Summary
Hier wird ein optimiertes Protokoll zur Isolierung, Kultivierung, Transfekung und Unterscheidung menschlicher Primärmonozyten von HIV-infizierten Personen und gesunden Kontrollen vorgestellt.
Abstract
Trotz der Einführung einer kombinierten antiretroviralen Therapie (cART) Mitte der 1990er Jahre ist das Humanimmundefizienzvirus (HIV) nach wie vor ein großes Gesundheitsproblem. Während die antiretrovirale Therapie die systemische Viruslast effizient senkt und die normale CD4+ T-Zellzahl wiederherstellt, stellt sie kein vollständig funktionierendes Immunsystem wieder her. Ein dysfunktionales Immunsystem bei HIV-infizierten Personen, die sich cART unterziehen, kann durch Immunaktivierung, frühe Alterung von Immunzellen oder anhaltende Entzündungen gekennzeichnet sein. Diese Bedingungen, zusammen mit komorbiden Faktoren im Zusammenhang mit HIV-Infektion, erhöhen die Komplexität der Krankheit, die nicht leicht in Zell- und Tiermodellen reproduziert werden kann. Um die molekularen Ereignisse zu untersuchen, die der Immunfunktionsstörung bei diesen Patienten zugrunde liegen, wird hier ein System zur Kultur und Manipulation menschlicher Primärmonozyten in vitro vorgestellt. Insbesondere ermöglicht das Protokoll die Kultur und Transfektion von primären CD14+ Monozyten, die von HIV-infizierten Personen, die sich cART unterziehen, sowie von HIV-negativen Kontrollen erhalten werden. Die Methode umfasst Isolation, Kultur und Transfektion von Monozyten und monozytenabgeleiteten Makrophagen. Während handelsübliche Kits und Reagenzien eingesetzt werden, bietet das Protokoll wichtige Tipps und optimierte Bedingungen für die erfolgreiche Haftung und Transfektion von Monozyten mit miRNA-Mimik und Inhibitoren sowie mit siRNAs.
Introduction
Eine Infektion mit dem Humanimmundefizienzvirus-1 (HIV-1) verursacht eine schwere Immunfunktionsstörung, die zu opportunistischen Infektionen und erworbenen Immunschwächesyndromen (AIDS) führen kann. Obwohl HIV-infizierte Patienten, die sich cART unterziehen, durch geringe Viruslasten und normale CD4+ T-Zellzahlen gekennzeichnet sind, kann die Funktion des Immunsystems bei diesen Personen beeinträchtigt werden, was zu einer dysfunktionalen Immunantwort führt, die mit einem erhöhten Risiko für die Entwicklung von Krebs verbunden ist1. Die Mechanismen der Immunfunktionsstörung bei HIV-Patienten auf cART bleiben weitgehend unbekannt. Daher ist die Charakterisierung von immunbasierten Immunzellen durch Patienten und die Untersuchung ihrer Biologie und Funktion ein kritischer Bestandteil der aktuellen HIV-Forschung.
Monozyten und Makrophagen sind wichtige Regulatoren von Immunantworten und spielen eine grundlegende Rolle bei der HIV-Infektion2,3,4,5. Heterogen und plastisch können Makrophagen grob in klassisch aktiviert (M1) oder alternativ aktiviert (M2) klassifiziert werden. Während diese allgemeine Klassifizierung bei der Einrichtung experimenteller Bedingungen notwendig ist, kann der Polarisationsstatus von Makrophagen durch eine Vielzahl von Zytokinen6,7,8,9umgekehrt werden. Obwohl mehrere Studien die Auswirkungen einer HIV-Infektion auf Monozyten und dendritische Zellen untersucht haben, sind molekulare Details von monozytenvermittelten Reaktionen weitgehend unbekannt6,7,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. Unter den Faktoren, die an der Immunzellregulation und -funktion beteiligt sind, haben sich gezeigt, dass microRNAs (miRNAs), kurze nicht-kodierende RNAs, die die Genexpression posttranscriptativ regulieren, eine wichtige Rolle im Kontext wichtiger zellulärer Pfade spielen (d. h. Wachstum, Differenzierung, Entwicklung und Apoptose)20. Diese Moleküle wurden als wichtige Regulatoren von Transkriptionsfaktoren beschrieben, die für die Diktat der funktionellen Polarisation von Makrophagen21unerlässlich sind. Die potenzielle Rolle von miRNAs bei Monozyten von HIV-infizierten Personen, die sich cART unterziehen, wurde untersucht, aber Fortschritte auf diesem Gebiet erfordern viel mehr Arbeit22,23,24,25,26. In diesem Beitrag wird eine optimierte Methode zur Transfektion von miRNAs und siRNAs in primäre menschliche Monozyten von HIV-infizierten Patienten und Kontrollen behandelt.
