Summary
복잡한 인간 질병은 전통적인 실험실 모형 시스템에서 모델링하는 것이 어려울 수 있습니다. 여기에서, 우리는 면역 결핍 마우스로 인간 골격 근 생검의 이식을 통해 인간 근육 질병을 모델링하는 외과 접근을 기술합니다.
Abstract
동물 연구에서 관찰 하는 치료 효과 종종 임상 시험에서 되풀이 실패. 이 문제는 다각적인 것이지만, 이 실패의 한 가지 이유는 부적절한 실험실 모델을 사용하기 때문입니다. 전통적인 실험실 유기체에서 복잡한 인간 질병을 모델링하는 것은 어렵지만,이 문제는 인간 이종이식의 연구를 통해 회피 될 수 있습니다. 우리가 여기에서 설명하는 외과 방법은 근육 질병을 모델링하고 전임상 치료 시험을 실행하기 위하여 이용될 수 있는 인간 골격 근 이종이식의 창조를 허용합니다. 기관 검토 위원회 (IRB) 승인 된 프로토콜에 따라, 골격 근육 표본은 환자로부터 획득 한 다음 NOD-Rag1nullIL2rγnull (NRG) 숙주 마우스로 이식됩니다. 이 마우스는 성숙한 림프톨을 만드는 그들의 무능력 때문에 이식 연구 결과를 위한 이상적인 호스트이고 이렇게 세포 중재되고 체액 적응성 면역 반응을 개발할 수 없습니다. 숙주 마우스는 이소플루란으로 마취되고, 마우스 경질전방 및 경전지성 경골 근육이 제거된다. 인간의 근육의 조각은 다음 빈 경골 구획에 배치하고 peroneus longus 근육의 근위 및 원위 힘줄에 봉합된다. 이종이식 근육은 마우스 숙주에 의해 자발적으로 혈관화되고 내심이 생겨전 임상 연구의 모델로 사용될 수 있는 튼튼하게 재생되는 인간의 근육을 생성합니다.
Introduction
임상 시험을 진행중인 모든 약물 개발 프로그램의 13.8 %만이 성공하고 승인 된 치료법으로 이어진다고보고되었습니다1. 이 성공률은 이전에 보고된 10.4%보다 높지만2.여전히 개선의 여지가 있습니다. 임상 시험의 성공률을 높이기 위한 한 가지 접근법은 전임상 연구에 사용되는 실험실 모델을 개선하는 것입니다. 미국 식품의약국(FDA)은 1상 임상 시험 전에 치료 효능을 보여주고 독성을 평가하기 위한 동물 연구를 요구합니다. 그러나, 종종 동물 연구와 임상 시험 사이 치료 결과제한 된일치가 있다 3. 또한, 전임상 동물 연구의 필요성은 허용된 동물 모델이 없는 질병에서 치료 개발을 위한 극복할 수 없는 장벽이 될 수 있으며, 이는 종종 희귀 또는 산발성 질환의 경우이다.
인간 질병을 모델링하는 한 가지 방법은 인간 조직을 면역 결핍 마우스로 이식하여 이종이식을 생성하는 것입니다. 이종이식 모델에는 세 가지 주요 장점이 있습니다: 첫째, 다른 동물 모델에서는 결코 재현할 수 없는 인간 질병에 존재하는 복잡한 유전적 및 후생유전학적 이상을 재현할 수 있습니다. 둘째, 이종이식은 환자 샘플이 제공되는 경우 희귀하거나 산발적인 질병을 모델링하는 데 사용할 수 있습니다. 셋째, 이종이식은 완전한 생체 내 시스템 내에서 질병을 모델링합니다. 이러한 이유로, 우리는 이종이식 모델의 치료 효능 결과가 환자에서 시험으로 번역 될 가능성이 더 높다는 가설을 세워. 인간 종양 이종이식은 이미 다발성 골수종을 포함한 일반적인 암 에 대한 치료법을 개발하는 데 성공적으로 활용되었으며, 개별 환자를 위한 맞춤형치료법4,5,6, 7.
