Summary
Komplekse menneskelige sykdommer kan være utfordrende å modellere i tradisjonelle laboratorie modellsystemer. Her beskriver vi en kirurgisk tilnærming til modell menneskelige muskel sykdom gjennom transplantasjon av menneskelige skjelettlidelser muskel biopsier inn immunodeficient mus.
Abstract
Behandlingseffekter observert i dyrestudier ofte ikke sammenfattet i kliniske studier. Selv om dette problemet er mangesidig, er en årsak til denne feilen bruk av utilstrekkelige laboratorie modeller. Det er utfordrende å modellere komplekse menneskelige sykdommer i tradisjonelle laboratorie organismer, men dette problemet kan omgås gjennom studiet av menneskelig xenotransplantater. Den kirurgiske metoden vi beskriver her gir mulighet for etablering av menneskelige skjelettlidelser muskel xenotransplantater, som kan brukes til å modellere muskel sykdom og å gjennomføre prekliniske terapeutisk testing. Under en institusjonell gjennomgang Board (IRB)-godkjent protokoll, skjelettlidelser muskel prøver er ervervet fra pasienter og deretter transplantert inn NOD-Rag1nullIL2rγnull (NRG) vert mus. Disse musene er ideelle verter for transplantasjon studier på grunn av deres manglende evne til å gjøre modne lymfocytter og er således ikke i stand til å utvikle celle-mediert og humoral adaptive immunresponser. Host mus er anesteserte med isoflurane, og musen tibialispuls fremre og extensor senen Longus musklene er fjernet. Et stykke av Human muskelen er så oppstilt inne det tom emballasje tibial avlukke og sutured å det proksimale og tømme sener av det peroneus Longus muskelen. Den xenografted muskelen er spontant vascularized og innervated av musen vert, noe som resulterer i robust generert menneskelig muskel som kan tjene som en modell for prekliniske studier.
Introduction
Det har blitt rapportert at bare 13,8% av alle narkotika utviklingsprogrammer gjennomgår kliniske studier er vellykket og føre til godkjent behandling1. Selv om denne suksessen rate er høyere enn 10,4% tidligere rapportert2, er det fortsatt betydelige rom for forbedring. En tilnærming for å øke suksessraten for kliniske studier er å forbedre laboratorie modeller som brukes i prekliniske forskning. Food and Drug Administration (FDA) krever dyrestudier for å vise behandlingseffekt og vurdere toksisitet før fase 1-kliniske studier. Det er imidlertid ofte begrenset overensstemmelse i behandlingsresultatene mellom dyrestudier og kliniske studier3. I tillegg, behovet for prekliniske dyrestudier kan være en umulig barriere for terapeutisk utvikling i sykdommer som mangler en akseptert dyremodell, som ofte er tilfelle for sjeldne eller sporadiske sykdommer.
En måte å modellere menneskelig sykdom er ved å transplantere menneskelig vev i immunodeficient mus for å generere xenotransplantater. Det er tre viktige fordeler ved xenograft modeller: for det første kan de recapitulate de komplekse genetiske og epigenetic unormalt som finnes i menneskelig sykdom som kanskje aldri kan reproduseres i andre dyremodeller. For det andre kan xenotransplantater brukes til å modellere sjeldne eller sporadiske sykdommer hvis pasientprøvene er tilgjengelige. For det tredje, xenotransplantater modellere sykdommen innenfor et komplett in vivo-system. Av disse grunner hypothesize vi at behandlingseffekten resulterer i xenograft modeller er mer sannsynlig å oversette til studier hos pasienter. Human svulst xenotransplantater har allerede blitt utnyttet til å utvikle behandlinger for vanlige kreftformer, inkludert flere myelom, samt personlig behandling for individuelle pasienter4,5,6, 7i.
