Summary
Здесь представлен оптимизированный протокол для изоляции, культивирования, трансфектирования и дифференциации первичных моноцитов человека от ВИЧ-инфицированных лиц и здорового контроля.
Abstract
Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) остается серьезной проблемой для здоровья, несмотря на внедрение комбинированной антиретровирусной терапии (САРТ) в середине 1990-х годов. В то время как антиретровирусная терапия эффективно снижает системную вирусную нагрузку и восстанавливает нормальные количество CD4и Т-клеток, она не восстанавливает полностью функциональную иммунную систему. Дисфункциональная иммунная система у ВИЧ-инфицированных лиц, проходящих КРТ, может характеризоваться иммунной активацией, ранним старением иммунных клеток или постоянным воспалением. Эти условия, наряду с сопутствующими факторами, связанными с ВИЧ-инфекцией, усугубляют сложность болезни, которая не может быть легко воспроизведена в клеточных и животных моделях. Для исследования молекулярных событий, лежащих в основе иммунной дисфункции у этих пациентов, система культуры и манипулировать человеческими первичными моноцитами in vitro представлена здесь. В частности, протокол допускает культуру и трансфекцию первичных монцитов CD14и, полученных от ВИЧ-инфицированных лиц, проходящих ЦАРТ, а также вич-отрицательных мер контроля. Метод включает в себя изоляцию, культуру и трансфекцию моноцитов и моноцитов, полученных макрофагами. В то время как коммерчески доступные комплекты и реагенты используются, протокол обеспечивает важные советы и оптимизированные условия для успешного присоединения и трансфекции моноцитов с миРНК мимикрирующими и ингибиторами, а также с siRNAs.
Introduction
Инфекция вируса иммунодефицита человека-1 (ВИЧ-1) вызывает тяжелую иммунную дисфункцию, которая может привести к оппортунистическим инфекциям и приобретенному синдрому иммунодефицита (СПИД). Хотя ВИЧ-инфицированных пациентов, проходящих CART характеризуются низкими вирусными нагрузками и нормальной CD4И Т-клеток рассчитывает, функционирование иммунной системы может быть поставлена под угрозу в этих людей, что приводит к дисфункциональной иммунной реакции, которая была связана с повышенным риском развития рака1. Механизмы иммунной дисфункции у ВИЧ-инфицированных пациентов на КАРТ остаются в значительной степени неизвестными. Поэтому характеристика иммунных клеток, полученных пациентом, и изучение их биологии и функции является важнейшим компонентом текущих исследований в области ВИЧ.
Моноциты и макрофаги являются ключевыми регуляторами иммунных реакций и играют основополагающую роль в ВИЧ-инфекции2,3,4,5. Неоднородные и пластиковые в природе, макрофаги могут быть широко классифицированы в классическо активированных (M1) или альтернативно активированных (M2). Хотя эта общая классификация необходима при создании экспериментальных условий, статус поляризации макрофагов может быть обращен вспять различными цитокинов6,7,8,9. Хотя несколько исследований исследовали влияние ВИЧ-инфекции на моноциты и дендритные клетки, молекулярные детали моноцитных реакций в значительной степени неизвестны6,7,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. Среди факторов, участвующих в регуляции и функции иммунных клеток, микроРНК (миРНК), короткие некодировочные РНК, которые после транскрипционно регулируют экспрессию генов, были показаны, чтобы играть важную роль в контексте основных клеточных путей (т.е. рост, дифференциация, развитие, и апоптоз)20. Эти молекулы были описаны как важные регуляторы транскрипционных факторов, необходимых для диктовки функциональной поляризации макрофагов21. Исследована потенциальная роль миРНК в моноцитах ВИЧ-инфицированных лиц, проходящих ЦАРТ, но прогресс в этой области требует гораздо больше работы22,23,24,25,26. В настоящем документе обсуждается оптимизированный метод перевода миРНК и сирны в первичные моноциты человека от ВИЧ-инфицированных пациентов и контроля.