최근, 이종이식은 인간 근육 질환의 모델을 개발하는 데 사용되어왔다 8. 이 모형에서는, 인간 적인 근육 생검 견본은 이종이식을 형성하기 위하여 면역 결핍 NRG 마우스의 뒷다리로 이식됩니다. 이식된 인간 근섬유는 죽지만, 이종이식에 존재하는 인간 근육 줄기 세포는 이후에 이식된 인간 기저 라미나를 다시 채우는 새로운 인간 근섬유로 확장및 분화한다. 따라서, 이러한 이종이식에서 재생된 근섬유는 전적으로 인간이며 마우스 숙성에 의해 자발적으로 재혈관화되고 내심이 생겨납니다. 중요한 것은, 마우스로 이식된 근이영양증(FSHD) 환자 근육 조직은 인간 질환의 주요 특징, 즉 DUX4 전사 인자의발현8을재구성한다. FSHD는 DUX4의 과발현에 의해 발생, 이는 후성 유전학적으로 정상적인 근육 조직에서 침묵9,10. FSHD 이종이식 모델에서, DUX4 특이적 모르폴리노를 함유한 치료는 성공적으로 DUX4 발현 및 기능을 억압하는 것으로 나타났으며, FSHD 환자11에대한 잠재적치료 옵션이 될 수 있다. 이러한 결과는 인간의 근육 이종이식은 인간 근육 질환을 모델링하고 마우스에서 잠재적 인 치료를 테스트하는 새로운 접근 방식임을 보여줍니다. 여기서, 우리는 면역 결핍 마우스에서 인간 골격 근 이종이식을 만들기위한 수술 방법을 자세히 설명합니다.
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Protocol
인간 과목에서 연구 표본의 모든 사용은 참가자의 권리와 복지를 보호하기 위해 존스 홉킨스 기관 검토 위원회 (IRB)에 의해 승인되었다. 모든 동물 실험은 존스 홉킨스 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인 되었다 건강의 국가 학회에 따라 (NIH) 실험실 동물의 관리 및 사용에 대 한 가이드. 수레NOD-Rag1nullIL2rγnull(NRG) 숙주 마우스(8-12주 령)는 이종이식 실험을 수행하기 위해 사용된다. 이 마우스는 환기 랙에 보관되어 HEPA 여과, 템퍼링 및 가습 공기뿐만 아니라 역삼투 압여 과염소화 물을 부여한다. 마우스는 물과 조사된 항생제식단(Table of Materials)광고 리비텀을 제공하고, 이 시설은 중앙 타이머에 의해 제어되는 바와 같이 14h의 빛을 10h의 어두운 색으로 제공한다.
1. 장비 준비
- NOD-Rag1nullIL2r γnull(NRG) 마우스를 획득, 8-12주 령.
- 오토 클레이브 수술 장비 : 가위, 집게, 바늘 홀더, 수술스테이플러 (재료표),상처 클립, 수술 용 물티슈(재료 표),및 비커(그림 1A).
- 50 mL의 근육 매체 (20 % 태아 소 혈청, 2 % 병아리 배아 추출물, Hams F10 Medium에서 1 % 항생제 / 항 균제)를 준비하십시오. 프로토콜에 다르게 명시되지 않는 한 수술에 사용되는 모든 화학 물질 /약물 / 솔루션을 실온에서 보관하십시오.
- 2 mg/mL진통제(재료 표)를포함하는 3/8 인치 길이의 26G 바늘로 1 mL 주사기를 준비하고 얼음 위에 놓습니다. 진통은 멸균 인산완충식염수린(PBS)을 사용하여 적절한 농도로 희석될 수 있다.
2. 외과 준비
- MRC (의학 연구 위원회) 규모12에근육이 강도를 표시하는 환자로부터 IRB 승인 프로토콜에 따라 인간 근육 생검을 얻을 > 4-/5. 연구 표본을 근육 매체가 함유된 100 mm x 15mm 페트리 접시에 놓습니다.
참고: MRC 스케일은 수축없음, 5는 정상 전력을 나타내는 0, 저항에 대한 움직임을 나타내는 4 (4- 4+)와 근육 강도의 평가로 임상 실습에서 사용된다12. 우리는 온화한에 온건한 약점을 가진 근육이 (MRC > 4-/5) 일반적으로 질병 병리학을 보여주지 만 광범위하게 지방 조직 또는 섬유증으로 대체되지 않는다는 것을 것을을 발견했습니다, 둘 다 이종이식 재생을 방해합니다. 최근 MRC 점수를 사용할 수없는 부검 조직의 경우, 근육 의 질은 총 관찰을 통해 액세스 할 수 있습니다. 외관에 있는 창백한 분홍색 또는 지방 조직의 큰 지역이 있는 근육 생검은 성공적으로 이종이식에 확률이 높지 않습니다. - 스테레오 현미경과 광원을 사용하여 수술용 가위로 시편에서 남은 근막 또는 지방 조직을 제거하여 시각화를 돕습니다.
- 스테레오 현미경과 광원을 사용하여 수술 가위로 약 7mm x 3mm x 3mm 조각으로 근육 생검을 해부하십시오. 섬유가 시편 내에 세로로 배열되도록 합니다.
