Summary
Komplexa mänskliga sjukdomar kan vara utmanande att modellera i traditionella laboratoriemodell system. Här beskriver vi en kirurgisk metod för att modellera människans muskelsjukdom genom transplantation av mänskliga skelettmuskulaturen biopsier till immunobristfällig möss.
Abstract
Behandlingseffekter som observerats i djurstudier misslyckas ofta att rekapitueras i kliniska prövningar. Även om detta problem är mångfacetterat, en orsak till detta misslyckande är användningen av otillräckliga laboratorie modeller. Det är utmanande att modellera komplexa mänskliga sjukdomar i traditionella laboratorieorganismer, men denna fråga kan kringgås genom studiet av mänskliga xenografts. Den kirurgiska metod som vi beskriver här gör det möjligt för skapandet av mänskliga skelettmuskulaturen xenografts, som kan användas för att modellera muskelsjukdom och utföra prekliniska terapeutiska tester. Enligt en institutionell granskningsnämnd (IRB)-godkänt protokoll, skelettmuskulaturen prover förvärvas från patienter och sedan transplanteras in NOD-Rag1NullIL2rγNull (NRG) värd möss. Dessa möss är idealiska värdar för transplantations studier på grund av deras oförmåga att göra mogna lymfocyter och är därmed oförmögna att utveckla Cell-medierad och humorala adaptiva immunsvar. Värd möss bedövas med isofluran, och musen tibialis anterior och extensor digitorum longus muskler avlägsnas. En bit av mänsklig muskel placeras sedan i den tomma Tibia facket och sys till proximala och distala senor i peroneus longus muskeln. Den xenografted muskeln är spontant vaskulariserad och innerveras av mus värden, vilket resulterar i robust regenererad mänsklig muskel som kan fungera som en modell för prekliniska studier.
Introduction
Det har rapporterats att endast 13,8% av alla läkemedelsutveckling program som genomgår kliniska prövningar är framgångsrika och leda till godkända terapier1. Även om denna framgång är högre än 10,4% tidigare rapporterat2, det finns fortfarande betydande utrymme för förbättringar. En metod för att öka andelen framgångsrika kliniska prövningar är att förbättra laboratorie modeller som används i preklinisk forskning. Food and Drug Administration (FDA) kräver djurstudier för att Visa behandlingseffekt och bedöma toxicitet före fas 1 kliniska prövningar. Emellertid, det finns ofta begränsad konkordans i behandlingsresultat mellan djurstudier och kliniska prövningar3. Dessutom kan behovet av prekliniska djurstudier vara ett oöverstigligt hinder för terapeutisk utveckling vid sjukdomar som saknar en accepterad djurmodell, vilket ofta är fallet för sällsynta eller sporadiska sjukdomar.
Ett sätt att modellera människans sjukdom är genom att transplanterar mänsklig vävnad till immunobristfälliga möss för att generera xenografter. Det finns tre viktiga fördelar med xenograft modeller: för det första kan de recapitulate de komplexa genetiska och epigenetiska avvikelser som finns i mänskliga sjukdomar som aldrig kan reproduceras i andra djurmodeller. För det andra kan xenografter användas för att modellera sällsynta eller sporadiska sjukdomar om patientprover finns tillgängliga. För det tredje, xenograft modellera sjukdomen inom ett komplett in vivo-system. Av dessa skäl, vi hypotes om att behandlingseffekt resultat i xenograft modeller är mer benägna att översätta till prövningar hos patienter. Human tumör xenograft har redanframgångsrikt utnyttjas för att utveckla behandlingar för vanliga cancerformer, inklusive multipelt myelom, samt individanpassade terapier för enskilda patienter4,5,6, 7.
