Summary
Presentert her er en optimalisert protokoll for å isolere, dyrking, transfecting, og differensiere menneskets primære monocytter fra HIV-smittede individer og sunne kontroller.
Abstract
Humant immunsviktvirus (HIV) er fortsatt en stor helse bekymring til tross for innføringen av kombinert antiretroviral behandling (cART) på midten av 1990-tallet. Mens antiretroviral behandling effektivt senker systemisk viral belastning og gjenoppretter normal CD4+ T celle tellinger, betyr det ikke Rekonstituer en helt funksjonell immunsystem. En dysfunksjonelle immunsystem i HIV-infiserte individer under cART kan være preget av immun aktivering, tidlig aldring av immunceller, eller vedvarende betennelse. Disse forholdene, sammen med komorbide faktorer forbundet med HIV-smitte, legger kompleksiteten til sykdommen, som ikke kan lett gjengis i cellulære og dyremodeller. For å undersøke den molekylære hendelser underliggende immun dysfunksjon hos disse pasientene, et system til kultur og manipulere menneskelig primære monocytter in vitro er presentert her. Nærmere bestemt, tillater protokollen for kultur og transfeksjoner av primære CD14+ monocytter innhentet fra HIV-infiserte individer gjennomgår cART så vel som fra HIV-negative kontroller. Metoden innebærer isolasjon, kultur, og transfeksjoner av monocytter og monocytt-avledede makrofager. Mens kommersielt tilgjengelige kits og reagenser er ansatt, gir protokollen viktige tips og optimaliserte vilkår for vellykket overholdelse og transfeksjoner av monocytter med miRNA og hemmere, så vel som med siRNAs.
Introduction
Humant immunsviktvirus-1 (HIV-1) infeksjon forårsaker alvorlig immun dysfunksjon, som kan føre til opportunistiske infeksjoner og ervervet immunsviktsyndrom (AIDS). Selv om HIV-smittede pasienter under cART er preget av lav viral belastninger og normal CD4+ T Cell teller, funksjon av immunsystemet kan bli kompromittert i disse individene, som fører til en dysfunksjonelle immunrespons som har vært knyttet til en økt risiko for å utvikle kreft1. Mekanismene for immun dysfunksjon i HIV-pasienter i handlevognen fortsatt i stor grad ukjent. Derfor karakteriserer pasient-avledet immunceller og gransker deres biologi og funksjon er en kritisk komponent i dagens HIV-forskning.
Monocytter og makrofager er sentrale regulatorer av immunresponser og spille grunnleggende roller i HIV-smitte2,3,4,5. Heterogen og plast i naturen, makrofager kan grovt klassifiseres i klassisk aktivert (M1) eller alternativt aktivert (M2). Mens denne generelle klassifiseringen er nødvendig når du setter opp eksperimentelle vilkår, polarisering status av makrofager kan reverseres av en rekke cytokiner6,7,8,9. Selv om flere studier har undersøkt virkningene av HIV-smitte på monocytter og dendrittiske celler, molekylære detaljer om monocytt-mediert svar er i stor grad ukjent6,7,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. Blant de faktorene som er involvert i immun celle regulering og funksjon, microRNAs (miRNAs), kort ikke-koding RNAs at post-transcriptionally regulere genuttrykk, har vist seg å spille en viktig rolle i sammenheng med store cellulære veier (dvs. vekst, differensiering, utvikling, og apoptose)20. Disse molekylene har blitt beskrevet som viktige regulatorer av transkripsjon faktorer avgjørende for å diktere funksjonell polarisering av makrofager21. Den potensielle rollen til miRNAs i monocytter fra HIV-infiserte individer gjennomgår handlevognen har blitt undersøkt, men fremgangen i feltet krever mye mer arbeid22,23,24,25,26. Dette papiret diskuterer en optimalisert metode for å transfect miRNAs og siRNAs i primære menneskelige monocytter fra HIV-infiserte pasienter og kontroller.
Denne protokollen er avhengig av kommersielt tilgjengelige reagenser og sett, som kontinuitet i den tekniske prosedyren bidrar til å eliminere unødvendige eksperimentelle variabler når du arbeider med kliniske prøver. Likevel gir metoden viktige tips (dvs. antall celler belagt eller kort inkubasjons med serum-frie medier for å fremme overholdelse av celler til platen). I tillegg er polarisering forholdene som brukes i denne protokollen avledet fra publisert arbeid27,28,29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metodene som er beskrevet nedenfor er godkjent av Louisiana State University Health Sciences Center New Orleans institusjonelle gjennomgang Board. Alt blod ble samlet inn etter innhente informert samtykke.
