Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Transformasjon, Genova redigering og bestemmelse av fenotype av nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Published: August 18, 2019 doi: 10.3791/59971
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,3, 1,4, 1, 1, 1, 1
1Laboratory of Molecular Biology, Department of Plant Sciences, Wageningen University & Research, 2Center of Technology for Agricultural Production, Agency for the Assessment and Application of Technology (BPPT), 3Department of Ecological Science, Faculty of Earth and Life Sciences, Vrije Universiteit Amsterdam, 4Beijing Advanced Innovation Center for Tree Breeding by Molecular Design, Beijing University of Agriculture

Summary

Parasponia andersonii er et raskt voksende tropisk tre som tilhører cannabis-familien (Cannabaceae) og kan danne nitrogen-fixing rot knuter i forbindelse med Rhizobium. Her beskriver vi en detaljert protokoll for omvendt genetiske analyser i P. andersonii basert på Agrobacterium tumefaciens-MEDIERT stabil transformasjon og CRISPR/Cas9-baserte Genova redigering.

Abstract

Parasponia andersonii er et raskt voksende tropisk tre som tilhører cannabis-familien (Cannabaceae). Sammen med 4 andre arter, danner det den eneste kjente ikke-legume avstamning i stand til å etablere en nitrogen-fixing nodule symbiose med Rhizobium. Sammenlignende studier mellom belgfrukter og P. andersonii kan gi verdifull innsikt i de genetiske nettverkene underliggende root nodule formasjon. For å lette sammenlignende studier, vi nylig sekvensert P. andersonii Genova og etablerte Agrobacterium tumefaciens-MEDIERT stabil transformasjon og CRISPR/Cas9-baserte Genova redigering. Her gir vi en detaljert beskrivelse av transformasjon og Genova redigerings prosedyrer utviklet for P. andersonii. I tillegg beskriver vi prosedyrer for frøet spire og karakterisering av symbiotisk fenotyper. Ved hjelp av denne protokollen kan stabile transgene mutant linjer genereres i en periode på 2-3 måneder. Vegetative in vitro-spredning av T0 transgene Lines gjør det mulig for bestemmelse av fenotype eksperimenter å initieres ved 4 måneder etter A. tumefaciens co-dyrking. Denne protokollen tar derfor bare marginalt lenger enn den midlertidige Agrobacterium rhizogenesrot transformerings metoden som er tilgjengelig for P. andersonii, men tilbyr flere klare fordeler. Sammen prosedyrene beskrevet her tillater P. andersonii skal brukes som en forsknings modell for studier som tar sikte på å forstå symbiotisk foreninger så vel som potensielt andre aspekter av biologi av denne tropiske treet.

Introduction

Parasponia andersonii er et tropisk tre som tilhører cannabis familien (Cannabaceae) og er innfødt til Papua Ny Guinea og flere Stillehavsøyene1,2,3. Sammen med 4 ekstra Parasponia arter, representerer den den eneste ikke-legume avstamning som kan etablere en nitrogen-fixing nodule symbiose med rhizobia. Dette symbiose er godt studert i legume (Fabaceae) modeller Medicago truncatula og Lotus japonicus, som har resultert i å anskaffe detaljert kunnskap om den molekylære genetiske natur nodule formasjon og funksjon4. I tillegg ble det demonstrert at roten nodule symbiose i belgfrukter er grunnlagt på den mye eldre, og utbredt arbuscular mycorrhizal symbiose5. Phylogenomic sammenligninger tyder på at nitrogen-fixing nodule symbioses av belgfrukter, Parasponia, så vel som, den såkalte actinorhizal plantearter som er vert diazotrophic Frankia bakterier, har en felles evolusjonær opprinnelse 6,7,8. For å avgjøre om genene identifisert å være involvert i legume nodule formasjon er den delen av en bevart genetisk basis, studier på ikke-legume arter er avgjørende. For dette formål, foreslår vi å bruke P. andersonii som en komparativ forsknings modell, sammen med belgfrukter, for å identifisere kjernen genetiske nettverk underliggende root nodule formasjon og funksjon.

P. andersonii er en pioner som kan bli funnet i bakkene av vulkanske åser. Det kan møte vekst hastigheter på 45 cm per måned og nå lengder på opptil 10 meter9. P. andersonii trær er vind-pollinated, som er tilrettelagt ved dannelsen av separate mannlige og kvinnelige blomster3,10. Vi har nylig sekvensert og kommenterte diploid Genova (2n = 20; 560 MB/1C) av P. andersonii, og samlet utkast til Genova sekvenser av 2 ekstra Parasponia arter; P. Rigida og p. rugosa6. Dette avslørte ~ 35 000 P. andersonii gen modeller som kan grupperes i > 20000 orthogroups sammen med gener fra M. truncatula, soyabønner (Glycine Max), Arabidopsis thaliana, skog jordbær ( Fragaria jordbær), trema orientalis, svart bomull poppel (Populus trichocarpa) og eucalypt (eucalyptus grandis)6. I tillegg transcriptome sammenligninger mellom M. truncatula og P. andersonii identifiserte et sett med 290 antatte orthologues som viser et nodule-forbedret uttrykks mønster i begge artene6. Dette gir en utmerket ressurs for sammenlignende studier.

For å studere gen funksjonen i P. andersonii røtter og knuter, har det blitt etablert en protokoll for Agrobacterium rhizogenes-mediert rot transformasjon11. Ved hjelp av denne protokollen, sammensatte planter bærende transgene røtter kan genereres i en relativt kort tidsramme. Denne metoden er også mye brukt i legume-symbiose forskning12,13,14. Men ulempen med denne metoden er at bare røttene er forvandlet og at hver transgene root representerer en uavhengig transformasjon hendelse, noe som resulterer i betydelig variasjon. Transformasjonen er også forbigående og transgene Lines kan ikke opprettholdes. Dette gjør en. rhizogenes-basert root transformasjon mindre egnet for CRISPR/Cas9-mediert Genova redigering. I tillegg, A. rhizogenes overfører sine root inducing geometrisk knute punkt (ROL) gener til anlegget Genova, som en gang uttrykt forstyrre hormon homeostase15. Dette gjør studere rollen av plantehormoner i A. rhizogenes-forvandlet røtter utfordrende. For å overkomme disse begrensningene har vi nylig utviklet en protokoll for Agrobacterium tumefaciens-basert transformasjon og CRISPR/Cas9-mediert mutagenese av P. andersonii10.

Her gir vi en detaljert beskrivelse av a. tumefaciens-basert transformasjon prosedyre og omvendt genetikk rørledning utviklet for P. andersonii. I tillegg gir vi protokoller for nedstrøms håndtering av transgene plantlets, inkludert analyser for å studere symbiotisk interaksjoner. Ved å bruke protokollen som er beskrevet her, kan flere transgene-linjer genereres i løpet av en 2-3 måneders periode. I kombinasjon med CRISPR/Cas9-mediert mutagenese, dette tillater effektiv generering av knockout mutant linjer. Disse muterte linjene kan vegetativt spres i vitro10,16,17, som tillater tilstrekkelig materiale skal genereres for å starte fenotypiske karakterisering på 4 måneder etter at transformasjonen prosedyren har blitt igangsatt10. Sammen, dette settet med prosedyrer bør tillate enhver Lab å vedta P. andersonii som en forsknings modell for studier som tar sikte på å forstå rhizobial og mycorrhizal foreninger, samt potensielt andre aspekter av biologi av dette tropiske treet.

Protocol

1. Grow P. andersonii trær i Greenhouse

  1. Spire P. andersonii WU1 frø18.
    1. Bruk friske Parasponia bær eller suge tørkede bær i vann for 2 h til rehydrate. Squash bær på et stykke silkepapir eller gni mot innsiden av en te sil for å fjerne frøene.
    2. Desinfisere frøene ved hjelp av kommersielle blekemidler (~ 4% natriumhypokloritt) for 15-20 min og deretter vaske frøene 6 ganger ved hjelp av sterilisert vann.
    3. Overfør frøene til sterile 200, μL PCR-rør. Fyll rørene med sterilisert vann, slik at frøene er helt neddykket. Ruge rørene i 10 dager i en thermocycler som kjører følgende program: 30 sykluser (7 ° c for 4 t, 28 ° c for 4 h). Ikke bruk et oppvarmet lokk, da dette kan drepe frøene.
    4. Forbered SH-0 plater (se tabell 1). Overfør frøene til SH-0 plater og ruge ved 28 ° c, 16 h:8 h dag: natt. Lukk platene med 2 lag elastisk tetnings folie for å hindre tørking under inkubasjons ved 28 ° c.
  2. Etter frøplanter har utviklet sitt første sett med ekte blader (~ 3-4 uker etter inkubasjons ved 28 ° c), overføre frøplanter til potter fylt med kommersiell potting jord og dekke frøplanter med en gjennomskinnelig plast kopp for å hindre uttørking. Plasser potter i en 28 ° c klima rom eller drivhus, ~ 85% RH, under en 16 h:8 h dag: natt regime.
  3. Etter 1 uke, Fjern gjennomskinnelig plast kopp. Vann pottene regelmessig og når trærne vokser større supplement med gjødsel for å opprettholde vekst.

2. kloning av konstruksjoner for CRISPR/Cas9-mediert mutagenese av P. andersonii

Merk: Standard binære transformasjon vektorer kan brukes for stabil transformasjon av P. andersonii. Her, som et eksempel, er en prosedyre for å generere konstruksjoner for CRISPR/Cas9-mediert mutagenese ved hjelp av modulær kloning (f. eks Golden Gate)19.