Nyligen har xenograft använts för att utveckla en modell av mänsklig muskelsjukdom8. I denna modell, mänskliga muskelbiopsi prover transplanteras in i bakbenen av immunobristfällig NRG möss att bilda xenografts. Den transplanterade humana myofibers dör, men mänskliga muskelstamceller som finns i xenograft senare expandera och differentiera till nya humana myofibers som återbefolkar den inympade mänskliga basal lamina. Därför är regenererad myofibers i dessa xenograft helt mänskliga och spontant revaskularized och innerveras av mus värden. Viktigt, fascioscapulohumeral muskeldystrofi (FSHD) patientens muskelvävnad transplanteras till möss recapitulates viktiga egenskaper hos den mänskliga sjukdomen, nämligen uttrycket av DUX4 transkriptionsfaktorn8. Fshd orsakas av överuttryck av DUX4, som är epigenetiskt tystas i normal muskelvävnad9,10. I fshd xenograft-modellen har behandling med en DUX4-specifik morfolino visat sig framgångsrikt förtränga DUX4 uttryck och funktion, och kan vara ett potentiellt terapeutiskt alternativ för fshd-patienter11. Dessa resultat visar att humana muskelxenografter är en ny metod för att modellera människans muskelsjukdom och testa potentiella terapier hos möss. Här beskriver vi i detalj den kirurgiska metoden för att skapa mänskliga skelettmuskulaturen xenograft hos immunobristfälliga möss.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
All användning av forskning prover från försökspersoner godkändes av Johns Hopkins institutionella Review Board (IRB) för att skydda rättigheter och välfärd för deltagarna. Alla djur experiment godkändes av Johns Hopkins University institutionella djuromsorg och användning kommittén (IACUC) i enlighet med National Institutes of Health (NIH) Guide för vård och användning av försöksdjur. Man nickar-Rag1NullIL2rγNull (NRG) värd möss (8-12 veckor gamla) används för att utföra xenograft experiment. Dessa möss är inhysta i ventilerade rack och ges HEPA-filtrerad, tempererad och fuktad luft samt omvänd osmos filtreras hyperklorerade vatten. Möss tillhandahålls vatten och en bestrålad antibiotika diet (tabell över material) annons libitum, och anläggningen ger 14 h ljus till 10 h mörkt som styrs av central timer.
1. förberedelse av utrustning
- Förvärva NOD-Rag1NullIL2r γnull (NRG) möss, 8-12 veckors ålder.
- Autoklav kirurgisk utrustning: sax, pinps, nål hållare, kirurgisk häftapparat (tabell över material), sår klämmor, kirurgiska våtservetter (tabell över material), och bägare (figur 1a).
- Förbered 50 mL av muskelvävnad media (20% foster bovint serum, 2% chick embryo extrakt, 1% antibiotika/antimycotic i skinka F10 medium). Förvara alla kemikalier/läkemedel/lösningar som används för kirurgi vid rumstemperatur om inte annat anges i protokollet.
- Förbered en 1 mL spruta med en 26 G nål som är 3/8 inches lång innehållande 2 mg/mL smärtstillande (tabell över material), och placera på is. Den analgetiska kan spädas till rätt koncentration med hjälp av steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
2. kirurgisk beredning
- Skaffa en mänsklig muskelbiopsi under ett IRB-godkänt protokoll från patienter vars muskler visar styrka > 4-/5 på MRC (medicinsk forskningrådet) skala12. Placera forsknings provet i en 100 mm x 15 mm petriskål som innehåller muskelmedia.
Anmärkning: MRC-skalan används i klinisk praxis som en bedömning av muskelstyrka med 0 visar ingen kontraktion, 5 visar normaleffekt, och 4 (4-till 4 +) visar rörelse mot motstånd12. Vi har funnit att muskler med mild till måttlig svaghet (MRC > 4-/5) vanligtvis uppvisar sjukdoms patologi men inte i stor utsträckning ersätts av fettvävnad eller fibros, som båda hämmar xenograft-förnyelse. När det gäller obduktions vävnad där en nyligen MRC-poäng inte är tillgänglig, kan muskel kvalitet nås via brutto observation. Muskelbiopsier som är ljusrosa i utseende eller har stora områden av fettvävnad är inte sannolikt att xenograft framgångsrikt. - Ta bort eventuella kvarvarande fascian eller fettvävnad från preparatet med kirurgisk sax med hjälp av ett stereomikroskop och ljuskälla för att bistå visualisering.
- Dissekera muskelbiopsi i cirka 7 mm x 3 mm x 3 mm bitar med kirurgisk sax med hjälp av stereomikroskop och en ljuskälla. Se till att fibrerna är ordnade longitudinellt inom preparatet.
- Placera petriskål som innehåller dissekerade muskler på is. I genomsnitt är xenografterna hålls i media i 4 timmar medan operationer utförs. Emellertid, biopsier har lagrats i media för 24 h före xenografting, och denna försening inte verkar negativt påverka transplantation eller förnyelse.
