में परिणाम रोगियों में परीक्षण करने के लिए अनुवाद करने के लिए और अधिक होने की संभावना है. मानव ट्यूमर xenografts पहले से ही सफलतापूर्वक कई myeloma सहित आम कैंसर के लिए उपचार विकसित करने के लिए उपयोग किया गया है, साथ ही व्यक्तिगत रोगियों के लिए व्यक्तिगत चिकित्सा4,5,6, 7.
हाल ही में, xexografts मानव मांसपेशियों की बीमारी8का एक मॉडल विकसित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. इस मॉडल में, मानव मांसपेशी बायोप्सी नमूनों इम्यूनोडेफिडेफिकेशिंग एनआरजी चूहों के हिंदलिंम में प्रतिरोपित करने के लिए xenografts फार्म कर रहे हैं. प्रतिरोपित मानव मायोफाइबर मर जाते हैं, लेकिन विदेशी भाषा में मौजूद मानव मांसपेशी स्टेम कोशिकाओं को बाद में विस्तार और नए मानव मायोफाइबर में अंतर है जो engrafted मानव बेसल पटल repopulate. इसलिए, इन xenografts में पुनर्जीवित मायोफाइबर पूरी तरह से मानव हैं और स्वतः revascularized और माउस मेजबान द्वारा innervated हैं. महत्वपूर्ण बात यह है कि fascioscapulohumeral मांसपेशियों dystrophy (FSHD) रोगी मांसपेशियों के ऊतकों चूहों में प्रत्यारोपित मानव रोग की प्रमुख विशेषताओं recapitulates, अर्थात् DUX4 प्रतिलेखन कारक8की अभिव्यक्ति . FSHD DUX4 के overexpression के कारण होता है, जो epigenetically सामान्य मांसपेशियों के ऊतकों में मौन है9,10. FSHD xenograft मॉडल में, एक DUX4-विशिष्ट morpholino के साथ उपचार सफलतापूर्वक DUX4 अभिव्यक्ति और समारोह को दबाने के लिए दिखाया गया है, और FSHD रोगियों11के लिए एक संभावित चिकित्सीय विकल्प हो सकता है. इन परिणामों से पता चलता है कि मानव मांसपेशियों xenografts मॉडल मानव मांसपेशियों की बीमारी और चूहों में संभावित उपचार का परीक्षण करने के लिए एक नया दृष्टिकोण हैं. यहाँ, हम प्रतिरक्षा की कमी चूहों में मानव कंकाल मांसपेशी xenografts बनाने के लिए शल्य चिकित्सा विधि विस्तार से वर्णन.
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Protocol
मानव विषयों से अनुसंधान नमूनों के सभी उपयोग जॉन्स हॉपकिंस संस्थागत समीक्षा बोर्ड (आईआरबी) द्वारा प्रतिभागियों के अधिकारों और कल्याण की रक्षा के लिए अनुमोदित किया गया था। सभी पशु प्रयोगों जॉन्स हॉपकिंस विश्वविद्यालय संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा प्रयोगशाला पशुओं की देखभाल और उपयोग के लिए राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (NIH) गाइड के अनुसार अनुमोदित किया गया. पुरुष NOD-Rag1नलआईएल2आरजेडनल (एनआरजी) मेजबान चूहों (8-12 सप्ताह पुराने) विदेशी प्रयोगों को पूरा करने के लिए उपयोग किया जाता है। इन चूहों हवादार रैक में रखे जाते हैं और HEPA फ़िल्टर, टेम्पर्ड, और humidified हवा के रूप में के रूप में अच्छी तरह से रिवर्स असमस फ़िल्टर्ड हाइपरक्लोरिनेट पानी दिया जाता है. चूहे पानी और एक विकिरणित एंटीबायोटिक आहार प्रदान कर रहे हैं (सामग्री की तालिका) विज्ञापन libitum, और सुविधा केंद्रीय टाइमर द्वारा नियंत्रित के रूप में अंधेरे के 10 एच करने के लिए प्रकाश के 14 एच प्रदान करता है.
1. उपकरण तैयारी
- प्राप्त NOD-Rag1नलIL2r $नल (एनआरजी) चूहों, उम्र के 8-12 सप्ताह.