Этот протокол опирается на коммерчески доступные реагенты и комплекты, так как непрерывность технической процедуры помогает устранить ненужные экспериментальные переменные при работе с клиническими образцами. Тем не менее, метод предоставляет важные советы (т.е. количество клеток, покрытых или краткое инкубации с сыворотки свободной среды для содействия присоединению клеток к пластине). Кроме того, условия поляризации, используемые в этом протоколе, вытекают из опубликованной работы27,28,29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все методы, описанные ниже, были одобрены Университетом штата Луизиана Центр медицинских наук Нью-Орлеан Институциональный обзор совета. Вся кровь была собрана после получения информированного согласия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вся процедура выполняется в стерильных условиях в объекте уровня биобезопасности 2 (BSL2), так что осторожность используется для обработки биологических материалов. В частности, каждый шаг выполняется с использованием стерильных методов под шкафом биобезопасности. После каждого шага с участием крови, продуктов крови, клеток или клеточного продукта пипетки, важно, чтобы промыть все пластиковые материалы (нат., серологические пипетки, пипетки советы, и трубки) с 10% отбеливателя из контейнера отходов внутри капота до надлежащего удаления.
1. Изоляция первичных человеческих моноцитов путем иммуномагнитного отрицательного отбора
- Соберите 40 мл свежей, человеческой цельной крови (отВИЧ-инфицированных или здорового контроля) в четырех 10 мл этилэндениаминететраацетической кислоты (ЭДТА) вакуумных трубок (10 мл крови на трубку). Используя стерильные методы под шкафом биобезопасности, перенесите все 40 мл крови в одну коническую пропилена нуючку 50 мл.
- Следуя протоколу производителя для выбранного человеческого комплекта изоляции моноцитов(Таблица материалов),добавьте 2 мл моноцитного изоляционного коктейля, предусмотренного в комплекте, в трубку крови. Вихрь магнитные бусы, также предусмотренные в комплекте, для 30 с, и добавить 2 мл в трубку крови.
- Если имеется менее 40 мл крови, снизируйте реагенты. Чтобы смешать раствор, пипетка вверх и вниз с пластиковой 25 мл серологического пипетки и инкубировать в течение 5 минут при комнатной температуре (RT).
- Разделите смесь крови поровну на четыре трубки 50 мл и добавьте 30 мл стерильного фосфатно-буферного солей (PBS), содержащего 1 мМ EDTA к каждой трубке. Смешайте трубачат вверх и вниз с пластиковой 25 мл серологического пипетки.
- Поместите трубки в держатели магнита в течение 10 минут, чтобы удалить антитела конъюгированные магнитные бусы. Используйте четыре держателя магнита одновременно, по одному для каждой трубки, чтобы обеспечить последовательное время инкубации и изоляции для каждого образца крови.
- Сорисуйте содержимое из центра каждой трубки, используя пипетку, в то время как они все еще находятся в держателях магнита. Будьте осторожны, чтобы не оформить красные кровяные тельца (не более 10% от 10 мл стартового объема), и поместить содержимое в один из четырех новых 50 мл труб.
- Добавьте 500 л вихревых магнитных бусин к каждой трубке 50 мл. Пипетка вверх и вниз с 25 мл пипетки и инкубировать на RT в течение 5 минут. Затем поместите трубки в держатели магнита в течение 5 минут.
- Тщательно перенесите содержимое из центра каждой трубки, находясь в держателях магнитов, в одну из четырех новых труб 50 мл. Непосредственно поместите каждую новую трубку 50 мл в держатели магнита в течение 5 минут.
- Тщательно перенесите содержимое из центра каждой трубки в одну из четырех новых 50 мл труб. Спин все новые трубы 50 мл на 300 х г в течение 5 мин. Аспирируйте супернатант и resuspend все четыре клеточные гранулы в общей сложности 10 мл стерильных PBS.
- Подсчитайте клетки, происключая синий исключение с помощью гемоситометра.
ПРИМЕЧАНИЕ: 8-20 х 106 клеток, как правило, получены из 40 мл цельной крови.
2. Культирование первичных человеческих моноцитов
- Используя водяную ванну 37 градусов Цельсия, теплая безмятежная сыворотка RPMI 1640 медиа дополнила 1% пенициллина-стрептомицина (перо/стрептоцит), и (продолжая использовать стерильные методы под шкафом биобезопасности) повторно приостанавливает изолированные моноциты в этом носителе при концентрации 1 х 106 клеток/мл.
- Добавьте 1 мл перепонковых клеток к каждой скважине из 6 скважинной пластины или в 35-мм тарелку (окончательное количество клеток должно быть 1 х 106 ячеек/пластины), и поместите в инкубатор 37 градусов по Цельсию с 5% CO2. Подождите 0,5-1,0 ч, чтобы клетки придерживались.
