Summary
这里介绍的是一个优化的协议，用于分离、培养、转染和区分人类原发性单核细胞与艾滋病毒感染者和健康对照。
Abstract
尽管1990年代中期采用了联合抗逆转录病毒疗法（cART），但人体免疫机能丧失病毒（艾滋病毒）仍然是一个重大的健康问题。虽然抗逆转录病毒疗法能有效地降低全身病毒载量并恢复正常的CD4+ T细胞计数，但它并不能重建一个完全功能的免疫系统。接受CART的HIV感染者免疫系统功能失调，其特征可能是免疫激活、免疫细胞早衰或持续炎症。这些情况，以及与艾滋病毒感染有关的合并因子，增加了疾病的复杂性，在细胞和动物模型中不容易重现。为了研究这些患者免疫功能障碍背后的分子事件，这里提出了一个在体外培养和操纵人类原发性单核细胞的系统。具体来说，该议定书允许从接受CART的艾滋病毒感染者以及艾滋病毒阴性对照中获得的原发性CD14和单核细胞的培养和转染。该方法涉及单核细胞和单核衍生巨噬细胞的分离、培养和转染。虽然使用了市售试剂盒和试剂，但该协议为使用miRNA模拟和抑制剂以及siRNA成功粘附和转染单核细胞提供了重要提示和优化条件。
Introduction
人体免疫缺陷病毒-1（HIV-1）感染导致严重的免疫功能障碍，可导致机会性感染和后天免疫机能丧失综合症（艾滋病）。虽然接受cART的HIV感染者的特点是病毒载量低和正常的CD4+T细胞计数，免疫系统的功能可能在这些领域受损，导致免疫反应功能失调，这与患癌症的风险增加有关。CART的HIV患者的免疫功能障碍机制在很大程度上仍不为人所知。因此，描述患者衍生的免疫细胞并研究其生物学和功能是当前艾滋病毒研究的重要组成部分。
单核细胞和巨噬细胞是免疫反应的主要调节者，在HIV感染2、3、4、5中起着基础性作用。异构和塑料在自然界中，巨噬细胞可以大致分为经典激活（M1）或替代激活（M2）。虽然这种一般分类在设置实验条件时是必要的，但巨噬细胞的极化状态可能被各种细胞因子6、7、8、9逆转。虽然有多项研究已研究爱滋病毒感染对单核细胞和树突细胞的影响，但单核细胞介导反应的分子细节基本上未知6、7、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19。在免疫细胞调节和功能所涉及的因素中，微RNA（miRNA），即转录后调节基因表达的短非编码RNA，已被证明在主要细胞通路（即生长、分化、发育和凋亡）20中发挥重要作用。这些分子被描述为转录因子的重要调节器，对控制巨噬细胞21的功能极化至关重要。miRNA在接受CART的HIV感染者的单核细胞中的潜在作用已经调查，但该领域的进展需要更多的工作22，23，24，25，26。本文讨论了一种从HIV感染者和对照组将miRNA和siRNA转染成原发人类单核细胞的优化方法。
该协议依赖于市售试剂和试剂盒，因为技术程序的连续性有助于消除临床样本工作时不必要的实验变量。尽管如此，该方法提供了重要的提示（即，用无血清培养基培养的细胞数量或短暂孵育，以促进细胞粘附在板中）。此外，该协议中使用的极化条件派生自已发表的作品27、28、29。
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Protocol
下面描述的所有方法都已获得路易斯安那州立大学健康科学中心新奥尔良机构审查委员会的批准。所有血液都是在征得知情同意后采集的。
注：整个过程在生物安全2级（BSL2）设施中的无菌条件下进行，以便谨慎处理生物材料。特别是，每个步骤都是在生物安全柜下使用无菌技术执行的。在涉及血液、血液制品、细胞或细胞产品移液的每一步后，在正确处置之前，使用罩内废物容器中的 10% 漂白剂冲洗所有塑料材料（即血清移液器、移液器头和管）非常重要。
1. 免疫磁负选择分离原人类单核细胞
- 在四个 10 mL 乙烯二甲二甲酸 （EDTA） 真空管（每管 10 mL 的血液）中收集 40 mL 的新鲜人类全血（来自 HIV+患者或健康控制）。使用生物安全柜下的无菌技术，将所有 40 mL 的血液转移到一个 50 mL 锥形丙烯管中。
- 按照制造商为选定的人类单核细胞分离试剂盒（材料表）的协议，在血液管中添加2 mL的单核细胞分离鸡尾酒。涡旋磁珠，也提供在套件中，30s，并添加2 mL到血液管。
- 如果血液可用量少于 40 mL，则缩小添加的试剂。要混合溶液，将移液器与塑料 25 mL 血清移液器上下混合，并在室温 （RT） 下孵育 5 分钟。
- 将血液混合物平均分离成四个 50 mL 管，并在每个管中加入含有 1 mM EDTA 的 30 mL 无菌磷酸盐缓冲盐水 （PBS）。通过上下移液与塑料 25 mL 血清移液器混合。
- 将管子放在磁体支架中 10 分钟，以去除抗体结合的磁珠。同时使用四个磁体支架，每个管一个，使每个血液样本的孵育和分离时间一致。