  1. Identifisere guide RNA mål sekvenser for genet (e) av interesse, ved hjelp av bioinformatikk programvare med et innebygd CRISPR design verktøy. Velg guide RNA-sekvenser som er plassert på 5 '-enden av kodings sekvensen til mål genet for å øke sjansen for å få full Knockouts. Sikre å sjekk for av-mål virkninger av forskende imot det P. andersonii Genova6.
    Merk: Bruk 2 sgRNAs per mål genet, fortrinnsvis 200-300 BP fra hverandre. Dette kan generere slettinger som kan identifiseres av PCR og deretter ved agarose gel elektroforese.
  2. Generer nivå 1 Golden Gate-konstruksjoner som inneholder sgRNA-sekvensene.
    1. Design primere for å forsterke hver enkelt sgRNA ved å sette inn 20 BP guide sekvens i posisjonen til N(20) i følgende primer sekvensen: 5 '-TGTGGTCTCAATTGN(20) GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG-3 '.
      Merk: Hvis førings sekvensen er lik GN(19), fjerner du G ved 5 ' enden av førings sekvensen før du setter inn i primer sekvensen.
    2. PCR forsterke sgRNAs fra pICH86966:: AtU6p:: sgRNA_PDS20 bruke Forward primere designet på trinn 2.2.1 og Universal Reverse primer: 5 '-TGTGGTCTCAAGCGTAATGCCAACTTTGTAC-3 '. Bruk en varme stabil DNA-polymerase av høy kvalitet og følgende PCR-forhold: 98 ° c i 30 s; 30 sykluser (98 ° c i 10 s; 53 ° c i 20 s; 72 ° c for 10 s); 72 ° c i 7 min. vellykkede PCR reaksjoner gir en 165 BP amplicon.
    3. Kolonne-rens PCR-amplicon ved hjelp av et kommersielt PCR rensesett. Deretter satt opp Golden Gate reaksjoner å klone sgRNAs bak Arabidopsis thaliana ATU6P liten RNA promoter: 10 ng av sgRNA PCR-amplicon, 150 ng av pICSL01009:: AtU6p20, 60 ng av riktig nivå 1 Acceptor vektor, 2 μL av T4 ligase buffer, 2 μL 0,1% av blod serum albumin (BSA), 0,5 μL av BsaI, 0,5 μL av T4-ligase, fyll til 20 μL med ultra-rent vann. Sørg for at alle sgRNAs er klonet i samme retning for å hindre dannelse av hæler.
    4. Ruge reaksjoner i en thermocycler som kjører følgende program: 37 ° c for 20 s; 26 sykluser (37 ° c i 3 min; 16 ° c i 4 min); 50 ° c i 5 min; 80 ° c i 5 min. Transformer Golden Gate reaksjoner på Escherichia coli og plate på lb medium21 som inneholder Ampicillin (50 mg/l), X-gal (200 mg/l) og ipth (1 mm).
      Merk: Forbered lager løsninger av IPTH og X-gal i ultra-rent vann og dimethylformamide, henholdsvis. Filter sterilisere Ampicillin og IPTH lager løsninger og lagre alle aksjer ved-20 ° c. Bruk hansker ved håndtering av dimethylformamide.
    5. Velg hvite kolonier og Isoler plasmider ved hjelp av et kommersielt plasmider isolasjons sett. Sekvens verifisere isolert plasmider før du fortsetter med Golden Gate nivå 2 montering.
  3. Monter nivå 2 Golden Gate konstruerer for stabil transformasjon.
    1. Utfør en Golden Gate-reaksjon ved å bruke nivå 1 AtU6p:: sgRNA-konstruksjoner (generert under avsnitt 2,2) i tillegg til pICH47802::NPTII, pICH47742:: 35SPro:: ΩNLS-aCas9:: 35Ster, nivå 2-Acceptor pICSL4723 og riktig (se engler et al.22). Utfør reaksjoner som følgende: Bruk ~ 100 fmol av hver giver vektor og ~ 20 fmol av Acceptor vektor og tilsett 2 μL av T4 ligase buffer, 2 μL av 0,1% BSA, 0,5 μL av BpiI, 0,5 μL av T4 ligase, fyll til 20 μL med ultra-rent vann.
      Merk: nivå 1 plasmider pICH47802::NPTII, pICH47742:: 35SPro:: ΩNLS-aCas9:: 35Ster må klonet først (se tilleggsfil 1), som er beskrevet for sgRNAs under avsnitt 2,220,22 ,23.
    2. Ruge reaksjoner som under trinn 2.2.4 og forvandle seg til E. coli. Plate på LB medium som inneholder kanamycin. Neste dag, Velg hvite kolonier og isolere plasmider. Bestem riktig plasmider forsamlingen av restriksjon-fordøyelsen analyse.
  4. Transformer nivå 2 konstruerer til Agrobacterium tumefaciens stamme AGL124.

3. stabil transformasjon av P. andersonii

  1. Vaksinere 2 LB plater inneholder riktig antibiotika med A. tumefaciens stamme AGL1 forvandlet med konstruere av interesse. Ruge plater ved 28 ° c i 2 dager.
  2. Harvest unge grener fra drivhus dyrket trær. Bruk ca 5 grener av 5-8 cm i lengde for hver transformasjon. Sørg for å bare bruke sunne ikke-infiserte grener. Fjern bladene ved å kutte dem som sådan at ~ 1 cm2 av blad vev er igjen på slutten av hver petiole. Kast bladene.
  3. Desinfisere vevet i 15 min ved hjelp av 1:1-fortynnet kommersiell blekemiddel (~ 2% natriumhypokloritt etter fortynning) som inneholder noen få dråper polysorbat 20. Skyll deretter vevet 6 ganger med autoklaveres vann.
    Notedenne steg, likeledes idet, det fulgte skritt nød å bli gjennomført innenfor en laminær ned-flyte skap å oppbevare tissue steril.
  4. Re-suspendere A. tumefaciens cellene fra 1-2 plater i 25 ml av infiltrasjon medium (se tabell 1) som inneholder acetosyringone (20 mg/L) og et ikke-ioniske overflateaktivt middel (0,001% v/v) for å nå en optisk tetthet (OD600) på ~ 5.
    Merk: Forbered acetosyringone lagerløsning i 70% etanol og oppbevares ved-20 ° c. Den ikke-ioniske overflateaktivt middel må filter-steriliseres før du legger til infiltrasjon medium.
  5. Skjær både stammen og petiole vev i biter av ~ 1 cm i lengde inne i A. tumefaciens suspensjon, og dermed skape friske sår på begge sider. La vev brikker i A. tumefaciens suspensjonen for 10-30 min.
  6. Klargjør rooting-mediet (se tabell 1) og Legg til acetosyringone (20 mg/L) etter autoklavering. Tørt vev brikker på en steril stykke filter papir og legg den på mediet (~ 10 explants/plate). Ruge plater i mørket ved 21 ° c i 2 dager.
    Merk: La mediet avkjøles til ~ 60 ° c før du legger til acetosyringone.
  7. Etter 2 dager, inspisere plater for sopp eller åpenbare bakteriell forurensning (bakterier enn A. tumefaciens). Forurensede plater må kastes.
  8. Klargjør flytende SH-10 medium (se tabell 1). Etter autoklavering, tilsett polysorbat 20 (0,01%, v/v). Overfør vevs deler til 10 mL SH-10 som inneholder polysorbat 20. I løpet av en periode på minst 10 min, forsiktig agitere hver 2-3 min å vaske vevet.
  9. Vask to ekstra ganger med fersk SH-10 som inneholder polysorbat 20. Disse tider, en 2-3 min inkubasjonstid per vask trinn er nok.
  10. Klargjør rooting-mediet (se tabell 1). Etter autoklavering legger du til cefotaksim (300 mg/L) og kanamycin (50 mg/L) og helle plater. For sekundære transformasjoner (transformasjoner av transgene kanamycin linjer), Påfør hygromycin (15 mg/L) valg.
  11. Tørre vevs brikker på sterile biter av filter papir. Etterpå, overføre vev stykker til platene utarbeidet i trinn 3,9.
  12. Ruge plater i 7 dager ved 28 ° c, 16 h:8 h dag: natt. Hver 2 dager sjekk plater for sopp eller bakteriell forurensning og overdreven vekst av A. tumefaciens. I tilfelle av forurensning, overføre ikke-infiserte brikker til en frisk plate.
  13. Etter 7 dager, Overfør vevs bitene til forplantning medium (se tabell 1) som inneholder cefotaksim (300 mg/l) og kanamycin (50 mg/l). Ruge plater ved 28 ° c, 16 h:8 h dag: natt. Oppdater platene en gang i uken til transgene shoots utvikler seg. Sørg for å bare overføre ikke-infiserte vev stykker til friske plater. Kast brikkene som er overgrodd av A. tumefaciens.
  14. Når påstått-transgene skudd er ≥ 1 cm i lengde, kutt skudd og kultur dem uavhengig i forplantning medium som inneholder cefotaksim (300 mg/L) og kanamycin (50 mg/L). For å sikre at skuddene representerer uavhengige transformants, ta bare ett skudd fra hver side av en explant.
  15. Vegetativt spre påstått-transgene skudd som beskrevet under trinn 5,2.