- Placera syntetiska, icke-resorberbara suturer (tabell över material) i en 100 mm x 15 mm petriskål med 70% etanol.
- Ställ in en dual Procedure anestesi krets: ordna Mapleson E andnings krets på stereomikroskopet och placera induktions kammaren i ett biosäkerhetsskåp (figur 1a,B).
- Hämta vikten av NRG-musen genom att placera i en autoklaverad bägare på en skala, och överför till induktions kammaren. Inducera anestesi under 3% isofluran. När lämplig anestesidjup uppnås — som bedöms genom observation av andningsfrekvens, muskelavslappning, och brist på frivilliga rörelser — minska spridare inställningen till 1,5% för resten av operationen.
- Överför musen från induktions kammaren till Mapleson E andnings krets och tillämpa oftalmisk salva för ögonen.
- Ta bort hår överliggande tibialis anterior (TA) från fotled till knä med en trimmer, följt av en 1 min behandling med hårborttagning lotion (tabell över material) (figur 2A).
- Desinficera operationsområdet genom att svabbing benet med povidon-jod lösning. Tvätta sedan bort resterande povidon-jod med 70% etanol.
- Injicera musen subkutant med smärtstillande medel, såsom karprofen, (tabell över material) vid en dos på 5 mg/kg.
3. xenograft kirurgi
- Tejpa ner benet och gör ett rakt snitt över tibilalis främre (TA) muskler med sax och Iris pinpett med ursprung vid distala senor och slutar under knäet (figur 2b).
- Separera huden från muskler med hjälp av trubbiga dissektion med kirurgisk sax.
- Skär genom epimysium av TA-muskeln med sax som börjar vid senan och slutar vid knäet.
Anmärkning: Detta är ett mycket ytligt snitt (mindre än 0,5 mm; Figur 2b, svart streckad linje), och den underliggande ta bör inte skadas i processen eftersom detta skulle göra avlägsnande mer utmanande. När den utförs korrekt, kommer muskelfibrerna synligt slappna av. - Skär den distala senan av TA med sax, greppa senan med Iris pinps, och dra TA upp mot knäet (figur 2C).
- Skär distala senan av extensor digitorum longus (EDL) med sax och dra EDL upp mot knäet (figur 2D). När proximala senan av peroneus longus (PL) muskeln är synlig, ta bort EDL med sax (figur 2D, grön streckad linje).
- Ta bort TA med sax (figur 2D, blå streckad linje) och Använd en kirurgisk torka FUKTAD med PBS och lätt tryck för att uppnå hemostas (figur 2e).
- Gänga en sutur genom proximala peroneus longus (PL) senan och trim, lämnar cirka 1,5 tum av tråden på vardera sidan av senan (figur 2F).
- Utför den första halvan av en två-Handkirurgiska kvadrat Knut, men dra inte åt: detta kommer att bilda en cirkel. Placera ett xenograft i denna cirkel och dra åt slingan för att säkra xenograft. Fyll den andra halvan av kvadratknut (figur 2g,H). Detta kommer sutur xenograft till proximala senan av PL.
- Tråd sutur genom distala PL senan och upprepa kvadratknut teknik från steg 3,8 att knyta xenograft till distala senan (figur 2H,I).
Anmärkning: Den mediala böjd artär och ven kan ligga nära eller ovanpå distala senan av pl. Placera inte suturer genom eller runt dessa kärl. Det är lätt att avgöra om en sutur har felaktigt placerats som fartyg kommer blanchera eller blöda. Om detta inträffar, ta bort suturen och placera på en annan plats. - Dra huden över xenografted muskler, tätning med kirurgiskt lim, och placera 2-3 kirurgiska häftklamrar över snittet (figur 2J).
- Placera musen i en ren bur på en uppvärmd pad att återhämta sig. Övervaka musen tills den är fullt medveten och regelbundet under de närmaste dagarna för tecken på lokal systemisk infektion och för att säkerställa att operationsområdet inte återupptas.
Anmärkning: En engångsdos av smärtstillande medel som beskrivs i steg 2,11 är vanligtvis tillräckligt för smärtlindring. Men möss bör också övervakas för ihållande smärta (t. ex. hälta, ruggiga päls, böjd kroppshållning), och, om nödvändigt, redoseras med analgetikum vid 24 h postoperativt.
4. xenograft-samling
Anmärkning: Xenografts vanligtvis samlas mellan 4 till 6 månader efter operationen. Emellertid, samlingar har utförts upp till 12 månader efter operationen.