Merk: hele prosedyren utføres under sterile forhold i et biosafety nivå 2 (BSL2) anlegg, slik at forsiktighet brukes til å håndtere biologiske materialer. Spesielt er hvert trinn utføres ved hjelp av sterile teknikker under et biosafety kabinett. Etter hvert trinn som involverer blod, blodprodukter, celler eller celle produkt pipettering, er det viktig å skylle alt plast materiale (dvs. serologisk Pipetter, pipette tips og rør) med 10% blekemiddel fra en avfallsbeholder inne i hetten før riktig avhending.
1. isolering av primære menneskelige monocytter ved immunomagnetisk Innfanging negativt utvalg
- Samle 40 mL frisk, humant hele blod (fra enten en HIV+ pasient eller sunn kontroll) i 4 10 ml ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA) vakuumrør (10 ml blod per tube). Ved hjelp av sterile teknikker under et biosafety kabinett, overfører du alle 40 mL blod til 1 50 mL konisk propylenglykol.
- Etter produsentens protokoll for den valgte menneskelige monocytt isolasjons sett (tabell av materialer), tilsett 2 ml monocytt isolasjon cocktail, gitt i settet, til røret av blod. Vortex magnetiske perler, også gitt i settet, for 30 s, og tilsett 2 mL til røret av blod.
- Hvis mindre enn 40 mL blod er tilgjengelig, skalerer du reagensene som er lagt til. For å blande oppløsningen, pipette opp og ned med en plast 25 mL serologisk pipette og ruge i 5 min ved romtemperatur (RT).
- Skill blod blandingen likt i 4 50 mL rør og tilsett 30 mL sterilt fosfat-bufret saltvann (PBS) som inneholder 1 mM EDTA til hvert rør. Bland ved pipettering opp og ned med en plast 25 mL serologisk pipette.
- Plasser rørene i magnet holdere i 10 min for å fjerne antistoffer-bøyd magnetiske perler. Bruk fire magnet holdere samtidig, ett for hvert rør, for å muliggjøre konsistente inkubasjons og isolasjons tider for hver blodprøve.
- Tegn opp innholdet fra midten av hvert rør, ved hjelp av en pipette, mens de fortsatt er i magnet holdere. Vær forsiktig så du ikke tegner opp røde blodlegemer (ikke mer enn 10% av 10 mL Start volum), og plasser innholdet i ett av fire nye 50 mL rør.
- Tilsett 500 μL av blåste magnetiske perler til hver 50 mL tube. Pipetter opp og ned med en 25 mL pipette og ruge ved RT i 5 minutter. Deretter plasserer du rørene i magnet holdere i 5 min.
- Overfør innholdet forsiktig fra midten av hvert rør mens du fremdeles er i magnet holdere i ett av fire nye 50 mL rør. Plasser hver nye 50 mL rør i magnet beholderne i 5 minutter.
- Overfør innholdet forsiktig fra midten av hvert rør til ett av fire nye 50 mL rør. Snurr alle nye 50 mL rør ved 300 x g i 5 min. aspirer supernatanten og resuspend alle fire celle pellets i totalt 10 ml sterilt PBS.
- Telle celler ved å trypan blå utelukkelse ved hjelp av en hemocytometer.
Merk: 8-20 x 106 celler er vanligvis hentet fra 40 ml hele blod.
2. dyrking av primære menneskelige monocytter
- Ved hjelp av en 37 ° c vannbad, varm serum-fri RPMI 1640 Media supplert med 1% penicillin-Streptomycin (penn/strep), og (mens du fortsetter å bruke sterile teknikker under et biosafety kabinett) resuspend de isolerte monocytter i dette mediet ved en konsentrasjon av 1 x 106 celler/ml.
- Tilsett 1 mL resuspendert celler til hver brønn av en 6 brønn plate eller i en 35 mm rett (det endelige antallet celler skal være 1 x 106 celler/plate), og plasser i en 37 ° c inkubator med 5% co2. Vent 0,5-1,0 h for at cellene skal følge.