- ऑटोक्लेव शल्य चिकित्सा उपकरण: कैंची, संदंश, सुई धारक, शल्य स्टेपलर (सामग्री कीतालिका), घाव क्लिप, शल्य पोंछे (सामग्री की तालिका), और बीकर ( चित्र1A)।
- मांसपेशियों मीडिया के 50 एमएल तैयार (20% भ्रूण गोजातीय सीरम, 2% लड़की भ्रूण निकालने, 1% एंटीबायोटिक / सभी रसायनों /दवाओं/समाधान कमरे के तापमान पर सर्जरी के लिए इस्तेमाल किया रखें जब तक प्रोटोकॉल में अलग ढंग से कहा गया है।
- एक 26 जी सुई के साथ एक 1 एमएल सिरिंज तैयार करें जो 3/8 इंच लंबा है जिसमें 2 मिलीग्राम/एमएल एनाल्जेसिक(सामग्री की तालिका)होती है, और बर्फ पर रखें। एनाल्जेसिक बाँझ फॉस्फेट बफर नमकीन (पीबीएस) का उपयोग कर उचित एकाग्रता के लिए पतला किया जा सकता है।
2. सर्जिकल तैयारी
- एमआरसी (मेडिकल रिसर्च काउंसिल) स्केल12पर आईआरबी-अनुमोदित प्रोटोकॉल के तहत मानव पेशी बायोप्सी प्राप्त करें, जिनकी मांसपेशियों में शक्ति का प्रदर्शन होता है। मांसपेशी मीडिया युक्त एक 100 मिमी x 15 मिमी पेट्री डिश में अनुसंधान नमूना रखें।
नोट: एमआरसी पैमाने पर नैदानिक अभ्यास में मांसपेशियों की ताकत के एक आकलन के रूप में प्रयोग किया जाता है 0 कोई संकुचन दिखा, 5 सामान्य शक्ति दिखा, और 4 (4 से 4 +) प्रतिरोध के खिलाफ आंदोलन दिखा12. हमने पाया है कि हल्के से मध्यम कमजोरी के साथ मांसपेशियों (एमआरसी और 4-/5) आम तौर पर रोग विकृति दिखाने के लिए, लेकिन बड़े पैमाने पर फैटी ऊतक या फाइब्रोसिस द्वारा प्रतिस्थापित नहीं कर रहे हैं, जो दोनों के exograft पुनर्जनन में बाधा. autopsy ऊतक के मामले में जहां हाल ही में एमआरसी स्कोर उपलब्ध नहीं है, मांसपेशियों की गुणवत्ता सकल अवलोकन के माध्यम से पहुँचा जा सकता है. मांसपेशी बायोप्सी कि उपस्थिति में पीला गुलाबी कर रहे हैं या फैटी ऊतक के बड़े क्षेत्रों में सफलतापूर्वक exograft की संभावना नहीं है. - दृश्य की सहायता करने के लिए एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप और प्रकाश स्रोत का उपयोग कर शल्य कैंची के साथ नमूना से किसी भी शेष फासिया या फैटी ऊतक निकालें।
- स्टीरियो माइक्रोस्कोप और एक प्रकाश स्रोत का उपयोग कर शल्य कैंची के साथ लगभग 7 मिमी x 3 मिमी x 3 मिमी टुकड़े में मांसपेशियों बायोप्सी विच्छेदन. सुनिश्चित करें कि फाइबर लंबे समय तक नमूना के भीतर व्यवस्थित कर रहे हैं.
- पेट्री डिश रखें जिसमें बर्फ पर विच्छेदित पेशी होती है। औसतन, एक्सोग्रैफ्ट ्स को 4 घंटे तक मीडिया में रखा जाता है, जबकि सर्जरी की जा रही है। हालांकि, बायोप्सी के लिए मीडिया में संग्रहीत किया गया है 24 ज xenografting से पहले, और इस देरी नकारात्मक प्रभाव प्रत्यारोपण या पुनर्जनन के लिए प्रकट नहीं हुआ.
- एक 100 मिमी x 15 मिमी पेट्री डिश में सिंथेटिक, गैर अवशोषित टांके (सामग्री की तालिका)रखें जिसमें 70% इथेनॉल होता है।
- एक दोहरी प्रक्रिया संज्ञाहरण सर्किट सेट करें: स्टीरियो माइक्रोस्कोप पर Mapleson ई श्वास सर्किट की व्यवस्था और एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में प्रेरण कक्ष जगह (चित्र 1A,बी).
- एक पैमाने पर एक autoclaved बीकर में रखकर NRG माउस के वजन प्राप्त करें, और प्रेरण कक्ष में स्थानांतरण. 3% आइसोफ्लुरेन के तहत संज्ञाहरण को प्रेरित करें। एक बार जब उपयुक्त संवेदनाहारी गहराई हासिल की जाती है, के रूप में श्वसन दर, मांसपेशियों में छूट, और स्वैच्छिक आंदोलन की कमी के अवलोकन के द्वारा मूल्यांकन के रूप में सर्जरी के शेष के लिए 1.5% vaporizer सेटिंग को कम.
- Mapleson ई श्वास सर्किट के लिए प्रेरण कक्ष से माउस स्थानांतरण और आंखों के लिए नेत्र मलम लागू होते हैं।
- एक ट्रिमर के साथ टखने से घुटने तक टिबियालिस पूर्वकाल (टीए) को दूर करें, इसके बाद बालों को हटाने लोशन के साथ 1 मिनट का उपचार किया जाता है (सामग्री की तालिका) ( चित्र2क) .
- पोविडोन-आयोडीन समाधान के साथ पैर को स्वाबिंग करके सर्जिकल साइट को संक्रमित करें। फिर 70% इथेनॉल के साथ शेष povidone-आयोडीन दूर धो लो.
- माउस को एनाल्जेसिक के साथ इंजेक्शन, जैसे कि कारप्रोफेन, (सामग्री की तालिका) 5 मिलीग्राम/किलोग्राम की खुराक पर।
3. Xenograft सर्जरी
- पैर को नीचे टेप करें और टिबिलालिस पूर्वकाल (टीए) मांसपेशियों पर कैंची और आईरिस बल के साथ एक सीधा चीरा बनाएं जो डिस्टल टेंडन से उत्पन्न होता है और घुटने के नीचे समाप्त होता है (चित्र 2 बी) ।
- शल्य कैंची के साथ कुंद विच्छेदन का उपयोग मांसपेशियों से अलग त्वचा.