- 해부된 근육이 들어 있는 페트리 접시를 얼음 위에 놓습니다. 평균적으로, 이종이식은 수술이 수행되는 동안 4 시간 동안 미디어에 보관됩니다. 그러나, 생검은 이종이식하기 전에 24시간 동안 미디어에 저장되어 왔으며, 이러한 지연은 이식 또는 재생에 부정적인 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.
- 70% 에탄올이 함유된 100mm x 15mm 페트리 접시에 합성, 흡수가 불가능한 봉합사(재료표)를놓습니다.
- 이중 절차 마취 회로를 설정 : 스테레오 현미경에 Mapleson E 호흡 회로를 배열하고 생체 안전 캐비닛에 유도 챔버를 배치(그림 1A,B).
- 오클라브 비커를 스케일에 배치하여 NRG 마우스의 중량을 얻고 유도 챔버로 전달한다. 3% 이소플루란 하에서 마취를 유도하십시오. 호흡속도, 근육 이완, 자발적 운동 부족을 관찰하여 평가한 바와 같이 적절한 마취 깊이가 달성되면 수술의 나머지 기간 동안 기화기 설정을 1.5%로 줄입니다.
- 유도 챔버에서 Mapleson E 호흡 회로로 마우스를 옮기고 눈에 안과 연고를 적용하십시오.
- 트리머로 발목에서 무릎까지 경질 전방 (TA)을 덮은 머리카락을 제거한 다음 제모 로션으로 1 분 트리트먼트(재료표)(그림2A).
- 포비도-요오드 용액으로 다리를 바태워 수술 부위를 소독하십시오. 그런 다음 남은 포비동 요오드를 70% 에탄올로 씻어내소서.
- 카프로펜(재료표)과 같은 진통제로 마우스를 피하주사하여5 mg/kg의 용량으로 주입합니다.
3. 이종이식 수술
- 다리를 테이프로 내리고 말단 힘줄에서 유래하고 무릎 아래를 종료 하는 가위와 홍채 집게와 tibilalis 전방 (TA) 근육을 통해 직선 절개를 합니다(그림 2B).
- 외과 용 가위로 무딘 해부를 사용하여 근육에서 피부를 분리하십시오.
- 힘줄에서 시작하여 무릎에서 끝나는 가위로 TA 근육의 에피소드를 잘라냅니다.
참고: 이것은 매우 피상적 인 컷입니다 (0.5mm 미만; 그림 2B,검은 색 파선) 및 기본 TA는 제거가 더 어려워지므로 프로세스에서 손상되지 않아야합니다. 올바르게 수행하면 근육 섬유가 눈에 띄게 이완됩니다. - 가위로 TA의 말단 힘줄을 잘라, 홍채 집게와 힘줄을 잡아, 무릎쪽으로 TA를 당겨(그림 2C).
- 가위로 신근 디지터럼 롱러스 (EDL)의 원위 힘줄을 잘라 무릎쪽으로 EDL을 당깁니다(그림 2D). 페로누스 롱구스 (PL) 근육의 근위 힘줄이 보이면 가위로 EDL을 제거하십시오(그림 2D, 녹색 파선).
- 가위로 TA를 제거하고(그림 2D,파란색 파선) 및 지혈을 달성하기 위해 PBS와 약간의 압력으로 젖은 수술 용 닦아를 사용합니다(그림 2E).
- 근위 경후 경부 (PL) 힘줄을 통해 봉합사를 스레드, 힘줄의 양쪽에 스레드의 약 1.5 인치를 떠나(그림 2F).
- 양손 수술 사각형 매듭의 첫 번째 절반을 수행하지만, 조이지 마십시오 : 이것은 원을 형성합니다. 이 원에 이종이식을 놓고 이종이식을 고정하기 위해 루프를 조입니다. 정사각형 매듭지의 나머지 절반을 완료합니다(그림2G,H). 이것은 PL의 근위 힘줄에 이종이식을 봉합할 것이다.
- 실 봉합은 원위 PL 힘줄을 통해 제곱 매듭 기술을 반복하여 3.8 단계에서 이종이식을 원위 힘줄에 묶는다(도 2H,I).
참고: 내측 타르살 동맥 및 정맥은 PL의 원위 힘줄 가까이 또는 위에 놓일 수 있습니다. 이 용기를 통해 또는 주변에 봉합사를 두지 마십시오. 혈관이 희미지거나 출혈하기 때문에 봉합사가 부적절하게 배치되었는지 쉽게 알 수 있습니다. 이 경우 봉합사를 제거하고 다른 위치에 놓습니다. - 이식된 근육 위로 피부를 당기고, 외과용 접착제로 밀봉하고, 절개에 2-3개의 수술용 스테이플을 놓습니다(그림2J).