- Ved hjelp av en 37 ° c vannbad, varm varme-deaktivert (HI) fosterets storfe serum (FBS). Tilsett 100 μL (10% endelig konsentrasjon) av FBS på hver tallerken. Legg vekstfaktorer til cellene for å fremme macrophage differensiering.
- Prime makrofager for en M1-lignende fenotype ved å legge 25 ng/mL granulocytt-macrophage koloni-stimulerende faktor (GM-CSF) til Media. Prime makrofager for en m2-lignende fenotype ved å legge 50 ng/mL av macrophage koloni-stimulerende faktor (M-CSF) til Media28.
Merk: både GM-CSF og M-CSF tillate monocytt differensiering til en generell macrophage fenotype (M0) mens grunning celler for M1 eller m2, henholdsvis7,28,30.
- Prime makrofager for en M1-lignende fenotype ved å legge 25 ng/mL granulocytt-macrophage koloni-stimulerende faktor (GM-CSF) til Media. Prime makrofager for en m2-lignende fenotype ved å legge 50 ng/mL av macrophage koloni-stimulerende faktor (M-CSF) til Media28.
3. Transfecting primære menneskelige monocytter i kultur
- Transfect monocytter med miRNA etterligner eller hemmere eller siRNA ved hjelp av et sett som inneholder en polymer-basert transfeksjoner reagens (tabell av materialer).
- Etter produsentens protokoll for transfeksjoner Kit (og fortsetter bruken av sterile teknikker under et biosafety kabinett), først fortynne den valgte miRNA etterligner/hemmere eller siRNAs i buffer til en endelig konsentrasjon av 1,83 μM. Forbered 10 μL av fortynnet etterligner/inhibitor per transfeksjoner på 1 x 106 celler.
- Klargjør transfeksjoner reagens ved å tilsette 1 μL av den leverte polymer til et friskt 1,5 mL mikrosentrifugen rør, etterfulgt umiddelbart ved å tilsette 90 μL av gitt buffer (for totalt 91 μL av reagens per transfeksjoner). Vortex for 3-5 s.
- Pipetter 90 μL av transfeksjoner oppløsning i røret som inneholder 10 μL av fortynnet miRNA etterligner/inhibitor eller siRNA. Bland med milde pipettering og ruge i 15 minutter ved RT.
- Tilsett 100 μL av transfeksjoner kompleks til en brønn (eller oppvask) på 1 x 106 -belagt monocytter. Ruge celler for 4 t ved 37 ° c, deretter erstatte mediet med 3 mL av komplette medier (RPMI 1640 supplert med 1% penicillin-Streptomycin og 10% varme deaktivert FBS) som inneholder enten GM-CSF eller M-CSF.
4. M1/m2 differensiering og aktivering
- Monocytter umiddelbart begynne å skille til bred M0 makrofager på plating i kultur. På den tredje dagen etter plating, fortsette å bruke sterile teknikker under en biosafety kabinett og erstatte Media med 3 mL fersk RMPI 1640 Media (supplert med 1% penicillin-Streptomycin, 10% varme-deaktivert FBS, og enten 25 ng/mL GM-CSF å fremme M1-lignende polarisering eller 50 ng/mL M-CSF å fremme m2-lignende polarisering). Kultur cellene i disse forholdene for totalt 6 dager fra første plating i en inkubator på 37 ° c, 5% CO2.
- For å fremme polarisering av primet celler til M1-macrophage fenotype, aktivere celler på dag 6 av inkubasjons ved å erstatte celle Media med nye medier som inneholder 5% varme-deaktivert FBS, 1% penn/strep, 100 ng/mL E. coli-avledet LIPOPOLYSAKKARID (LPS), og 20 ng/ml interferon gamma (IFN-γ).
- For å fremme polarisering av primet celler til m2-macrophage fenotype, aktivere celler på dag 6 av inkubasjons ved å erstatte celle Media med nye medier som inneholder 5% varme-deaktivert FBS, 1% penn/strep, 10 ng/mL M-CSF, og 20 ng/mL interleukin 4 (IL-4).
- Etter 24 h, høste cellene for RNA, protein, eller flow flowcytometri analyser.
- Når cellene er klare for oppsamling, vask celler i fatet 2x med PBS (ved RT for RNA-ekstraksjon eller kjølt på is for protein ekstraksjon). Fordi de differensiert makrofager er nå godt festet til platene, lyse cellene i platene direkte for å få materiale for RNA og protein analyser.