- 使用移液器从每个管的中心绘制内容物，而它们仍在磁体中。小心不要绘制红血球（不超过10mL起始体积的10%），并将内容物放入四个新的50 mL管之一。
- 将 500 μL 的涡旋磁珠添加到每根 50 mL 管中。使用 25 mL 移液器上下移液器，并在 RT 孵育 5 分钟。然后，将管子放入磁铁支架中 5 分钟。
- 小心地将内容物从每个管的中心转移到磁体支架中，并放入四个新的 50 mL 管中的一个。直接将每个新的 50 mL 管放入磁体支架中 5 分钟。
- 小心地将内容物从每个管的中心转移到四个新的 50 mL 管之一。在300 x g下旋转所有新的50 mL管5分钟。吸出上清液，并在总共10 mL无菌PBS中重新悬浮所有四个细胞颗粒。
- 使用血细胞计通过锥体蓝色排除来计数细胞。
注：8-20 x 106细胞一般从40 mL全血中获得。
2. 培养原发性人类单核细胞
- 使用37°C水浴，无热的RPMI 1640培养基辅以1%青霉素-链霉素（笔/链球菌），（在继续使用生物安全柜下的无菌技术）重新悬浮该介质中分离的单核细胞，浓度为1 x 106细胞/mL。
- 将1 mL的再悬浮细胞添加到6孔盘的每个孔中或放入35毫米的培养皿中（细胞的最终数量应为1 x 106细胞/板），并放置在含有5%CO2的37°C培养箱中。等待 0.5-1.0 小时，让单元格粘附。
- 使用37°C水浴，热热灭活（HI）胎儿牛血清（FBS）。在每个板中加入 100 μL（10% 最终浓度）的 FBS。向细胞添加生长因子，促进巨噬细胞分化。
- 通过在介质中添加25纳克/mL的粒细胞-巨噬细胞菌群刺激因子（GM-CSF），为M1样表型的主要巨噬细胞。通过在介质28中添加50纳克/mL的巨噬细胞群落刺激因子（M-CSF），M2类表型的主要巨噬细胞。
注：GM-CSF和M-CSF都允许单细胞分化到一般巨噬细胞表型（M0），同时为M1或M2的细胞注注，分别为7、28、30。
- 通过在介质中添加25纳克/mL的粒细胞-巨噬细胞菌群刺激因子（GM-CSF），为M1样表型的主要巨噬细胞。通过在介质28中添加50纳克/mL的巨噬细胞群落刺激因子（M-CSF），M2类表型的主要巨噬细胞。
3. 在文化中转染原始人类单核细胞
- 使用含有聚合物转染试剂（材料表）的试剂盒，用miRNA模拟或抑制剂或siRNA转染单核细胞。
- 按照制造商的转染试剂盒协议（并继续在生物安全柜下使用无菌技术），首先将缓冲液中选定的miRNA模拟/抑制剂或siRNA稀释至1.83 μM的最终浓度。
- 通过在新鲜的1.5 mL微离心管中加入1μL的聚合物，然后立即加入90μL提供的缓冲液（每次转染共91μL试剂），制备转染试剂。涡旋3-5s。
- 移液器 90 μL 转染溶液进入含有 10 μL 稀释 miRNA 模拟/抑制剂或 siRNA 的管中。通过温和的移液混合，在RT孵育15分钟。
- 将100 μL转染复合物添加到1个1 x 106镀单核细胞的孔（或盘）。在37°C下孵育细胞4小时，然后用3mL的完整介质（RPMI 1640补充1%青霉素-链霉素和10%热灭活FBS）代替该介质，含有GM-CSF或M-CSF。
4. M1/M2 差异化和激活
- 单核细胞在培养电镀后立即开始区分到广义M0巨噬细胞。在电镀后的第三天，在生物安全柜下继续使用无菌技术，并用 3 mL 的新鲜 RMPI 1640 介质（辅以 1% 青霉素-链霉素、10% 热灭活 FBS 和 25 纳克/mL GM-CSF，以促进 M1 型极化或 50 纳克/mL M-CSF 以促进 M2 样极化）。在这些条件下培养细胞，从在37°C、5%CO2的培养箱中初始电镀起共6天。
- 为了推进预基细胞的极化到M1-大噬细胞表型，在孵育的第6天激活细胞，用含有5%热灭活FBS、1%笔/链球菌、100纳克/mL大肠杆菌衍生脂多糖（LPS）和20纳克/mL干扰素伽马（IFN-+）的新媒体取代细胞培养基。
- 为了推进预感细胞的极化到M2-巨噬细胞表型，在孵育的第6天激活细胞，用含有5%热灭活FBS、1%笔/链球菌、10纳克/mL M-CSF和20纳克/mL白细胞介素4（IL-4）的新媒体替换细胞培养基。
- 24小时后，收获细胞进行RNA、蛋白质或流式细胞测定分析。
- 当细胞准备好收集时，用PBS洗涤盘中的细胞2x（RT用于RNA提取或在冰上冷冻以提取蛋白质）。由于分化的巨噬细胞现在牢固地附着在板上，因此直接在板中对细胞进行分辨，以获得用于RNA和蛋白质分析的材料。
- 对于流动细胞学的材料收集，在培养皿中加入含有2 mM EDTA的PBS，在37°C下孵育细胞10分钟，轻轻刮取培养皿中的细胞，并将内容物收集到1.5 mL微离心管中，然后再按照标准方案进行。
5. 流动细胞仪