- 가열된 패드에 깨끗한 케이지에 마우스를 놓고 복구합니다. 마우스를 완전히 의식하고 주기적으로 다음 며칠 동안 국소 전신 감염의 징후를 확인하고 수술 부위가 다시 열리지 않도록 하십시오.
참고: 단계 2.11에 기술된 바와 같이 진통의 단 하나 복용량은 전형적으로 진통을 위해 충분합니다. 그러나, 마우스는 또한 지속적인 고통 (예를 들면 절름발이, 주름진 코트, 구부러진 자세)를 위해 감시되어야 하고, 필요한 경우에, 수술 후 24 시간에서 진통제로 다시 투약해야 합니다.
4. 이종이식 컬렉션
참고: 이종이식은 일반적으로 수술 후 4~6개월 사이에 수집됩니다. 그러나, 수집은 수술 후 12 개월까지 수행되었습니다.
- 2-메틸부탄 200mL가 들어 있는 덮인 비커를 이종이식 수집 전에 최소 30분 동안 드라이 아이스가 들어 있는 상자에 놓습니다.
- 유도 챔버에서 3 % 이소플루란 에서 마취를 유도하십시오. 적절한 마취 깊이가 달성되면, 수술의 나머지 부분에 대한 1.5 %로 기화기 설정을 줄일 수 있습니다.
- 유도 챔버에서 스테레오 현미경으로 배열된 Mapleson E 호흡 회로로 마우스를 옮김으로 옮김을 전달합니다.
- 트리머와 제모 로션으로 발목에서 무릎까지 경골 앞쪽에 있는 모발을 제거합니다. 이종이식을 제자리에 들고 있는 봉합사는 피부를 통해 볼 수있다(도 3A).
- 다리를 테이프로 내리고 가위와 홍채 집게를 사용하여 두 봉합사가 보일 때까지 이종이식 위에 피부를 엽니다(그림3B). 이종이식을 겹치게 하는 피부는 이종이식을 쉽게 제거할 수 있도록 하는 것처럼 제거될 수 있다.
- 메스를 사용하여 이종이식과 경골 사이를 잘라냅니다(그림 3B, 화살표는 초기 부위와 절개 방향을 나타냅니다). 이렇게하면 이종이식의 한쪽이 해방됩니다.
- 메스를 사용하여 PL 근육과 위장혈성 근육 사이를 절단합니다(그림3C,화살표로 표시된 상피시슘을 따라 ncision). PL은 이종이식으로 제거됩니다.
- 말단 봉합사 아래와 PL의 말단 힘줄을 통해 잘라(그림 3D,점선을 따라 잘라).
- 홍채 집게로 봉합사를 잡고 가위를 사용하여 기본 근육에서 멀리 자르는 동안 무릎쪽으로 편향하여 이종이식 및 PL을 제거하십시오(그림 3E).
- 이종이식과 PL을 제거하기 위해 가위로 근위 봉합사 위를 잘라냅니다(그림 3F, 3E의점선을 따라 잘라).
- 작은 판지 나 플라스틱 조각에 표본을 놓고 가능한 한 봉합사에 가깝게 고정하십시오. 시편을 고정하는 동안 근육을 부드럽게 스트레칭하여 스냅 동결 과정에서 섬유 배향이 유지되도록 합니다. 핀이 제자리에 단단히 고정된 후, 근육이 핀 위로 밀어 올려 골판지 바로 위에 놓이게 합니다.
참고: 양자택일로, 이종이식의 한쪽 끝은 코르크에 트라가칸트에 장착될 수 있고, 또는 극저온에서 최적의 절삭 온도(O.C.T.) 화합물에 완전히 잠길 수 있다. 주의하여 근육 형태는 두 가지 방법으로 유지할 수 있습니다. - 스냅은 미리 냉각 된 2-메틸 부탄에 이종이식을 동결.
- 이종이식을 -80°C에서 보관하십시오.
- 이종이식 수집 직후, 미국 수의학 협회 지침에 따라 마우스를 안락사:
- 적절한 폐가스 청소 시스템으로 마우스를 밀폐된 챔버에 놓습니다. 마취를 유도하기 위해 3-4 %의 농도로 이소플루란을 사용하십시오.
- 호흡속도, 근육 이완, 자발적 운동 부족을 관찰하여 평가한 바와 같이 적절한 마취 깊이가 달성되면 기화기 설정을 5%로 늘려 사망을 유도합니다. 호흡이 중단된 후 2분 동안 마우스를 챔버에 둡니다. 이소플루란을 과다 복용한 후 10분 이내에 마우스가 회복되지 못하는 것을 관찰하여 사망이 확인됩니다.
- 마지막으로, 마우스에 자궁 경부 탈구를 수행합니다.