4. genotyperingteknologi av påstått-transgene shoots

  1. Design primere som spenner over sgRNA anerkjennelse nettsted (r). For å tillate PCR amplicon sekvensering, Velg grunning 150-250 BP bort fra sgRNA anerkjennelse nettsted (r).
  2. Skjær et blad spissen (~ 5 mm) fra hver transgene shoot å være genotyped. Også høste en vill-type kontroll prøve.
  3. Utfør 50 μL PCR-reaksjoner ved hjelp av primere som er utformet i trinn 4,1 og et kommersielt sett for å forsterke DNA direkte fra plante prøver. PCR-reaksjoner kan også utføres på renset DNA ved hjelp av en High-Fidelity polymerase.
  4. Separate PCR-amplicons på en 1,5-2% agarose gel.
  5. Analyser resultatene fra gel elektroforese. Se etter prøver som produserer flere bånd (mer enn 1 allel) og PCR-amplicons med størrelser forskjellig fra vill type, som indikerer tilstedeværelsen av mellom store indeler.
  6. Sekvens PCR-amplicons for å identifisere de eksakte mutasjoner. For prøver som produserer en enkelt PCR-amplicon, kan PCR-produkter settes i rekkefølge direkte. Prøver som produserer mer enn 1 bånd etter gel elektroforese eller som synes å være heterozygot etter direkte sekvensering av PCR-amplicon, må klonet i en stump-end kloning vektor først. Deretter sekvens flere kloner for hver prøve å identifisere alle mulige alleler stede i utvalget.
  7. Juster sekvensering resultater til genet av interesse og inspisere justeringen å se etter mutasjoner i nærheten av sgRNA målområde (r). Deretter kontrollerer du om disse mutasjoner skaper frameshifts. Kast linjer med > 2 alleler, og linjer som inneholder i-ramme mutasjoner.
  8. Velg flere linjer for videre analyse.
  9. Overfør valgte linjer som beskrevet under trinn 5,2.
  10. Når linjer har utviklet flere nye skudd, ta nye prøver fra ≥ 3 Leaf tips og gjenta trinn 4.3-4.7. Bestem om mutasjoner som finnes i hvert av prøvene som stammer fra samme linje i tillegg til den opprinnelige PCR-prøven er identiske. Linjer som gir samme mutasjoner i alle prøvene er homogent mutert og kan brukes til videre eksperimentering. Forkast linjer som ikke gir de samme resultatene som disse linjene er chimeric.

5. utarbeidelse av forankret P. andersonii Plantlets for eksperimentering

  1. Initiere en ny vev kultur linje av P. andersonii.
    1. Harvest aksillær knopper, unge adventitious skyter eller blad vev fra friske trær. Alternativt kan frøplanter brukes som utgangsmateriale.
    2. Desinfisere vevet ved hjelp av 1:1-fortynnet kommersiell blekemiddel (~ 2% natriumhypokloritt etter fortynning) som inneholder noen få dråper polysorbat 20 i 15 min. etterpå, skyll vevet 6 ganger ved hjelp av autoklaveres vann.
      Notedenne steg, likeledes idet, det fulgte skritt nød å bli gjennomført innenfor en laminær downflow eller laminær crossflow skap å oppbevare tissue steril.
    3. Overfør vev til forplantning medium (se tabell 1). Stenger plater med 2 lag elastisk tetting folie og ruge plater ved 28 ° c, 16 h:8 h dag: natt.
    4. Inspiser platene hver noen dager i løpet av de første 2 ukene for å sikre at vevet er fri for sopp eller bakteriell forurensning.
  2. Overfør vev ved å plassere ~ 10 skudd på en frisk plate av forplantning medium og Lukkeplate med 2 lag med elastisk tetting folie. Ruge plater ved 28 ° c, 16 h:8 h dag: natt. Gjenta dette trinnet hver 4 uker.
  3. Når skuddene er > 1 cm i lengde, kutt skyter på sin base og plassere dem på rooting medium (se tabell 1). Ca 10 skudd kan plasseres på en enkelt rooting plate. Stilling skyter oppreist ved å sette basal spissen av skyte inn i mediet. Røttene vises på 10-14 dager etter inkubasjons av platene ved 28 ° c, 16 h:8 h dag: natt.
    Merk: ikke rot alle skuddene, men holde en del for vev kultur forplantning (se trinn 5,2).

6. Nodulation av P. andersonii Plantlets i potter

  1. Forbered Rhizobium inokulum.
    1. Vaksinere 10 mL flytende YEM medium (se tabell 2) fra en enkelt koloni av Mesorhizobium plurifarium BOR26 og ruge ved 28 ° c i 2 dager.
      Merk: M. plurifarium BOR2 er foretrukket som det effektivt nodulates P. andersonii. Imidlertid kan andre Rhizobium stammer også brukes for nodulation av P. andersonii (f. eks Bradyrhizobium elkanii WUR325, Rhizobium Ariosto CIAT89926,27 eller Bradyrhizobium Sp. Kelud2A4).
    2. Bruk 10 mL kultur for å vaksinere et større volum av flytende YEM medium. Volumet av denne kulturen er avhengig av antall Potter som må inokulert.
    3. Klargjør flytende EKM-medium (se tabell 3, bord 4). Sentrifuger bakterie kulturen i 10 min ved 3 500 x g for å høste cellene. Deretter, re-suspendere bakteriell pellet i flytende EKM (bruk omtrent samme volum som den opprinnelige YEM kulturen) og bestemme den optiske tettheten (OD600).
  2. For ~ 20 Potter, forberede 3 L flytende EKM medium og vaksinere med rhizobial suspensjon forberedt på trinn 6.1.3. for å nå OD600 = 0,025.
  3. Bland 3 L av EKM inneholdende rhizobia med 1 250 g Perlite. Deretter legger 210 g av denne blandingen til sterile gjennomsiktige polypropylen potter. Alternativt, i stedet for Perlite, bruke sand som et substrat for nodulation analyser.
  4. Plant 1-3 P. andersonii plantlets i hver pott. Også forberede flere Potter som inneholder P. andersonii plantlets FORVANDLET med CRISPR-kontroll konstruere (se supplerende tabell 1). Veie flere Potter for å kunne bestemme vanntap under eksperimentet. Dekk bunnen av hver pott for å skjerme røttene fra lys eksponering.
  5. Ruge potter i en klimatisert vekst rom (28 ° c, 16 h:8 h dag: natt) for 4-6 uker. En gang i uken, veie flere Potter å bestemme vanntap. Hvis vanntap overstiger 10 mL, supplere med ultra-rent vann for å kompensere for tapet.
  6. Etter 4-6 uker, rense røttene fra Perlite og bestemme nodule tall ved hjelp av en kikkert å undersøke nodulation effektivitet.

7. Nodulation av P. andersonii Plantlets på plater

  1. Forbered cellofan membraner 28og andre.
    1. Skjær cellofan membranen for å passe inn i et kvadrat 12 cm x 12 cm Petri parabolen. Skjær membraner litt kortere på toppen for å tillate plass til skuddene å vokse.
    2. For å øke permeabilitet av cellofan membraner, kok membraner i EDTA-løsning (1 g/L) i 20 min. etterpå, skyll minst 6 ganger med demineralisert vann for å fjerne EDTA.
      Merk: som tørr membran har en tendens til å rynke når du er i kontakt med vann, Senk de tørre membraner en etter en i løsningen.
    3. Ordne membraner horisontalt i et tynt lag av vann i en rund glassplate. Sterilisere membraner ved autoklavering to ganger.
  2. Plasser 1 autoklaveres cellofan membran på en firkant 12 x 12 cm Petri parabolen inneholder agar-befestet EKM medium (se tabell 3, tabell 4). Plasser to 3-ukers gamle forankret P. andersonii plantlets (se pkt. 5) eller 4-ukers gamle frøplanter (se avsnitt 1,1) på toppen av membranen. Sørg for å bare plukke plantlets eller frøplanter med røtter som har hvit rot tips, som indikerer at disse røttene er fortsatt økende.
  3. Forsiktig dekke røttene med en andre cellofan membran, skaper en sandwich lag. Forsegle platen med 3 lag elastisk forsegling folie. Pakk den nederste halvdelen av platene med aluminiumsfolie, for å dekke røttene fra lys eksponering.
  4. Ruge platene i en klimatisert vekst rom (28 ° c, 16 h:8 h dag: natt) for 3-4 uker. Merk plasseringen av rot tips for å følge rot veksten over tid.
  5. Hvis EKM platene begynner å tørke ut på grunn av forlenget inkubasjons, overføre plantene til friske EKM plater noen dager foran bakteriell inoculation.
  6. Klargjør bakteriell inokulum som beskrevet i trinn 6,1.
  7. Fjern den øverste cellofan membranen og påfør 1 mL Rhizobium kultur (OD600 = 0,025) til røttene. Deretter plasserer en ny cellofan membran på inokulert røtter. Vikle utsiden av platen ved hjelp av aluminiumsfolie for å dekke røttene fra lys eksponering.
  8. Etter 4 uker, undersøke nodule tall ved hjelp av en kikkert å bestemme nodulation effektivitet.

8. Nodulation av P. andersonii frøplanter i porsjon

  1. Spire P. andersonii frø som beskrevet i avsnitt 1,1. Etter at cotyledons har helt dukket opp (~ 12 dager på SH-0 plater ved 28 ° c), overføre frøplanter til poser.
  2. For å forberede poser, rive brettet delen av papiret Wick og tilsett 7 mL av modifisert EKM medium (se tabell 3, tabell 4).
  3. Sett inn 1 eller 2 frøplanter ved å plassere røttene i mellom begge ark som danner papiret Wick og fronten plast ark av posen.
  4. Skjerme røttene fra lys eksponering, ved folding aluminiumsfolie rundt posen. Suspendere poser i en plastboks dekket med et gjennomskinnelig lokk for å opprettholde høy luftfuktighet. Plasser boksen i et klimatisert vekst rom (28 ° c, 16 h:8 h dag: natt).
  5. Kompensere for vann fordampning ved å tilsette sterilt ultra-rent vann, som sådan at papiret Wick forblir fuktig (unngå stående vann i bunnen av posen). Etter den første uken, dette krever vanligvis legge 2-3 ml hver 4 dager.
  6. Klargjør bakteriell inokulum som beskrevet i trinn 6,1.
  7. Etter at frøplanter har blitt dyrket i 10-12 dager i poser, vaksinere rotsystemet med 500 μL av Rhizobium kultur (OD600 = 0,025).
  8. Følg nodule formasjon gjennom tiden. Fire uker etter inoculation kan knuter telles og høstes for å fastslå nodulation effektivitet.