- Используя водяную ванну 37 градусов, тепла активированная (HI) сыворотка крупного рогатого скота (FBS). Добавьте к каждой пластине 100 кЛ (10% конечной концентрации) FBS. Добавьте факторы роста в клетки для содействия дифференциации макрофагов.
- Премьер макрофагов для M1-как фенотип, добавив 25 нг / мл гранулоцитов-макрофаг колонии стимулирующий фактор (GM-CSF) в средствах массовой информации. Премьер макрофаги для M2-как фенотип, добавив 50 нг / мл макрофагов колонии стимулирующего фактора (M-CSF) в средствах массовой информации28.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оба GM-CSF и M-CSF позволяют моноцитной дифференциации общего фенотипа макрофага (M0) в то время как грунтовки для M1 или M2, соответственно7,28,30.
- Премьер макрофагов для M1-как фенотип, добавив 25 нг / мл гранулоцитов-макрофаг колонии стимулирующий фактор (GM-CSF) в средствах массовой информации. Премьер макрофаги для M2-как фенотип, добавив 50 нг / мл макрофагов колонии стимулирующего фактора (M-CSF) в средствах массовой информации28.
3. Трансфектирование первичных человеческих моноцитов в культуре
- Трансфект моноциты с миРНК имитируют или ингибиторы или siRNA с использованием комплекта, содержащего полимерной основе трансфекционного реагента(Таблица материалов).
- Следуя протоколу производителя для трансфекционного комплекта (и продолжая использование стерильных методов под шкафом биобезопасности), сначала разбавляют выбранные мимилики/ингибиторы миРНК или сиРНК в буфере до конечной концентрации 1,83 мкм. Приготовьте 10 л разбавленного мимилика/ингибитора в трансфекции 1 х 106 клеток.
- Подготовьте трансфекционный реагент, добавив 1 кЛ предоставленного полимера в свежую микроцентрифугную трубку объемом 1,5 мл, после чего сразу же пополнив 90 л предоставленного буфера (в общей сложности 91 л реагента за трансфикцией). Вихрь для 3-5 с.
- Пипетка 90 л трансфекционного раствора в трубку, содержащую 10 злиц разбавленного митрк-миРНК мимилик/ингибитор или siRNA. Смешайте нежным пипеткой и инкубируйте в течение 15 минут на RT.
- Добавьте 100 л трансфективного комплекса в один колодец (или блюдо) из 1 х 106 покрывало моноцитов. Инкубировать клетки для 4 ч при температуре 37 градусов по Цельсию, затем заменить среду с 3 мл полного носителя (RPMI 1640 дополнен 1% пенициллина-стрептомицина и 10% тепло-инактивированных FBS), содержащих либо ГМ-CSF или M-CSF.
4. Дифференциация и активация M1/M2
- Моноциты сразу же начинают дифференциировать сятвик к широким макрофагам M0 на покрытии в культуре. На третий день после покрытия, продолжать использование стерильных методов под биобезопасности кабинета и заменить средства массовой информации с 3 мл свежих RMPI 1640 средств массовой информации (дополнены 1% пенициллина-стрептомицина, 10% тепло-инактивированных FBS, и либо 25 нг / мл GM-CSF для содействия M1-как поляризация или 50 нг/mL M-CSF содействовать поляризации. Культура клеток в этих условиях в общей сложности 6 дней с момента первоначального покрытия в инкубаторе на 37 градусов по Цельсию, 5% CO2.
- Для продвижения поляризации загрунтованный клетки в Фенотип M1-макрофага, активировать клетки на 6-й день инкубации путем замены клеток с новыми средствами, содержащими 5% теплоинактивированных FBS, 1% пера / стрептококка, 100 нг /мл E. coli-производные липополисахарида (LPS), и 20 нг /мL интерферон гамма (IFN.
- Для продвижения поляризации загрунтовавшихся клеток к фенотипу M2-макрофага активируйте клетки на 6-й день инкубации, заменив клеточные носители новыми носителями, содержащими 5% теплоинактивированных FBS, 1% пера/стрептококка, 10 нг/мл M-CSF и 20 нг/мл интерлейкина 4 (IL-4).
- После 24 ч, урожай клетки для РНК, белка, или потока цитометрии анализов.