Nylig har xenotransplantater blitt brukt til å utvikle en modell av menneskelig muskel sykdom8. I denne modellen, menneskelige muskel biopsi prøvene er transplantert inn i hindlimbs av immunodeficient NRG mus å danne xenotransplantater. Det transplantert Human myofibers dø, bortsett fra Human muskelen stilk celler gave inne det xenograft heretter utfolde og skille ut i ny Human myofibers hvilke gjenbefolke det engrafted Human basal lamina. Derfor, den genereres myofibers i disse xenotransplantater er helt menneskelig og er spontant revascularized og innervated av musen verten. Viktigere, fascioscapulohumeral muskuløse dystrofi (FSHD) pasient muskel vev transplantert til mus viser viktige funksjoner i den menneskelige sykdommen, nemlig uttrykk for DUX4 transkripsjon faktor8. FSHD er forårsaket av overuttrykte av DUX4, som er epigenetically taushet i normal muskel vev9,10. I FSHD xenograft-modellen har behandling med en DUX4-spesifikk morpholino vist å kunne undertrykke DUX4 uttrykk og funksjon, og kan være et mulig terapeutisk alternativ for FSHD pasienter11. Disse resultatene viser at menneskelige muskel xenotransplantater er en ny tilnærming til modell menneskelige muskel sykdom og teste potensielle terapier i mus. Her beskriver vi i detalj den kirurgiske metoden for å skape menneskelige Skjelettmuskel xenotransplantater i immunodeficient mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
All bruk av forsknings prøver fra forsøkspersoner ble godkjent av Johns Hopkins institusjonelle Review Board (IRB) for å beskytte rettighetene og velferden til deltakerne. Alle dyr eksperimenter ble godkjent av Johns Hopkins University institusjonelle Animal Care og use Committee (IACUC) i samsvar med National Institutes of Health (NIH) guide for omsorg og bruk av Laboratoriedyr. Mann NOD-Rag1nullIL2rγnull (NRG) vert mus (8-12 uker gammel) brukes til å utføre xenograft eksperimenter. Disse musene er plassert i ventilerte stativer og gis HEPA-filtrert, herdet, og fuktet luft samt omvendt osmose filtrert hyperchlorinated vann. Mus leveres vann og en bestrålt antibiotika diett (tabell av materialer) ad lib, og anlegget gir 14 h av lys til 10 h av mørke som styres av sentrale timer.
1. forberedelse av utstyret
- Skaff deg NOD-Rag1nullIL2r γnull (NRG) mus, 8-12 ukers alder.
- Autoklav kirurgisk utstyr: saks, tang, nål holder, kirurgisk stiftemaskin (tabell over materialer), sår klips, kirurgiske kluter (tabell over materialer) og beger (figur 1a).
- Forbered 50 mL av muskel medier (20% Foster storfe serum, 2% Chick embryo ekstrakt, 1% antibiotika/antimykotisk i skinke F10 medium). Oppbevar alle kjemikalier/medikamenter/løsninger brukes til kirurgi ved romtemperatur med mindre annet er angitt i protokollen.
- Forbered en 1 mL sprøyte med en 26 G nål som er 3/8 tommer lang inneholdende 2 mg/mL smertestillende (tabell av materialer), og plasser på isen. Smertestillende kan fortynnes til riktig konsentrasjon ved hjelp av sterilt fosfat bufret saltvann (PBS).
2. kirurgisk forberedelse
- Få en menneskelig muskel biopsi under en IRB-godkjent protokoll fra pasienter der musklene viser styrke > 4-/5 på MRC (Medical Research Council) skala12. Plasser forskningen prøven i en 100 mm x 15 mm Petri parabolen inneholder muskel medier.
Merk: MRC-skalaen brukes i klinisk praksis som en vurdering av muskelstyrke med 0 som ikke viser noen sammentrekning, 5 som viser normal effekt, og 4 (4-til 4 +) som viser bevegelse mot motstand12. Vi har funnet at musklene med mild til moderat svakhet (MRC > 4-/5) vanligvis viser sykdoms patologi, men er ikke mye erstattet av fettvev eller fibrose, som begge hindrer xenograft regenerering. Når det gjelder obduksjon vev der en nylig MRC score ikke er tilgjengelig, muskel kvalitet kan nås via brutto observasjon. Muskel biopsier som er blek rosa i utseende eller har store områder av fettvev er sannsynligvis ikke xenograft vellykket. - Fjern eventuelle gjenværende konseptet eller fettvevet fra prøven med kirurgisk saks ved hjelp av et stereo mikroskop og lyskilde for å hjelpe til med visualisering.
- Analysere muskelen biopsi i ca 7 mm x 3 mm x 3 mm stykker med kirurgisk saks ved hjelp av stereo mikroskop og en lyskilde. Sørg for at fibrene er anordnet lengderetningen i prøven.
- Plasser Petri parabolen inneholder dissekert muskel på is. I gjennomsnitt holdes xenotransplantater i Media i 4 timer mens operasjonene utføres. Men biopsier har vært lagret i media for 24 h før xenografting, og denne forsinkelsen ikke ut til å negativt påvirke transplantasjon eller regenerering.
- Plasser syntetiske, ikke-absorberbare sting (tabell av materialer) i en 100 mm x 15 mm Petri parabolen inneholder 70% etanol.