9. nodule Cytoarchitecture analyse

  1. Samle 10-15 knuter i et 2 mL rør som inneholder bindemiddel (5% glutaraldehyde i 0,1 M fosfat buffer, pH 7,2). Påfør vakuum for 1/2-1 h og ruge over natten ved 4 ° c. I løpet av denne perioden, prøvene synke til bunnen av røret.
    Merk: bindemiddel-løsningen kan oppbevares ved 4 ° c i ~ 2-4 uker før bruk. Pass på at du bruker hansker når du arbeider med vevs bindemiddel.
  2. Vask knuter 2x med 0,1 M fosfat buffer, pH 7,2. Påfør 10 min intervaller mellom hvert vasketrinn.
  3. Tørke prøvene ved senere incubating i 30%, 50%, 70%, og 100% etanol. For å sikre at alt vann er fjernet fra prøvene, gjenta 100% etanol trinn 3x. Påfør 10 min intervaller mellom hvert dehydrering trinn.
  4. Forbered polymerisering blanding I (PM-I) ved å legge 1 pakke med Herder I til 2,5 mL PEG400 blandet med 100 mL HEMA (2-hydroxyethyl akrylat)-basert harpiks løsning. Rør løsningen for ~ 15 min å fullstendig oppløse Herder I. Deretter lagrer PM-I ved-20 ° c.
  5. Fjern etanol fra trinn 9,3. og infiltrere prøvene i følgende rekkefølge: PM-I:100% etanol (1:3, v/v), PM-I:100% etanol (1:1, v/v) og PM-I:100% etanol (3:1, v/v). Ruge prøvene i hver løsning på RT for 1/2-1 h eller til prøvene synke til bunns.
  6. Ruge prøver over natten ved 4 ° c i 100% PM-I løsning.
  7. Forbered polymerisering blanding II ved å blande PM-I og herder II i en 15:1 (v/v) ratio. Fyll plast mold med polymerisering løsning, orientere prøvene horisontalt på bunnen av mold, og dekk med et stykke elastisk tetting folie. Unngå dannelse av luftbobler.
    Merk: da løsningen begynner å polymeres ved eksponering for RT, prøv å orientere prøvene så raskt som mulig i plast holderen. Polymerisering er fullført etter natten inkubasjons på RT, eller 1 t ved 37 ° c.
  8. Fjern det elastiske tetnings folie dekselet fra trinn 9,7 og sett en holder til polymerisert prøvene. For å montere holderen til prøvene, oppløse 10 mL av methyl akrylat-basert harpiks pulver i 5 mL metyl akrylat harpiks løsning. Raskt legge løsningen til hullet i toppen av holderen.
    Merk: Utfør det polymerisering trinnet i avtrekks panseret (~ 30 min ved RT).
  9. Fra mikrotomen til en tykkelse på 4-5. Plasser et mikroskop bilde på en varmeplate på 58 ° c, og Legg til en stor dråpe vann i hvert lysbilde. Plasser delene på toppen av vannet. Når vannet har fordampet, vil delene festes til lysbildet.
  10. Beis lysbilder ved å fordype i 0,05% (w/v) toluidine blå i 2 min. Deretter skylle lysbilder 3x med ultra-rent vann. Lysbilder kan observeres ved hjelp av et lys-felt mikroskop.

10. Mycorrhization av P. andersonii Plantlets

  1. Forbered Rhizophagus irregularis sporer ' inokulum
    1. Forbered en stabel med polyester vevd filtre med følgende størrelser (topp til bunn): 210 μm, 120 μm, og 36 μm mesh størrelse.
    2. Pipetter den nødvendige mengden av en kommersiell spore suspensjon på stakken av polyester filtre. Skyll filtrene 3x med 100 mL autoklaveres demineralisert vann. Sporene beholdes på overflaten av 36 μm filter.
      Merk: klargjør spore-fjæringen i laminær crossflow kabinett for å hindre forurensning.
    3. Demonter polyester stabelen og hold bare 36 μm filter. Gjenta vaske trinnet med autoklaveres demineralisert vann i minst 6 ganger.
    4. Plasser filteret på en Petri parabolen og re-suspendere sporer i autoklaveres demineralisert vann. Bruk et volum av vann lik volumet av spore suspensjonen som brukes i trinn 10.1.2. Overfør spore-fjæringen til et sterilt rør ved pipettering.
    5. Plasser 5 dråper 20 μL av spore-fjæringen på et glass lysbilde og Tell antall sporer med et skarpt mikroskop. Konverter spore teller inn i et forhold av sporer/mL og fortynne spore suspensjonen til den når 250 sporer/mL. Oppbevar spore-fjæringen ved 4 ° c.
  2. Utfør mycorrhization analysen. For dette formål, tilsett 800 g autoklaveres sand supplert med 70 mL 1/2-Hoagland medium til sterile gjennomsiktige polypropylen Potter (se tabell 5-6). Bland sand og medium direkte i potten ved å riste kraftig.
  3. Plasser en P. andersonii plantlet i hver pott, og Pipetter 1 ml av spore suspensjonen direkte på roten av P. andersonii plantlet. Sørg for å inkludere flere Potter som inneholder P. andersonii plantlets transformert med en CRISPR-kontroll-konstruksjon (se supplerende tabell 1).
  4. Ruge potter i et klimatisert vekst rom (28 ° c, 16 h:8 h dag: natt) i 6 uker.
  5. Ta ut plantene fra pottene og vask røttene med rennende vann for å fjerne så mye sand som mulig.
  6. Skjær røtter i 1 cm lange biter og kok roten brikker i 10% KOH (w/v) i 20 min ved 90 ° c. Deretter plasserer kokte røtter på en celle sil med en 100 μm mesh størrelse og skyll 3x med 50 mL vann.
  7. Stain røtter med 0,05% (w/v) trypan blå i lactoglycerol (300 mL av melkesyre; 300 mL glyserol, og 400 mL demineralisert vann) i 5 min ved 90 ° c i et vannbad eller varme blokk. Deretter overføre røtter til 30% glyserol. Rot prøvene kan lagres ved RT.
  8. Plasser 15-25 rot fragmenter på ett enkelt mikroskop lysbilde. Tilsett 30% glyserol og dekk med et deksel glass og trykk til roten brikkene blir flat. Observer roten fragmenter ved hjelp av en lys-feltet mikroskop og scorer mycorrhizal kolonisering.
    Merk: en metode for å score mycorrhization er beskrevet i henhold til Trouvelot et al.29. Denne metoden bruker flere klasser (% F,% M og% A), som gir rask estimering av nivået av mycorrhizal kolonisering av hvert rot fragment og overflod av arbuscules.

Representative Results

P. andersoniiRees kan dyrkes i et betinget drivhus ved 28 ° c og ~ 85% relativ fuktighet (figur 1a). Under disse forholdene, trær starte blomstring på 6-9 måneder etter planting. Kvinne P. andersonii blomster produserer bær som hver inneholder en enkelt frø. Under modning, bærene endre farge; først fra grønt til hvitt og deretter fra hvit til brun (figur 1B). Frø Hentet fra den modnet brune bær, spirer godt etter en 10-dagers temperatur syklus og en 7-dagers inkubasjons på SH-0 plater (figur 1C). Spirer frø fortsetter å utvikle seg til unge frøplanter som kan brukes til eksperimentering etter ~ 4 uker (figur 1d).

Vi har tidligere vist at petioles og segmenter av unge P. andersonii stengler kan effektivt transformeres ved hjelp av A. tumefaciens stamme AGL110. Ved starten av transformasjon prosedyren, vevet explants er co-dyrket med A. tumefaciens for 2 dager ved 21 ° c (figur 2a). Langvarig co-dyrking resulterer i over-kolonisering av vevet explants av A. tumefaciens og bør derfor forebygges (figur 2b). Etter co-dyrking perioden, vev explants overføres til selektiv Media, som fremmer utvekst av transformert vev. To til tre uker senere, små grønne mikro-calli er generelt observert langs den opprinnelige såret overflaten (figur 2C). Disse calli skal fortsette å vokse og utvikle 1 eller flere påstått skudd på 6-8 uker etter at transformerings prosedyren er igangsatt (figur 2D). På dette stadiet, transformasjon effektivitet vanligvis spenner fra ~ 10-30% for transformasjoner initiert med vev explants tatt fra modne og delvis Woody grener (Tabell 7). Hvis transformasjoner er initiert med explants tatt fra de unge og raskt voksende tips av grener som ennå ikke bærende blomster, transformasjon effektiviteten av ~ 65-75% kan oppnås (Tabell 7). Noen ganger, hvitaktig calli dannes på siden av en explant som ikke er i kontakt med mediet, og derfor ikke oppleve kanamycin utvalg. Disse calli er ofte ikke transgene og noen skudd dannet fra disse calli vil generelt bleke og dø etter direkte kontakt med kanamycin medium (figur 2e). I tilfelle transformasjon rate er lav og/eller utgangsmaterialet var suboptimal, kan tissue stykker bli brun (figur 2F) og lider av over-spredning av A. Tumefaciens (figur 2g). For å hindre at A. tumefaciens sprer seg og gjengroing nærliggende explants, er det nødvendig med regelmessige forfriskninger av mediet, og alvorlig smittet explants må fjernes. Når individuelle transgene shoots er plassert i forplantning medium, over-spredning av A. tumefaciens er vanligvis ikke forekommer lenger (figur 2h). Transgene shoots kan multipliseres gjennom in vitro forplantning, som vil gi opphav til titalls skudd i en periode på en måned (Figur 3a-B). Disse skuddene kan plasseres på rooting medium, som skal indusere rot formasjon etter ~ 2 uker (Figur 3C-D). Forankret plantlets kan senere brukes til eksperimentering.