- For innsamling av materiale for strømnings flowcytometri, tilsett PBS inneholder 2 mM EDTA til parabolen, ruge cellene i 10 min ved 37 ° c, forsiktig skrape cellene fra fatet, og samle innholdet i en 1,5 mL mikrosentrifugen rør før du fortsetter med standardprotokoller.
5. Flow flowcytometri
- Skyll celler i PBS å fjerne dyrking medium. Snurr ned 100 000 celler (per hver strømnings flowcytometri tilstand) og resuspend pellet i 100 μL av PBS som inneholder 2 μL av HuFcR bindende inhibitor. Ruge for RT for 15 min.
- Tilsett 50 μL av farge buffer og de ønskede antistoffer (her, CD80, CD83, CD163 og CD209 ble brukt) i de anbefalte beløpene.
- Bland forsiktig og ruge ved 4 ° c i mørket i 30 minutter.
- Vask 2x med PBS og resuspend av fargede celler i 150 μL av PBS før du kjører prøven på en cytofluorimeter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjelp av prosedyren beskrevet, primære menneskelige monocytter fra HIV-smittede individer og sunne donorer ble isolert. Alle data som presenteres her ble innhentet fra HIV+ gjennomgår cART med lav (< 20 eksemplarer/ml) eller undetectable viral belastninger og normal CD4+ T Cell teller. Umiddelbart etter isolasjon, celler ble farget, og flyt flowcytometri ble utført for å bekrefte renheten av celle populasjoner. Resultatene viste at > 97% av cellene farget positivt for CD14 (data ikke vist). For polarisering av makrofager, en publisert protokoll ble brukt28. Primær menneskelige monocytter ble kultivert i nærvær av GM-CSF eller M-CSF i 6 dager. På den sjette dagen ble celler aktivert mot enten M1 eller m2 makrofager. Tjuefire timer etter aktivering, celler ble høstet og beiset for Flow flowcytometri analyse av macrophage celle markører.
Figur 1 viser representative histogrammer av M1-aktivert kontroll-(figur 1A) og pasient-avledet (figur 1B) celler med økte nivåer av CD80 og CD83 og reduserte nivåer av CD163 sammenlignet med ikke-aktiverte T0 celler, samt m2-aktiverte celler med økte nivåer av CD163 og CD209. Panel C i viser uttrykk for CD80, CD83, CD163, og CD209 i M1 og m2 polariserte celler. Grafen representerer gjennomsnittsdata innhentet fra Trekontroll-og tre HIV-avledede sett med celler. Som forventet økte uttrykks nivåene på CD80 og CD83 i M1 sammenlignet med m2 polariserte celler, mens CD209 og CD163 var mer høyt uttrykt i m2 sammenlignet med M1 polariserte celler. Interessant, CD80 og CD83 ut til å være mer svært uttrykt i kontroll-avledet celler i forhold til HIV-avledet celler. Potensielle forskjeller i evnen til å polariserer og/eller uttrykks nivåer av polarisering-markører i HIV-avledede celler sammenlignet med kontroller, krever imidlertid videre etterforskning. Selv om GM-CSF, M-CSF, LPS, og IFN-γ ble valgt som behandlinger, andre kombinasjoner av vekstfaktorer, cytokiner, eller stimulatorer kan brukes med denne protokollen28.
Etter foreløpige eksperimenter viste at isolasjonen var vellykket, ble nylig innsamlet monocytter belagt i 6 brønn plater og transfekterte med en forvrengt, nær-infrarød-merket miRNA å bestemme transfeksjoner effektivitet. Celler ble avbildet 24 h post-transfeksjoner av fluorescerende konfokalmikroskopi mikroskopi. Med denne metoden, > 90% effektivitet av transfeksjoner ble oppnådd, som bestemmes av Flow flowcytometri (figur 2A) og konfokalmikroskopi mikroskopi (figur 2B).