- Placera en täckt bägare som innehåller 200 mL 2-metylbutan i en låda som innehåller torris i minst 30 min före xenograft-samlingen.
- Inducera anestesi under 3% isofluran i induktions kammaren. När lämplig anestesidjup uppnås, minska spridare inställningen till 1,5% för resten av operationen.
- Överför musen från induktions kammaren till Mapleson E andnings krets arrangerade på ett stereomikroskop.
- Ta bort hår överliggande tibialis anterior från fotled till knä med en trimmer och hårborttagning lotion. De suturer som håller xenograft på plats kan ses genom huden (figur 3a).
- Tejpa ner benet och Använd saxar och Iris tång för att öppna huden över xenograft tills båda suturer är synliga (figur 3b). Huden överliggande xenograft kan tas bort som visat sig göra avlägsnande av xenograft lättare.
- Använd en skalpell för att skära mellan xenograft och skenbenet (figur 3b, pilen betecknar initial plats och riktning av snitt). Detta kommer att befria ena sidan av xenograft.
- Använd en skalpell för att skära mellan PL muskeln och gastrocnemius muskeln (figur 3c, jagncision längs epimysium märkt med pil). PL kommer att tas bort med xenograft.
- Skär under distala suturen och genom distala senan av PL (figur 3D, skär längs prickad linje).
- Ta bort xenograft och pl genom att gripa tag i suturen med Iris pincett och avböjning den mot knäet medan du använder sax för att skära bort den från den underliggande muskeln (figur 3e).
- Skär över den proximala suturen med sax för att ta bort xenograft och PL (figur 3F, skär längs prickad linje i 3e).
- Placera preparatet på en liten bit kartong eller plast, och stift så nära suturer som möjligt. När du fäster preparatet, försiktigt sträcka muskeln för att säkerställa att fiber orientering bibehålls under Snap frysning processen. När stiften är säkert på plats, Skjut muskeln upp stiften så det vilar precis ovanför kartongen.
Anmärkning: Alternativt kan ena änden av xenograft monteras i dragant på en kork, eller det kan vara nedsänkt helt i optimal skärtemperatur (O.C.T.) förening i en cryomold. Med försiktighet, muskel konformation kan behållas med båda metoderna. - Snap frysa xenograft i förkyld 2-metylbutan.
- Förvara xenograft vid-80 ° c.
- Omedelbart efter xenograft insamling, euthanize möss i enlighet med American veterinärmedicinska medicinsk Association riktlinjer:
- Placera möss i en sluten kammare med ett lämpligt rensnings system för avgaser. Använd isofluran vid en koncentration av 3-4% för att inducera anestesi.
- När lämplig anestesidjup uppnås — som bedöms genom observation av andningsfrekvens, muskelavslappning, och brist på frivillig rörelse — öka spridare inställningen till 5% att inducera döden. Lämna mössen i kammaren i ytterligare 2 minuter efter andningen har upphört. Döden verifieras genom att Observera att möss inte återhämta sig inom 10 min efter överdosering av isofluran.
- Slutligen, utför cervikal dislokation på möss.
Anmärkning: I fallet med bilateralt xenografted möss, den kontralaterala xenograft kan sparas för en senare samling. För att utföra en överlevnads kollektion, öppna huden överliggande xenograft med en enda rak klippa med kirurgisk sax, och ta bort xenograft som beskrivs i steg 4,6 till 4,10. Stäng sedan huden över det tomma tibial facket med hjälp av kirurgisk lim och häftklamrar. Behandla musen med analgetikum som beskrivs i steg 2,11 och Placera musen i ren bur på uppvärmd pad att återhämta sig. Övervaka musen tills den är fullt medveten och regelbundet under de närmaste dagarna för tecken på lokal systemisk infektion och för att säkerställa att operationsområdet inte återupptas.
5. xenograft immunohistokemi
- Använd en kryostat för att skära 10 till 12 μm sektioner från den insamlade xenograft på positivt laddade diabilder (tabell över material).
- Fyll färgning burk med metanol och pre-cool vid-20 ° c i 30 min.
- Placera diabilder i iskall metanol för 10 min att fixa och permeabilize den xenograft sektioner.
- Placera diabilder i färgning burk och tvätta 3x med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för 5 min.
- Block med anti-Mouse IgG (tabell över material) för 2 h vid 4 ° c.