Dieses Protokoll stützt sich auf handelsübliche Reagenzien und Kits, da die Kontinuität des technischen Verfahrens dazu beiträgt, unnötige experimentelle Variablen bei der Arbeit mit klinischen Proben zu vermeiden. Nichtsdestotrotz gibt die Methode wichtige Tipps (d.h. die Anzahl der zellenbeschichteten oder kurzen Inkubation mit serumfreien Medien, um die Haftung der Zellen an der Platte zu fördern). Zusätzlich werden die in diesem Protokoll verwendeten Polarisationsbedingungen aus veröffentlichten Arbeitenabgeleitet 27,28,29.
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Protocol
Alle unten beschriebenen Methoden wurden vom Louisiana State University Health Sciences Center New Orleans Institutional Review Board genehmigt. Das gesamte Blut wurde nach Einholung der Einwilligung in Kenntnis der Sachlage entnommen.
HINWEIS: Das gesamte Verfahren wird unter sterilen Bedingungen in einer Biosicherheitseinrichtung der Stufe 2 (BSL2) durchgeführt, so dass beim Umgang mit biologischen Materialien Vorsicht geboten ist. Insbesondere wird jeder Schritt mit sterilen Techniken unter einem Biosicherheitsschrank durchgeführt. Nach jedem Schritt mit Blut, Blutprodukten, Zellen oder ZellproduktPipettierung ist es wichtig, das gesamte Kunststoffmaterial (d. h. serologische Pipetten, Pipettenspitzen und Tuben) vor der ordnungsgemäßen Entsorgung mit 10% Bleichmittel aus einem Abfallbehälter in der Haube zu spülen.
1. Isolierung primärer menschlicher Monozyten durch immunmagnetische Negativselektion
- Sammeln Sie 40 ml frisches, menschliches Vollblut (entweder von einem HIV+ Patienten oder einer gesunden Kontrolle) in vier 10 ml Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) Vakuumröhren (10 ml Blut pro Tube). Übertragen Sie alle 40 ml Blut mit sterilen Techniken unter einem Biosicherheitsschrank in ein 50 ml konisches Propylenrohr.
- Nach dem Herstellerprotokoll für das ausgewählte menschliche Monozyten-Isolationskit (Tabelle der Materialien) fügen Sie 2 ml Monozyten-Isolationscocktail, im Kit vorgesehen, in die Blutröhre ein. Vortex magnetische Perlen, auch im Kit vorgesehen, für 30 s, und fügen Sie 2 ml, um die Röhre des Blutes.
- Wenn weniger als 40 ml Blut zur Verfügung stehen, verkleinern Sie die zugesetzten Reagenzien. Um die Lösung zu mischen, Pipette nach oben und unten mit einer 25 ml serologischen Kunststoffpipette und inkubieren für 5 min bei Raumtemperatur (RT).
- Trennen Sie das Blutgemisch gleichmäßig in vier 50 ml-Röhrchen und fügen Sie 30 ml sterile Phosphat-gepufferte Saline (PBS) mit 1 mM EDTA in jedes Röhrchen. Mischen Sie durch Pipettieren nach oben und unten mit einer 25 ml serologischen Pipette aus Kunststoff.
- Legen Sie die Rohre 10 min in Magnethalter, um die antikörperkonjugierten Magnetperlen zu entfernen. Verwenden Sie vier Magnethalter gleichzeitig, einen für jede Röhre, um konsistente Inkubations- und Isolationszeiten für jede Blutprobe zu ermöglichen.
- Zeichnen Sie den Inhalt aus der Mitte jedes Rohres mit einer Pipette, während sie sich noch in den Magnethaltern befinden. Achten Sie darauf, keine roten Blutkörperchen (nicht mehr als 10 % des 10 ml Startvolumens) zu erstellen und den Inhalt in eine von vier neuen 50 ml-Röhren zu legen.