Deretter ble levedyktigheten til cellene etter transfeksjoner bestemt. Figur 3 viser levedyktigheten til celler, bestemmes ved hjelp av en fargemetrisk analyse som et gjennomsnitt av celler avledet fra to pasienter (Figur 3a) og to kontroller (Figur 3B) transfekterte på dag 1 (Figur 3a) eller dag 4 (Figur 3B) og høstet på dag 7. For dette eksperimentet, 50 000 celler ble belagt på en 96 multi-brønn plate og transfekterte etter protokollen. Generelt, transfeksjoner ikke signifikant redusere levedyktigheten til cellene, uavhengig av stadium av modning av celler og transfeksjoner forhold (dvs. mock, forvrengt siRNA/miRNA, eller siRNA/miRNA). Det bør bemerkes at Figur 3 representerer data innhentet fra pasient-avledet celler (panel A) og kontroll-avledet celler (panel B). Dette var nødvendig, siden ikke nok celler til å utføre hele eksperimentet (både levedyktighet og Western Blot for dag 1 og dag 4 transfections, i seks ulike forhold per transfeksjoner) med en enkelt prøve var i stand til å fås. Likevel gir figuren representative resultater oppnåelig med enten kontroll-eller pasient-avledet celler.
Deretter ble effektiviteten av siRNA transfeksjoner på målet mRNA vurdert ved å evaluere protein uttrykk. Resultater i Figur 4 viser effektiv DOWNREGULATION av EIF4EBP1, en translational regulator svært rikelig i disse cellene, ved transfeksjoner med en bestemt siRNA på både dag 1 (Figur 4a) og dag 4 (Figur 4C). Samme regulator også opprettholdt uttrykk under de ulike kontroll forhold (dvs. untransfected, mock, forvrengt siRNA, og EIF4EBP1 siRNA uten transfeksjoner reagens: siR *). Kvantifisering av Western Blot eksperimenter for dag 1 og dag 4 transfeksjoner er vist i Figur 4B og Figur 4D, henholdsvis. I tillegg ble uttrykket nivåer av miR-146a-5p etter transfeksjoner på dag 1 eller dag 4 av RT-qPCR av HIV-avledede celler fastslått (Figur 4E). Celler transfekterte med miRNA etterligne viste en 48-til 72-fold økning i miRNA uttrykk over untransfected celler, mens alle transfeksjoner kontrollene viser ingen merkbar endringer.
Figur 1: monocytt makrofager er polarisert og aktivert mot M1 eller m2 macrophage fenotyper. Flow flowcytometri analyseresultater av celler avledet fra en sunn kontroll (A) og en HIV-avledet celleprøve (B) Vis nivåer av CD80, CD83, CD163 og CD209. Eksperimentet ble gjentatt med to ekstra kontroller og ytterligere to HIV-positive prøver med lignende resultater. Celle befolkning av interesse var gated på grunnlag av fremover og side scatter parametre, etterfulgt av doublet diskriminering. (C) SØYLEDIAGRAM viser CD80, CD83, CD163, og CD209 i M1 og m2 polariserte celler. Grafen representerer gjennomsnittsdata og standardavvik innhentet fra Trekontroll-(Ctrl) og tre HIV-avledet (PTS) sett med celler. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: primær menneskelige CD14+ celler er effektivt transfekterte med miRNAs. (A) Flow flowcytometri analyse av primære monocytter avledet fra sunne kontroller, 24 h post-transfeksjoner, viser > 90% transfeksjoner effektivitet. (B) representative konfokalmikroskopi bilde tatt 24 h post-transfeksjoner viser at alle cellene i feltet uttrykker miRNA bøyd med en nær-infrarød fargestoff (i hvitt). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: levedyktigheten til transfekterte celler. Graf stolper representerer gjennomsnittlig celle levedyktighet av to HIV+ pasienter (a) og to sunne kontroller (b) bestemmes ved hjelp av et fargemetrisk analyse, etter transfeksjoner med MiR-146A-5P eller siRNA til EIF4EBP1 (siRNA) og de aktuelle kontrollene på dag 1 (a) eller dag 4 (b), alle testet på dag 7. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: effektiv downregulation av proteinnivåer ved siRNA/miRNA transfeksjoner etter isolering av CD14+ monocytter. Kontroll og HIV-avledet monocytter (1 x 106 celler) ble transfekterte på dag 1 (A) eller dag 4 (C) post-isolasjon med siRNA mot EIF4EBP1 mRNA. Paneler (B) og (D) Representer kvantifisering av EIF4EBP1-uttrykk sammenlignet med GAPDH, og uttrykkes som prosentandel over mock for pasienten (PT) eller kontroll (Ctrl) (A) eller untransfected for pasient eller kontroll (B). (E) representative søylediagram av to eksperimenter som viser miR-146a-5p uttrykk i HIV-avledede celler transfekterte på dag 4 (barer 1-4) eller dag 1 (høyre stolpe) og høstet på dag 7. Fold endringen er beregnet over untransfected prøven (siR = siRNA). siR * eller miR-145a-5p * indikerer inkubasjons av cellene med siRNA eller miR-146a-5p uten transfeksjoner reagens. Eksperimentet ble gjentatt 2x med kontroll-avledet celler og produsert i hovedsak de samme resultatene (data ikke vist). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den presenterte protokollen demonstrerer bruk av primær celler fra HIV-smittede som en modell for å studere monocytter og makrofager. HIV+ pasienter gjennomgår cART leve med infeksjon i flere år og kan også ha andre co-infeksjoner knyttet en kompromittert immunsystem. Å studere immunomodulation i nærvær av HIV kronisk infeksjon, celler ble høstet fra pasienter direkte. Som miRNAs har vist å spille store roller i celle utvikling og differensiering, fokuserer protokollen på evnen til å manipulere miRNA uttrykk i disse primære cellene (figur 2, Figur 3, Figur 4). Ved hjelp av samme fremgangsmåte, fungerer denne protokollen også svært godt for siRNAs (Figur 3, Figur 4). På grunn av den potensielle phagocytic aktiviteten til modne makrofager, i tillegg til å spotte og rykke ut siRNA-kontroller, brukes en kontroll (angitt som siR * eller miR * i Figur 3 og Figur 4), der transfeksjoner reagens utelates. Data bekrefter at transfeksjoner reagens er nødvendig for riktig siRNA/miRNA levering i cellene, som uten reagens, celler ikke spontant opptak av miRNA eller siRNA, selv når de allerede er differensiert i makrofager (dag 4 etter plating og polarisering, Figur 3 og Figur 4).
Stund benytter kommersielt anvendelig kits for isolasjon og transfeksjoner av Human primære CD14+ monocytter, der er nøkkel skritt optimert å vil få fremgangsmåte reproduserbar og heldig. Nærmere bestemt, 1) antall celler belagt er avgjørende for deres overlevelse og differensiering, og 1 x 106 celler/35 mm parabolen ble funnet å fungere best. 2) fersk isolert CD14+ celler ikke jevnt feste til kultur parabolen hvis sådd i nærvær av FBS. Som en konsekvens, når du skifter medium 4 h etter transfeksjoner, vil alle ledige celler bli fjernet, noe som gjør plate-til-plate forhold svært variabel. 3) det ble funnet at å erstatte mediet 4 h følgende transfeksjoner, reduserer toksisitet på grunn av transfecting reagenser, mens ikke påvirker effektiviteten av transfeksjoner. 4) transfeksjoner forhold var optimalisert for å kreve mindre siRNA eller miRNA (15 nM) enn konsentrasjoner anbefalt av produsenten (25 nM). 5) på grunn av den svært tilhenger natur av cellene, legger lyseringsbuffer direkte til platen forbedrer konsentrasjonen av proteiner eller RNA høstes. Men hvis det er nødvendig å fjerne celler fra platen (dvs. for Flow flowcytometri analyse), er det best å bruke PBS med EDTA og forsiktig skrape cellene. Denne metoden reduserer antall innsamlede celler med ca 20%-30%, så det er viktig å planlegge eksperimenter tilsvarende for å oppnå tilstrekkelige celle tall for videre analyse.