- Sett opp en dual Procedure anestesi krets: ordne Mapleson E puste kretsen på stereomikroskopet og plassere induksjon kammeret i et biosafety kabinett (figur 1a,B).
- Oppnå vekten av NRG-musen ved å plassere i et autoklaveres beger på en skala, og Overfør til induksjon kammeret. Indusere anestesi under 3% isoflurane. Når riktig bedøvelse dybde er oppnådd-som vurderes ved observasjon av respirasjonsfrekvens, muskel avslapning, og mangel på frivillig bevegelse-redusere fordamper innstillingen til 1,5% for resten av operasjonen.
- Overfør musen fra induksjon kammeret til Mapleson E puste kretsen og påfør øyen salve til øynene.
- Fjern hår overliggende tibialispuls fremre (TA) fra ankelen til kneet med en trimmer, etterfulgt av en 1 min behandling med hårfjerning lotion (tabell av materialer) (figur 2a).
- Desinfisere operasjonsstedet ved å skure beinet med povidon-jod løsning. Vask deretter bort de resterende povidon-jod med 70% etanol.
- Injiser musen subkutant med smertestillende, slik som karprofen, (tabell av materialer) med en dose på 5 mg/kg.
3. Xenograft kirurgi
- Tape ned beinet og lage en rett snitt over tibilalis fremre (TA) muskel med saks og Iris tang med opprinnelse i de ikke-gående sener og avslutte under kneet (figur 2b).
- Skill huden fra muskelen ved hjelp av Butt disseksjon med kirurgisk saks.
- Skjær gjennom epimysium av TA muskelen med saks starter ved sene og slutter ved kneet.
Merk: Dette er en veldig overfladisk kutt (mindre enn 0,5 mm; Figur 2b, svart stiplet linje), og den underliggende ta bør ikke være skadet i prosessen da dette ville gjøre fjerningen mer utfordrende. Når den utføres riktig, vil muskel fibrene synlig slappe av. - Skjær den klare sene av TA med saks, grip senen med Iris tang, og trekk TA opp mot kneet (figur 2C).
- Skjær den klare sene av extensor senen Longus (EDL) med saks og trekk EDL opp mot kneet (figur 2D). Når proksimale sene av peroneus Longus (PL) muskelen er synlig, Fjern EDL med saks (figur 2D, grønn stiplet linje).
- Fjern TA med saks (figur 2D, blå stiplet linje) og bruke en kirurgisk tørk fuktet med PBS og lett trykk for å oppnå Hemostase (figur 2e).
- Thread en Sutur gjennom proksimale peroneus Longus (PL) sene og trim, etterlot ca 1,5 tommer av tråden på hver side av senen (figur 2F).
- Utfør den første halvdelen av en to-hånds kirurgisk kvadrat knute, men ikke stram: Dette vil danne en sirkel. Plasser en xenograft i denne sirkelen og stram til løkken for å feste xenograft. Fullfør den andre halvdelen av kvadrat knuten (figur 2g,H). Dette vil Sutur xenograft til proksimale sene av PL.
- Thread Sutur gjennom det kan være en sene og gjenta firkantet knute teknikk fra trinn 3,8 for å knytte xenograft til den ikke--sene senen (figur 2h,I).
Merk: Den midtre tarsal arterien og venen kan ligge i nærheten av eller på toppen av den av de like sene i PL. Ikke plasser sting gjennom eller rundt disse fartøyene. Det er lett å si om en Sutur har blitt feil plassert som fartøy vil Blanch eller blø. Hvis dette skjer, fjerner du Sutur og plasserer det på et annet sted. - Trekk huden over xenografted muskel, forsegle med kirurgisk lim, og plasser 2-3 kirurgiske stifter over snittet (figur 2J).
- Sted musen inne en feilfri bur opp på en oppvarmet pute å komme seg. Monitor musen til fullt bevisst og med jevne mellomrom i løpet av de neste dagene for tegn på lokal systemisk infeksjon og for å sikre at operasjonsstedet ikke er gjenåpnet.
Merk: En enkelt dose av smertestillende som beskrevet i trinn 2,11 er vanligvis tilstrekkelig for smertelindring. Imidlertid bør musene også overvåkes for vedvarende smerter (f. eks halthet, ruffled pels, bøyd holdning), og, om nødvendig, re-legemidlene med smertestillende på 24 h post-operativt.
4. Xenograft samling
Merk: Xenotransplantater er vanligvis samlet inn mellom 4 og 6 måneder etter operasjonen. Imidlertid har samlinger blitt utført opp til 12 måneder etter operasjonen.