- Fügen Sie jedem 50 ml-Rohr 500 l wirbelnde Magnetperlen hinzu. Pipette rauf und runter mit einer 25 ml Pipette und inkubieren bei RT für 5 min. Legen Sie die Rohre dann 5 min in Magnethalter.
- Übertragen Sie den Inhalt vorsichtig aus der Mitte jedes Rohres, während Sie noch in Magnethaltern in einem von vier neuen 50 ml-Rohren sind. Legen Sie jedes neue 50 ml Rohr für 5 min direkt in die Magnethalter.
- Übertragen Sie den Inhalt vorsichtig von der Mitte jedes Rohres in eines von vier neuen 50 ml-Rohren. Drehen Sie alle neuen 50 ml-Rohre bei 300 x g für 5 min. Aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie alle vier Zellpellets in insgesamt 10 ml sterilem PBS wieder auf.
- Zählen Sie Zellen nach Trypanblauausschluss mit einem Hämozytometer.
HINWEIS: 8-20 x 106 Zellen werden in der Regel aus 40 ml Vollblut gewonnen.
2. Kultivieren von primären menschlichen Monozyten
- Mit einem 37 °C Wasserbad, warme serumfreie RPMI 1640 Medien ergänzt mit 1% Penicillin-Streptomycin (Pen/Strep) und (während weiterhin sterile Techniken unter einem Biosicherheitsschrank verwenden) setzen die isolierten Monozyten in diesem Medium in einer Konzentration von 1 x 106 Zellen/ml.
- Fügen Sie 1 ml resuspendierte Zellen zu jedem Brunnen einer 6-Well-Platte oder in eine 35-mm-Schale (die endgültige Anzahl der Zellen sollte 1 x 106 Zellen/Platte) und legen Sie in einem 37 °C Inkubator mit 5%CO2. Warten Sie 0,5-1,0 h, bis zellenhaft sind.
- Mit einem 37 °C Wasserbad, warm wärmeinaktiviert (HI) fetales Rinderserum (FBS). Fügen Sie jeder Platte 100 l (10 % Endkonzentration) von FBS hinzu. Fügen Sie den Zellen Wachstumsfaktoren hinzu, um die Makrophagendifferenzierung zu fördern.
- Prime-Makrophagen für einen M1-ähnlichen Phänotyp durch Zugabe von 25 ng/ml Granulozyt-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF) zu Medien. Prime-Makrophagen für einen M2-ähnlichen Phänotyp durch Zugabe von 50 ng/ml Makrophagenkolonie-stimulierenden Faktor (M-CSF) zu Medien28.
HINWEIS: Sowohl GM-CSF als auch M-CSF ermöglichen eine Monozytendifferenzierung zu einem allgemeinen Makrophagen-Phänotyp (M0) während der Grundierung von Zellen für M1 bzw. M2 bzw.7,28,30.
- Prime-Makrophagen für einen M1-ähnlichen Phänotyp durch Zugabe von 25 ng/ml Granulozyt-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF) zu Medien. Prime-Makrophagen für einen M2-ähnlichen Phänotyp durch Zugabe von 50 ng/ml Makrophagenkolonie-stimulierenden Faktor (M-CSF) zu Medien28.
3. Transfizierung primärer menschlicher Monozyten in der Kultur
- Transfekte Monozyten mit miRNA-Mimik oder Inhibitoren oder siRNA mit einem Kit, das ein polymerbasiertes Transfektionsreagenz (Materialtabelle )enthält.
- Nach dem Herstellerprotokoll für das Transfektionskit (und der weiteren Verwendung steriler Techniken unter einem Biosicherheitsschrank) verdünnen Sie zunächst die ausgewählten miRNA-Mimiks/Inhibitoren oder siRNAs im Puffer auf eine Endkonzentration von 1,83 m. Bereiten Sie 10 l verdünnte Mimik/Inhibitor pro Transfektion von 1 x 106 Zellen vor.