- Blot med primära antikroppar, såsom spectrin, Lamin A/C, och embryonala myosin (tabell över material) i PBS kompletteras med 2% get serum över natten vid 4 ° c.
- Placera diabilder i en Färgnings burk och tvätta 3x med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i 5 min.
- Blot med fluorescerande-Dye konjugerade sekundära antikroppar (tabell över material) i PBS kompletteras med 2% get serum för 1 h vid rumstemperatur.
- Placera diabilder i färgning burk och tvätta 3x med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för 5 min.
- Placera monteringsmedium (tabell över material) över xenograft sektioner, placera täckslip ovanpå och Använd nagellack för att täta täckglådet.
Figur 2: xenograft-kirurgi. (A) hår avlägsnas från operationsstället. (B) ett snitt görs över tibialis ANTERIOR (ta). Den distala senor av TA och extensor digitorum longus (EDL) är markerade med pilar. Den svarta streckade linjen indikerar var epimysiumet ska klippas i steg 3,3. Cden distala SENAN i ta skärs och muskeln dras upp till knäet. Dsenan av EDL skärs och EDL dras upp till knäet. Detta exponerar den proximala senan av peroneus longus (PL) markerade med en pil. Streckade linjer indikerar var de ska klippas med sax för att ta bort EDL (grön) och PL (blå). E) EDL och ta tas bort. (F) en sutur placeras genom den proximala SENAN av pl. (G) xenograft placeras i det tomma Tibia facket och sys till proximala pl senan med hjälp av en två-hand kirurgisk kvadrat Knut. (H) en sutur placeras genom distala SENAN av pl, markerad med en pil, och en annan två-Handkirurgiska kvadrat Knut används för att sutur xenograft till distala senan. (I) xenograft är helt transplanterad och sys till pl. (J) huden är stängd med kirurgiskt lim. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3:4 månad xenograft samling. (A) hår avlägsnas från operationsstället. Suturer är synliga under huden. (B) huden överliggande xenograft avlägsnas. Då xenograft är grep med Iris pinps på distala suturen och försiktigt drog uppåt. Börjar vid fotleden, en skalpell används för att skära längs skenbenet och frigöra xenograft. Pilen visar början av snittet längs skenbenet. (C) genom att dra gastrocnemius muskeln åt sidan, en svag vit linje av epimysium separera peroneus LONGUS (pl) muskler och gastrocnemius (visas av pilen) blir synlig. Använd skalpell att skära längs denna linje för att separera PL från andra benet muskler. (D) den högra sidan av xenograft, och pl är nu fria från de andra musklerna i benet och är redo för avlägsnande. Den streckade linjen indikerar var man ska skära med kirurgisk sax för att börja ta bort xenograft och PL. (E) efter styckning under distala suturen, avleda xenograft mot knäet. Den streckade linjen indikerar var man ska skära med kirurgisk sax för att ta bort xenograft och PL från tibial facket. Fdet tomma Tibia-facket med xenograft och pl har avlägsnats. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som framgår av yuanfläkt Zhang et al., detta kirurgiska protokoll är en enkel metod för att producera mänskliga skelettmuskulaturen xenograft8. Regenererad xenograft blir spontant innerveras och Visa funktionell kontraktilitet. Dessutom, muskelxenografted från FSHD patienter recapitulates förändringar i genuttryck observerats i FSHD patienter8.
Enligt vår erfarenhet, cirka 7 av 8 xenograft utförs från kontroll patientprover kommer att Visa framgångsrik muskel inympelse. En lyckad xenograft visar robust förnyelse av humana myofibers som identifierats med humana specifika antikroppar (figur 4). Positiva embryonala myosin färgning inom en andel av myofibers indikerar att regenereringsprocessen fortfarande pågår. Däremot kan dålig kirurgisk teknik eller ett otillräckligt preparat leda till dålig regenerering av muskelfibrer (figur 4).