- टेंडन से शुरू होने वाली कैंची के साथ टीए मांसपेशी के एपिमिजियम के माध्यम से कट और घुटने पर समाप्त होता है।
नोट: यह एक बहुत ही सतही कटौती है (कम से कम 0.5 मिमी; चित्र 2B, काले डैश्ड लाइन), और अंतर्निहित टीए को इस प्रक्रिया में क्षतिग्रस्त नहीं किया जाना चाहिए क्योंकि इससे हटाने को अधिक चुनौतीपूर्ण बना देगा। जब सही ढंग से प्रदर्शन किया, मांसपेशी फाइबर जाहिरा तौर पर आराम करेंगे. - टीए के दूरस्थ कण्डरा को कैंची से काटें, आईरिस संदों से कण्डरा को पकड़ें, और टीए को घुटने की ओर खींचें (चित्र 2C)।
- एक्स्टेंजर डिजिटाम लांगस (ईडीएल) के डिस्टेंसर डिस्टेंस को कैंची से काटें और ईडीएल को घुटने की ओर खींचें (चित्र 2डी) । एक बार पेरोनियस लांगस (पीएल) मांसपेशियों के निकट स्थन कण्डरा दिखाई देता है, कैंची से ईडीएल को हटा दें (चित्र 2 डी, हरे रंग की डैश्ड लाइन)।
- कैंची से टीए निकालें (चित्र 2 डी, नीले डैश्ड लाइन ) और एक शल्य पोंछ PBS के साथ गीला और hemostasis प्राप्त करने के लिए थोड़ा दबाव का उपयोग करें ( चित्र2E) .
- समीपस्थ पेरोनियस लांगस (पीएल) कण्डरा और ट्रिम के माध्यम से एक सीवन धागा, कण्डरा के दोनों ओर लगभग 1.5 इंच धागे को छोड़कर (चित्र 2 एफ)।
- एक दो हाथ शल्य वर्ग गाँठ की पहली छमाही प्रदर्शन, लेकिन कस नहीं है: यह एक चक्र के रूप में होगा. इस सर्कल में एक xenograft प्लेस और विदेशी को सुरक्षित करने के लिए पाश कस. वर्ग गाँठ के दूसरे भाग को पूरा करें (चित्र 2जी,एच) यह पी एल के निकट कण्डरा के लिए xenograft सीवन होगा.
- जिला पी एल कण्डरा के माध्यम से धागा सीवन और चरण 3.8 से वर्ग गाँठ तकनीक को दोहराने के लिए दूर कण्डरा के लिए exograft टाई (चित्र 2H,मैं).
नोट: मध्य टार्सल धमनी और नस पी एल के दूरस्थ कण्डरा के करीब या शीर्ष पर झूठ बोल सकते हैं। इन जहाजों के माध्यम से या उसके आसपास टांके न रखें। यह बताना आसान है कि सीवन को अनुचित तरीके से रखा गया है या नहीं क्योंकि जहाजों को ब्लैंच या खून बहेगा। यदि ऐसा होता है, तो सीवन और स्थान को किसी भिन्न स्थान पर निकालें. - xenografted मांसपेशियों पर त्वचा खींचो, शल्य गोंद के साथ सील, और चीरा पर 2-3 शल्य स्टेपल जगह (चित्र 2J).
- ठीक होने के लिए एक गर्म पैड पर एक साफ पिंजरे में माउस रखें। मॉनिटर माउस जब तक पूरी तरह से जागरूक और समय समय पर स्थानीय प्रणालीगत संक्रमण के संकेत के लिए अगले कुछ दिनों में और शल्य साइट फिर से खोला नहीं है सुनिश्चित करने के लिए.
नोट: चरण 2.11 में वर्णित एनाल्जेसिक की एक खुराक आम तौर पर दर्द से राहत के लिए पर्याप्त है। हालांकि, चूहों को भी लगातार दर्द के लिए निगरानी की जानी चाहिए (जैसे लंगड़ापन, झालरदार कोट, hunched मुद्रा), और, यदि आवश्यक हो, 24 एच पोस्ट ऑपरेटिव पर एनाल्जेसिक के साथ फिर से dosed.
4. Xenograft संग्रह
नोट: Xenografts आम तौर पर 4 से 6 महीने के बाद सर्जरी के बीच एकत्र कर रहे हैं. हालांकि, संग्रह सर्जरी के बाद 12 महीने तक किया गया है।
- एक कवर बीकर रखें जिसमें 2-मेथिलब्यून के 200 एमएल को एक बॉक्स में रखें जिसमें एक्सोग्रेफ्ट संग्रह से पहले कम से कम 30 मिनट के लिए सूखी बर्फ होती है।
- प्रेरण कक्ष में 3% आइसोलुरेन के तहत संज्ञाहरण को प्रेरित करें। एक बार उपयुक्त संवेदनाहारी गहराई हासिल की है, vaporizer सेटिंग को कम करने के लिए 1.5% सर्जरी के शेष के लिए.
- एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप पर व्यवस्था Mapleson ई श्वास सर्किट के लिए प्रेरण कक्ष से माउस स्थानांतरण.
- एक ट्रिमर और बालों को हटाने लोशन के साथ घुटने के लिए टखने से tibialis पूर्वकाल overlying बाल निकालें. जगह में xenograft पकड़े टांके त्वचा के माध्यम से देखा जा सकता है (चित्र 3ए) .
- पैर को टेप करें और कैंची और आईरिस बलकाउपयोग करके त्वचा को विदेशी पर तब तक खोलने के लिए जब तक कि दोनों सीवन दिखाई न दें (चित्र 3ख) . त्वचा overlying xenograft के रूप में दूर किया जा सकता है के रूप में xenograft को हटाने आसान बनाने के लिए दिखाया गया है.