- Bereiten Sie das Transfektionsreagenz vor, indem Sie einem frischen 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr 1 l des mitgelieferten Polymers zufügen, gefolgt von sofortiger Zeit durch Zugabe von 90 l des bereitgestellten Puffers (für insgesamt 91 l Reagenz pro Transfektion). Wirbel für 3-5 s.
- Pipette 90 l Transfektionslösung in die Röhre mit 10 l verdünnter miRNA-Mimik/-Inhibitor oder siRNA. Mischen Sie durch sanftePipettierung und inkubieren für 15 min bei RT.
- Fügen Sie 100 l Transfektionskomplex zu einem Brunnen (oder einer Schale) von 1 x 106 vergoldeten Monozyten hinzu. Inkubieren Sie Zellen für 4 h bei 37 °C, dann ersetzen Sie das Medium durch 3 ml komplette Medien (RPMI 1640 ergänzt durch 1% Penicillin-Streptomycin und 10% hitzeinaktiviertes FBS), das entweder GM-CSF oder M-CSF enthält.
4. M1/M2 Differenzierung und Aktivierung
- Monozyten beginnen sofort, sich nach der Beschichtung in der Kultur auf breite M0-Makrophagen zu differenzieren. Am dritten Tag nach der Beschichtung die Verwendung steriler Techniken unter einem Biosicherheitsschrank fortsetzen und Medien durch 3 ml frische RMPI 1640-Medien ersetzen (ergänzt durch 1% Penicillin-Streptomycin, 10% hitzeaktiviertes FBS und entweder 25 ng/mL GM-CSF zur Förderung der M1-ähnlichen Polarisation oder 50 ng/ml M-CSF zur Förderung der M2-ähnlichen Polarisation). Kultur die Zellen unter diesen Bedingungen für insgesamt 6 Tage von der Erstbeschichtung in einem Inkubator bei 37 °C, 5%CO2.
- Um die Polarisation der grundierten Zellen zum M1-Makrophagen-Phänotyp voranzutreiben, aktivieren Sie die Zellen am 6. Tag der Inkubation, indem Sie Zellmedien durch neue Medien ersetzen, die 5% wärmeinaktiviertes FBS, 1% Pen/Strep, 100 ng/mL E.coli-abgeleitetes Lipopolysaccharid (LPS) und 20 ng/ml Interferon-Gamma (IFN-) enthalten.
- Um die Polarisation der grundierten Zellen zum M2-Makrophagen-Phänotyp voranzutreiben, aktivieren Sie die Zellen am 6. Tag der Inkubation, indem Sie Zellmedien durch neue Medien ersetzen, die 5% wärmeinaktiviertes FBS, 1% Pen/Strep, 10 ng/mL M-CSF und 20 ng/mL Interleukin 4 (IL-4) enthalten.
- Nach 24 h ernten Sie die Zellen für RNA-, Protein- oder Durchflusszytometrie-Analysen.
- Wenn Zellen zur Sammlung bereit sind, waschen Sie Zellen in der Schale 2x mit PBS (bei RT für RNA-Extraktion oder gekühlt auf Eis für die Proteinextraktion). Da die differenzierten Makrophagen nun fest an den Platten befestigt sind, lysieren Sie die Zellen in Platten direkt, um Material für RNA- und Proteinanalysen zu erhalten.
- Zur Sammlung von Material für die Durchflusszytometrie PBS mit 2 mM EDTA in die Schale geben, die Zellen 10 min bei 37 °C inkubieren, die Zellen vorsichtig aus der Schale kratzen und den Inhalt in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr sammeln, bevor Sie mit Standardprotokollen fortfahren.
5. Durchflusszytometrie
- Spülen Sie Zellen in PBS, um das Kultivierungsmedium zu entfernen. Drehen Sie 100.000 Zellen (pro Durchflusszytometriezustand) und setzen Sie das Pellet in 100 l PBS wieder auf, die 2 L HuFcR-Bindungsinhibitor enthalten. 15 min bei RT inkubieren.
- Fügen Sie 50 L Färbepuffer und die gewünschten Antikörper (hier wurden CD80, CD83, CD163 und CD209 verwendet) in den empfohlenen Mengen hinzu.
- Sanft mischen und bei 4 °C im Dunkeln 30 min inkubieren.
- 2x mit PBS waschen und die gefärbten Zellen in 150 l PBS wieder aufsetzen, bevor die Probe auf einem Zytofluorimeter ausgeführt wird.