참고: 양측 이종이식 마우스의 경우, 반대로 이종이식은 나중에 수집을 위해 저장될 수 있다. 생존 컬렉션을 수행하려면 수술 용 가위로 단일 직선 컷으로 이종이식을 덮는 피부를 열고 단계 4.6 내지 4.10에 설명 된 대로 이종이식을 제거하십시오. 그런 다음 수술용 접착제와 스테이플을 사용하여 빈 경골 구획 위로 피부를 닫습니다. 2.11단계에서 설명한 대로 진통제로 마우스를 치료하고 마우스를 가열된 패드에 깨끗한 케이지에 넣어 복구합니다. 국소 전신 감염의 징후가 있는지 다음 며칠 동안 완전히 의식하고 주기적으로 마우스를 모니터링하고 수술 부위가 다시 열리지 않도록하십시오.
5. 이종이식 면역화학
- 저온 저온 을 사용하여 수집 된 이종이식에서 10 내지 12 μm 섹션을 양전하 슬라이드(재료 표)에잘라냅니다.
- 염색 항아리에 메탄올을 채우고 -20°C에서 30분간 미리 식힙니다.
- 얼음 차가운 메탄올에 슬라이드를 10 분 동안 놓고 이종이식 부분을 수정하고 퍼메아빌화하십시오.
- 염색 병에 슬라이드를 놓고 인산염 완충 식염수 (PBS)로 3 x를 5 분 동안 씻으십시오.
- 4 °C에서 2 시간 동안 마우스 반대 IgG(재료 표)로블록.
- PBS에서 스펙린, 라민 A/C 및 배아 미오신(물자표)과같은 1차 항체를 가진 블롯은 4°C에서 하룻밤 동안 2% 염소 혈청을 보충하였다.
- 슬라이드를 염색 용기에 놓고 인산염 완충 식염수(PBS)로 3x를 5분 동안 씻습니다.
- PBS에 형광 염료 공액 이차 항체(재료표)를가진 얼룩은 실온에서 1 시간 동안 2 % 염소 혈청으로 보충되었습니다.
- 염색 병에 슬라이드를 놓고 인산염 완충 식염수 (PBS)로 3 x를 5 분 동안 씻으십시오.
- 이식편 부분 위에 장착매체(재료 표)를놓고 커버슬립을 위에 놓고 매니큐어를 사용하여 커버슬립을 밀봉합니다.
그림 2: 이종이식 수술. (A)수술 부위에서 머리카락이 제거됩니다. (B)경골 전방 (TA)을 통해 절개가 이루어집니다. TA와 신근 디지터룸 롱구스 (EDL)의 원위 힘줄은 화살표로 표시됩니다. 검은 색 파선은 3.3 단계에서 에미슘이 절단 될 위치를 나타냅니다. (C)TA의 말단 힘줄이 절단되고 근육이 무릎까지 당겨져 있습니다. (D)EDL의 힘줄이 절단되고 EDL이 무릎까지 당겨졌습니다. 이것은 화살표로 표시된 페로누스 롱구스 (PL)의 근위 힘줄을 노출시다. 파선은 EDL(녹색) 및 PL(파란색)을 제거하기 위해 가위로 잘라야 할 위치를 나타냅니다. (E)EDL과 TA가 제거됩니다. (F)봉합사는 PL의 근위 힘줄을 통해 배치된다.(G)이종이식은 빈 경골 구획에 배치되고 양손 수술 정사각형 매듭을 사용하여 근위 PL 힘줄에 봉합된다. (H)봉합사는 화살로 표시된 PL의 말단 힘줄을 통해 배치되고, 또 다른 양손 외과 정사각형 매듭은 말단 힘줄에 이종이식을 봉합하는 데 사용된다. (I)이종이식은 PL에 완전히 이식되고 봉합된다.(J)피부는 외과용 접착제로 닫힙니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 4개월 제종이식 컬렉션. (A)수술 부위에서 머리카락이 제거됩니다. 봉합사는 피부 아래에 볼 수 있습니다. (B)이종이식을 덮는 피부가 제거됩니다. 그런 다음 이종이식은 말단 봉합사에서 홍채 집게로 잡고 부드럽게 위쪽으로 당겼습니다. 발목에서 시작하여 메스는 경골을 따라 자르고 이종이식을 풀어내는 데 사용됩니다. 화살표는 경골을 따라 절개의 시작을 보여줍니다. (C)위장혈을 옆으로 당기면, 페로너스 롱러스(PL) 근육과 위장관(화살표로 표시됨)을 분리하는 희미한 백색 의 상피선이 보입니다. 이 선을 따라 잘라 다른 다리 근육에서 PL을 분리 하는 메스를 사용 합니다. (D)이종이식의 오른쪽과 PL이 다리의 다른 근육에서 자유로이 제거되고 제거할 준비가 되었습니다. 파선은 이종이식 및PL을제거하기 시작하기 위해 수술용 가위로 절단할 위치를 나타내며, 말단 봉합사 아래를 절단한 후, 이종이식을 무릎쪽으로 편향시다. 파선은 경골 구획에서 이종이식 및 PL을 제거하기 위해 수술 용 가위로 절단 할 위치를 나타냅니다. (F)이종이식 및 PL이 있는 빈 경골 구획이 성공적으로 제거되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Representative Results
Yuanfan Zhang 등에서 입증한 바와 같이, 이 외과 프로토콜은 인간 골격 근 이종이식8을생산하는 간단한 방법입니다. 재생된 이종이식은 자발적으로 내면화되고 기능적 수축성을 표시합니다. 또한, FSHD 환자로부터 이식된 근육은 FSHD환자에서관찰된 유전자 발현의 변화를 8.