- xenograft और टिबिया के बीच कटौती करने के लिए एक स्केलपेल का उपयोग करें (चित्र 3 बी, तीर प्रारंभिक साइट और चीरा की दिशा को दर्शाता है)। यह विदेशी भाषा के एक पक्ष को मुक्त कर देगा.
- PL मांसपेशियों और gastrocnemius मांसपेशियों के बीच कटौती करने के लिए एक स्केलपेल का प्रयोग करें (चित्र 3C, तीर के साथ लेबल epimysium साथ ncision). पीएल को जेनेरोग्रैफ्ट के साथ हटा दिया जाएगा।
- जिला सीवन के नीचे कट और पी एल के दूरस्थ कण्डरा के माध्यम से (चित्र 3 डी, डॉटेड लाइन के साथ काट)।
- आईरिस संदंश के साथ सीवन को पकड़कर और कैंची का उपयोग करते समय इसे घुटने की ओर मोड़कर इसे अंतर्निहित मांसपेशी से दूर करने के लिए एक्सोग्रेफ्ट और पीएल को हटा दें (चित्र 3ई) ।
- विदेशी और पीएल को हटाने के लिए कैंची से समीप सीवन के ऊपर कटें (चित्र 3 एफ, 3ईमें डॉटेड लाइन के साथ कट ) ।
- कार्डबोर्ड या प्लास्टिक के एक छोटे टुकड़े पर नमूना रखें, और संभव के रूप में टांके के करीब के रूप में पिन। नमूना pinning जबकि, धीरे मांसपेशी खिंचाव सुनिश्चित करने के लिए कि फाइबर अभिविन्यास तस्वीर ठंड प्रक्रिया के दौरान बनाए रखा है. पिन जगह में सुरक्षित रूप से कर रहे हैं के बाद, पिन ऊपर मांसपेशियों स्लाइड तो यह सिर्फ कार्डबोर्ड के ऊपर टिकी हुई है.
नोट: वैकल्पिक रूप से, xenograft का एक सिरा एक कॉर्क पर tragacanth में रखा जा सकता है, या यह एक cryomold में इष्टतम काटने के तापमान (O.C.T.) परिसर में पूरी तरह से जलमग्न किया जा सकता है. देखभाल के साथ, मांसपेशियों अनुरूपता दोनों तरीकों के साथ बनाए रखा जा सकता है. - स्नैप पूर्व ठंडा 2-मेथिलब्यून में जेनेग्रैफ्ट को फ्रीज करें।
- -80 डिग्री सेल्सियस पर जेनेग्रैफ्ट स्टोर करें।
- xenograft संग्रह के तुरंत बाद, अमेरिकी पशु चिकित्सा चिकित्सा एसोसिएशन के दिशा निर्देशों के अनुसार चूहों euthanize:
- एक उचित अपशिष्ट गैस अपमार्जन प्रणाली के साथ एक सील कक्ष में चूहों प्लेस. संज्ञाहरण प्रेरित करने के लिए 3-4% की एकाग्रता पर आइसोफ्लुरेन का उपयोग करें।
- एक बार जब उपयुक्त संवेदनाहारी गहराई हासिल की जाती है, के रूप में श्वसन दर, मांसपेशियों में छूट, और स्वैच्छिक आंदोलन की कमी के अवलोकन के द्वारा मूल्यांकन के रूप में 5% करने के लिए vaporizer सेटिंग वृद्धि मौत प्रेरित करने के लिए. सांस लेने के बाद एक अतिरिक्त 2 मिनट के लिए कक्ष में चूहों छोड़ दें बंद कर दिया है. मौत को यह देखकर सत्यापित किया जाता है कि चूहे इसोफ्लुरेन की अधिक मात्रा के बाद 10 मिनट के भीतर ठीक नहीं हो जाते हैं।
- अंत में, चूहों पर गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था प्रदर्शन करते हैं।
नोट: द्विपक्षीय रूप से exografted चूहों के मामले में, contralateral xenograft एक बाद में संग्रह के लिए बचाया जा सकता है. एक अस्तित्व संग्रह प्रदर्शन करने के लिए, शल्य कैंची के साथ एक सीधे कटौती के साथ xenograft overlying त्वचा को खोलने के लिए, और कदम 4.6 से 4.10 में वर्णित के रूप में xenograft हटा दें। फिर सर्जिकल गोंद और स्टेपल का उपयोग करके खाली टिबिलिक डिब्बे पर त्वचा को बंद करें। चरण 2.11 में वर्णित के रूप में एनाल्जेसिक के साथ माउस का इलाज और ठीक करने के लिए गर्म पैड पर साफ पिंजरे में माउस जगह है। स्थानीय प्रणालीगत संक्रमण के संकेत के लिए अगले कुछ दिनों में पूरी तरह से जागरूक और समय-समय पर जब तक माउस की निगरानी और शल्य साइट फिर से खोला नहीं है यह सुनिश्चित करने के लिए।
5. Xenograft इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री
- धनावेशित स्लाइडों ( सामग्री की सारणी ) पर एकत्रित विदेशी ग्राफ से 10 से 12 डिग्री मीटर खंडों को काटने के लिए क्रायोस्टैटका प्रयोगकरें .