Xenografter utförs från en patient som diagnostiserats med en idiopatisk inflammatorisk myopati (IIM) visar måttlig antal regenererad humana myofibers vid 4-och 6-månaders samlingar, och embryonala myosin färgning kvarstår vid 6 månader (figur 5a). Inflammatoriska celler finns i xenograft som visas av H & E färgning (figur 5a), och har bekräftats med CD3, CD68, och andra immunologiska markörer (data visas inte). Xenografts är stabila inom musen, och upp till 12-månaders samlingar har utförts. Enskilda myofiber storlek är jämförbar mellan 4-och 6-månaders IIM xenograft och den ursprungliga IIM patientbiopsi (Figur 5b). Sällsynta fibrer som visar en tvärsnittsarea (CSA) större än 3500 μm2 observeras i xenograft men inte i IIM biopsi, vilket tyder på att vissa myofibers i xenograft kan regenerera till en CSA jämförbar i storlek med friska myofibers (Figur 5b ).
Figur 1: kirurgisk uppsättning.
A) standard orientering av stereomikroskop, Mapleson E andnings krets, och kirurgiska verktyg under xenograft kirurgi. B) placering av induktions kammare i biosäkerhetsskåp.
Figur 4: förväntade positiva och negativa resultat.
Xenografts samlas 4-månader efter operationen visar bra eller dålig förnyelse färgas med Human-specifika Lamin A/C (1:50) och Human-specifik spectrin (1:20) och embryonala myosin (1:10) (tabell över material). Regioner som anges med de vita streckade rutorna visas som högre förstorings skär. Skalstapel: 200 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: representativ xenograft-förnyelse.
A) xenografts (skisserat med streckade linjer) utförs från en patient som diagnostiserats med en idiopatisk inflammatorisk myopati (IIM) färgade med hematoxylin och eosin (H & E), mänskliga specifika Lamin A/C, och mänskliga specifika spectrin, visar myofiber formation inom NRG-möss vid både 4-och 6-månaders tidpunkter. Embryonal myosin färgning visar att förnyelse fortfarande pågår vid båda tidpunkter. Scale bar: 200 μm. B) histogram som skildrar tvärsnittsarea (CSA) av myofibers från 4-och 6-månaders xenograft och humana biopsier från en patient som diagnostiserats med en idiopatisk inflammatorisk myopati (IIM) och en hälsosam kontroll patient. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Xenograft från patient är ett innovativt sätt att modellera muskelsjukdomar och genomföra prekliniska studier. Den metod som beskrivs här för att skapa skelettmuskulaturen xenograft är snabb, okomplicerad, och reproducerbara. Ensidiga operationer kan utföras i 15 till 25 minuter, eller bilateralt i 30 till 40 minuter. Bilaterala xenograft kan ge ytterligare experimentell flexibilitet. Till exempel kan forskare utföra lokaliserad behandling av en xenograft, med den andra kvar som en kontroll. Den NRG möss är resistenta mot kirurgisk plats infektion när inrymt i en patogen fri anläggning; i vår erfarenhet av att utföra mer än 200 xenografts, har vi aldrig haft en mus förvärva en kirurgisk infektion. Dessutom, värd möss tolerera avlägsnande av TA och EDL mycket väl. Inom en timme efter operationen, unilateralt och bilateralt xenografted möss kommer att vara aktiv och gå runt sin bur, och även stå upp på sina bakbenen. Ibland ser vi några fot droppe i värd möss, men vanligtvis först efter en period av inaktivitet, såsom om nyligen vaknat, och inom några minuter av vakna benet användning kommer att vara normal.
Det finns flera kritiska steg i protokollet. Först, under avlägsnande av EDL och TA, det är mycket viktigt att inte skada intilliggande PL muskel eller dess senor. Detta kan undvikas genom att noggrant och korrekt identifiera placeringen av alla distala senor efter det initiala snittet över TA utförs. Dessutom bör den proximala senan av PL identifieras och tydligt synlig före avlägsnande av EDL (figur 2D). För det andra måste suturer placeras genom senor och dras åt helt i en ordentlig två-hand kirurgisk kvadrat Knut. Xenografts regenererar mer robust under spänning, och detta är endast kan erhållas om xenograft är bundna till pl senor och om suturer inte lossnar post-operativt. Slutligen, det är viktigt att inte skada eller bryta några större blodkärl som försörjer foten. I synnerhet, mediala böjd artär och ven kan ligga nära eller ovanpå distala senan av pl. Placera inte suturer genom eller runt dessa kärl. Det är lätt att avgöra om en sutur har felaktigt placerats som fartyg kommer blanchera eller blöda. Om detta inträffar, ta bort suturen och placera på en annan plats.