Når fulgte riktig, demonstrerer denne prosedyren innhenting av svært ren CD14+ befolkning av monocytter, Transfeksjoner av siRNAs og små RNAs som miRNAs, kultur forhold, og differensiering i M1 eller m2 makrofager. Denne metoden kan anvendes for å studere komplekse sykdommer eller infeksjoner enn HIV.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gjerne takke HIV Clinical/tumor Biorepository Core for å gi pasienten prøver og Cellular immunologi metabolisme Core for å gi flyt flowcytometri analyse. Dette prosjektet ble finansiert av NIH P20GM121288 og P30GM114732.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5M EDTA | Invitrogen | AM9260G | |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K2EDTA | BD Biosciences | 366643 | |
| Brilliant Stain Buffer | BD Horizon | 563794 | Flow cytometry |
| CD14 PerCP | Invitrogen | 46-0149-42 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD163 BV711 | BD Horizon | 563889 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD209 BV421 | BD Horizon | 564127 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD80 FITC | BD Horizon | 557226 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD83 APC | BD Horizon | 551073 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| Easy 50 EasySep Magnet | StemCell Technologies | 18002 | |
| Easy Sep Direct Human Monocyte Isolation Kit | StemCell Technologies | 19669 | |
| EIF4EBP1 mAb | Cell Signaling | 9644 | Monoclonal antibody for Western blot |
| EIF4EBP1 siRNA | Santa Cruz | sc-29594 | |
| Fetal Bovin Serum Defined Heat Inactivated | Hyclone | SH30070.03HI | |
| Gallios Flow Cytometer | Beckman Coulter | B43618 | |
| GAPDH mAb | Santa Cruz | SC-47724 | Monoclonal antibody for Western blot |
| HuFcR Binding Inhibitor | eBiosciences | 14-9161-73 | Flow cytometry- blocking buffer |
| Kaluza Analysis Software | Beckman Coulter | B16406 | Software to analyze flow cytometry data |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O55:B5 | Sigma | L4524 | |
| miRCURY LNA microRNA Mimic hsa-miR-146a-5p | Qiagen | YM00472124 | |
| MISSION miRNA Negative Control | Sigma | HMC0002 | Scrambled miRNA conjugated with a near infrared dye |
| Nunc 35mm Cell Culture Dish | Thermo Scientific | 150318 | |
| PBS | Gibco | 20012027 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Recombinant Human GM-CSF | R&D Systems | 215-GM-050 | |
| Recombinant Human IFN-γ | R&D Systems | 285-IF-100 | |
| Recombinant Human IL-4 | R&D Systems | 204-IL-010 | |
| Recombinant Human M-CSF | R&D Systems | 216-MC-025 | |
| RPMI 1640 with L-Glutamine | Corning | 10040CVMP | |
| Scrambled Control siRNA | Santa Cruz | sc-37007 | |
| Viromer Blue Transfection Reagent Kit | Lipocalyx | VB-01LB-01 | |
| WST-1 Cell Proliferation Reagent | Roche | 5015944001 | Colorimetric assay to assess cell viability |
References
- Slim, J., Saling, C. F. A Review of Management of Inflammation in the HIV Population. Biomedical Research International. 2016, 3420638 (2016).
- Herskovitz, J., Gendelman, H. E. HIV and the Macrophage: From Cell Reservoirs to Drug Delivery to Viral Eradication. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 52-67 (2019).
- Machado Andrade, V., Stevenson, M. Host and Viral Factors Influencing Interplay between the Macrophage and HIV-1. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 33-43 (2019).
- Merino, K. M., Allers, C., Didier, E. S., Kuroda, M. J. Role of Monocyte/Macrophages during HIV/SIV Infection in Adult and Pediatric Acquired Immune Deficiency Syndrome. Frontiers in Immunology. 8, 1693 (2017).
- Wacleche, V. S., Tremblay, C. L., Routy, J. P., Ancuta, P. The Biology of Monocytes and Dendritic Cells: Contribution to HIV Pathogenesis. Viruses. 10 (2), (2018).
- Davis, M. J., et al. Macrophage M1/M2 polarization dynamically adapts to changes in cytokine microenvironments in Cryptococcus neoformans infection. MBio. 4 (3), e00264 (2013).
- Raggi, F., et al. Regulation of Human Macrophage M1-M2 Polarization Balance by Hypoxia and the Triggering Receptor Expressed on Myeloid Cells-1. Frontiers in Immunology. 8, 1097 (2017).
- Van Overmeire, E., et al. M-CSF and GM-CSF Receptor Signaling Differentially Regulate Monocyte Maturation and Macrophage Polarization in the Tumor Microenvironment. Cancer Research. 76 (1), 35-42 (2016).
- Vogel, D. Y., et al. Human macrophage polarization in vitro: maturation and activation methods compared. Immunobiology. 219 (9), 695-703 (2014).
- Almeida, M., Cordero, M., Almeida, J., Orfao, A. Different subsets of peripheral blood dendritic cells show distinct phenotypic and functional abnormalities in HIV-1 infection. AIDS. 19 (3), 261-271 (2005).
- Ciesek, S., et al. Impaired TRAIL-dependent cytotoxicity of CD1c-positive dendritic cells in chronic hepatitis C virus infection. Journal of Viral Hepatitis. 15 (3), 200-211 (2008).