- मेथनॉल के साथ धुंधला जार भरें और 30 मिनट के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व ठंडा।
- को ठीक करने और विदेशी वर्गों permebilize करने के लिए 10 मिनट के लिए बर्फ ठंड मेथनॉल में स्लाइड रखें।
- धुंधला जार में स्लाइड प्लेस और 5 मिनट के लिए फॉस्फेट बफर नमकीन (पीबीएस) के साथ 3x धो।
- एंटी-माउस आईजी(सामग्री की तालिका) के साथ ब्लॉक 2 ज के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर।
- पीबीएस में प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ ब्लॉट, जैसे स्पेक्ट्रिन, लेमिनए/
- एक धुंधला जार में स्लाइड प्लेस और 5 मिनट के लिए फॉस्फेट बफर नमकीन (पीबीएस) के साथ 3x धो।
- पीबीएस में फ्लोरोसेंट डाई संयुग्मी माध्यमिक एंटीबॉडी (सामग्री की तालिका) के साथ ब्लॉट कमरे के तापमान पर 1 एच के लिए 2% बकरी सीरम के साथ पूरक।
- धुंधला जार में स्लाइड प्लेस और 5 मिनट के लिए फॉस्फेट बफर नमकीन (पीबीएस) के साथ 3x धो।
- जगह बढ़ते माध्यम (सामग्री की तालिका)xenografts वर्गों पर, शीर्ष पर कवरपर्ची जगह है, और कवरपर्ची सील करने के लिए नेल पॉलिश का उपयोग करें।
चित्र 2: Xenograft सर्जरी. (ए) बाल शल्य चिकित्सा साइट से हटा दिया जाता है. (ख) एक चीरा टिबियालिस पूर्वकाल (टीए) पर किया जाता है। टीए और एक्स्टेंजर डिजिटाम लांगस (ईडीएल) के डिस्टेटल कण्डरा तीर ों के साथ चिह्नित किए जाते हैं। काले डैश्ड लाइन इंगित करता है कि एपिमिसियम चरण 3.3 में कहां काटा जाएगा। (ग) टीए का दूरस्थ कण्डरा कट जाता है और मांसपेशी को घुटने तक खींच लिया जाता है। (घ)ईडीएल का कण्डरा कट जाता है और ईडीएल को घुटने तक खींच ालुम दिया जाता है. यह एक तीर के साथ चिह्नित peroneus longus (पीएल) के निकट कण्डरा को उजागर करता है. डैश्ड लाइनों से संकेत मिलता है जहां कैंची के साथ कटौती करने के लिए EDL (हरा) और पी एल (नीला) को दूर करने के लिए. (ई) ईडीएल और टीए को हटा दिया जाता है। (च) एक सीवन पी एल के निकटक कण्डरा के माध्यम से रखा जाता है. (जी) एक्सोग्रेफ्ट को खाली टिबिलिक कम्पार्टमेंट में रखा जाता है और दो हाथ की शल्य चिकित्सा वर्ग गाँठ का उपयोग करके समीपस्थ पी एल कण्डरा में सीवन किया जाता है। (ज) एक सीवन पी एल के दूरस्थ कण्डरा के माध्यम से रखा जाता है, एक तीर के साथ चिह्नित, और एक और दो हाथ शल्य वर्ग गाँठ distal कण्डरा के लिए xenograft सीवन करने के लिए प्रयोग किया जाता है. (मैं) xenograft पूरी तरह से प्रत्यारोपित किया जाता है और पी एल (जे) के लिए सीवन किया जाता है त्वचा शल्य गोंद के साथ बंद कर दिया जाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 3: 4 महीने Xenograft संग्रह. (ए) बाल शल्य चिकित्सा साइट से हटा दिया जाता है. त्वचा के नीचे सीतलदिखाई दिखाई देते हैं। (बी) त्वचा को एक्सोग्रेफ्ट से अधिक हटा दिया जाता है। फिर जेनोग्रैफ्ट को डिस्टेंस सीवन में आईरिस बल के साथ पकड़ा जाता है और धीरे से ऊपर की ओर खींचा जाता है। टखने पर शुरू, एक स्केलपेल टिबिया के साथ कटौती और exograft मुक्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है। तीर टिबिया के साथ चीरा की शुरुआत से पता चलता है. (सी) गैस्ट्रोकेनिअस मांसपेशियों को साइड में खींचकर, पर्युयस लांगस (पीएल) मांसपेशियों को अलग करने वाली एपिमिसियम की एक बेहोश सफेद रेखा और गैस्ट्रोकेनिमियस ( तीर द्वारा दिखाया गया) दिखाई देता है। अन्य पैर की मांसपेशियों से पी एल अलग करने के लिए इस लाइन के साथ कटौती करने के लिए स्केलपेल का प्रयोग करें। (डी)xenograft के दाईं ओर, और पी एल अब पैर में अन्य मांसपेशियों से मुक्त कर रहे हैं और हटाने के लिए तैयार हैं. डैश्ड लाइन इंगित करता है कि एक्सोग्रैफ्ट और पी एल ( ई ) को हटाने के लिए सर्जिकल कैंची से काटने के लिए कहां से काटा जाए,(ई) डिस्टेबल सीवन के नीचे काटने के बाद, घुटने की ओर जेनोग्रैफ्ट को मोड़ें। डैश्ड लाइन इंगित करता है कि टिबियल डिब्बे से जेनोग्रैफ्ट और पीएल को हटाने के लिए सर्जिकल कैंची से काटने के लिए कहां काटा जाए। (च)खाली टिबील कम्पार्टमेंट जिसमें एक्सोग्रेफ्ट और पी एल सफलतापूर्वक हटा दिए गए। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Representative Results
Yuanfan झांग एट अल द्वारा प्रदर्शन के रूप में, इस शल्य प्रोटोकॉल मानव कंकाल मांसपेशी xenografts8का उत्पादन करने के लिए एक सीधा तरीका है. पुनरुज्जीवित xenografts स्वतः innervated हो जाते हैं और कार्यात्मक संकुचन प्रदर्शित करते हैं। इसके अलावा, FSHD रोगियों से मांसपेशियों exografted FSHD रोगियों8में मनाया जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन recapitulates.