우리의 경험에서, 대략 7 의 8 대조군 참을성 있는 견본에서 수행된 이종이식은 성공적인 근육 생착을 보여줄 것입니다. 성공적인 이종이식은 인간 특이적 항체로 확인된 바와 같이 인간 근섬유의 강력한 재생을나타낸다(그림 4). myofibers의 비율 내의 양성 배아 myosin 염색은 재생 과정이 여전히 진행중임을 나타냅니다. 대조적으로, 가난한 외과 기술 또는 부적당한 견본은 근육 섬유의 나쁜 재생으로 이끌어 낼 수 있습니다(그림 4).
특발성 염증성 근병증(IIM)으로 진단받은 환자로부터 수행된 Xenografts는 4-및 6개월 의 회수에서 재생된 인간 근섬유의 적당한 숫자를 나타내고, 배아 myosin 염색은 6개월(도5A)에서지속된다. 염증세포는 H&E염색(도 5A)에의해 도시된 바와 같이 이종이식에 존재하며, CD3, CD68 및 기타 면역학적 마커(나타내지 않은 데이터)로 확인되었다. 제종이식은 마우스 내에서 안정되어 있으며 최대 12개월의 수집이 수행되었습니다. 개별 근섬유 크기는 4-및 6개월 IIM 이종이식과 본래 의 IIM 환자 생검(도5B)과비교된다. 3500 μm2보다 큰 단면적(CSA)을 나타내는 희귀 섬유는 이종이식에서 관찰되지만 IIM 생검에서는 관찰되지 않으며, 이는 이종이식의 일부 근섬유가 건강한 근섬유와 유사한 크기의 CSA로 재생될 수 있음을나타냅니다(그림 5B) ).
그림 1: 외과 적 설정.
A)이종이식 수술 중 스테레오 현미경, Mapleson E 호흡 회로 및 수술 도구의 표준 방향. B)생체 안전 캐비닛에 유도 챔버의 배치.
그림 4: 예상 긍정적 및 부정적 결과.
양호하거나 열악한 재생을 나타내는 4개월 후 수집된 이종이식은 인간 특이적 라민 A/C(1:50) 및 인간 특이적 스펙트린(1:20) 및 배아 미오신(1:10)으로염색된다(재료표). 흰색 파선 상자로 표시된 영역은 더 높은 배율 인서트가 표시됩니다. 배율 표시줄: 200 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 대표적인 이종이식 재생.
A)헤마톡실린과 에오신(H&E),인간 특이적 라민 A/C 및 인간 특정 스펙트린으로 염색된 특발성 염증성 근병증(IIM)으로 진단받은 환자로부터 수행된 Xenografts(파선으로 윤곽선)는 근섬유 형성을 보여줍니다. 4 개월 및 6 개월 시점에서 NRG 마우스 내에서. 배아 myosin 염색은 재생이 두 시점 모두에서 여전히 진행중임을 보여줍니다. 스케일 바: 200 μm. B)특발성 염증성 근병증(IIM)으로 진단된 한 환자로부터 4-및 6개월 이종이식 및 인간 생검으로부터의 근섬유의 단면적(CSA)을 묘사한 히스토그램(CsA)과 1명의 건강한 대조군 환자. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
환자 유래 이종이식은 근육 질환을 모델링하고 전임상 연구를 수행하는 혁신적인 방법입니다. 골격 근 이종이식을 만들기 위해 여기에 설명된 방법은 빠르고 간단하며 재현 가능합니다. 일방적 인 수술은 15 ~ 25 분 또는 30 ~ 40 분 에서 양자 간 으로 수행 할 수 있습니다. 양측 이종이식은 추가적인 실험 적 유연성을 제공할 수 있습니다. 예를 들어, 연구원은 하나의 이종이식의 국부적 인 치료를 수행 할 수 있습니다, 다른 하나는 대조군으로 왼쪽. NRG 마우스는 병원균이 없는 시설에 보관될 때 수술 부위 감염에 내성이 있다; 200개 이상의 이종이식을 수행한 경험에서, 우리는 마우스가 외과 적 감염을 취득한 적이 없었습니다. 또한, 숙주 마우스는 TA 및 EDL의 제거를 아주 잘 용인한다. 수술 후 1시간 이내에 일방적으로 그리고 양자 이식된 쥐가 활동적이고 케이지 주위를 걷고, 심지어 뒷다리에 서있을 것입니다. 때때로 우리는 호스트 마우스에 있는 몇몇 보병 투하를 관찰합니다, 그러나 일반적으로 최근에 깨어난 경우에 와 같은 비활동의 기간 후에, 그리고 깨어있는 다리 사용의 분 안에 정상일 것입니다.