- 冲洗PBS中的细胞，去除培养培养基。剥离100，000个细胞（每个流细胞测定条件），在含有2μLHuFcR结合抑制剂的PBS中重新悬浮颗粒。在 RT 孵育 15 分钟。
- 在推荐量中加入50μL的染色缓冲液和所需的抗体（此处为CD80、CD83、CD163和CD209）。
- 轻轻混合，在黑暗中4°C孵育30分钟。
- 在细胞荧光计上运行样品之前，用PBS清洗2倍，在150μL的PBS中重新悬浮染色细胞。
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Representative Results
使用所述程序，从艾滋病毒感染者和健康捐赠者中分离出主要的人类单核细胞。这里提供的所有数据均来自艾滋病毒和接受低（<20份/mL）或检测不到的病毒载量和正常CD4+T细胞计数的CART的受试者。分离后，细胞立即被染色，并进行流动细胞测量，以确认细胞群的纯度。结果显示，超过97%的细胞对CD14的染色呈阳性（数据未显示）。对于巨噬细胞的极化，使用已公布的协议28。在GM-CSF或M-CSF的存在下，主要人类单核细胞培养了6天。在第六天，细胞被激活对M1或M2巨噬细胞。激活后24小时，细胞被采集并染色，用于巨噬细胞标记的流细胞学分析。
图1显示了M1激活对照细胞（图1A）和患者衍生（图1B）细胞的代表性直方图，与非活化T0细胞相比，CD80和CD83水平增加，CD163水平降低，以及M2激活细胞的CD163和CD209水平增加。面板 C 中显示了 M1 和 M2 偏振细胞中 CD80、CD83、CD163 和 CD209 的表达。该图显示了从三个对照细胞和三个HIV衍生细胞组获得的平均数据。正如预期的那样，与M2偏振细胞相比，M1的CD80和CD83的表达水平有所增加，而CD209和CD163在M2中比M1偏振细胞表达的更高。有趣的是，与HIV衍生细胞相比，CD80和CD83在对照衍生细胞中的表达方式似乎更为高。然而，与对照组相比，艾滋病毒衍生细胞极化标记的极化和/或表达水平的潜在差异需要进一步调查。虽然选择GM-CSF、M-CSF、LPS和IFN-+作为治疗方法，但生长因子、细胞因子或刺激物的其他组合可用于本方案28。
初步实验表明，分离程序成功，将新采集的单核细胞镀在6个孔板中，并转染出一个经过炒的、近红外标记的miRNA，以确定转染效率。细胞在转染后通过荧光共聚焦显微镜成像24小时。通过这种方法，通过流动细胞学（图2A）和共聚焦显微镜（图2B）测定，实现了超过90%的转染效率。
其次，确定转染后细胞的生存能力。图3显示了细胞的生存能力，使用色度测定法确定，作为从两个患者（图3A）和两个对照组（图3 B）中转染的细胞（图3A）和在第7天收获的细胞的平均值。在这个实验中，50，000个细胞被镀在96个多孔板上，并按照协议转染。一般来说，转染不会显著降低细胞的生存能力，无论细胞的成熟阶段和转染条件（即模拟、炒siRNA/miRNA或siRNA/miRNA）。应该注意的是，图3显示了从患者衍生细胞（面板A）和控制衍生细胞（面板B）获得的数据。这是必要的，因为没有足够的细胞进行完整的实验（第1天和第4天转染的可行性和西方污点，在6个不同的条件，每个转染）能够获得一个单一的样本。然而，该图提供了可采用对照细胞或患者衍生细胞获得的代表性结果。
然后，通过评价蛋白质表达，对靶点mRNA进行siRNA转染的有效性。图4的结果显示，EIF4EBP1是这些细胞中高度丰富的转化调节器，在第1天（图4A）和第4天（图4C）用特异性siRNA转染时，有效降低调节。同一稳压器还在各种控制条件下保持表达（即，未转染、模拟、炒siRNA和EIF4EBP1 siRNA，无转染试剂：siR+）。图4B和图4D分别显示了第1天和第4天转染的西显子实验的量化。此外，确定HIV衍生细胞RT-qPCR在第1天或第4天转染后miR-146a-5p的表达水平（图4E）。用miRNA模拟转染的细胞显示，在未转染的细胞中，miRNA表达增加了48至72倍，而所有转染对照组均无明显变化。
图1：单核细胞衍生巨噬细胞成功极化并激活至M1或M2巨噬细胞表型。从一个健康对照（A）和一个 HIV 衍生细胞样本（B）派生的细胞的流式细胞测定分析结果显示 CD80、CD83、CD163 和 CD209 的水平。实验重复与两个额外的对照和两个额外的艾滋病毒阳性样本，结果相似。感兴趣的细胞群基于正向和侧散射参数进行封闭，然后是双重歧视。（C）显示 M1 和 M2 偏振细胞中的 CD80、CD83、CD163 和 CD209 的条形图。该图表示从三个对照组（Ctrl）和三个HIV衍生（Pts）细胞组获得的平均数据和标准偏差。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：原人类CD14+细胞使用miRNA有效转染。