- Когда клетки готовы к сбору, мыть клетки в тарелке 2x с PBS (на RT для экстракции РНК или охлажденный на льду для извлечения белка). Потому что дифференцированные макрофаги теперь твердо прикреплены к плитам, lyse клетки в плитах сразу для того чтобы получить материал для анализа RNA и протеина.
- Для сбора материала для цитометрии потока, добавить PBS, содержащий 2 мМ EDTA к блюду, инкубировать клетки в течение 10 минут при 37 градусов по Цельсию, аккуратно соскребать клетки из тарелки, и собрать содержимое в 1,5 мл микроцентрифуг трубки, прежде чем приступить к стандартным протоколам.
5. Цитометрия потока
- Промыть клетки в PBS, чтобы удалить культивирование среды. Спин вниз 100000 клеток (на каждый поток цитометрии условие) и повторной блокировки гранулы в 100 Л Л ПБС, содержащий 2 Зл ингибитора Связывания HuFcR. Инкубировать на RT в течение 15 мин.
- Добавьте 50 кл окрашивания буфера и желаемые антитела (здесь, CD80, CD83, CD163, и CD209 были использованы) в рекомендуемых количествах.
- Смешайте осторожно и инкубировать при 4 градусах в темноте в течение 30 минут.
- Вымойте 2x с PBS и resuspend окрашенных клеток в 150 Л ПБС перед запуском образца на цитофлуориметр.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Используя описанную процедуру, были выделены первичные моноциты человека от ВИЧ-инфицированных людей и здоровых доноров. Все данные, представленные здесь, были получены из ВИЧ-испытуемых, подвергаясь АРТ с низким (злт;20 коп/мл) или необнаруживаемыми вирусными нагрузками и обычными cd4 и T-клетками. Сразу же после изоляции, клетки были окрашены, и поток цитометрии была выполнена для подтверждения чистоты популяций клеток. Результаты показали, что 97% клеток окрашенных положительные для CD14 (данные не показаны). Для поляризации макрофагов был использован опубликованный протокол28. Первичные человеческие моноциты культивировались в присутствии ГМ-CSF или M-CSF в течение 6 дней. На шестой день, клетки были активированы к либо M1 или M2 макрофагов. Двадцать четыре часа после активации, клетки были собраны и окрашены для анализа цитометрии потока маркеров макрофаг овой.
На рисунке 1 показаны репрезентативные гистограммы M1-активированного контроля -(рисунок 1A)и клеток пациента (Рисунок 1B) с повышенными уровнями CD80 и CD83 и пониженными уровнями CD163 по сравнению с неактивированными клетками T0, а также m2-активированными клетками с повышенными уровнями CD163 и CD209. Панель C показывает выражение CD80, CD83, CD163 и CD209 в поляризованных ячейках M1 и M2. График представляет средние данные, полученные из трех контрольно-и трех наборов клеток, полученных от ВИЧ. Как и ожидалось, уровни экспрессии CD80 и CD83 увеличились в M1 по сравнению с поляризованными клетками M2, в то время как CD209 и CD163 были более высоко выражены в M2 по сравнению с поляризованными клетками M1. Интересно, что CD80 и CD83, как представляется, более высоко выражены в контрольно-производных клеток по сравнению с ВИЧ-производных клеток. Однако потенциальные различия в способности поляризовать и/или уровни экспрессии маркеров поляризации в клетках, полученных от ВИЧ, по сравнению с мерами контроля требуют дальнейшего изучения. Хотя GM-CSF, M-CSF, LPS и IFN-Я были выбраны в качестве лечения, другие комбинации факторов роста, цитокинов или стимуляторов могут быть использованы с этим протоколом28.
После того, как предварительные эксперименты показали, что процедура изоляции была успешной, свежесобранные моноциты были покрыты 6 колодцами и трансфицированы скремблированной, ближней инфракрасной маркировкой miRNA для определения эффективности трансфекции. Клетки были изображены 24 h после трансфекции флуоресцентной конфокальной микроскопии. С помощью этого метода, 90% эффективность трансфекции была достигнута, как это определено поток цитометрии(Рисунок 2)и конфокальная микроскопия (Рисунок 2B).