हमारे अनुभव में, नियंत्रण रोगी नमूनों से प्रदर्शन 8 xenografts में से लगभग 7 सफल मांसपेशी engraftment दिखाएगा. एक सफल xenograft मानव विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ की पहचान के रूप में मानव मायोफाइबर के मजबूत पुनर्जनन से पता चलता है (चित्र 4) . मायोफाइबर के अनुपात में सकारात्मक भ्रूण मायोसिन धुंधला इंगित करता है कि पुनर्जनन प्रक्रिया अभी भी चल रही है। इसके विपरीत, खराब शल्य चिकित्सा तकनीक या एक अपर्याप्त नमूना मांसपेशी फाइबर के गरीब पुनर्जनन के लिए नेतृत्व कर सकते हैं (चित्र 4).
एक अज्ञातहेतुक सूजन मायोपथी (आईआईएम) के साथ का निदान एक रोगी से प्रदर्शन Xenografts 4 और 6 महीने के संग्रह में पुनर्जीवित मानव मायोफाइबर की मध्यम संख्या दिखाने के लिए, और भ्रूण मायोसिन दाग 6 महीने पर बनी हुई है (चित्र 5A)। भड़काऊ कोशिकाओं एच एंड ई धुंधला द्वारा दिखाए गए के रूप में xenograft में मौजूद हैं (चित्र 5A),और CD3, CD68, और अन्य इम्यूनोलॉजिकल मार्करों (डेटा नहीं दिखाया) के साथ पुष्टि की गई है। Xenografts माउस के भीतर स्थिर हैं, और अप करने के लिए 12 महीने के संग्रह प्रदर्शन किया गया है. व्यक्तिगत मायोफाइबर आकार 4 और 6 महीने के आईआईएम xenografts और मूल आईआईएम रोगी बायोप्सी के बीच तुलनीय है (चित्र 5B) . एक पार अनुभागीय क्षेत्र दिखा दुर्लभ फाइबर (सीएसए) 350 0डिग्री 2 से अधिक xenografts में मनाया जाता है, लेकिन आईआईएम बायोप्सी में नहीं, यह दर्शाता है कि xenografts में कुछ मायोफाइबर स्वस्थ myofibers के आकार में तुलनीय एक सीएसए को पुनर्जीवित कर सकते हैं (चित्र 5B ).
चित्रा 1: सर्जिकल सेट-अप।
एक) स्टीरियो माइक्रोस्कोप के मानक अभिविन्यास, Mapleson ई श्वास सर्किट, और xenograft सर्जरी के दौरान शल्य चिकित्सा उपकरण. बी) जैव सुरक्षा कैबिनेट में प्रेरण कक्ष की नियुक्ति.
चित्र 4: अपेक्षित सकारात्मक और नकारात्मक परिणाम.
Xenografts एकत्र 4 महीने के बाद सर्जरी अच्छा या गरीब पुनर्जनन दिखा मानव-विशिष्ट lamin A/C (1:50) और मानव-विशिष्ट स्पेक्ट्रिन (1:20) और भ्रूण मायोसिन (1:10) (सामग्री की तालिका) के साथ दाग रहे हैं। सफेद डैश्ड बक्सों द्वारा दर्शाए गए क्षेत्र उच्च आवर्धन आवेषण के रूप में दर्शाए जाते हैं। स्केल बार: 200 डिग्री मी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 5: प्रतिनिधि Xenograft पुनर्जनन.