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Representative Results
Mit dem beschriebenen Verfahren wurden primäre menschliche Monozyten von HIV-infizierten Personen und gesunden Spendern isoliert. Alle hier vorgestellten Daten stammen von HIV+ Probanden, die sich mit niedrigen (<20 Kopien/ml) oder nicht nachweisbaren Viruslasten und normalen CD4+ T-Zellzahlen unter cART befinden. Unmittelbar nach der Isolierung wurden Zellen befleckt und die Durchflusszytometrie durchgeführt, um die Reinheit der Zellpopulationen zu bestätigen. Die Ergebnisse zeigten, dass >97% der Zellen positiv für CD14 gefärbt wurden (Daten nicht gezeigt). Zur Polarisation von Makrophagen wurde ein veröffentlichtes Protokoll verwendet28. Primäre menschliche Monozyten wurden in Gegenwart von GM-CSF oder M-CSF für 6 Tage kultiviert. Am sechsten Tag wurden die Zellen entweder in Richtung M1- oder M2-Makrophagen aktiviert. 24 Stunden nach der Aktivierung wurden Zellen geerntet und für die Durchflusszytometrieanalyse von Makrophagenzellmarkern gebeizt.
Abbildung 1 zeigt repräsentative Histogramme von M1-aktivierten Kontrollzellen (Abbildung 1A) und patientenabgeleiteten (Abbildung 1B) Zellen mit erhöhtem CD80- und CD83-Spiegel und verringerten CD163-Werten im Vergleich zu nicht aktivierten T0-Zellen sowie M2-aktivierten Zellen mit erhöhtem CD163- und CD209-Spiegel. Panel C in zeigt die Expression von CD80, CD83, CD163 und CD209 in polarisierten M1- und M2-Zellen an. Das Diagramm stellt die durchschnittlichen Daten dar, die aus drei kontroll- und drei HIV-abgeleiteten Zellsätzen gewonnen wurden. Wie erwartet stiegen die Expressionswerte von CD80 und CD83 in M1 im Vergleich zu m2 polarisierten Zellen an, während CD209 und CD163 in M2 stärker exprimiert wurden als m1 polarisierte Zellen. Interessanterweise schienen CD80 und CD83 in kontrollabgeleiteten Zellen stärker exprimiert zu sein als in HIV-abgeleiteten Zellen. Mögliche Unterschiede in der Fähigkeit zur Polarisierung und/oder Expression von Polarisationsmarkern in HIV-abgeleiteten Zellen im Vergleich zu Kontrollen erfordern jedoch weitere Untersuchungen. Obwohl GM-CSF, M-CSF, LPS und IFN-A als Behandlungen gewählt wurden, können andere Kombinationen von Wachstumsfaktoren, Zytokinen oder Stimulatoren mit diesem Protokoll28verwendet werden.
Nach ersten Experimenten zeigte sich, dass das Isolationsverfahren erfolgreich war, frisch gesammelte Monozyten wurden in 6 Brunnenplatten plattiert und mit einer gerebten, nahinfrarot-beschrifteten miRNA transfiziert, um die Transfektionseffizienz zu bestimmen. Die Zellen wurden 24 h nach der Transfektion durch fluoreszierende konfokale Mikroskopie abgebildet. Mit dieser Methode wurde >90% Effizienz der Transfektion erreicht, wie durch Durchflusszytometrie (Abbildung 2A) und konfokale Mikroskopie bestimmt (Abbildung 2B).