Далее была определена жизнеспособность клеток после трансфекции. Рисунок 3 показывает жизнеспособность клеток, определяется с помощью колористетрического контроля, как в среднем клеток, полученных из двух пациентов(рисунок 3A) и два контроля(Рисунок 3B) транссексуалов в день 1 (Рисунок 3А) или день 4 (Рисунок 3B) и собрали в день 7. Для этого эксперимента 50 000 клеток были покрыты на 96 многоколодцной пластине и трансфицированы в соответствии с протоколом. В целом, трансфекция не значительно снизила жизнеспособность клеток, независимо от стадии созревания клеток и условий трансфекции (т.е. макета, скремированных siRNA/miRNA, или siRNA/miRNA). Следует отметить, что рисунок 3 представляет данные, полученные из клеток, полученных от пациента (панель А) и клеток, полученных от контроля (панель B). Это было необходимо, так как не хватает клеток для выполнения полного эксперимента (как жизнеспособность и западная подательная для дня 1 и 4 дня трансфекции, в шести различных условиях на трансфекцию) с одной выборки были в состоянии быть получены. Тем не менее, эта цифра обеспечивает репрезентативные результаты, получаемые либо с помощью контрольных или пациент-полученных клеток.
Затем эффективность трансфекции siRNA на мРНК была оценена путем оценки экспрессии белка. Результаты на рисунке 4 показывают эффективное downregulation EIF4EBP1, трансляционный регулятор весьма обильные в этих клетках, при трансфекции с конкретнымs siRNA на обоих днях 1 (Рисунок 4A) и день 4(Рисунок 4C). Тот же регулятор также поддерживал выражение в различных условиях контроля (т.е. нетрансинфицированных, макет, скремблированный siRNA, и EIF4EBP1 siRNA без трансфекционного реагента: siR). Количественная оценка западных экспериментов по блотдляой для первого и 4-го дня трансфекции показана на рисунке 4B и рисунке 4D,соответственно. Кроме того, были определены уровни экспрессии miR-146a-5p после трансфекции в день 1 или 4-го дня RT-qPCR ВИЧ-клеток(рисунок 4E). Клетки, трансфицируемые миРНК,мимитировали, показали 48-72-кратное увеличение экспрессии miRNA по сравнению с нетрансинфицированными клетками, в то время как все трансфекционные элементы контроля не показывают заметных изменений.
Рисунок 1: Макрофаги, полученные из моноцитов, успешно поляризуются и активируются в направлении фенотипов макрофагов M1 или M2. Результаты анализа цитометрии потока клеток, полученных из одного здорового контроля (A) и одного ОБРАЗЦа ВИЧ-клеток (B), показывают уровни CD80, CD83, CD163 и CD209. Эксперимент был повторен с двумя дополнительными контрольными мерами и двумя дополнительными ВИЧ-положительными образцами с аналогичными результатами. Популяция клеток, представляющих интерес, была закрытой на основе параметров переднего и бокового рассеяния, за которыми последовала двойная дискриминация. (C) График баров, показывающий CD80, CD83, CD163 и CD209 в поляризованных ячейках M1 и M2. График представляет средние данные и стандартные отклонения, полученные из трех контрольных (Ctrl) и трех наборов клеток, полученных от ВИЧ(Pts). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Первичные клетки CD14 человека эффективно трансфицируются миРНК. (A) Анализ цитометрии потока первичных моноцитов, полученных из здорового контроля, 24 ч после трансфекции, показывая, что эффективность трансфекции. (B) Представитель конфокального изображения, сделанного 24 ч после трансфекции показывает, что все клетки в поле выражают miRNA спряженный с ближнего инфракрасного красителя (в белом). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Жизнеспособность трансинфицированных клеток. Граф бары представляют среднюю жизнеспособность клеток двухВИЧ-инфицированных (A) и два здоровых контроля (B) определяется с помощью колористического исследования, после трансфекции с miR-146a-5p или siRNA к EIF4EBP1 (siRNA) и соответствующие элементы управления в день 1 (A) или день 4 (B), все испытания в день 7. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Эффективное downregulation уровня белка при трансфекции siRNA/miRNA после изоляции CD14и моноцитов. Моноциты контроля и ВИЧ-инфицированных (1 х 106 клеток) были трансинфицированы в день 1 (A) или послеизоляции дня 4 (C) с использованием siRNA против EIF4EBP1 mRNA. Панели (B) и (D) представляют количественную оценку выражения EIF4EBP1 по сравнению с GAPDH и выражаются в процентах от макета для пациента (Pt) или контроля (Ctrl) (A) или нетрансинфицированных для пациента или контроля (B). (E) Представитель бар график двух экспериментов, показывающих miR-146a-5p выражение в ВИЧ-производных клеток транссексуалов в день 4 (бары 1-4) или день 1 (правый бар) и собрали в день 7. Изменение складки рассчитывается по сравнению с нетрансfected образца (siR siRNA). siR или miR-145a-5p' указывают на инкубацию клеток с siRNA или miR-146a-5p без трансфекционного реагента. Эксперимент был повторен 2x с контрольно-полученных клеток и дали по существу те же результаты (данные не показаны). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Представленный протокол демонстрирует использование первичных клеток ВИЧ-инфицированных испытуемых в качестве модели для изучения моноцитов и макрофагов. ВИЧ-и пациенты, проходящие ЛЕЧЕНИЕ, живут с инфекцией в течение нескольких лет, а также могут иметь другие сопутствующие инфекции, связанные с ослабленной иммунной системой. Для изучения иммуномодуляции при наличии ВИЧ-хронической инфекции клетки собирали у пациентов напрямую. Как было показано, miRNAs играют важную роль в развитии клеток и дифференциации, протокол фокусируется на способности манипулировать выражением miRNA в этих первичных клетках(Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4). Используя ту же процедуру, этот протокол также работает очень хорошо для siRNAs(Рисунок 3, Рисунок 4). В связи с потенциальной фагоцитной активностью зрелых макрофагов, в дополнение к макету и борьбе siRNA управления, контроль используется (указано как siR или miR' на рисунке 3 и рисунок 4), в котором трансфекционный реагент опущен. Данные подтверждают, что трансфекционный реагент необходим для правильной доставки siRNA/miRNA в клетки, так как без реагента клетки не спонтанно поглощение miRNA или siRNA, даже если они уже дифференцированы в макрофаги (день 4 после покрытия и поляризации, Рисунок 3 и Рисунок 4).
При использовании коммерчески доступных комплектов для изоляции и трансфекции первичных cd14 -моноцитов человека, есть ключевые шаги, оптимизированные, чтобы сделать процедуру воспроизводимой и успешной. В частности, 1) количество клеток покрытием имеет решающее значение для их выживания и дифференциации, и 1 х 106 клеток / 35 мм блюдо было установлено, работать лучше всего. 2) Свежеизолированныеклетки CD14 не прикрепляются равномерно к культуре блюдо, если посеяны в присутствии FBS. Как следствие, при замене среды 4 ч после трансфекции, все незакрепленные клетки будут удалены, что делает пластины к пластине условия весьма переменной. 3) Было установлено, что замена среды 4 ч после трансфекции, снижает токсичность из-за трансфектирования реагентов, не влияя на эффективность трансфекции. 4) Условия трансфекции были оптимизированы, чтобы требовать меньше siRNA или miRNA (15 нм), чем концентрации, рекомендованные производителем (25 нм). 5) Из-за высоко приверженного характера клеток, добавление лисис буфера непосредственно в пластину значительно улучшает концентрацию белков или РНК собраны. Однако, если необходимо удалить клетки из пластины (т.е. для анализа цитометрии потока), лучше всего использовать PBS с ЭДТА и аккуратно соскребать клетки. Этот метод уменьшает количество собранных клеток примерно на 20%-30%, поэтому важно планировать эксперименты соответствующим образом, чтобы получить достаточное количество клеток для дальнейшего анализа.