- Plasser et dekket beger med 200 mL 2-methylbutane i en eske som inneholder tørr is i minst 30 minutter før xenograft oppsamling.
- Indusere anestesi under 3% isoflurane i induksjon kammer. Når riktig bedøvelse dybde er oppnådd, redusere fordamper innstillingen til 1,5% for resten av operasjonen.
- Overfør musen fra induksjon kammeret til Mapleson E puste kretsen arrangert på et stereo mikroskop.
- Fjern hår overliggende tibialispuls fremre fra ankelen til kneet med en trimmer og hårfjerning lotion. Sting holde xenograft på plass kan sees gjennom huden (figur 3a).
- Tape ned beinet og bruke saks og Iris tang for å åpne huden over xenograft til begge sting er synlige (figur 3b). Skin overliggende xenograft kan fjernes som vist for å gjøre fjerning av xenograft enklere.
- Bruk en skalpell å skjære mellom xenograft og Tibia (figur 3b, pilen betegner første området og retning av snitt). Dette vil frigjøre den ene siden av xenograft.
- Bruk en skalpell til å skjære mellom PL muskelen og gastrocnemius muskelen (figur 3c, incision langs epimysium merket med pil). PL vil bli fjernet med xenograft.
- Skjær under den ikke-Sutur og gjennom den, den ikke-sene senen av PL (figur 3D, Skjær langs stiplet linje).
- Fjern xenograft og PL ved å ta tak i Sutur med Iris tang og avlede den mot kneet mens du bruker saks til å skjære den bort fra den underliggende muskelen (figur 3e).
- Klipp over proksimale Sutur med saks for å fjerne xenograft og PL (figur 3F, Skjær langs stiplet linje i 3e).
- Plasser prøven på et lite stykke papp eller plast, og PIN så nær sting som mulig. Mens låsing prøven, forsiktig strekke muskelen for å sikre at fiber orientering opprettholdes under snap frysing prosessen. Etter at pinnene er sikkert på plass, skyver du muskelen opp pinnene slik at den hviler like over papp.
Merk: Alternativt kan den ene enden av xenograft monteres i tragacanth på en kork, eller den kan senkes helt i optimal skjære temperatur (O.C.T.) sammensatte i en cryomold. Med forsiktighet, kan muskel konformasjon beholdes med begge metoder. - Smekk fryse xenograft i pre-avkjølt 2-methylbutane.
- Store xenograft ved-80 ° c.
- Umiddelbart etter xenograft samling, euthanize mus i henhold til American veterinary Medical Association retningslinjer:
- Plasser mus i et forseglet kammer med et passende renovasjons system for avfalls gass. Bruk isoflurane ved en konsentrasjon på 3-4% for å indusere anestesi.
- Når den aktuelle bedøvelse dybden er oppnådd-som vurderes ved observasjon av respirasjonsfrekvens, muskel avslapning, og mangel på frivillig bevegelse-øke fordamper innstillingen til 5% for å indusere død. La musene i kammeret for ytterligere 2 min etter pusten har opphørt. Døden bekreftes ved å observere at musene ikke klarer å utvinne innen 10 min etter overdosering av isoflurane.
- Til slutt utfører cervical forvridning på mus.
Merk: Når det gjelder bilateralt xenografted mus, kan kontralateral xenograft lagres for en senere samling. For å utføre en overlevelses samling, åpne huden overliggende xenograft med et enkelt rett snitt med kirurgisk saks, og fjern xenograft som beskrevet i trinn 4,6 til 4,10. Deretter lukker huden over den tomme tibial kupé med kirurgisk lim og stifter. Unn musen med smertestillende som beskrevet i trinn 2,11 og Plasser musen i rent bur på oppvarmet pad for å gjenopprette. Overvåk musen til fullt bevisst og med jevne mellomrom i løpet av de neste dagene for tegn på lokal systemisk infeksjon og for å sikre at operasjonsstedet ikke er gjenåpnet.
5. Xenograft immunhistokjemi
- Bruk en kryostaten til å skjære deler fra 10 til 12 μm fra de innsamlede xenograft til positivt ladet lysbilder (tabell av materialer).
- Fyll flekker jar med metanol og pre-Cool ved-20 ° c i 30 min.
- Plasser lysbildene i iskald metanol i 10 min for å fikse og permeabilize de xenograft seksjonene.
- Plasser lysbilder i flekker jar og vask 3x med fosfat bufret saltvann (PBS) i 5 min.