For å lage knockout mutant linjer, gjør vi bruk av CRISPR/Cas9-mediert mutagenese. For dette formål gjør vi bruk av en binær vektor som inneholder kanamycin motstand genet NPTII, en Cas9-koding sekvens drevet av CaMV35S arrangøren og 2 sgRNAs per mål genet som er uttrykt fra ATU6P liten RNA promoter20. En grafisk representasjon av konstruksjonen som brukes for CRISPR/Cas9-mediert mutagenese av P. andersonii er gitt i figur 4a. Ved hjelp av denne metoden, er det observert en redigering i ~ 40% av påstått-forvandlet skudd10. For å identifisere mutant linjer, er påstått-forvandlet skudd genotyped for mutasjoner på sgRNA målområde (r) ved hjelp av primere som spenner over den målrettede regionen. Et eksempel på de forventede resultatene er gitt i Figur 4. Som kan sees fra bildet tatt etter gel elektroforese, flere prøver produsere en PCR amplicon med tilsvarende størrelse til Wild type (figur 4b). Disse plantene kan inneholde små indeler som ikke kan bli visualisere av agarose gel elektroforese eller forbli uredigerte av Cas9 enzymet. I tillegg gir flere prøver ut band som er forskjellige i størrelse fra den ville typen (for eksempel linje 2, 4, 7 og 8 i figur 4b). I disse linjene, 1 (linje 4, 7 og 8) eller begge (Line 2) alleler inneholder større indeler som lett kan visualisere. Den eksakte arten av mutasjoner på målområdet (e) er avslørt etter PCR amplicon sekvensering. Som kan sees fra figur 4c, både små indeler av 1-4 BP, så vel som, større slettinger kan FÅS etter CRISPR/Cas9 mutagenese. I figur 4cer sekvensen for linje 1 identisk med den ville typen, noe som indikerer at denne linjen ikke kan redigeres, og derfor bør forkastes. Blant de linjene som inneholder mutasjoner, heterozygot, homozygote og bi-allel mutanter kan identifiseres (figur 4c). Men heterozygot mutanter er generelt sjeldne10. Homozygote eller bi-allel knockout mutanter kan spres vegetativt å få tilstrekkelig materiale for fenotypiske analyse. Siden fenotypiske analyse utføres i generering av T0 , er det viktig å kontrollere om det kan være chimeric mutant linjer. For dette formål må genotyperingteknologi gjentas på minst 3 forskjellige prøver tatt fra hver mutant linje. Hvis genotyperingteknologi resultatene er identiske med hverandre og den opprinnelige genotyperingteknologi prøven (f. eks, linje 8 i figur 4d), linjen er homogent mutert og kan brukes for videre analyse. Men hvis de genotyperingteknologi resultatene varierer mellom selvstendige prøver (f. eks linje 4 i figur 4d), er den muterte linjen chimeric og må kastes.

Inoculation av P. andersonii med M. plurifarium BOR2 resulterer i dannelsen av rot knuter (figur 5). Som det kan sees i figur 5a, er disse knuter fordelt langs rotsystemet. Knuter av P. andersonii er lys brun i fargen, men kan lett diskriminert fra rot vevet basert på deres form (figur 5B). Inoculation eksperimenter i Potter og påfølgende vekst for 4-6 uker vanligvis resultere i dannelsen av ~ 10-30 knuter (figur 6a). Et tilsvarende antall knuter dannes etter inoculation av EKM plate dyrket P. andersonii plantlets ved 4 uker etter inoculation (figur 6a). I poser, P. andersonii frøplanter vanligvis form ~ 5-15 knuter på 5 uker etter inoculation (figur 5C-D, 6a). For å analysere nodule cytoarchitecture kan knuter delt og observeres ved hjelp av lyse felt mikroskopi. Figur 6b viser et eksempel på en langsgående del gjennom midten av en P. andersonii nodule. Denne delen viser den sentrale vaskulære bunt av en P. andersonii nodule, som er flankert av nodule fliker som inneholder infiserte celler (figur 6b).

P. andersonii plantlets kan også være mycorrhized. Etter 6 uker med inoculation med R. irregularis, mycorrhizal kolonisering frekvens vanligvis når > 80% (figur 6C). På dette tidspunktet punkt, generelt ~ 30% av cellene inneholder arbuscules (figur 6C). Et representativt bilde av et P. andersonii rot segment som inneholder arbuscles, vises i figur 6D.

Figure 1
Figur 1: representative bilder av en P. andersonii Tree, frø og frøplanter. (A) seks måneders gammel P. andersonii treet dyrkes i potting jord i et klimaanlegg ved 28 ° c. (B) representative bilde som viser P. andersonii bær på ulike stadier av modning. Young P. andersonii bær (umoden) vil endre farge fra grønt til hvitt og til slutt til brun (moden) ved modning. (C) P. andersonii frø inkubert på sh-0 medium for 1 uke. En svart sirkel indikerer en spirer frøplante. (D) fire ukers gamle P. andersonii frøplanter dyrket i sh-0 medium. Skala stolpene er lik 25 cm (A) og 1 cm i (B-D). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: representative bilder av explants på ulike stadier av stabil transformasjon prosedyre. (A) Explant co-dyrket med A. tumefaciens. (B) Explant overgrodd av A. tumefaciens i løpet av de første 2 ukene etter transformasjon. (C) transgene mikro-Callus dannet nær såret stedet av en explant på 2,5 uker etter dyrking. (D) representativt bilde av en explant ved 6 uker etter dyrking som viser fremveksten av skudd fra (transgene) calli. (E) representative bilde av et skudd som blir hvitaktig og til slutt dør når i direkte kontakt med kanamycin-inneholdende medium. Dette skyter er mest sannsynlig ikke-transgene og rømte kanamycin valg når festet til explant. (F) representative bilde av en mislykket transformert explant. (G) representative bilde av en mislykket forvandlet explant overgrodd av A. tumefaciens. (H) enkel transgene Shoot vokst på forplantning medium ved 8 uker etter dyrking med A. tumefaciens. Skala stenger lik 2,5 mm. bokser som inneholder grønne haker eller Røde Kors indikerer vellykket eller mislykket transformasjon av explants. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: representative bilder av in vitro forplantning. (A) skyter vokst på forplantning medium. Bildet ble tatt 1 uke etter at platene ble oppdatert. (B) skyter vokst på forplantning medium. Bildet ble tatt 4 uker etter at platene ble oppdatert. (C) fersk kuttet skyter plassert på rooting medium. (D) skyter inkubert på rooting medium for 2 uker. Legg merke til tilstedeværelsen av røtter. Scale barer er lik 2,5 cm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: representative resultater etter genotyperingteknologi av P. andersonii T0 transgene CRISPR/Cas9 mutant linjer. (A) representative kart over en binær vektor som brukes for CRISPR/Cas9-mediert mutagenese av P. andersonii. (B) representativt resultat etter PCR-basert genotyperingteknologi av potensielle CRISPR/Cas9 mutant linjer ved hjelp av primere som spenner over sgRNA målområde (r). Vist er et bilde etter agarose gel elektroforese av amplicons. Prøver tatt fra individuelle transgene linjer indikeres av tall. Wild type (WT) og ingen mal kontroll (NTC) indikerer baner som inneholder positive og negative kontroller, henholdsvis. (C) skjematisk fremstilling av mutant alleler oppnådd etter CRISPR/Cas9-mediert genredigering. Uthevet i blå og røde farger er sgRNA målnettsteder og PAM sekvenser, henholdsvis. (D) representativt resultat etter PCR-basert screening for potensielle chimeric mutant linjer. Vist er et bilde etter agarose gel elektroforese av 3 individuelle prøver tatt fra mutant linjer 4 og 8. Vær oppmerksom på at transgene mutant linje 4 er chimeric. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: representative bilder av nodulation analyser i tallerkener og poser. (A) Nodulation på plater som inneholder agar-befestet EKM medium og inokulert med M. plurifarium BOR2 i 4 uker. (B) representativt bilde av en P. andersonii root-nodule. Bildet ble tatt på 4 uker etter inoculation med M. plurifarium BOR2. (C) Nodulation i poser som inneholder flytende EKM medium. Frøplanter ble inokulert med Bradyrhizobium Sp. Kelud2A4 i 5 uker. (D) representativt bilde av et komplett oppsett som brukes for nodulation i poser. Vektstenger er lik 2,5 cm i (A, C), 1 mm i (B) og 5 cm i (D). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: representative resultater av nodulation og mycorrhization analyser. (A) representative søylediagram som viser antall knuter dannet per plante ved 4 uker etter inoculation med M. plurifarium BOR2 i potter eller på tallerkener og ved 5 uker etter inoculation med Bradyrhizobium Sp. Kelud2A4 i poser. Data representerer gjennomsnittlig ± SD (n = 10). (B) representative bilde av en langsgående del gjennom en nodule dannet ved 4 uker etter inoculation med M. plurifarium BOR2. Seksjonen er farget med toluidine blå. (C) representative søylediagram som viser kvantifisering av mycorrhization. Variabler som kvantifisert i henhold til Trouvelot et al.29 er F, frekvensen av analyserte rot fragmenter som er mycorrhized; M, intensiteten av infeksjonen; A, overflod av modne arbuscules i det totale rotsystemet. Mycorrhization ble kvantifisert på 6 uker etter inoculation med R. irregularis (stamme DAOM197198). Data representerer gjennomsnittlig ± SD (n = 10). (D) representative bilde av modne arbuscules tilstede i P. andersonii root kortikale celler ved 6 uker etter inoculation med R. irregularis. Scale barer lik 75 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Sammensatte SH-0 SH-10 Forplantning medium Rooting medium Infiltrasjon medium
SH-basal salt medium 3,2 g 3,2 g 3,2 g 3,2 g 3,2 g
SH-vitamin blanding 1 g 1 g 1 g 1 g 1 g
Sukrose - 10 g 20 g 10 g 10 g
BAP (1 mg/mL) - - 1 mL (4,44 μM) - -
IBA (1 mg/mL) - - 100 μL (0,49 μM) 1 mL (4,92 μM) -
NAA (1 mg/mL) - - - 100 μL (0,54 μM) -
1 M MES pH = 5.8 3 mL 3 mL 3 mL 3 mL 3 mL
1 M KOH Juster pH til 5,8 Juster pH til 5,8 Juster pH til 5,8 Juster pH til 5,8 Juster pH til 5,8
Daishin agar 8 g - 8 g 8 g -

Tabell 1: sammensetning av Schenk-Hildebrandt-baserte30 medier som brukes for å dyrke P. andersonii frøplanter, stabil transformasjon, og in vitro forplantning. Løs opp solide forbindelser i 750 mL ultra-rent vann før du legger til flytende bestander. Etterpå fyller hele medium til 1 L. Forbered BAP, IBA, NAA aksjer i 0,1 M KOH og lagre på-20 oC.