Als nächstes wurde die Lebensfähigkeit der Zellen nach der Transfektion bestimmt. Abbildung 3 zeigt die Lebensfähigkeit von Zellen, die anhand eines kolorimetrischen Assays als Durchschnitt der Zellen ermittelt werden, die von zwei Patienten abgeleitet wurden (Abbildung 3A) und zwei Kontrollen (Abbildung 3B), die an Tag 1 (Abbildung 3A) oder Tag 4 (Abbildung 3B) transfiziert und an Tag 7 geerntet wurden. Für dieses Experiment wurden 50.000 Zellen auf einer 96 Multi-Well-Platte plattiert und nach dem Protokoll transfiziert. Im Allgemeinen verringerte die Transfektion die Lebensfähigkeit der Zellen nicht signifikant, unabhängig vom Stadium der Reifung der Zellen und den Transfektionsbedingungen (d. h. Mock, Scrambled siRNA/miRNA oder siRNA/miRNA). Es sei darauf hingewiesen, dass Abbildung 3 Daten darstellt, die aus patientenabgeleiteten Zellen (Panel A) und kontrollabgeleiteten Zellen (Panel B) gewonnen wurden. Dies war notwendig, da nicht genügend Zellen durchgeführt werden konnten, um das vollständige Experiment (sowohl Lebensfähigkeit als auch Western-Blot für Tag 1 und Tag 4 Transfektionen, in sechs verschiedenen Bedingungen pro Transfektion) mit einer einzigen Probe durchzuführen. Dennoch liefert die Zahl repräsentative Ergebnisse, die entweder mit Kontroll- oder Patientenzellen erzielt werden können.
Anschließend wurde die Wirksamkeit der siRNA-Transfektion auf Ziel-mRNA durch Die Bewertung der Proteinexpression bewertet. Die Ergebnisse in Abbildung 4 zeigen eine effektive Downregulation von EIF4EBP1, einem in diesen Zellen reichlich vorhandenen Translationsregulator, bei Transfektion mit einer spezifischen siRNA an beiden Tagen 1 (Abbildung 4A) und Tag 4 (Abbildung 4C). Derselbe Regler behielt auch die Expression unter den verschiedenen Kontrollbedingungen bei (d. h. untransfiziert, verspottet, gerührt siRNA und EIF4EBP1 siRNA ohne Transfektionsreagenz: siR*). Die Quantifizierung der Western-Blot-Experimente für die Transfektion von Tag 1 und Tag 4 ist in Abbildung 4B bzw. Abbildung 4Ddargestellt. Zusätzlich wurden Expressionsniveaus von miR-146a-5p nach Transfektion am Tag 1 oder Tag 4 durch RT-qPCR von HIV-abgeleiteten Zellen bestimmt (Abbildung 4E). Zellen, die mit miRNA-Mimik transfiziert wurden, zeigten eine 48- bis 72-fache Zunahme der miRNA-Expression über untransfizierte Zellen, während alle Transfektionskontrollen keine nennenswerten Veränderungen aufweisen.
Abbildung 1: Monozyten-abgeleitete Makrophagen werden erfolgreich polarisiert und in Richtung M1- oder M2-Makrophänotypen aktiviert. Die Ergebnisse der Durchflusszytometrieanalyse von Zellen, die aus einer gesunden Kontrolle (A) und einer HIV-abgeleiteten Zellprobe (B) abgeleitet wurden, zeigen Konzentrationen von CD80, CD83, CD163 und CD209. Das Experiment wurde mit zwei zusätzlichen Kontrollen und zwei zusätzlichen HIV-positiven Proben mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt. Die Zellpopulation wurde auf der Grundlage von Vorwärts- und Seitenstreuungsparametern abgegrenzt, gefolgt von einer doppelten Diskriminierung. (C) Balkendiagramm mit CD80, CD83, CD163 und CD209 in polarisierten M1- und M2-Zellen. Das Diagramm stellt die durchschnittlichen Daten und Standardabweichungen dar, die aus drei Kontroll- (Strg) und drei HIV-abgeleiteten (Pts) Zellsätzen gewonnen wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Primäre menschliche CD14+ Zellen werden effizient mit miRNAs