- Blokk med anti-mus IgG (tabell av materialer) for 2 h ved 4 ° c.
- Blot med primære antistoffer, slik som spectrin, Lamin A/C, og embryonale myosin (tabell over materialer) i PBS supplert med 2% geit serum over natten ved 4 ° c.
- Plasser lysbildene i en farge krukke og vask 3x med fosfat bufret saltvann (PBS) i 5 minutter.
- Blot med fluorescerende-Dye bøyd sekundære antistoffer (tabell av materialer) i PBS supplert med 2% geit serum for 1 time ved romtemperatur.
- Plasser lysbilder i flekker jar og vask 3x med fosfat bufret saltvann (PBS) i 5 min.
- Sted montering medium (tabell over materialer) over xenotransplantater seksjoner, sted dekkglass på toppen, og bruk neglelakk å forsegle dekkglass.
Figur 2: Xenograft kirurgi. (A) hår fjernes fra operasjonsstedet. (B) et snitt er gjort over tibialispuls FREMRE (ta). De klare sener i TA og extensor senen Longus (EDL) er merket med piler. Den svarte stiplede linjen viser hvor epimysium vil bli kuttet i trinn 3,3. (C) den mot-sene SENEN av ta er kuttet og muskelen er trukket opp til kneet. (D) SENEN av EDL er kuttet og EDL er trukket opp til kneet. Dette utsetter proksimale sene av peroneus Longus (PL) merket med en pil. Stiplede linjer indikerer hvor du skal skjære med saks for å fjerne EDL (grønn) og PL (blå). (E) EDL og ta er fjernet. (F) en Sutur plasseres gjennom proksimale SENE av pl. (G) xenograft er plassert i det tomme tibial kupé og sutured til proksimale pl sene ved hjelp av en to-hånd kirurgisk kvadrat knute. (H) en Sutur plasseres gjennom den klare SENEN til pl, merket med en pil, og en annen to-hånds kirurgisk kvadrat knute brukes til å Sutur xenograft til den klare sene. (I) xenograft er fullt transplantert og SUTURED til pl. (J) huden er lukket med kirurgisk lim. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3:4 måned Xenograft Collection. (A) hår fjernes fra operasjonsstedet. Sting er synlige under huden. (B) huden overliggende xenograft fjernes. Da xenograft er fanget med Iris tang på den Sutur og forsiktig trukket oppover. Starter på ankelen, en skalpell brukes til å skjære langs Tibia og frigjøre xenograft. Pilen viser begynnelsen av snittet langs Tibia. (C) ved å trekke gastrocnemius muskelen til siden, en svak hvit linje av epimysium skille peroneus LONGUS (pl) muskelen og gastrocnemius (vist av pilen) blir synlig. Bruk skalpell til å skjære langs denne linjen for å skille PL fra de andre etappe musklene. (D) høyre side av xenograft, og pl er nå fri fra de andre musklene i benet og er klar for fjerning. Den stiplede linjen viser hvor du skal skjære med kirurgisk saks for å begynne å fjerne xenograft og PL. (E) etter klipping under den fjerne Sutur, avlede xenograft mot kneet. Den stiplede linjen indikerer hvor du skal skjære med kirurgisk saks for å fjerne xenograft og PL fra tibial kupé. (F) det tomme tibial rommet med XENOGRAFT og pl ble fjernet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som demonstrert av Yuanfan Zhang et al., er denne kirurgiske protokollen en grei metode for å produsere menneskelige Skjelettmuskel xenotransplantater8. Generert xenotransplantater blir spontant innervated og viser funksjonell contractility. I tillegg, muskel xenografted fra FSHD pasienter viser endringer i genuttrykk observert hos FSHD pasienter8.
I vår erfaring, ca 7 av 8 xenotransplantater utført fra kontroll pasientens prøver vil vise vellykket muskel engraftment. En vellykket xenograft viser robust regenerering av humant myofibers som identifisert med humane spesifikke antistoffer (Figur 4). Positive embryonale myosin farging innenfor en andel av myofibers indikerer at regenerering prosessen er fortsatt pågående. I kontrast, dårlig kirurgisk teknikk eller en utilstrekkelig prøve kan føre til dårlig regenerering av muskelfibre (Figur 4).