（A）从健康对照衍生的初级单核细胞的流式细胞分析，转染后24小时，显示>90%转染效率。（B） 24小时转染后拍摄的代表性共聚焦图像显示，场内所有细胞均表示miRNA与近红外染料（白色）结合。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：转染细胞的生存能力。图条表示两个HIV+患者（A）和两个健康对照（B）的平均细胞活力，使用色度测定确定，在用miR-146a-5p或siRNA转染后转染到EIF4EBP1（siRNA）和适当的对照在第1天（A）或第4天（B），所有测试在第7天。请点击此处查看此图的较大版本。
图4：在CD14+单核细胞分离后，对siRNA/miRNA转染时蛋白质水平进行有效降低。对照组和HIV衍生的单核细胞（1 x 106细胞）在第1天（A）或第4天（C）分离后转染，使用siRNA对EIF4EBP1 mRNA进行。面板（B）和（D）表示与 GAPDH 相比 EIF4EBP1 表达式的量化，表示为患者 （Pt） 或对照 （Ctrl） 或未转染的患者或对照 （B） 的比模拟的百分比。（E）两个实验的代表性条形图，显示在HIV衍生细胞中miR-146a-5p表达在第4天（柱1-4）或第1天（右条）转染并在第7天收获。折叠变化是在未转染的样品（siR = siRNA）上计算的。siR® 或 miR-145a-5p* 表示在没有转染试剂的情况下，使用 siRNA 或 miR-146a-5p 的细胞孵育。实验在对照派生细胞中重复2倍，结果基本相同（数据未显示）。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
提出的方案演示了使用HIV感染者的初级细胞作为研究单核细胞和巨噬细胞的模型。HIV–接受 CART 的患者感染了多年，并且可能还有其他与免疫系统受损相关的共同感染。为了研究在HIV慢性感染的情况下的免疫调节，细胞直接从患者身上采集。由于miRNA已被证明在细胞发育和分化中起着重要作用，该协议侧重于在这些主细胞中操作miRNA表达的能力（图2，图3，图4）。使用相同的过程，该协议也适用于siRNA（图3，图4）。由于成熟巨噬细胞的潜在噬菌体活性，除了模拟和扰动siRNA对照外，还使用了对照（如图3和图4所示为siR+或miR+），其中省略了转染试剂。数据证实转染试剂是正确将siRNA/miRNA输送到细胞所必需的，因为如果没有试剂，细胞也不会自发地吸收miRNA或siRNA，即使它们已被分化成巨噬细胞（电镀和极化后的第4天，图3和图4）。
虽然使用市售试剂盒进行人体原发CD14和单核细胞的分离和转染，但有一些关键步骤进行了优化，使程序可重复和成功。具体来说，1） 镀层细胞的数量对其生存和分化至关重要，1 x 106细胞/35 mm 盘发现最佳工作。2） 新鲜分离的CD14–细胞不均匀地连接到培养皿，如果种子在FBS的存在。因此，在转染后更换介质 4 小时时，将去除所有未连接的细胞，使板对板条件高度可变。3）在转染后更换培养基4小时，降低转染试剂的毒性，同时不影响转染效率。4） 转染条件经过优化，要求比制造商建议的浓度（25 nM）少的siRNA或miRNA（15 nM）。5） 由于细胞的高度粘附性，将莱沙缓冲液直接添加到板中可大大提高所收获的蛋白质或RNA的浓度。但是，如果需要从板中取出细胞（即用于流式细胞测定分析），最好使用带 EDTA 的 PBS 并轻轻刮擦细胞。此方法将收集的细胞数量减少约 20%-30%，因此相应地规划实验以获得足够的细胞数以进行进一步分析非常重要。
如果正确遵循，此过程表明获得高度纯 CD14=单核细胞的种群、siRNA 和小型RNA（如 miRNA）的转染、培养条件以及分化为 M1 或 M2 巨噬细胞。这种方法可用于研究艾滋病毒以外的复杂疾病或感染。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者要感谢HIV临床/肿瘤生物储存核心提供患者样本和细胞免疫学代谢核心提供流式细胞测定分析。该项目由NIH P20GM121288和P30GM114732资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5M EDTA | Invitrogen | AM9260G | |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K2EDTA | BD Biosciences | 366643 | |
| Brilliant Stain Buffer | BD Horizon | 563794 | Flow cytometry |