Denna metod har flera begränsningar. Det är inte mottaglig för standard funktionella analyser som används i musmodeller av muskelsjukdom, såsom greppstyrka eller löpband uthållighet. Elektrofysiologiska bedömningar av xenograft-funktionen kan dock fortfarande utföras. Evoked Force mätningar kan registreras från xenograft explants, och enstaka enzymatiskt isolerade myofibers från xenograft laddad med ratiometriska kalcium färgämnen och elektriskt stimulerad kan användas för att studera kalciumdynamik8. En annan inneboende utmaning i denna modell är att förvärva och arbeta med mänsklig vävnad kan vara svårt. Inte alla laboratorier kommer att ha enkel tillgång till färska Muskelbiopsier, men det har visats att xenograft utförs från obduktions vävnad cirka 48 timmar efter slakt kan framgångsrikt engraft, och denna vävnad kan vara lättare att få för vissa laboratorier8. Det är också utmanande att manipulera genuttryck i mänsklig vävnad, medan forskare som använder vanliga musmodeller av sjukdom kan lätt använda den uppsjö av mus genetiska verktyg tillgängliga.
En styrka av denna xenograft modell är att det tillåter forskare att studera mänskliga muskler in vivo. Vävnads kulturen har använts i stor utsträckning för att studera cell-och molekylärbiologi av mänskliga muskler. Ändå, dessa kortsiktiga, ex vivo studier inte alltid approximera funktionella muskler in vivo. Emellertid, en varning är att det är svårt att avgöra hur nära xenograft biologi och funktion approximerar mänsklig muskel på grund av bidraget av värd mus komponenter under regenerativ process. Till exempel, mänskliga och mus neuromuskulära korsningar (NMJs) är morfologiskt distinkta, och det finns betydande skillnader mellan Synaptic proteomet av mänskliga och mus NMJs13. Eftersom xenograft innerveras av mus värden, kan detta resultera i biologiska förändringar som är unika för de mänskliga xenografterna.
I framtida studier, denna skelettmuskulaturen xenograft metod kan användas för att bättre förstå människans muskel cellbiologi och att utveckla nya modeller för sällsynta eller förvärvade muskelsjukdomar som för närvarande saknar djurmodeller. Vi räknar med att detta kommer att ha en betydande gynnsam inverkan på terapeutisk utveckling för dessa sjukdomar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Myositis Association och Peter Buck Foundation. Vi skulle vilja tacka Dr Yuanfläkt Zhang för att dela sin expertis och utbildning i xenograft kirurgisk teknik.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm x 15 mm Petri dish | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| 2-Methylbutane | Fisher | O3551-4 | |
| 20 mm x 30 mm micro cover glass | VWR | 48393-151 | |
| Animal Weighing Scale | Kent Scientific | SCL- 1015 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution | Corning, Cellgro | 30-004-CI | |
| AutoClip System | F.S.T | 12020-00 | |
| Castroviejo Needle Holder | F.S.T | 12565-14 | |
| Chick embryo extract | Accurate | CE650TL | |
| CM1860 UV cryostat | Leica Biosystems | CM1860UV | |
| Coplin staining jar | Thermo Scientific | 19-4 | |
| Dissection Pins | Fisher Scientific | S13976 | |
| Dry Ice - pellet | Fisher Scientific | NC9584462 | |
| Embryonic Myosin antibody | DSHB | F1.652 | recommended concentration 1:10 |
| Ethanol | Fisher Scientific | 459836 | |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30071.01 | |
| Fiber-Lite MI-150 | Dolan-Jenner | Mi-150 | |
| Forceps | F.S.T | 11295-20 | |
| Goat anti-mouse IgG1, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21121 | recommended concentration 1:500 |
| Goat anti-mouse IgG2b, AlexaFluor 594 | Invitrogen | A-21145 | recommended concentration 1:500 |
| Gum tragacanth | Sigma | G1128 | |
| Hams F-10 Medium | Corning | 10-070-CV | |
| Histoacryl Blue Topical Skin Adhesive | Tissue seal | TS1050044FP | |
| Human specific lamin A/C antibody | Abcam | ab40567 | recommended concentration 1:50-1:100 |