Xenotransplantater utført fra en pasient diagnostisert med en idiopatisk inflammatorisk myopati (IIM) viser moderat antall generert menneskelig myofibers ved 4-og 6-måneders samlinger, og embryonale myosin farging vedvarer på 6 måneder (figur 5a). Inflammatoriske celler er til stede i xenograft som vist av H & E farging (figur 5a), og har blitt bekreftet med CD3, CD68, og andre immunologiske markører (data ikke vist). Xenotransplantater er stabile inne musa, og til 12-måneden samlingene ha blitt utført. Individuell myofiber størrelse er sammenlignbar mellom 4-og 6-måneders IIM-xenotransplantater og den opprinnelige IIM-pasienten biopsi (figur 5B). Sjeldne fibre som viser et tverrsnitt (CSA) større enn 3500 μm2 er observert i xenotransplantater, men ikke i IIM biopsi, noe som indikerer at noen myofibers i xenotransplantater kan regenerere til en CSA sammenlignbare i størrelse til sunn Myofibers (figur 5B ).
Figur 1: kirurgisk oppsett.
A) standard orientering av stereo mikroskop, Mapleson E puste krets, og kirurgiske verktøy under xenograft kirurgi. B) plassering av induksjon kammer i biosafety kabinett.
Figur 4: forventede positive og negative resultater.
Xenotransplantater samlet 4-måneders etter operasjonen viser god eller dårlig gjenfødelse er farget med menneskelig-spesifikke Lamin A/C (1:50) og menneskelig-spesifikke spectrin (1:20) og embryonale myosin (1:10) (tabell over materialer). Områder som indikeres av de hvite stiplede boksene, vises som høyere forstørrelses innsettinger. Scale bar: 200 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: representative Xenograft regenerering.
A) xenotransplantater (skissert med stiplede linjer) utført fra en pasient diagnostisert med en idiopatisk inflammatorisk MYOPATI (IIM) beiset med Hematoksylin og Eosin (H & E), menneskelig spesifikke Lamin A/C, og menneskelig spesifikke spectrin, viser myofiber formasjon i NRG-mus både på 4-og 6-måneders tidspunkter. Embryonale myosin flekker viser at regenerering pågår fortsatt på begge tidspunkt poeng. Skala bar: 200 μm. B) histogrammer som viser tverrsnitt område (CSA) av myofibers fra 4-og 6-måneders xenotransplantater og menneskelig biopsier fra en pasient diagnostisert med en idiopatisk inflammatorisk MYOPATI (IIM) og en sunn kontroll pasient. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Pasient-avledet xenotransplantater er en innovativ måte å modellere muskel sykdom og gjennomføre prekliniske studier. Metoden er beskrevet her for å lage skjelettlidelser muskel xenotransplantater er rask, grei, og reproduserbar. Ensidige operasjoner kan utføres i 15 til 25 minutter, eller bilateralt i 30 til 40 minutter. Bilaterale xenotransplantater kan gi ekstra eksperimentell fleksibilitet. For eksempel kan forskerne utføre lokaliserte behandling av en xenograft, med den andre venstre som en kontroll. NRG-mus er motstandsdyktig mot kirurgisk område infeksjon når den ligger i en patogen-fritt anlegg; i vår erfaring utføre mer enn 200 xenotransplantater, har vi aldri hatt en mus få en kirurgisk infeksjon. I tillegg er vert mus tolerere fjerning av TA og EDL veldig bra. Innen en time etter kirurgi, ensidig og bilateralt xenografted mus vil være aktiv og vandre rundt buret sitt, og selv stå opp på deres hindlimbs. Noen ganger ser vi noen fot dråpe i vert mus, men vanligvis bare etter en periode med inaktivitet, for eksempel hvis nylig vekket, og i løpet av minutter for å våkne beinet bruk vil være normal.
Det er flere kritiske trinn i protokollen. Først under fjerning av EDL og TA, er det svært viktig å ikke skade tilstøtende PL muskel eller dens sener. Dette kan unngås ved å nøye og korrekt identifisere plasseringen av alle de som er i ferd med å utføre, etter det første snittet over TA. I tillegg bør proksimale sene av PL identifiseres og godt synlig før fjerning av EDL (figur 2D). For det andre må sting plasseres gjennom sener og strammet fullt i en skikkelig to-hånds kirurgisk kvadrat knute. Xenotransplantater regenerere mer robust under spenning, og dette er bare oppnåelig hvis xenograft er bundet til PL sener og hvis sting ikke løsne post-operativt. Til slutt er det viktig å ikke skade eller bryte noen store blodkar forsyne foten. Spesielt kan den midtre tarsal arterien og venen ligge i nærheten av eller oppå den like sene av PL. Ikke plasser sting gjennom eller rundt disse fartøyene. Det er lett å si om en Sutur har blitt feil plassert som fartøy vil Blanch eller blø. Hvis dette skjer, fjerner du Sutur og plasserer det på et annet sted.