При правильном следовании эта процедура демонстрирует получение высокочистойпопуляции моноцитов CD14, трансфекции siRNA и небольших РНК, таких как миРНК, культурные условия и дифференциация в макрофаги M1 или M2. Этот метод может быть применен для изучения сложных заболеваний или инфекций, помимо ВИЧ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить ВИЧ клинической / опухолевой биопозитория core для предоставления пациентов образцов и клеточной иммунологии Метаболизм ядро для обеспечения потока цитометрии анализа. Этот проект был профинансирован NIH P20GM12288 и P30GM114732.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5M EDTA | Invitrogen | AM9260G | |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K2EDTA | BD Biosciences | 366643 | |
| Brilliant Stain Buffer | BD Horizon | 563794 | Flow cytometry |
| CD14 PerCP | Invitrogen | 46-0149-42 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD163 BV711 | BD Horizon | 563889 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD209 BV421 | BD Horizon | 564127 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD80 FITC | BD Horizon | 557226 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD83 APC | BD Horizon | 551073 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| Easy 50 EasySep Magnet | StemCell Technologies | 18002 | |
| Easy Sep Direct Human Monocyte Isolation Kit | StemCell Technologies | 19669 | |
| EIF4EBP1 mAb | Cell Signaling | 9644 | Monoclonal antibody for Western blot |
| EIF4EBP1 siRNA | Santa Cruz | sc-29594 | |
| Fetal Bovin Serum Defined Heat Inactivated | Hyclone | SH30070.03HI | |
| Gallios Flow Cytometer | Beckman Coulter | B43618 | |
| GAPDH mAb | Santa Cruz | SC-47724 | Monoclonal antibody for Western blot |
| HuFcR Binding Inhibitor | eBiosciences | 14-9161-73 | Flow cytometry- blocking buffer |
| Kaluza Analysis Software | Beckman Coulter | B16406 | Software to analyze flow cytometry data |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O55:B5 | Sigma | L4524 | |
| miRCURY LNA microRNA Mimic hsa-miR-146a-5p | Qiagen | YM00472124 | |
| MISSION miRNA Negative Control | Sigma | HMC0002 | Scrambled miRNA conjugated with a near infrared dye |
| Nunc 35mm Cell Culture Dish | Thermo Scientific | 150318 | |
| PBS | Gibco | 20012027 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Recombinant Human GM-CSF | R&D Systems | 215-GM-050 | |
| Recombinant Human IFN-γ | R&D Systems | 285-IF-100 | |
| Recombinant Human IL-4 | R&D Systems | 204-IL-010 | |
| Recombinant Human M-CSF | R&D Systems | 216-MC-025 | |
| RPMI 1640 with L-Glutamine | Corning | 10040CVMP | |
| Scrambled Control siRNA | Santa Cruz | sc-37007 | |
| Viromer Blue Transfection Reagent Kit | Lipocalyx | VB-01LB-01 | |
| WST-1 Cell Proliferation Reagent | Roche | 5015944001 | Colorimetric assay to assess cell viability |
References
- Slim, J., Saling, C. F. A Review of Management of Inflammation in the HIV Population. Biomedical Research International. 2016, 3420638 (2016).
- Herskovitz, J., Gendelman, H. E. HIV and the Macrophage: From Cell Reservoirs to Drug Delivery to Viral Eradication. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 52-67 (2019).
- Machado Andrade, V., Stevenson, M. Host and Viral Factors Influencing Interplay between the Macrophage and HIV-1. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 33-43 (2019).
- Merino, K. M., Allers, C., Didier, E. S., Kuroda, M. J. Role of Monocyte/Macrophages during HIV/SIV Infection in Adult and Pediatric Acquired Immune Deficiency Syndrome. Frontiers in Immunology. 8, 1693 (2017).
- Wacleche, V. S., Tremblay, C. L., Routy, J. P., Ancuta, P. The Biology of Monocytes and Dendritic Cells: Contribution to HIV Pathogenesis. Viruses. 10 (2), (2018).
- Davis, M. J., et al. Macrophage M1/M2 polarization dynamically adapts to changes in cytokine microenvironments in Cryptococcus neoformans infection. MBio. 4 (3), e00264 (2013).
- Raggi, F., et al. Regulation of Human Macrophage M1-M2 Polarization Balance by Hypoxia and the Triggering Receptor Expressed on Myeloid Cells-1. Frontiers in Immunology. 8, 1097 (2017).
- Van Overmeire, E., et al. M-CSF and GM-CSF Receptor Signaling Differentially Regulate Monocyte Maturation and Macrophage Polarization in the Tumor Microenvironment. Cancer Research. 76 (1), 35-42 (2016).
- Vogel, D. Y., et al. Human macrophage polarization in vitro: maturation and activation methods compared. Immunobiology. 219 (9), 695-703 (2014).
- Almeida, M., Cordero, M., Almeida, J., Orfao, A. Different subsets of peripheral blood dendritic cells show distinct phenotypic and functional abnormalities in HIV-1 infection. AIDS. 19 (3), 261-271 (2005).
- Ciesek, S., et al. Impaired TRAIL-dependent cytotoxicity of CD1c-positive dendritic cells in chronic hepatitis C virus infection. Journal of Viral Hepatitis. 15 (3), 200-211 (2008).