프로토콜에는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫째, EDL 및 TA를 제거하는 동안 인접한 PL 근육 이나 힘줄을 손상시키지 않는 것이 매우 중요합니다. 이것은 TA를 통해 초기 절개가 수행된 후에 모든 말위 힘줄의 배치를 주의깊게 정확하게 확인해서 피할 수 있습니다. 또한, PL의 근위 힘줄은 EDL의 제거 전에 식별되고 명확하게 볼 수 있어야한다(도 2D). 둘째, 봉합사는 힘줄을 통해 배치하고 적절한 양손 수술 사각형 매듭에 완전히 조여야합니다. Xenografts는 장력 하에서 더 강력하게 재생되며, 이것은 이종이식이 PL 힘줄에 묶여 있고 봉합사가 수술 후 느슨해지지 않는 경우에만 얻을 수 있습니다. 마지막으로, 발을 공급하는 주요 혈관을 손상시키거나 단절하지 않는 것이 중요합니다. 특히, 내측 타르살 동맥 및 정맥은 PL의 원위 힘줄 에 가깝거나 위에 놓일 수 있다. 이 용기를 통해 또는 주변에 봉합사를 두지 마십시오. 혈관이 희미지거나 출혈하기 때문에 봉합사가 부적절하게 배치되었는지 쉽게 알 수 있습니다. 이 경우 봉합사를 제거하고 다른 위치에 놓습니다.
이 메서드에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 그립 강도 또는 러닝머신 지구력과 같은 근육 질환의 마우스 모델에서 사용되는 표준 기능성 검사에 는 적용되지 않습니다. 그러나, 이종이식 기능의 전기 생리학적 평가는 여전히 수행될 수 있다. 이종이식 이식으로부터 유발된 힘 측정을 기록할 수 있으며, 비메트릭 칼슘 염료및 전기자극이 가중된 이종이식에서 단일 효소 절연 근섬유가 칼슘 역학 을 연구하는데 사용될 수있다 8. 이 모형에 있는 또 다른 본질적인 도전은 인간 조직을 취득하고 일하는 것이 어려울 수 있다는 것입니다. 모든 실험실이 신선한 근육 생검에 쉽게 접근 할 수있는 것은 아니지만 부검 조직에서 수행 된 이종이식은 약 48 시간 후 성공적으로 이식 할 수 있으며,이 조직은 일부 사람들에게 쉽게 얻을 수 있습니다. 실험실8. 그것은 또한 인간의 조직에 유전자 발현을 조작 하는 도전, 질병의 표준 마우스 모델을 사용 하 여 연구원은 쉽게 사용할 수 있는 마우스 유전 도구의 과다를 사용할 수 있는 반면.
이 이종이식 모델의 강점은 연구원이 생체 내에서 인간의 근육을 연구할 수 있다는 것입니다. 조직 배양은 인간 근육의 세포 및 분자 생물학을 연구하기 위하여 광범위하게 이용되었습니다. 그러나, 이러한 단기, 전 생체 내 연구는 항상 생체 내에서 기능성 근육을 근사화하지는 않는다. 그러나, 한 가지 주의할 점은 재생 과정 동안 호스트 마우스 성분의 기여로 인해 이종이식 생물학 및 기능이 인간의 근육과 얼마나 근접하는지 결정하는 것이 어렵다는 것입니다. 예를 들어, 인간 및 마우스 신경근육 접합부(NMJs)는 형태학적으로 구별되며, 인간 및 마우스 NMJs13의시냅스 프로테오메 사이에 상당한 차이가 있다. 이종이식은 마우스 숙주에게 의해 자극되기 때문에 인간 이종이식에 고유한 생물학적 변화를 초래할 수 있습니다.