Denne metoden har flere begrensninger. Det er ikke mottagelig for standard funksjonell analyser som brukes i musen modeller av muskel sykdom, som grep styrke eller tredemølle utholdenhet. Elektrofysiologisk vurderinger av xenograft funksjon kan imidlertid fortsatt utføres. Målinger av fremkalt kraft kan registreres fra xenograft explants, og enkelt enzymatisk isolert myofibers fra xenotransplantater lastet med ratiometrisk kalsium fargestoffer og elektrisk stimulert kan brukes til å studere kalsium dynamikk8. En annen iboende utfordring i denne modellen er at å anskaffe og arbeide med menneskelig vev kan være vanskelig. Ikke alle laboratorier vil ha lett tilgang til fersk muskel biopsier, men det har vist seg at xenotransplantater utført fra obduksjon vev ca 48 timer etter obduksjon kan lykkes engraft, og dette vevet kan være lettere å få for noen laboratorier8. Det er også utfordrende å manipulere genuttrykk i menneskelig vev, mens forskere bruker standard musemodeller av sykdommen kan lett bruke overflod av musen genetiske verktøy tilgjengelig.
En styrke av denne xenograft modellen er at det tillater forskere å studere menneskelig muskel in vivo. Tissue kulturen har blitt brukt mye for å studere celle og molekylærbiologi av menneskelig muskel. Likevel, disse kortsiktige, ex vivo studier ikke alltid omtrentlige funksjonell muskel in vivo. Imidlertid er en påminnelse som er det utfordrende å finne ut hvor tett xenograft biologi og funksjon tilnærmet menneskelige muskler på grunn av bidrag av verten musen komponenter under regenererende prosessen. For eksempel er menneskelige og mus nevromuskulær knutepunkter (NMJs) morfologisk distinkte, og det er betydelig forskjeller mellom Synaptic proteom av menneskelig og mus NMJs13. Som xenotransplantater er innervated av musen vert, dette kan føre til biologiske endringer unik for den menneskelige xenotransplantater.
I fremtidige studier, denne skjelettlidelser muskel xenograft metoden kan brukes til å bedre forstå menneskelig muskel cellebiologi og å utvikle romanen modeller for sjeldne eller ervervet muskel sykdommer som for tiden mangler dyremodeller. Vi forventer at dette vil ha en betydelig fordelaktig innvirkning på terapeutisk utvikling for disse sykdommene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av The myositt Association og Peter Buck Foundation. Vi vil gjerne takke Dr. Yuanfan Zhang for å dele sin ekspertise og opplæring i xenograft kirurgisk teknikk.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm x 15 mm Petri dish | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| 2-Methylbutane | Fisher | O3551-4 | |
| 20 mm x 30 mm micro cover glass | VWR | 48393-151 | |
| Animal Weighing Scale | Kent Scientific | SCL- 1015 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution | Corning, Cellgro | 30-004-CI | |
| AutoClip System | F.S.T | 12020-00 | |
| Castroviejo Needle Holder | F.S.T | 12565-14 | |
| Chick embryo extract | Accurate | CE650TL | |
| CM1860 UV cryostat | Leica Biosystems | CM1860UV | |
| Coplin staining jar | Thermo Scientific | 19-4 | |
| Dissection Pins | Fisher Scientific | S13976 | |
| Dry Ice - pellet | Fisher Scientific | NC9584462 | |
| Embryonic Myosin antibody | DSHB | F1.652 | recommended concentration 1:10 |
| Ethanol | Fisher Scientific | 459836 | |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30071.01 | |
| Fiber-Lite MI-150 | Dolan-Jenner | Mi-150 | |
| Forceps | F.S.T | 11295-20 | |
| Goat anti-mouse IgG1, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21121 | recommended concentration 1:500 |
| Goat anti-mouse IgG2b, AlexaFluor 594 | Invitrogen | A-21145 | recommended concentration 1:500 |
| Gum tragacanth | Sigma | G1128 | |
| Hams F-10 Medium | Corning | 10-070-CV | |
| Histoacryl Blue Topical Skin Adhesive | Tissue seal | TS1050044FP | |
| Human specific lamin A/C antibody | Abcam | ab40567 | recommended concentration 1:50-1:100 |