- Granelli-Piperno, A., Golebiowska, A., Trumpfheller, C., Siegal, F. P., Steinman, R. M. HIV-1-infected monocyte-derived dendritic cells do not undergo maturation but can elicit IL-10 production and T cell regulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7669-7674 (2004).
- Hearps, A. C., et al. HIV infection induces age-related changes to monocytes and innate immune activation in young men that persist despite combination antiretroviral therapy. AIDS. 26 (7), 843-853 (2012).
- Heggelund, L., et al. Stimulation of toll-like receptor 2 in mononuclear cells from HIV-infected patients induces chemokine responses: possible pathogenic consequences. Clinical and Experimental Immunology. 138 (1), 116-121 (2004).
- Hernandez, J. C., et al. Up-regulation of TLR2 and TLR4 in dendritic cells in response to HIV type 1 and coinfection with opportunistic pathogens. AIDS Research and Human Retroviruses. 27 (10), 1099-1109 (2011).
- Hernandez, J. C., Latz, E., Urcuqui-Inchima, S. HIV-1 induces the first signal to activate the NLRP3 inflammasome in monocyte-derived macrophages. Intervirology. 57 (1), 36-42 (2014).
- Low, H. Z., et al. TLR8 regulation of LILRA3 in monocytes is abrogated in human immunodeficiency virus infection and correlates to CD4 counts and virus loads. Retrovirology. 13, 15 (2016).
- Sachdeva, M., Sharma, A., Arora, S. K. Functional Impairment of Myeloid Dendritic Cells during Advanced Stage of HIV-1 Infection: Role of Factors Regulating Cytokine Signaling. PLoS ONE. 10 (10), e0140852 (2015).
- Sachdeva, M., Sharma, A., Arora, S. K. Increased expression of negative regulators of cytokine signaling during chronic HIV disease cause functionally exhausted state of dendritic cells. Cytokine. 91, 118-123 (2017).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
- Li, H., Jiang, T., Li, M. Q., Zheng, X. L., Zhao, G. J. Transcriptional Regulation of Macrophages Polarization by MicroRNAs. Frontiers in Immunology. 9, 1175 (2018).
- Hu, X., et al. Genome-Wide Analyses of MicroRNA Profiling in Interleukin-27 Treated Monocyte-Derived Human Dendritic Cells Using Deep Sequencing: A Pilot Study. International Journal of Molecular Sciences. 18 (5), (2017).
- Huang, J., et al. MicroRNA miR-126-5p Enhances the Inflammatory Responses of Monocytes to Lipopolysaccharide Stimulation by Suppressing Cylindromatosis in Chronic HIV-1 Infection. Journal of Virology. 91 (10), (2017).
- Lodge, R., et al. Host MicroRNAs-221 and -222 Inhibit HIV-1 Entry in Macrophages by Targeting the CD4 Viral Receptor. Cell Reports. 21 (1), 141-153 (2017).
- Ma, L., Shen, C. J., Cohen, E. A., Xiong, S. D., Wang, J. H. miRNA-1236 inhibits HIV-1 infection of monocytes by repressing translation of cellular factor VprBP. PLoS ONE. 9 (6), e99535 (2014).
- Riess, M., et al. Interferons Induce Expression of SAMHD1 in Monocytes through Down-regulation of miR-181a and miR-30a. Journal of Biological Chemistry. 292 (1), 264-277 (2017).
- Buchacher, T., Ohradanova-Repic, A., Stockinger, H., Fischer, M. B., Weber, V. M2 Polarization of Human Macrophages Favors Survival of the Intracellular Pathogen Chlamydia pneumoniae. PLoS ONE. 10 (11), e0143593 (2015).
- Jaguin, M., Houlbert, N., Fardel, O., Lecureur, V. Polarization profiles of human M-CSF-generated macrophages and comparison of M1-markers in classically activated macrophages from GM-CSF and M-CSF origin. Cellular Immunology. 281 (1), 51-61 (2013).
- Lacey, D. C., et al. Defining GM-CSF- and macrophage-CSF-dependent macrophage responses by in vitro models. Journal of Immunology. 188 (11), 5752-5765 (2012).
- Tarique, A. A., et al. Phenotypic, functional, and plasticity features of classical and alternatively activated human macrophages. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 53 (5), 676-688 (2015).