| Human specific spectrin antibody | Leica Biosystems | NCLSPEC1 | recommended concentration 1:20-1:100 |
| Induction Chamber | VetEquip | 941444 | |
| Iris Forceps | F.S.T | 11066-07 | |
| Irradiated Global 2018 (Uniprim 4100 ppm) | Envigo | TD.06596 | Antibiotic rodent diet to protect again respiratory infections |
| Isoflurane | MWI Veterinary Supply | 502017 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | surgical wipes |
| Mapleson E Breathing Circuit | VetEquip | 921412 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412 | |
| Mobile Anesthesia Machine | VetEquip | 901805 | |
| Mouse on Mouse Basic Kit | Vector Laboratories | BMK-2202 | mouse IgG blocking reagent |
| Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| NAIR Hair remover lotion/oil | Fisher Scientific | NC0132811 | |
| NOD-Rag1null IL2rg null (NRG) mice | The Jackson Laboratory | 007799 | 2 to 3 months old |
| O.C.T. Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| Oxygen | Airgas | OX USPEA | |
| PBS (phosphate buffered saline) buffer | Fisher Scientific | 4870500 | |
| Povidone Iodine Prep Solution | Dynarex | 1415 | |
| ProLong™ Gold Antifade Mountant | Fisher Scientific | P10144 (no DAPI); P36935 (with DAPI) | |
| Puralube Ophthalmic Ointment | Dechra | 17033-211-38 | |
| Rimadyl (carprofen) injectable | Patterson Veterinary | 10000319 | surgical analgesic, administered subcutaneously at a dose of 5 mg/kg |
| Scalpel Blades - #11 | F.S.T | 10011-00 | |
| Scalpel Handle - #3 | F.S.T | 10003-12 | |
| Stereo Microscope | Accu-scope | 3075 | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Suture, Synthetic, Non-Absorbable, 30 inches long, CV-11 needle | Covidien | VP-706-X | |
| 1ml Syringe (26 gauge, 3/8 inch needle) | BD Biosciences | 329412 | |
| Trimmer | Kent Scientific | CL9990-KIT | |
| Vannas Spring Scissors, 8.0 mm cutting edge | F.S.T | 15009-08 | |
| VaporGaurd Activated Charcoal Filter | VetEquip | 931401 | |
| Wound clips, 9 mm | F.S.T | 12022-09 |
References
- Wong, C. H., Siah, K. W., Lo, A. W. Estimation of clinical trial success rates and related parameters. Biostatistics. 0, 1-14 (2018).
- Hay, M., Thomas, D. W., Craighead, J. L., Economides, C., Rosenthal, J. Clinical development success rates for investigational drugs. Nature Biotechnology. 32, 40-51 (2014).
- Perel, P., et al. Comparison of treatment effects between animal experiments and clinical trials: systematic review. BMJ. 334, 1-6 (2007).
- Rubio-Viqueira, B., Hidalgo, M. Direct in vivo xenograft tumor model for predicting chemotherapeutic drug response in cancer patients. Clinical Pharmacology Therapeutics. 85, 217-221 (2009).
- Roberts, K. G., et al. Targetable Kinase-Activating Lesions in Ph-like Acute Lymphoblastic Leukemia. New England Journal of Medicine. 371, 1005-1015 (2014).
- Kim, J., et al. GDF11 Controls the Timing of Progenitor Cell Competence in Developing Retina. Science. 308, 1927-1930 (2005).
- Sako, D., et al. Characterization of the ligand binding functionality of the extracellular domain of activin receptor type IIB. Journal of Biological Chemisty. 285, 21037-21048 (2010).
- Zhang, Y., et al. Human skeletal muscle xenograft as a new preclinical model for muscle disorders. Human Molecular Genetics. 23, 3180-3188 (2014).
- Gabellini, D., Green, M. R., Tupler, R. Inappropriate Gene Activation in FSHD : A Repressor Complex Binds a Chromosomal Repeat Deleted in Dystrophic Muscle. Cell. 110, 339-348 (2002).
- Lemmers, R. J. L. F., et al. A Unifying Genetic Model for Facioscapulohumeral Muscular Dystrophy. Science. 329, 1650-1654 (2010).
- Chen, J. C. J., et al. Morpholino-mediated Knockdown of DUX4 Toward Facioscapulohumeral Muscular Dystrophy Therapeutics. Molecular Therapy. 24, 1405-1411 (2016).
- Medical Research Council. Aids to the investigation of the peripheral nervous system. , Her Majesty’s Stationary Office. London. (1943).
- Jones, R. A., et al. Cellular and Molecular Anatomy of the Human Neuromuscular Junction. Cell Reports. 21, 2348-2356 (2017).