transfiziert. (A) Durchflusszytometrieanalyse von primärmonozyten, die aus gesunden Kontrollen gewonnen werden, 24 h nach der Transfektion, die eine Transfektionseffizienz von >90 % aufweisen. (B) Repräsentatives konfokales Bild, das 24 h nach der Transfektion aufgenommen wurde, zeigt, dass alle Zellen im Feld die miRNA exprimieren, die mit einem Nahinfrarotfarbstoff (in Weiß) konjugiert ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Lebensfähigkeit transfizierter Zellen. Graphenbalken stellen die durchschnittliche Zelllebensfähigkeit von zwei HIV+ Patienten (A) und zwei gesunden Kontrollen (B) dar, die mit einem kolorimetrischen Assay nach transfektion mit miR-146a-5p oder siRNA zu EIF4EBP1 (siRNA) und den entsprechenden Kontrollen an Tag 1 (A) oder Tag 4 (B) bestimmt wurden, die alle an Tag 7 getestet wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Effiziente Downregulation des Proteinspiegels nach siRNA/miRNA-Transfektion nach der Isolierung von CD14+ Monozyten. Kontroll- und HIV-abgeleitete Monozyten (1 x 106 Zellen) wurden am Tag 1 (A) oder Tag 4 (C) nach der Isolation mit siRNA gegen EIF4EBP1 mRNA transfiziert. Die Panels (B) und (D) stellen die Quantifizierung des EIF4EBP1-Ausdrucks im Vergleich zu GAPDH dar und werden als Prozentsatz gegenüber Spott für Patienten (Pt) oder Kontrolle (Strg) (A) oder untransfiziert für Patienten oder Kontrolle (B) ausgedrückt. (E) Repräsentatives Balkendiagramm von zwei Experimenten, die eine miR-146a-5p-Expression in HIV-abgeleiteten Zellen zeigen, die an Tag 4 (Bars 1-4) oder Tag 1 (rechter Balken) transfiziert und am Tag 7 geerntet werden. Die Faltenänderung wird über die untransfäftete Probe (siR = siRNA) berechnet. siR* oder miR-145a-5p* zeigen die Inkubation der Zellen mit siRNA oder miR-146a-5p ohne transfektionspflichtiges Reagenz an. Das Experiment wurde 2x mit kontrollabgeleiteten Zellen wiederholt und lieferte im Wesentlichen die gleichen Ergebnisse (Daten nicht gezeigt). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Das vorgestellte Protokoll zeigt die Verwendung von Primärzellen von HIV-infizierten Probanden als Modell für die Untersuchung von Monozyten und Makrophagen. HIV+ Patienten, die sich mit cART unterziehen, leben mehrere Jahre mit einer Infektion und können auch andere Co-Infektionen haben, die mit einem geschwächten Immunsystem zusammenhängen. Um die Immunmodulation in Gegenwart einer chronischen HIV-Infektion zu untersuchen, wurden Zellen direkt von Patienten geerntet. Da sich gezeigt hat, dass miRNAs eine wichtige Rolle bei der Zellentwicklung und -differenzierung spielen, konzentriert sich das Protokoll auf die Fähigkeit, die miRNA-Expression in diesen primärzellen zu manipulieren (Abbildung 2, Abbildung 3, Abbildung 4). Mit dem gleichen Verfahren funktioniert dieses Protokoll auch sehr gut für siRNAs (Abbildung 3, Abbildung 4). Aufgrund der potentiellen phagozytischen Aktivität ausgereifter Makrophagen wird zusätzlich zu den SiRNA-Steuerelementen mock und scramble siRNA eine Steuerung (angezeigt als siR* oder miR* in Abbildung 3 und Abbildung 4) verwendet, bei der das Transfektionsreagenz weggelassen wird. Die Daten bestätigen, dass das Transfektionsreagenz für die richtige siRNA/miRNA-Abgabe in die Zellen erforderlich ist, da Zellen ohne reagenznicht spontan die miRNA oder siRNA aufnehmen, selbst wenn sie bereits in Makrophagen differenziert sind (Tag 4 nach Beschichtung und Polarisation, Abbildung 3 und Abbildung 4).
Bei der Verwendung kommerziell erhältlicher Kits zur Isolierung und Transfektion menschlicher Primär-CD14+ Monozyten gibt es wichtige Schritte, die optimiert wurden, um das Verfahren reproduzierbar und erfolgreich zu machen. Insbesondere ist 1) die Anzahl der plattierten Zellen entscheidend für ihr Überleben und ihre Differenzierung, und 1 x 106 Zellen/35 mm Schale wurde gefunden, um am besten zu funktionieren. 2) Frisch isolierte CD14+ Zellen heften sich nicht gleichmäßig an die Kulturschale an, wenn sie in Gegenwart von FBS gesät werden. Infolgedessen werden beim Austausch des Mediums 4 h nach der Transfektion alle ungebundenen Zellen entfernt, wodurch die Platten-zu-Platte-Bedingungen sehr variabel sind. 3) Es wurde festgestellt, dass der Austausch des Mediums 4 h nach der Transfektion die Toxizität durch transfizierende Reagenzien reduziert, ohne die Effizienz der Transfektion zu beeinträchtigen. 4) Die Transfektionsbedingungen wurden so optimiert, dass sie weniger siRNA oder miRNA (15 nM) als vom Hersteller empfohlene Konzentrationen (25 nM) erfordern. 5) Aufgrund der hochgradig anhaftenden Natur der Zellen verbessert die direkte Zugabe von Lysepuffern auf der Platte die Konzentration von Proteinen oder RNA geerntet. Wenn es jedoch notwendig ist, Zellen von der Platte zu entfernen (d. h. für die Analyse der Durchflusszytometrie), ist es am besten, PBS mit EDTA zu verwenden und die Zellen vorsichtig zu kratzen. Diese Methode reduziert die Anzahl der gesammelten Zellen um ca. 20%-30%, daher ist es wichtig, Experimente entsprechend zu planen, um ausreichende Zellzahlen für die weitere Analyse zu erhalten.
Wenn dieses Verfahren korrekt befolgt wird, zeigt es die Erlangung von hochreinen CD14+ Populationen von Monozyten, die Transfektion von siRNAs und kleinen RNAs wie miRNAs, Kulturbedingungen und die Differenzierung in M1- oder M2-Makrophagen. Diese Methode kann angewendet werden, um komplexe Krankheiten oder Infektionen außer HIV zu untersuchen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Die Autoren danken dem HIV Clinical/Tumor Biorepository Core für die Bereitstellung von Patientenproben und dem Cellular Immunology Metabolism Core für die Bereitstellung von Durchflusszytometrieanalysen. Dieses Projekt wurde von NIH P20GM121288 und P30GM114732 finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5M EDTA | Invitrogen | AM9260G | |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K2EDTA | BD Biosciences | 366643 | |
| Brilliant Stain Buffer | BD Horizon | 563794 | Flow cytometry |
| CD14 PerCP | Invitrogen | 46-0149-42 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD163 BV711 | BD Horizon | 563889 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD209 BV421 | BD Horizon | 564127 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD80 FITC | BD Horizon | 557226 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD83 APC | BD Horizon | 551073 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| Easy 50 EasySep Magnet | StemCell Technologies | 18002 | |
| Easy Sep Direct Human Monocyte Isolation Kit | StemCell Technologies | 19669 | |
| EIF4EBP1 mAb | Cell Signaling | 9644 | Monoclonal antibody for Western blot |
| EIF4EBP1 siRNA | Santa Cruz | sc-29594 | |
| Fetal Bovin Serum Defined Heat Inactivated | Hyclone | SH30070.03HI | |
| Gallios Flow Cytometer | Beckman Coulter | B43618 | |
| GAPDH mAb | Santa Cruz | SC-47724 | Monoclonal antibody for Western blot |
| HuFcR Binding Inhibitor | eBiosciences | 14-9161-73 | Flow cytometry- blocking buffer |
| Kaluza Analysis Software | Beckman Coulter | B16406 | Software to analyze flow cytometry data |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O55:B5 | Sigma | L4524 | |
| miRCURY LNA microRNA Mimic hsa-miR-146a-5p | Qiagen | YM00472124 | |
| MISSION miRNA Negative Control | Sigma | HMC0002 | Scrambled miRNA conjugated with a near infrared dye |
| Nunc 35mm Cell Culture Dish | Thermo Scientific | 150318 | |
| PBS | Gibco | 20012027 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Recombinant Human GM-CSF | R&D Systems | 215-GM-050 | |
| Recombinant Human IFN-γ | R&D Systems | 285-IF-100 | |
| Recombinant Human IL-4 | R&D Systems | 204-IL-010 | |
| Recombinant Human M-CSF | R&D Systems | 216-MC-025 | |
| RPMI 1640 with L-Glutamine | Corning | 10040CVMP | |
| Scrambled Control siRNA | Santa Cruz | sc-37007 | |
| Viromer Blue Transfection Reagent Kit | Lipocalyx | VB-01LB-01 | |
| WST-1 Cell Proliferation Reagent | Roche | 5015944001 | Colorimetric assay to assess cell viability |
References
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