| CD14 PerCP | Invitrogen | 46-0149-42 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD163 BV711 | BD Horizon | 563889 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD209 BV421 | BD Horizon | 564127 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD80 FITC | BD Horizon | 557226 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD83 APC | BD Horizon | 551073 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| Easy 50 EasySep Magnet | StemCell Technologies | 18002 | |
| Easy Sep Direct Human Monocyte Isolation Kit | StemCell Technologies | 19669 | |
| EIF4EBP1 mAb | Cell Signaling | 9644 | Monoclonal antibody for Western blot |
| EIF4EBP1 siRNA | Santa Cruz | sc-29594 | |
| Fetal Bovin Serum Defined Heat Inactivated | Hyclone | SH30070.03HI | |
| Gallios Flow Cytometer | Beckman Coulter | B43618 | |
| GAPDH mAb | Santa Cruz | SC-47724 | Monoclonal antibody for Western blot |
| HuFcR Binding Inhibitor | eBiosciences | 14-9161-73 | Flow cytometry- blocking buffer |
| Kaluza Analysis Software | Beckman Coulter | B16406 | Software to analyze flow cytometry data |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O55:B5 | Sigma | L4524 | |
| miRCURY LNA microRNA Mimic hsa-miR-146a-5p | Qiagen | YM00472124 | |
| MISSION miRNA Negative Control | Sigma | HMC0002 | Scrambled miRNA conjugated with a near infrared dye |
| Nunc 35mm Cell Culture Dish | Thermo Scientific | 150318 | |
| PBS | Gibco | 20012027 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Recombinant Human GM-CSF | R&D Systems | 215-GM-050 | |
| Recombinant Human IFN-γ | R&D Systems | 285-IF-100 | |
| Recombinant Human IL-4 | R&D Systems | 204-IL-010 | |
| Recombinant Human M-CSF | R&D Systems | 216-MC-025 | |
| RPMI 1640 with L-Glutamine | Corning | 10040CVMP | |
| Scrambled Control siRNA | Santa Cruz | sc-37007 | |
| Viromer Blue Transfection Reagent Kit | Lipocalyx | VB-01LB-01 | |
| WST-1 Cell Proliferation Reagent | Roche | 5015944001 | Colorimetric assay to assess cell viability |
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