ए) Xenografts (डैश्ड लाइनों के साथ outlined) एक अज्ञातहेतुक सूजन मायोपथी के साथ का निदान एक रोगी से प्रदर्शन किया (आईआईएम) Hematoxylin और Eosin के साथ दाग (एच एंड ई), मानव विशिष्ट Lamin A/ दोनों 4 और 6 महीने के समय अंक पर NRG चूहों के भीतर. भ्रूण मायोसिन धुंधला दर्शाता है कि पुनर्जनन अभी भी दोनों समय बिंदुओं पर चल रहा है. स्केल बार: 200 डिग्री मी. बी) हिस्टोग्राम में 4 से 4 और 6 महीने के जेनोग्रैफ्ट्स और मानव बायोप्सी से मायोफाइबर के क्रॉस सेक्शनल एरिया (सीएसए) को चित्रित किया गया है, जिसमें एक अज्ञातहेतुक सूजन मायोपथी (आईआईएम) और एक स्वस्थ नियंत्रण रोगी का निदान किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
रोगी व्युत्पन्न xenografts मांसपेशियों की बीमारी मॉडल और पूर्व नैदानिक अध्ययन बाहर ले जाने के लिए एक अभिनव तरीका है। कंकाल की मांसपेशी xenografts बनाने के लिए यहाँ वर्णित विधि तेजी से, सीधा, और reproduible है. एकपक्षीय सर्जरी 15 से 25 मिनट में या द्विपक्षीय रूप से 30 से 40 मिनट में की जा सकती है। द्विपक्षीय विदेशी लोगों को अतिरिक्त प्रयोगात्मक लचीलापन प्रदान किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, शोधकर्ताओं ने एक xenograft के स्थानीयकृत उपचार प्रदर्शन कर सकते हैं, अन्य एक नियंत्रण के रूप में छोड़ दिया के साथ. NRG चूहों शल्य साइट संक्रमण के लिए प्रतिरोधी रहे हैं जब एक रोगज़नक़ मुक्त सुविधा में रखे; हमारे अनुभव में 200 से अधिक xenografts प्रदर्शन, हम एक माउस एक शल्य संक्रमण प्राप्त कभी नहीं किया है. इसके अलावा, मेजबान चूहों टीए और EDL को हटाने को बहुत अच्छी तरह से बर्दाश्त. सर्जरी के एक घंटे के भीतर, एकतरफा और द्विपक्षीय रूप से exografted चूहों सक्रिय हो जाएगा और उनके पिंजरे के चारों ओर घूमना, और यहां तक कि उनके hindlimbs पर खड़े. कभी कभी हम मेजबान चूहों में कुछ पैर ड्रॉप निरीक्षण, लेकिन आम तौर पर केवल निष्क्रियता की अवधि के बाद, जैसे कि हाल ही में awken, और जागने पैर का उपयोग के मिनट के भीतर सामान्य हो जाएगा.
प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण चरण हैं। सबसे पहले, EDL और टीए को हटाने के दौरान, यह आसन्न पी एल मांसपेशियों या उसके tendons घायल नहीं करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है। टीए पर प्रारंभिक चीरा प्रदर्शन किया जाता है के बाद यह ध्यान से और सही ढंग से सभी distal tendons की नियुक्ति की पहचान से बचा जा सकता है. इसके अतिरिक्त, ईडीएल(चित्र 2डी)को हटाने से पहले पीएल के समीपस्थ कण्डरा की पहचान की जानी चाहिए और स्पष्ट रूप से दिखाई देनी चाहिए। दूसरा, टांके tendons के माध्यम से रखा जाना चाहिए और एक उचित दो हाथ शल्य वर्ग गाँठ में पूरी तरह से कस दिया. Xenografts तनाव के तहत और अधिक मजबूती से पुनर्जीवित, और यह केवल प्राप्य है अगर xenograft PL tendons के लिए tethered है और अगर टांके के बाद ऑपरेटिव ढीला नहीं है. अंत में, यह नुकसान या पैर की आपूर्ति किसी भी प्रमुख रक्त वाहिकाओं को तोड़ने के लिए महत्वपूर्ण है। विशेष रूप से, मध्य टार्सल धमनी और नस पी एल के दूरस्थ कण्डरा के करीब या शीर्ष पर झूठ बोल सकते हैं। इन जहाजों के माध्यम से या उसके आसपास टांके न रखें। यह बताना आसान है कि सीवन को अनुचित तरीके से रखा गया है या नहीं क्योंकि जहाजों को ब्लैंच या खून बहेगा। यदि ऐसा होता है, तो सीवन और स्थान को किसी भिन्न स्थान पर निकालें.
इस विधि में कई सीमाएँ हैं। यह इस तरह पकड़ शक्ति या ट्रेडमिल धीरज के रूप में मांसपेशियों की बीमारी के माउस मॉडल में इस्तेमाल मानक कार्यात्मक परख के लिए अनुकूल नहीं है. हालांकि, xenograft समारोह के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल आकलन अभी भी किया जा सकता है. Evoked बल माप xenograft explants से दर्ज किया जा सकता है, और एक एंजाइमी रूप से अलग myofibers से xenografts अनुपात के साथ भरी हुई कैल्शियम रंगों और विद्युत प्रेरित कैल्शियम गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकताहै 8. इस मॉडल में एक और अंतर्निहित चुनौती यह है कि प्राप्त करने और मानव ऊतक के साथ काम करना मुश्किल हो सकता है. नहीं सभी प्रयोगशालाओं ताजा मांसपेशियों बायोप्सी के लिए आसान पहुँच होगा, लेकिन यह दिखाया गया है कि autopsy ऊतक से प्रदर्शन xenografts लगभग 48 घंटे पोस्टमार्टम सफलतापूर्वक engraft कर सकते हैं, और इस ऊतक के लिए प्राप्त करने के लिए आसान हो सकता है कुछ प्रयोगशालाओं8| यह भी मानव ऊतक में जीन अभिव्यक्ति में हेरफेर करने के लिए चुनौतीपूर्ण है, जबकि रोग के मानक माउस मॉडल का उपयोग शोधकर्ताओं को आसानी से उपलब्ध माउस आनुवंशिक उपकरणों की बहुतायत का उपयोग कर सकते हैं.