향후 연구에서, 이 골격 근 이종이식 방법은 인간의 근육 세포 생물학을 더 잘 이해하고 현재 동물 모델이 부족한 희귀 또는 획득 된 근육 질환에 대한 새로운 모델을 개발하는 데 사용될 수 있습니다. 우리는 이것이 이 질병을 위한 치료 발달에 중요한 유익한 충격이 있을 것이라는 점을 예상합니다.
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Disclosures
저자는 그들이 경쟁 적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 작품은 근염 협회와 피터 벅 재단에 의해 지원되었다. 우리는 이종이식 외과 기술에 있는 그녀의 전문지식을 공유하고 훈련을 공유해 준 Yuanfan 장 박사에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm x 15 mm Petri dish | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| 2-Methylbutane | Fisher | O3551-4 | |
| 20 mm x 30 mm micro cover glass | VWR | 48393-151 | |
| Animal Weighing Scale | Kent Scientific | SCL- 1015 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution | Corning, Cellgro | 30-004-CI | |
| AutoClip System | F.S.T | 12020-00 | |
| Castroviejo Needle Holder | F.S.T | 12565-14 | |
| Chick embryo extract | Accurate | CE650TL | |
| CM1860 UV cryostat | Leica Biosystems | CM1860UV | |
| Coplin staining jar | Thermo Scientific | 19-4 | |
| Dissection Pins | Fisher Scientific | S13976 | |
| Dry Ice - pellet | Fisher Scientific | NC9584462 | |
| Embryonic Myosin antibody | DSHB | F1.652 | recommended concentration 1:10 |
| Ethanol | Fisher Scientific | 459836 | |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30071.01 | |
| Fiber-Lite MI-150 | Dolan-Jenner | Mi-150 | |
| Forceps | F.S.T | 11295-20 | |
| Goat anti-mouse IgG1, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21121 | recommended concentration 1:500 |
| Goat anti-mouse IgG2b, AlexaFluor 594 | Invitrogen | A-21145 | recommended concentration 1:500 |
| Gum tragacanth | Sigma | G1128 | |
| Hams F-10 Medium | Corning | 10-070-CV | |
| Histoacryl Blue Topical Skin Adhesive | Tissue seal | TS1050044FP | |
| Human specific lamin A/C antibody | Abcam | ab40567 | recommended concentration 1:50-1:100 |
| Human specific spectrin antibody | Leica Biosystems | NCLSPEC1 | recommended concentration 1:20-1:100 |
| Induction Chamber | VetEquip | 941444 | |
| Iris Forceps | F.S.T | 11066-07 | |
| Irradiated Global 2018 (Uniprim 4100 ppm) | Envigo | TD.06596 | Antibiotic rodent diet to protect again respiratory infections |
| Isoflurane | MWI Veterinary Supply | 502017 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | surgical wipes |
| Mapleson E Breathing Circuit | VetEquip | 921412 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412 | |
| Mobile Anesthesia Machine | VetEquip | 901805 | |
| Mouse on Mouse Basic Kit | Vector Laboratories | BMK-2202 | mouse IgG blocking reagent |
| Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| NAIR Hair remover lotion/oil | Fisher Scientific | NC0132811 | |
| NOD-Rag1null IL2rg null (NRG) mice | The Jackson Laboratory | 007799 | 2 to 3 months old |
| O.C.T. Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| Oxygen | Airgas | OX USPEA | |
| PBS (phosphate buffered saline) buffer | Fisher Scientific | 4870500 | |
| Povidone Iodine Prep Solution | Dynarex | 1415 | |
| ProLong™ Gold Antifade Mountant | Fisher Scientific | P10144 (no DAPI); P36935 (with DAPI) | |
| Puralube Ophthalmic Ointment | Dechra | 17033-211-38 | |
| Rimadyl (carprofen) injectable | Patterson Veterinary | 10000319 | surgical analgesic, administered subcutaneously at a dose of 5 mg/kg |
| Scalpel Blades - #11 | F.S.T | 10011-00 | |
| Scalpel Handle - #3 | F.S.T | 10003-12 | |
| Stereo Microscope | Accu-scope | 3075 | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Suture, Synthetic, Non-Absorbable, 30 inches long, CV-11 needle | Covidien | VP-706-X | |
| 1ml Syringe (26 gauge, 3/8 inch needle) | BD Biosciences | 329412 | |
| Trimmer | Kent Scientific | CL9990-KIT | |
| Vannas Spring Scissors, 8.0 mm cutting edge | F.S.T | 15009-08 | |
| VaporGaurd Activated Charcoal Filter | VetEquip | 931401 | |
| Wound clips, 9 mm | F.S.T | 12022-09 |
References
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