- Granelli-Piperno, A., Golebiowska, A., Trumpfheller, C., Siegal, F. P., Steinman, R. M. HIV-1-infected monocyte-derived dendritic cells do not undergo maturation but can elicit IL-10 production and T cell regulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7669-7674 (2004).
- Hearps, A. C., et al. HIV infection induces age-related changes to monocytes and innate immune activation in young men that persist despite combination antiretroviral therapy. AIDS. 26 (7), 843-853 (2012).
- Heggelund, L., et al. Stimulation of toll-like receptor 2 in mononuclear cells from HIV-infected patients induces chemokine responses: possible pathogenic consequences. Clinical and Experimental Immunology. 138 (1), 116-121 (2004).
- Hernandez, J. C., et al. Up-regulation of TLR2 and TLR4 in dendritic cells in response to HIV type 1 and coinfection with opportunistic pathogens. AIDS Research and Human Retroviruses. 27 (10), 1099-1109 (2011).
- Hernandez, J. C., Latz, E., Urcuqui-Inchima, S. HIV-1 induces the first signal to activate the NLRP3 inflammasome in monocyte-derived macrophages. Intervirology. 57 (1), 36-42 (2014).
- Low, H. Z., et al. TLR8 regulation of LILRA3 in monocytes is abrogated in human immunodeficiency virus infection and correlates to CD4 counts and virus loads. Retrovirology. 13, 15 (2016).
- Sachdeva, M., Sharma, A., Arora, S. K. Functional Impairment of Myeloid Dendritic Cells during Advanced Stage of HIV-1 Infection: Role of Factors Regulating Cytokine Signaling. PLoS ONE. 10 (10), e0140852 (2015).
- Sachdeva, M., Sharma, A., Arora, S. K. Increased expression of negative regulators of cytokine signaling during chronic HIV disease cause functionally exhausted state of dendritic cells. Cytokine. 91, 118-123 (2017).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
- Li, H., Jiang, T., Li, M. Q., Zheng, X. L., Zhao, G. J. Transcriptional Regulation of Macrophages Polarization by MicroRNAs. Frontiers in Immunology. 9, 1175 (2018).
- Hu, X., et al. Genome-Wide Analyses of MicroRNA Profiling in Interleukin-27 Treated Monocyte-Derived Human Dendritic Cells Using Deep Sequencing: A Pilot Study. International Journal of Molecular Sciences. 18 (5), (2017).
- Huang, J., et al. MicroRNA miR-126-5p Enhances the Inflammatory Responses of Monocytes to Lipopolysaccharide Stimulation by Suppressing Cylindromatosis in Chronic HIV-1 Infection. Journal of Virology. 91 (10), (2017).
- Lodge, R., et al. Host MicroRNAs-221 and -222 Inhibit HIV-1 Entry in Macrophages by Targeting the CD4 Viral Receptor. Cell Reports. 21 (1), 141-153 (2017).
- Ma, L., Shen, C. J., Cohen, E. A., Xiong, S. D., Wang, J. H. miRNA-1236 inhibits HIV-1 infection of monocytes by repressing translation of cellular factor VprBP. PLoS ONE. 9 (6), e99535 (2014).
- Riess, M., et al. Interferons Induce Expression of SAMHD1 in Monocytes through Down-regulation of miR-181a and miR-30a. Journal of Biological Chemistry. 292 (1), 264-277 (2017).
- Buchacher, T., Ohradanova-Repic, A., Stockinger, H., Fischer, M. B., Weber, V. M2 Polarization of Human Macrophages Favors Survival of the Intracellular Pathogen Chlamydia pneumoniae. PLoS ONE. 10 (11), e0143593 (2015).
- Jaguin, M., Houlbert, N., Fardel, O., Lecureur, V. Polarization profiles of human M-CSF-generated macrophages and comparison of M1-markers in classically activated macrophages from GM-CSF and M-CSF origin. Cellular Immunology. 281 (1), 51-61 (2013).
- Lacey, D. C., et al. Defining GM-CSF- and macrophage-CSF-dependent macrophage responses by in vitro models. Journal of Immunology. 188 (11), 5752-5765 (2012).
- Tarique, A. A., et al. Phenotypic, functional, and plasticity features of classical and alternatively activated human macrophages. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 53 (5), 676-688 (2015).