| Human specific spectrin antibody | Leica Biosystems | NCLSPEC1 | recommended concentration 1:20-1:100 |
| Induction Chamber | VetEquip | 941444 | |
| Iris Forceps | F.S.T | 11066-07 | |
| Irradiated Global 2018 (Uniprim 4100 ppm) | Envigo | TD.06596 | Antibiotic rodent diet to protect again respiratory infections |
| Isoflurane | MWI Veterinary Supply | 502017 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | surgical wipes |
| Mapleson E Breathing Circuit | VetEquip | 921412 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412 | |
| Mobile Anesthesia Machine | VetEquip | 901805 | |
| Mouse on Mouse Basic Kit | Vector Laboratories | BMK-2202 | mouse IgG blocking reagent |
| Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| NAIR Hair remover lotion/oil | Fisher Scientific | NC0132811 | |
| NOD-Rag1null IL2rg null (NRG) mice | The Jackson Laboratory | 007799 | 2 to 3 months old |
| O.C.T. Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| Oxygen | Airgas | OX USPEA | |
| PBS (phosphate buffered saline) buffer | Fisher Scientific | 4870500 | |
| Povidone Iodine Prep Solution | Dynarex | 1415 | |
| ProLong™ Gold Antifade Mountant | Fisher Scientific | P10144 (no DAPI); P36935 (with DAPI) | |
| Puralube Ophthalmic Ointment | Dechra | 17033-211-38 | |
| Rimadyl (carprofen) injectable | Patterson Veterinary | 10000319 | surgical analgesic, administered subcutaneously at a dose of 5 mg/kg |
| Scalpel Blades - #11 | F.S.T | 10011-00 | |
| Scalpel Handle - #3 | F.S.T | 10003-12 | |
| Stereo Microscope | Accu-scope | 3075 | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Suture, Synthetic, Non-Absorbable, 30 inches long, CV-11 needle | Covidien | VP-706-X | |
| 1ml Syringe (26 gauge, 3/8 inch needle) | BD Biosciences | 329412 | |
| Trimmer | Kent Scientific | CL9990-KIT | |
| Vannas Spring Scissors, 8.0 mm cutting edge | F.S.T | 15009-08 | |
| VaporGaurd Activated Charcoal Filter | VetEquip | 931401 | |
| Wound clips, 9 mm | F.S.T | 12022-09 |
References
- Wong, C. H., Siah, K. W., Lo, A. W. Estimation of clinical trial success rates and related parameters. Biostatistics. 0, 1-14 (2018).
- Hay, M., Thomas, D. W., Craighead, J. L., Economides, C., Rosenthal, J. Clinical development success rates for investigational drugs. Nature Biotechnology. 32, 40-51 (2014).
- Perel, P., et al. Comparison of treatment effects between animal experiments and clinical trials: systematic review. BMJ. 334, 1-6 (2007).
- Rubio-Viqueira, B., Hidalgo, M. Direct in vivo xenograft tumor model for predicting chemotherapeutic drug response in cancer patients. Clinical Pharmacology Therapeutics. 85, 217-221 (2009).
- Roberts, K. G., et al. Targetable Kinase-Activating Lesions in Ph-like Acute Lymphoblastic Leukemia. New England Journal of Medicine. 371, 1005-1015 (2014).
- Kim, J., et al. GDF11 Controls the Timing of Progenitor Cell Competence in Developing Retina. Science. 308, 1927-1930 (2005).
- Sako, D., et al. Characterization of the ligand binding functionality of the extracellular domain of activin receptor type IIB. Journal of Biological Chemisty. 285, 21037-21048 (2010).
- Zhang, Y., et al. Human skeletal muscle xenograft as a new preclinical model for muscle disorders. Human Molecular Genetics. 23, 3180-3188 (2014).
- Gabellini, D., Green, M. R., Tupler, R. Inappropriate Gene Activation in FSHD : A Repressor Complex Binds a Chromosomal Repeat Deleted in Dystrophic Muscle. Cell. 110, 339-348 (2002).
- Lemmers, R. J. L. F., et al. A Unifying Genetic Model for Facioscapulohumeral Muscular Dystrophy. Science. 329, 1650-1654 (2010).
- Chen, J. C. J., et al. Morpholino-mediated Knockdown of DUX4 Toward Facioscapulohumeral Muscular Dystrophy Therapeutics. Molecular Therapy. 24, 1405-1411 (2016).
- Medical Research Council. Aids to the investigation of the peripheral nervous system. , Her Majesty’s Stationary Office. London. (1943).
- Jones, R. A., et al. Cellular and Molecular Anatomy of the Human Neuromuscular Junction. Cell Reports. 21, 2348-2356 (2017).