Før autoklavering:
Sammensatte Beløp per liter Endelig konsentrasjon
Mannitol 5 g 27,45 mM
MD-gluconate 5 g 22,92 mM
Gjærekstrakt 0,5 g -
MgSO4· 7H2O 0,2 g 0,81 mM
Nacl 0,1 g 1,71 mM
K2HPO4 0,5 g 2,87 mM
Etter autoklavering:
Sammensatte Beløp per liter Endelig konsentrasjon
1,5 M CaCl2 1 mL av 1,5 mM

Tabell 2: sammensetning av gjær-mannitol (YEM) medium som brukes for dyrking av Rhizobium. Juster pH til 7,0 og fyll med ultra-rent vann til 1 L. For å forberede agar-befestet YEM medium, tilsett 15 g microagar før autoklavering.

Før autoklavering:
Sammensatte Stock konsentrasjon Beløp per liter medium Endelig konsentrasjon
KH2PO4 0,44 til 5m Tilsett 2 mL 0,88 mM
K2HPO4 1,03 til 5m Tilsett 2 mL 2,07 mM
500x mikro-elementer lagerløsning - Tilsett 2 mL -
MES pH = 6.6 1 M fra Tilsett 3 mL 3 mM av
Hcl 1 M fra Juster pH til 6,6 -
Ultra-rent vann - Fyll til 990 mL -
Etter autoklavering:
Sammensatte Stock konsentrasjon Beløp per liter medium Endelig konsentrasjon
MgSO4· 7H2O 1,04 til 5m 2 mL med 2,08 mM
Na2so4 0,35 til 5m 2 mL med 0,70 mM
NH4no3 0,18 til 5m 2 mL med 0,36 mM
CaCl2· 2h2O 0,75 til 5m 2 mL med 1,5 mM
Fe (III)-citrate 27 mM 2 mL med 54 μM

Tabell 3: sammensetning av 1 L endret EKM medium31 brukt til P. andersonii nodulation-analysen. Sammensetningen av 500x lagerløsning er listet opp i tabell 4. For å forberede 2% agar-befestet EKM medium, tilsett 20 g Daishin agar før autoklavering. Autoklav den MgSO4· 7H2o, na2so4, CaCl2· 2h2O, og fe (III)-citrate aksjer for å sterilisere. Filtrer sterilisere NH4no3 Stock-løsning for å sterilisere.

Sammensatte Beløp per liter Stock konsentrasjon
MnSO4 500 mg 3,31 mM
ZnSO4· 7H2O 125 mg 0,43 mM
CuSO4· 5h2O 125 mg 0,83 mM
H3bo3 125 mg 2,02 mM
Na2MoO4· 2h2O 50 mg 0,21 mM

Tabell 4: sammensetningen av 500x lagerløsning som brukes for å utarbeide modifisert EKM-medium. Oppbevar mikro-elementene lagerløsning ved 4 ° c.

Forbindelser Stock konsentrasjon Beløp per liter medium Endelig konsentrasjon
K2HPO4 20 mM 1 mL av 0,2 mM
NH4no3 0,28 til 5m 10 mL 2,8 mM
MgSO4 40 mM 10 mL 0,4 mM
K2så4 40 mM 10 mL 0,4 mM
Fe (II)-EDTA 9 mM 10 mL 0,9 mM
CaCl2 80 mM 10 mL 0,8 mM
50x mikro-elementer lagerløsning - 10 mL -

Tabell 5: sammensetning av 1/2-Hoagland32 medium som brukes til mycorrhization analyser. Sammensetningen av 50x lagerløsning er listet opp i tabell 6. Forbered fe (II)-EDTA-løsningen ved å kombinere FeSO4· 7H2O (9 mm) og na2· EDTA (9 mM) i 1 lagerløsning, og oppbevares ved 4 ° c. Juster pH på mediet til 6,1 ved hjelp av 1 M KOH og fyll med ultra-rent vann til 1 L.

Forbindelser Beløp per liter Stock konsentrasjon
H3bo3 71,1 mg 1,15 mM
MnCl2· 4h2O 44,5 mg 0,22 mM
CuSO4· 5h2O 3,7 mg 23,18 μM
ZnCl2 10,2 mg 74,84 μM
Na2MoO4· 2h2O 1,2 mg 4,96 μM

Tabell 6: sammensetningen av 50x mikro-elementer lagerløsning som brukes for å forberede 1/2-Hoagland medium.

Alder på explants Transformasjon effektivitet
Unge 69,4 ± 6,2% (n = 2)
Modne 18,3 ± 10,2% (n = 15)

Tabell 7: virkningsgrad for transformasjon av P. andersonii. Her defineres transformasjon av effektivitet som prosentandelen av explants som dannes minst 1 transgene Callus eller skyter. Transformasjon effektivitet ble scoret på 6 uker etter transformasjon og er avbildet som gjennomsnittet ± SD. n indikerer antall transformasjon eksperimenter som transformasjon effektiviteten ble bestemt.

Tilleggsfil 1: oversikt over nivå 1 og nivå 2-konstruksjoner som brukes for CRISPR/Cas9-mutagenese. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Belgfrukter og den fjernt-relaterte Cannabaceae slekten Parasponia representerer de eneste to klader av plantearter i stand til å etablere et endosymbiotic forhold til nitrogen-fixing rhizobia og danner rot knuter. Sammenlignende studier mellom arter av begge klader er svært relevante for å gi innsikt i de viktigste genetiske nettverkene som tillater dette symbiose. For tiden er genetiske studier i hovedsak gjort i belgfrukter; spesielt de to modell artene M. truncatula og L. japonicus. For å gi en ekstra eksperimentell plattform og tilrettelegge komparative studier med en nodulating ikke-legume, beskriver vi her en detaljert protokoll for stabil transformasjon og omvendt genetiske analyser i P. andersonii. Den presenterte protokollen bruker in vitro forplantning av T0 transgene P. andersonii linjer, slik at fenotypiske analyse skal igangsettes innen 4 måneder etter A. tumefaciens co-dyrking. Dette er vesentlig raskere enn dagens protokoller som er etablert for stabil transformasjon av belgfrukter33. Dette gjør P. andersonii en attraktiv forsknings modell.

Protokollen som beskrives her, inneholder flere viktige trinn. Det første som angår frø spire. For å forberede P. andersonii frø for spire, frø må isoleres fra bær. Dette gjøres ved å gni bærene på et stykke silkepapir eller mot innsiden av en te sil. Denne prosedyren må utføres forsiktig for å hindre skade på frø pelsen. Hvis frøet pelsen blir skadet, blekemiddel kunne gå inn i frøet under sterilisering, noe som reduserer frø levedyktighet. Å bryte frø dormancy, frø er utsatt for en 10-dagers temperatur syklus. Men til tross for denne behandlingen, er spire ikke helt synkronisert. Vanligvis, de første frøene viser radicle fremveksten etter 7 dager, men andre kan ta flere dager lengre tid å spire.

Kritiske punkter i transformasjon prosedyren gjelder valg av Start materialet og varigheten av co-dyrking trinn. For å nå effektiv transformasjon, er det best å bruke sunne og unge stengler eller petioles av ikke-sterile drivhus dyrket planter som utgangsmaterialet. For å indusere veksten av unge grener, er det tilrådelig å trimme Parasponia trær hver 2-3 måneder og friske trær en gang i året. I tillegg må co-dyrking trinn skal utføres for 2 dager bare. Langvarig co-dyrking fremmer over-kolonisering av vev explants av A. tumefaciens og generelt reduserer transformasjon effektivitet. For å hindre over-kolonisering av A. tumefaciens det er også viktig å regelmessig oppdatere platene som explants er dyrket. I tilfelle over-kolonisering forekommer, kan vevs explants vaskes (se Seksjon 3,8) for å fjerne A. tumefaciens celler. Vi anbefaler å legge blekemiddel til SH-10 løsning som brukes til vask (endelig konsentrasjon: ~ 2% natriumhypokloritt). Det er viktig å merke seg at dette ekstra vaske trinnet kanskje ikke fungerer på tungt infiserte explants (figur 2b). I tilfelle en transformasjon med en CRISPR/Cas9 konstruere gir bare et begrenset antall påstått-transformert skudd eller hvis mutagenese av et bestemt gen er forventet å forårsake problemer i regenerering, er det tilrådelig å inkludere en tom vektor kontroll konstruere som den positive kontrollen. Til slutt er det viktig å sikre at alle transgene-linjer som velges er et resultat av uavhengige hendelser i T-DNA-integrasjon. Derfor instruerer vi til å ta bare ett påstått-transgene Shoot fra hver side av en explant. Vi innser imidlertid at dette reduserer det potensielle antallet uavhengige linjer. Hvis mange linjer er nødvendig, kan forskerne bestemme seg for å skille påstått-forvandlet calli fra den opprinnelige explants når disse calli er ≥ 2 mm i størrelse og kultur disse calli uavhengig. På denne måten kan flere linjer isoleres fra hver explant, noe som øker antall potensielle transgene linjer.