इस विदेशी मॉडल की एक ताकत यह है कि यह शोधकर्ताओं vivo में मानव मांसपेशियों का अध्ययन करने की अनुमति देता है. ऊतक संस्कृति बड़े पैमाने पर मानव मांसपेशियों की कोशिका और आणविक जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। फिर भी, इन अल्पकालिक, पूर्व vivo अध्ययन हमेशा vivo में कार्यात्मक मांसपेशियों अनुमानित नहीं है. हालांकि, एक चेतावनी यह है कि यह निर्धारित करने के लिए कैसे बारीकी से xenograft जीव विज्ञान और समारोह पुनर्योजी प्रक्रिया के दौरान मेजबान माउस घटकों के योगदान के कारण मानव मांसपेशियों अनुमानित चुनौतीपूर्ण है. उदाहरण के लिए, मानव और माउस neuromuscular जंक्शनों (NMJs) आकृति विज्ञान अलग हैं, और मानव और माउस NMJs13के synaptic proteome के बीच महत्वपूर्ण अंतर है. के रूप में xenografts माउस मेजबान द्वारा innervated रहे हैं, यह जैविक मानव xenografts के लिए अद्वितीय परिवर्तन में परिणाम हो सकता है.
भविष्य के अध्ययनों में, इस कंकाल मांसपेशी exograft विधि बेहतर मानव मांसपेशी सेल जीव विज्ञान को समझने के लिए और दुर्लभ या प्राप्त मांसपेशी रोगों है कि वर्तमान में पशु मॉडल की कमी के लिए उपन्यास मॉडल विकसित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हम आशा करते हैं कि इससे इन रोगों के चिकित्सीय विकास पर महत्वपूर्ण लाभकारी प्रभाव पड़ेगा।
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Disclosures
लेखक घोषणा करते हैं कि उनका कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित नहीं है।
Acknowledgments
यह काम Myositis एसोसिएशन और पीटर बक फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया था. हम डॉ युआनफान झांग को उसकी विशेषज्ञता और जेनोग्रैफ्ट सर्जिकल तकनीक में प्रशिक्षण साझा करने के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm x 15 mm Petri dish | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| 2-Methylbutane | Fisher | O3551-4 | |
| 20 mm x 30 mm micro cover glass | VWR | 48393-151 | |
| Animal Weighing Scale | Kent Scientific | SCL- 1015 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution | Corning, Cellgro | 30-004-CI | |
| AutoClip System | F.S.T | 12020-00 | |
| Castroviejo Needle Holder | F.S.T | 12565-14 | |
| Chick embryo extract | Accurate | CE650TL | |
| CM1860 UV cryostat | Leica Biosystems | CM1860UV | |
| Coplin staining jar | Thermo Scientific | 19-4 | |
| Dissection Pins | Fisher Scientific | S13976 | |
| Dry Ice - pellet | Fisher Scientific | NC9584462 | |
| Embryonic Myosin antibody | DSHB | F1.652 | recommended concentration 1:10 |
| Ethanol | Fisher Scientific | 459836 | |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30071.01 | |
| Fiber-Lite MI-150 | Dolan-Jenner | Mi-150 | |
| Forceps | F.S.T | 11295-20 | |
| Goat anti-mouse IgG1, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21121 | recommended concentration 1:500 |
| Goat anti-mouse IgG2b, AlexaFluor 594 | Invitrogen | A-21145 | recommended concentration 1:500 |
| Gum tragacanth | Sigma | G1128 | |
| Hams F-10 Medium | Corning | 10-070-CV | |
| Histoacryl Blue Topical Skin Adhesive | Tissue seal | TS1050044FP | |
| Human specific lamin A/C antibody | Abcam | ab40567 | recommended concentration 1:50-1:100 |
| Human specific spectrin antibody | Leica Biosystems | NCLSPEC1 | recommended concentration 1:20-1:100 |
| Induction Chamber | VetEquip | 941444 | |
| Iris Forceps | F.S.T | 11066-07 | |
| Irradiated Global 2018 (Uniprim 4100 ppm) | Envigo | TD.06596 | Antibiotic rodent diet to protect again respiratory infections |
| Isoflurane | MWI Veterinary Supply | 502017 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | surgical wipes |
| Mapleson E Breathing Circuit | VetEquip | 921412 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412 | |
| Mobile Anesthesia Machine | VetEquip | 901805 | |
| Mouse on Mouse Basic Kit | Vector Laboratories | BMK-2202 | mouse IgG blocking reagent |
| Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| NAIR Hair remover lotion/oil | Fisher Scientific | NC0132811 | |
| NOD-Rag1null IL2rg null (NRG) mice | The Jackson Laboratory | 007799 | 2 to 3 months old |
| O.C.T. Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| Oxygen | Airgas | OX USPEA | |
| PBS (phosphate buffered saline) buffer | Fisher Scientific | 4870500 | |
| Povidone Iodine Prep Solution | Dynarex | 1415 | |
| ProLong™ Gold Antifade Mountant | Fisher Scientific | P10144 (no DAPI); P36935 (with DAPI) | |
| Puralube Ophthalmic Ointment | Dechra | 17033-211-38 | |
| Rimadyl (carprofen) injectable | Patterson Veterinary | 10000319 | surgical analgesic, administered subcutaneously at a dose of 5 mg/kg |
| Scalpel Blades - #11 | F.S.T | 10011-00 | |
| Scalpel Handle - #3 | F.S.T | 10003-12 | |
| Stereo Microscope | Accu-scope | 3075 | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Suture, Synthetic, Non-Absorbable, 30 inches long, CV-11 needle | Covidien | VP-706-X | |
| 1ml Syringe (26 gauge, 3/8 inch needle) | BD Biosciences | 329412 | |
| Trimmer | Kent Scientific | CL9990-KIT | |
| Vannas Spring Scissors, 8.0 mm cutting edge | F.S.T | 15009-08 | |
| VaporGaurd Activated Charcoal Filter | VetEquip | 931401 | |
| Wound clips, 9 mm | F.S.T | 12022-09 |
References
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