I den gjeldende protokollen, transgene linjer av P. andersonii spres vegetativt gjennom in vitro forplantning. Fordelen med dette er at mange transgene plantlets kan genereres på relativt kort tidsperiode. Imidlertid har denne metoden også flere begrensninger. For det første er vedlikeholdet av T0 transgene Lines gjennom in vitro forplantning arbeidsintensiv og kan føre til uønskede genetiske eller epigenetic endringer34,35. For det andre, T0 linjer fortsatt inneholde en kopi av t-DNA, inkludert antibiotikaresistens kassetten. Dette begrenser antall mulige re-transformasjoner, som ulike utvalgs markører er nødvendig for hver re-transformasjon. Foreløpig har vi bare testet transformasjon ved hjelp av kanamycin eller hygromycin utvalg (data ikke vist). Videre, tilstedeværelsen av Cas9-koding sekvens og sgRNAs i T0 transgene linjene kompliserer komplementering studier. Komplementering analyser er mulig, men krever sgRNA målområdet (e) for å være mutert som sådan at gen-redigering av komplementering konstruere er forhindret. For det tredje, en ulempe med å arbeide med T0 linjer er at CRISPR/Cas9 mutanter kan være chimeric. For å forhindre fenotypiske analyse av chimeric mutant linjer anbefaler vi at du gjentar genotyperingteknologi analysen etter in vitro-forplantning på minst 3 forskjellige skudd. Selv om antall chimeric mutanter innhentet ved hjelp av protokollen som er beskrevet her er begrenset, de er tidvis observert10. For å overvinne begrensningene ved å arbeide med T0 linjer, kan P. andersonii mutant linjer overføres generatively. P. andersonii trær er dioecious og vind-pollinated2. Dette betyr at hver transgene linje må manipuleres som sådan at mannlige og kvinnelige blomster er produsert på en enkelt person, og senere vokst som sådan at korset pollinering ikke oppstår. Som P. andersonii er en raskt voksende treet det krever en betydelig mengde plass i et tropisk drivhus (28 ° c, ~ 85% relativ fuktighet). Derfor, selv om det er teknisk mulig, er generative forplantning av P. andersonii transgene Lines logistisk utfordrende.

I protokoll seksjonen har vi beskrevet 3 metoder for nodulation av P. andersonii. Fordelen med platen og posen systemer er at røttene er lett tilgjengelig, som kan tillate flekk-inoculation av bakterier og etter nodule formasjon over tid. Imidlertid er plate systemet ganske arbeidsintensiv, noe som gjør det mindre egnet for store nodulation eksperimenter. En ulempe med posen systemet er at det er vanskelig å hindre sopp forurensning. Poser er ikke sterile, og derfor soppvekst er ofte observert på den øverste halvdelen av posen. Men dette påvirker ikke P. andersonii vekst, og derfor ikke forstyrrer nodulation analyser. I tillegg er posen systemet kun egnet for frøplanter. Til tross for flere forsøk, har vi ikke vært i stand til å vokse plantlets innhentet gjennom in vitro forplantning i poser.

P. andersonii omvendt genetikk rørledningen beskrevet her gir en betydelig forbedring i forhold til den eksisterende a. rhizogenes-basert root Transformation metode11. Ved hjelp av de beskrevne prosedyrene kan stabile transgene-linjer genereres effektivt og kan opprettholdes via in vitro-forplantning. I kontrast er A. rhizogenes transformasjon forbigående og resulterer bare i dannelsen av transgene røtter. Fordi hver transgene root resultater fra en uavhengig transformasjon, A. rhizogenes transformasjon-baserte analyser lider av betydelig fenotypiske variasjon. Denne variasjonen er mye mindre i tilfelle av stabile linjer, selv om in vitro forplantning også skaper noen grad av variasjon. På grunn av denne reduserte variasjonen og det faktum at flere plantlets kunne phenotyped for hver stabil linje, er stabile linjer mer egnet for kvantitative analyser sammenlignet med en. rhizogenes-forvandlet røtter. I tillegg er den stabile transformasjonen ikke avhengig av innføringen av A. rhizogenes root inducing geometriske (ROL) som påvirker den endogene hormonet balanse15. Derfor stabile linjer er bedre egnet for omvendt genetisk analyse av gener involvert i hormon homeostase sammenlignet med A. rhizogenes-forvandlet røtter. En mer generell fordel av P. andersonii som forsker modell er at det ikke opplever en nylig hele Genova DUPLISERING (WGD). Den legume Papilionoideae gruppe, som inkluderer modellen belgfrukter M. truncatula og L. Japonicus, samt Vierfamilien (rekkefølge Malpighiales) som inkluderer modelltreet Populus trichocarpa erfarne WGDs ~ 65 millioner år siden36,37. Mange paralogous Gene eksemplarer som følge av disse WGDs er beholdt i genomer av M. truncatula, L. japonicus og P. trichocarpa37,38,39, som skaper redundans som kan komplisere omvendt genetiske analyser. Ettersom p. andersonii ikke opplevde en nylig WGD, kan omvendt genetiske analyser på P. andersonii bli mindre påvirket av overflødig paralogous gen kopier.

Samlet gir vi en detaljert protokoll for omvendt genetisk analyse i P. andersonii. Ved hjelp av denne protokollen, kan enkelt mutant linjer effektivt genereres i en tidsramme på 2-3 måneder10. Denne protokollen kan utvides til å skape høyere orden mutanter gjennom multipleksing av sgRNAs målretting ulike gener samtidig, som vist for andre plantearter40,41,42. I tillegg er den stabile transformerings prosedyren som beskrives her, ikke begrenset til CRISPR/Cas9 gen målretting, men kan også brukes til å innføre andre typer konstruksjoner (f.eks. for promoter-reporter-analyser, svangerskap/formidling eller trans- komplementering). Vi etablerte P. andersonii som en komparativ forsknings modell for å studere mutualistic symbioses med nitrogen-fixing rhizobia eller endomycorrhizal sopp. Men protokollene beskrevet her også gi verktøy for å studere andre aspekter av biologi av dette tropiske treet, slik som tre dannelse, utvikling av bi-seksuelle blomster eller biosyntesen av Cannabaceae-spesifikke sekundære metabolitter.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne liker å anerkjenne Markus Youles, Sophien Kamoun og Sylvestre Marillonnet for å lage Golden Gate kloning deler tilgjengelig gjennom Addgene databasen. I tillegg vil vi gjerne takke E. James, P. Hadobas, og T. J. Higgens for p. andersonii frø. Dette arbeidet ble støttet av Nederland organisasjon for Scientific Research (NWO-VICI Grant 865.13.001; NWO-åpen konkurranse stipend 819.01.007) og departementet for forskning, teknologi og høyere utdanning i republikken Indonesia (RISET-PRO Grant 8245-ID).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sigma-Aldrich N0640 NAA
Duchefa Biochemie M1503.0250 MES
Sigma-Aldrich D134406 Acetosyringone
Duchefa Biochemie X1402.1000 X-Gal
Merck 101236 For nucleic acid electrophoresis gel
- - Pouches box material, hangers
Merck 101188 NH4NO3
Sigma-Aldrich B3408-1G BAP
Merck 100156 H3BO3
Thermo-Fisher ER1011 Used as restriction enzyme in Golden Gate cloning assembly
Thermo-Fisher 15561020 Used in Golden Gate cloning assembly
Merck 137101 CaCl2·2H2O
Duchefa Biochemie C0111.0025 C16H16N5O7S2Na
Thermo-Fisher K1231 Used for cloning the blunt-ended PCR amplicons in genotyping procedure
Agronutrition AP2011 Containing Rhizophagus irregularis DAOM 197198 (1,000 spores/mL), used for mychorrization assay
Merck 102790 CuSO4·5H2O
Duchefa Biochemie D1004.1000 Used for plant tissue culture agar-based medium
Merck 105101 K2HPO4
VWR Chemicals 20302.293 Na2·EDTA
Duchefa Biochemie M0803.1000 C6H14O6
Thermo-Fisher ER0291 Used as restriction enzyme in Golden Gate cloning assembly
Merck 100983 C2H5OH
VWR Chemicals BDH9232-500G EDTA
Sigma-Aldrich Z377600-1PAK Cellophane membrane
Biomatters, Ltd. R9 or higher Bioinformatics software for in silico cloning and designing of sgRNAs
Mega International - Technical information at https://mega-international.com/tech-info/
Sigma-Aldrich 65882 Used for fixating nodule tissues
VWR Chemicals 24385.295 -
Vink 219341 Pouches box material, bottom part
Leica Biosystems 14702218311 Used as a template for plastic embedding
Merck 100317 HCl
Sigma-Aldrich I5386-1G IBA
Merck 103862 C6H5FeO7
Merck 103965 FeSO4O·7H2O
Duchefa Biochemie I1401.0005 IPTG
Duchefa Biochemie K0126.0010  
Sigma-Aldrich L2000  
Merck 105886 MgSO4O·7H2O
Merck 105934 MnCl2·4H2O
Merck 102786 MnSO4O
Duchefa Biochemie M1002.1000 Used for bacterial culture agar-based medium
Manutan 92007687 Pouches material
Paraxisdienst 130774 Elastic sealing foil
Pull Rhenen Agra-Perlite No.3 Used as growing substrate in pots for nodulation assay
VWR Chemicals 391-0581 Used as container for cellophane membranes
Thermo-Fisher F130WH For genotyping transgenic lines
Addgene 50337 Level 0 terminator, 3’UTR, 35s (Cauliflower Mosaic Virus)
Addgene 48017 End-link 2 for assembling 2 level one part into a level 2 acceptor
Addgene 48018 End-link 3 for assembling 3 level one part into a level 2 acceptor
Addgene 48001 Level 1 acceptor. Position 5. Forward orientation
Addgene 48007 Level 1 Acceptor. Position 1. Reverse orientation
Addgene 50268 Level 0 promoter (0.4 kb), 35s (Cauliflower Mosaic Virus) + 5’UTR, Ω (Tobacco Mosaic Virus)
Addgene 46966 Used for designing CRISPR/Cas9 module
Addgene 46968 Used for designing CRISPR/Cas9 module
Addgene 50334 Level 0 Kanamycin/Neomycin/Paromomycin resistance cassette
Topzeven - Used as filters for washing spore suspension
Sigma-Aldrich 8.17003 PEG400
Duchefa Biochemie E1674.0001 Pots to grow Parasponia plantlets/seedlings
Merck 104871 KH2PO4
Merck 105033 KOH
Merck 105153 K2SO4O
Van Leusden b.v. - Used as growing substrate for mychorrhization assay
Duchefa Biochemie S0225.0050 SH-basal salt medium
Duchefa Biochemie S0411.0250 SH-vitamin mixture
Lehle Seeds VIS-02 Used as non-ionic surfactant in the washing step of stable transformation
Merck 137017 NaCl
VWR Chemicals 89230-072 C6H11NaO7
Merck 106521 Na2MoO4·2H2O
Merck 106574 Na2HPO4·7H2O
Merck 567549 NaH2PO4·H2O
Sigma-Aldrich 239313 Na2SO4O
Duchefa Biochemie S0809.5000 C12H22O11
Thermo-Fisher B69 Used in Golden Gate cloning assembly
Thermo-Fisher EL0013 Used in Golden Gate cloning assembly
Kulzer-Mitsui Chemicals Group 64708806 Methyl methacrylate-based resin powder
Kulzer-Mitsui Chemicals Group 64709003 HEMA (2-hydroxyethyl methacrylate)-based resin solution
Kulzer-Mitsui Chemicals Group 66022678 Methyl methacrylate-based resin solution
Merck 1159300025  
Acros 189350250  
VWR Chemicals 663684B Polysorbate 20
Stout Perspex - pouches box material, lid
Duchefa Biochemie Y1333.1000  
Merck 108816 ZnCl2
Alfa Aesar 33399 ZnSO4O·7H2O

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Clason, E. W. THE VEGETATION OF THE UPPER-BADAK REGION OF MOUNT KELUT (EAST JAVA). Bulletin du Jardin Botanique de Buitenzorg. Serie III, 509-518 (1936).
  2. Soepadmo, E. Ulmaceae. Flora Malesiana-Series 1, Spermatophyta. 8, 31-76 (1974).
  3. Becking, J. H. The Rhizobium symbiosis of the nonlegume Parasponia. Biological Nitrogen Fixation. , 497-559 (1992).
  4. Oldroyd, G. E. D. Speak, friend, and enter: signalling systems that promote beneficial symbiotic associations in plants. Nature Reviews Microbiology. 11, 252-263 (2013).
  5. Gutjahr, C., Parniske, M. Cell and developmental biology of arbuscular mycorrhiza symbiosis. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 593-617 (2013).
  6. van Velzen, R., et al. Comparative genomics of the nonlegume Parasponia reveals insights into evolution of nitrogen-fixing rhizobium symbioses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, E4700-E4709 (2018).
  7. van Velzen, R., Doyle, J. J., Geurts, R. A Resurrected Scenario: Single Gain and Massive Loss of Nitrogen-Fixing Nodulation. Trends in Plant Science. 24, 49-57 (2019).
  8. Griesmann, M., et al. Phylogenomics reveals multiple losses of the nitrogen-fixing root nodule symbiosis. Science. 1743, eaat1743 (2018).
  9. Becking, J. H. Root-Nodule Symbiosis Between Rhizobium And Parasponia (Ulmaceae). Plant and Soil. 51, 289-296 (1979).
  10. van Zeijl, A., et al. CRISPR/Cas9-Mediated Mutagenesis of Four Putative Symbiosis Genes of the Tropical Tree Parasponia andersonii Reveals Novel Phenotypes. Frontiers in Plant Science. 9, 284 (2018).
  11. Cao, Q., et al. Efficiency of Agrobacterium rhizogenes–mediated root transformation of Parasponia and Trema is temperature dependent. Plant Growth Regulation. 68, 459-465 (2012).
  12. Limpens, E., et al. RNA interference in Agrobacterium rhizogenes-transformed roots of Arabidopsis and Medicago truncatula. Journal of Experimental Botany. 55, 983-992 (2004).
  13. Boisson-Dernier, A., et al. Agrobacterium rhizogenes-Transformed Roots of Medicago truncatula for the Study of Nitrogen-Fixing and Endomycorrhizal Symbiotic Associations. Molecular Plant-Microbe Interactions. 14, 695-700 (2001).
  14. Kumagai, H., Kouchi, H. Gene Silencing by Expression of Hairpin RNA in Lotus japonicus Roots and Root Nodules. Molecular Plant-Microbe Interactions. 16, 663-668 (2003).
  15. Nilsson, O., Olsson, O. Getting to the root: The role of the Agrobacterium rhizogenes rol genes in the formation of hairy roots. Physiologia Plantarum. 100, 463-473 (1997).
  16. Davey, M. R., et al. Effective Nodulation of Micro-Propagated Shoots of the Non-Legume Parasponia andersonii by Bradyrhizobium. Journal of Experimental Botany. 44, 863-867 (1993).
  17. Webster, G., Poulton, P. R., Cocking, E. C., Davey, M. R. The nodulation of micro-propagated plants of Parasponia andersonii by tropical legume rhizobia. Journal of Experimental Botany. 46, 1131-1137 (1995).
  18. Op den Camp, R., et al. LysM-type mycorrhizal receptor recruited for rhizobium symbiosis in nonlegume Parasponia. Science. 331, 909-912 (2011).
  19. Weber, E., Engler, C., Gruetzner, R., Werner, S., Marillonnet, S. A Modular Cloning System for Standardized Assembly of Multigene Constructs. PLOS ONE. 6, e16765 (2011).
  20. Nekrasov, V., Staskawicz, B. J., Weigel, D., Jones, J. D. G., Kamoun, S. Targeted mutagenesis in the model plant Nicotiana benthamiana using Cas9 RNA-guided endonuclease. Nature Biotechnology. 31, 691-693 (2013).
  21. Bertani, G. Studies On Lysogenesis. I. The Mode Of Phage Liberation By Lysogenic Escherichia Coli. Journal of Bacteriology. 62, 293-300 (1951).
  22. Engler, C., et al. A Golden Gate modular cloning toolbox for plants. ACS Synthetic Biology. 3, 839-843 (2014).
  23. Fauser, F., Schiml, S., Puchta, H. Both CRISPR/Cas-based nucleases and nickases can be used efficiently for genome engineering in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 79, 348-359 (2014).
  24. Lazo, G. R., Stein, P. A., Ludwig, R. A. A DNA Transformation-Competent Arabidopsis Genomic Library in Agrobacterium. Biotechnology. 9, 963-967 (1991).
  25. Op den Camp, R. H. M., et al. N Nonlegume Parasponia andersonii Deploys A Broad Rhizobium Host Range Strategy Resulting in Largely Variable Symbiotic Effectivenes. Molecular Plant-Microbe Interactions. 25, 954-963 (2012).
  26. Graham, P. H., Viteri, S. E., Mackie, F., Vargas, A. T., Palacios, A. Variation in acid soil tolerance among strains of Rhizobium phaseoli. Field Crops Research. 5, 121-128 (1982).
  27. Martinez-Romero, E., et al. Rhizobium tropici, A Novel Species Nodulating Phaseolus vulgaris L. Beans and Leucaena sp. Trees. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 41, 417-421 (1991).
  28. Felten, J., et al. The Ectomycorrhizal Fungus Laccaria bicolor Stimulates Lateral Root Formation in Poplar and Arabidopsis through Auxin Transport and Signaling. Plant Physiology. 151, 1991-2005 (1991).
  29. Trouvelot, A., Kough, J. L., Gianinazzi-Pearson, V. Mesure du taux de mycorhization VA d’un systeme radiculaire. Recherche de methods d’estimation ayant une signification fonctionnelle. Aspects Physiologiques et Genetiques des Mycorhizes. , 217-221 (1986).
  30. Schenk, R. U., Hildebrandt, A. C. Medium and techniques for induction and growth of monocotyledonous and dicotyledonous plant cell cultures. Canadian Journal of Botany. 50, 199-204 (1972).
  31. Becking, J. H. The Parasponia parviflora - Rhizobium symbiosis. Host specificity, growth and nitrogen fixation under various conditions. Plant and Soil. 75, 309-342 (1983).
  32. Hoagland, D. R., Arnon Revised, D. I., Arnon, D. I. The Water-Culture Method for Growing Plants without Soil. Circular California Agricultural Experiment Station. 347, 1-32 (1950).
  33. Wang, K. Methods in Molecular Biology: Agrobacterium Protocols. 1, Humana Press. (2015).
  34. Smulders, M. J. M., de Klerk, G. J. Epigenetics in plant tissue culture. Plant Growth Regulation. 63, 137-146 (2011).
  35. Larkin, P. J., Scowcroft, W. R. Somaclonal variation — a novel source of variability from cell cultures for plant improvement. Theoretical and Applied Genetics. 60, 197-214 (1981).
  36. Cannon, S. B., et al. Legume genome evolution viewed through the Medicago truncatula and Lotus japonicus genomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 14959-14964 (2006).
  37. Tuskan, G. A., et al. The Genome of Black Cottonwood, Populus trichocarpa (Torr. & Gray). Science. 313, 1596-1604 (2006).
  38. Young, N. D., et al. The Medicago genome provides insight into the evolution of rhizobial symbioses. Nature. 480, 520 (2011).
  39. Sato, S., et al. Genome Structure of the Legume, Lotus japonicus. DNA Research. 15, 227-239 (2008).
  40. Xing, H. L., et al. A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants. BMC Plant Biology. 14, 327 (2014).
  41. Lowder, L. G., et al. A CRISPR/Cas9 Toolbox for Multiplexed Plant Genome Editing and Transcriptional Regulation. Plant Physiology. 169, 971 (2015).
  42. van Zeijl, A. Dissecting Hormonal Pathways in Nitrogen-Fixing Rhizobium Symbioses. , Wageningen University. (2017).

Tags

Genetikk Parasponia andersonii Cannabaceae tre tre Agrobacterium tumefaciens stabil transformasjon CRISPR-Cas9 Genova redigering nodulation Rhizobium mycorrhization
Transformasjon, Genova redigering og bestemmelse av fenotype av nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree <em>Parasponia andersonii</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wardhani, T. A. K., Roswanjaya, Y.… More

Wardhani, T. A. K., Roswanjaya, Y. P., Dupin, S., Li, H., Linders, S., Hartog, M., Geurts, R., van Zeijl, A. Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii. J. Vis. Exp. (150), e59971, doi:10.3791/59971 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter