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Immunology and Infection

वायरस उपप्रकारों के पार सीरम एंटीबॉडी की रोटी को मापने के लिए एक इन्फ्लुएंजा एंटीजन माइक्रोरेरे का उपयोग

Published: July 26, 2019 doi: 10.3791/59973
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2
1Division of Infectious Diseases, Department of Medicine, University of California Irvine Health, 2Vaccine Research and Development Center, Department of Physiology, University of California Irvine

Summary

हम एक साथ विभिन्न वायरस उपभेदों से 250 से अधिक प्रतिजनों के खिलाफ कई एंटीबॉडी आइसोटाइप के लिए सीरम की जांच करने के लिए नाइट्रोसेलुलोस लेपित स्लाइड पर इन्फ्लूएंजा एंटीजन मुद्रण द्वारा निर्मित एक प्रोटीन microarray का उपयोग करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, इस प्रकार वायरस subtypes भर में सीरम एंटीबॉडी की चौड़ाई की माप की अनुमति.

Abstract

इन्फ्लूएंजा वायरस वर्तमान में उपलब्ध टीकों की सीमित प्रभावशीलता के कारण दुनिया भर में मृत्यु का एक महत्वपूर्ण कारण बना हुआ है. सार्वभौमिक इन्फ्लूएंजा टीकों के विकास के लिए एक प्रमुख चुनौती उच्च एंटीजेनिक विविधता एंटीजेनिक बहाव से उत्पन्न है. इस चुनौती पर काबू पाने के लिए विभिन्न एंटीजेनिक उपप्रकारों में कई वायरस उपभेदों के खिलाफ निर्देशित सीरम एंटीबॉडी की चौड़ाई को मापने के लिए उपन्यास अनुसंधान उपकरण की आवश्यकता है। यहाँ, हम इन्फ्लूएंजा प्रतिजनों के एक प्रोटीन microarray का उपयोग कर विविध इन्फ्लूएंजा वायरस उपभेदों के खिलाफ सीरम एंटीबॉडी की चौड़ाई का विश्लेषण करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं.

इस इन्फ्लूएंजा एंटीजन microarray एक microarray प्रिंटर का उपयोग कर एक नाइट्रोसेल्यूलोस लेपित झिल्ली पर शुद्ध hemagglutinin और neuraminidase प्रतिजन मुद्रण द्वारा निर्माण किया है. मानव सीरा इन्फ्लूएंजा एंटीजन के खिलाफ एंटीबॉडी बाध्य करने के लिए microarray पर incubated रहे हैं। क्वांटम डॉट-संयोजित माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग माइक्रोरेरे पर प्रत्येक प्रतिजन के लिए बाध्यकारी आईजीजी और आईजीए एंटीबॉडी का एक साथ पता लगाने के लिए किया जाता है। मात्रात्मक एंटीबॉडी बाइंडिंग को एक पोर्टेबल इमेजर का उपयोग करके फ्लोरोसेंट तीव्रता के रूप में मापा जाता है। प्रतिनिधि परिणाम मानव सीरा में उपप्रकार-विशिष्ट और पार प्रतिक्रियाशील इन्फ्लूएंजा एंटीबॉडी को मापने में परख reproducibility प्रदर्शित करने के लिए दिखाया गया है.

इस तरह के एलिसा के रूप में पारंपरिक तरीकों की तुलना में, इन्फ्लूएंजा प्रतिजन microarray एक कम समय सीमा में प्रतिजनों के सैकड़ों के खिलाफ कई एंटीबॉडी आइसोटाइप के लिए सीरा के सैकड़ों परीक्षण करने में सक्षम एक उच्च थ्रूपुट बहुसंकेतित दृष्टिकोण प्रदान करता है, और इस तरह है सीरो-सर्वेक्षण और वैक्सीन विकास में आवेदन। एक सीमा बाध्यकारी एंटीबॉडी को एंटीबॉडी को निष्क्रिय करने से अलग करने में असमर्थता है।

Introduction

इन्फ्लूएंजा वायरस मौत या विकलांगता से सालाना 20 लाख जीवन वर्ष के नुकसान के लिए जिम्मेदार है, दुनिया भर में हर साल सभी मौतों का 1% सहित, उष्णकटिबंधीय और विकासशील दुनिया में बुजुर्गों और आबादी पर आय से अधिक प्रभावों के साथ1, 2,3. मौसमी महामारियों के रोग के बोझ के अलावा, आनुवंशिक फिर से वर्गीकरण के माध्यम से उपन्यास इन्फ्लूएंजा उपभेदों के उद्भव या तो स्वाभाविक रूप से आम मेजबानों में या कृत्रिम रूप से जैव आतंकवाद के लिए तेजी से प्रसार और उच्च घातकता के साथ दुनिया भर में महामारी के लिए नेतृत्व कर सकते हैं 4 , 5.जबकि कई इन्फ्लूएंजा टीके वर्तमान में उपलब्ध हैं, उनकी प्रभावशीलता उपप्रकार विशिष्टता6द्वारा सीमित है , सार्वभौमिक इन्फ्लूएंजा टीके है कि कई वायरस के खिलाफ लंबे समय से स्थायी प्रतिरक्षा प्रदान विकसित करने की आवश्यकता पैदा तनाव7|

सार्वभौमिक इन्फ्लूएंजा टीकों के विकास के लिए एक प्रमुख चुनौती उपभेदों भर में उच्च antigenic विविधता है. घूम वायरस के एंटीजेनिक भिन्नता के साथ संयुक्त वर्तमान टीकों की एंटीजेनिक विशिष्टता वैक्सीन उपभेदों और घूम उपभेदों के बीच एक बेमेल बनाता है। यह एक महामारी के दौरान वैक्सीन के उपभेदों से आगे आनुवंशिक बहाव के पक्ष में एक विकासवादी लाभ प्रदान करता है , जो अक्सर 50%8,9से कम तक सीमित होता है . एंटीजेनिक बेमेल का एक अतिरिक्त स्रोत अंडे के अनुकूली वायरल उत्परिवर्तनों टीके के निर्माण के दौरान उत्पन्न होता है, जो एंटीबॉडी के लिए नेतृत्व करता है जो खराब वायरस को घूम करने के लिए बाध्यकरता है 10,11.

उच्च एंटीजेनिक विविधता की इस चुनौती पर काबू पाने के लिए पहले से मौजूद की चौड़ाई की विशेषता के लिए उपन्यास अनुसंधान उपकरणों की आवश्यकता होगी और सीरम और म्यूकोसल नमूनों में नैदानिक रूप से प्रासंगिक एंटीजेनिक वेरिएंट में प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को प्रकाश में लाया जाएगा। वर्तमान में उपलब्ध तरीकों, hemaglutination निषेध (HAI), microneutralization (MN), और पारंपरिक ELISA सहित, एक समय में एक एकल वायरस तनाव के खिलाफ एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए सीमित हैं, तो कई एंटीबॉडी आइसोटाइप का पता लगाने के लिए उनके उपयोग कई वायरस उपभेदों के खिलाफ जल्दी से उपलब्ध नैदानिक नमूना और प्रयोगशाला संसाधनों exhausts. इसके अलावा, HAI और MN लाइव वायरस संस्कृति है कि केवल विशेष प्रयोगशालाओं में उपलब्ध है की आवश्यकता है.

प्रोटीन माइक्रोरेरे, संभावित रूप से हजारों एंटीजनों से मिलकर, जो चित्र 1में दर्शाए अनुसार नाइट्रोसेलुलोस-कोट्ड स्लाइडों पर मुद्रित होते हैं, इस आवश्यकताको 12भर सकते हैं। इन microarrays का उत्पादन किया जा सकता है और एक उच्च थ्रूपुट तरीके से जांच की, जबकि नैदानिक नमूना की छोटी मात्रा लेने के लिए मात्रात्मक एंटीबॉडी आइसोटाइप / एंटीजन खोज के लिए यह दृष्टिकोण कई संक्रामक रोगजनकों के खिलाफ नैदानिक और टीका के विकास के लिए लागू किया गयाहै 13. आज तक, हमने 35 से अधिक रोगजनकों के लिए प्रोटीन माइक्रोरेरेसिस का उत्पादन किया है, जिसमें 60,000 से अधिक कुल व्यक्त प्रोटीन शामिल हैं और संक्रमित और नियंत्रण व्यक्तियों से 30,000 से अधिक मानव सीरा की जांच करने के लिए उनका उपयोग किया गया है। माइक्रोरे स्लाइड के लिए हाल ही में विकसित पोर्टेबल इमेजिंग प्लेटफॉर्म ने इस पद्धति को अंतिम उपयोगकर्ता14के लिए अधिक सुलभ बना दिया है.

क्षेत्र में कई योगदानकर्ताओं द्वारा व्यापक पिछले काम पर बिल्डिंग15,16,17,18,19, एक इन्फ्लूएंजा प्रोटीन microarray हाल ही में विकसित किया गया था कि अधिक शामिल 250 शुद्ध हेमाग्लूटिनिन (एचए) सभी 18 उपप्रकारों12,20के प्रतिनिधित्व के साथ एंटीजेनिक वेरिएंट . इस पद्धति का उपयोग करते हुए, एक प्राकृतिक इन्फ्लूएंजा संक्रमण को मोटे तौर पर प्रतिक्रियाशील आईजीजी और आईजीए एंटीबॉडी को जातिवृत् तीय रूप से संबंधित हा उपप्रकारों के खिलाफ उत्पन्न करने के लिए प्रदर्शित किया गया था, जबकि एक इंट्रामस्क्युलर इन्फ्लूएंजा टीकाकरण केवल उप-प्रकार-विशिष्ट आईजीजी उत्पन्न करता था एंटीबॉडी21| हालांकि, एक सहायक है कि इन्फ्लूएंजा टीकों के लिए टोल की तरह रिसेप्टर्स को सक्रिय जोड़ने के लिए पशु अध्ययन22में हा उपप्रकारों भर में प्राप्त आईजीजी एंटीबॉडी प्रतिक्रिया को व्यापक करने के लिए दिखाया गया था.

इस microarray वर्तमान में कॉलेज के छात्रों को जो इन्फ्लूएंजा संक्रमण के लिए पीछा किया गया के एक संभावित सहगण अध्ययन से एकत्र सीरा की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है. यहाँ, इस अध्ययन से नमूनों के एक सबसेट में उपप्रकार-विशिष्ट और पार प्रतिक्रियाशील एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए परख reproducibility के प्रदर्शन के साथ इन्फ्लूएंजा प्रतिजन microarray की पद्धति की सूचना दी है.

Protocol

सभी मानव सीरा को सुरक्षात्मक व्यक्तिगत उपकरणों के उपयोग के साथ जैव सुरक्षा के लिए अनुमोदित संस्थागत प्रोटोकॉल के अनुसार संभाला और निपटान किया जाता है। इस प्रोटोकॉल में भाग लेने वाले सभी प्रयोगशाला कामकों को जैव सुरक्षा और अनुसंधान नैतिकता में प्रशिक्षण प्राप्त हुआ है।

1. इन्फ्लूएंजा प्रतिजन microarrays का उत्पादन

  1. डिजाइन और माइक्रोरेरे के लिए एंटीजन सेट प्राप्त
    1. lyophilized पाउडर के रूप में व्यक्त और शुद्ध प्रोटीन प्रतिजनों प्राप्त करें।
  2. माइक्रोरेस्लाइड स्लाइड्स पर एंटीजन मुद्रित करें
    1. फॉस्फेट-बफर नमकीन (पीबीएस) में 0.1 मिलीग्राम/एमएल की सांद्रता के लिए प्रत्येक लाइओफिलाइज़्ड प्रतिजन का पुनर्गठन 0.001% ट्वीन-20 (टी-पीबीएस) के साथ। एक अनुपचारित 384-अच्छी तरह से फ्लैट नीचे प्लेट के व्यक्तिगत कुओं के लिए प्रत्येक पुनर्गठन प्रतिजन के 10 डिग्री सेल्सियस स्थानांतरण.
    2. एक microarray प्रिंटर का उपयोग कर प्रिंट प्रतिजनों (इस अध्ययन में इस्तेमाल microarray प्रिंटर अब व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं है, चर्चादेखें) कम मात्रा microarray खोलना पिन के साथ कि नमूना चैनल में aspirate प्रतिजन और प्रत्यक्ष के माध्यम से जमा संपर्क और 16-पैड नाइट्रोसेलुलोस लेपित ग्लास स्लाइड पर केशिका कार्रवाई।
      1. स्रोत प्लेट विन्यास और मुद्रण मापदंडों के साथ मुद्रण सॉफ्टवेयर (जैसे, Gridder) प्रोग्राम.
        1. इस मुद्रण विधि के साथ उपयोग किया जाएगा जो प्लेट प्रकार का नाम चुनने के लिए पुल-डाउन मेनू का उपयोग करें। इस अध्ययन के लिए, एक अनुपचारित 384-वेल फ्लैट-नीचे प्लेट का उपयोग करें।
        2. प्लेट्स की संख्या के आगे पाठ बॉक्स का चयन करें और इस मुद्रण प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले नमूना प्लेट्स की संख्या लिखें. इस अध्ययन के लिए, 1 प्लेट का उपयोग करें।
        3. इस विधि के साथ उपयोग करने के लिए पिन कॉन्फ़िगरेशन का चयन करें. इस अध्ययन के लिए, एक 8-पिन कॉन्फ़िगरेशन का उपयोग करें।
        4. सुनिश्चित करें कि मूल ऑफ़सेट स्लाइड मूल (जो व्यवस्थापकीय अनुभाग में कैलिब्रेट किया गया है) और वह स्थान जहाँ मुद्रण पिन स्लाइड पर मुद्रण प्रारंभ हो जाएगा के बीच (X- और Y-निर्देशों में) दूरी हैं।
        5. सरणी डिज़ाइन टैब का उपयोग करके, सरणियों का आकार और आकार निर्धारित करें (बिंदु रिक्ति और डॉट्स की संख्या प्रति सबरे). इस अध्ययन के लिए, प्रिंट 324 स्पॉट (180 डिग्री मीटर रिक्ति के साथ व्यास) एक 18x18 प्रारूप में 16-पैड स्लाइड पर 8 पिन का उपयोग कर.
        6. कैसे मुद्रण पिन लेने और नमूने वितरित करने के लिए पैरामीटर का चयन करें। इस अध्ययन के लिए, प्रत्येक पिन aspirates 250 प्रतिजन समाधान के nL और प्रिंट 1 nL 40 स्थानों में से प्रत्येक पर (कुल 20 सभी 8 पिन के लिए स्लाइड)
        7. पिन क्लीनिंग प्रोटोकॉल और ब्लॉटिंग प्रोटोकॉल कॉन्फ़िगर करें। इस अध्ययन के लिए, प्रत्येक पिन प्रिंट प्रतिजन, बाँझ ddH में डूबा हुआ है2O sonicated धोने कंटेनर में, और फिर अगले प्रतिजन aspirates.
        8. उस अनुक्रम को परिभाषित करें जिसमें स्लाइड पर नमूना ब्लॉक मुद्रित किए जाते हैं. सरणी सॉफ्टवेयर प्रत्येक microarray के भीतर प्रतिजनों की व्यवस्था का वर्णन करने के लिए एक एनोटेट ग्रिड सूचकांक (.gal) फ़ाइल का निर्माण करेगा.
          नोट: शीर्ष पंक्ति (इमेजिंग में इस्तेमाल सभी तरंगदैर्ध्य पर फ्लोरोसेंट के साथ) के लिए प्रयोग किया जाता है, उदाहरण के लिए, Qdot 585 एनएम streptavidin संयुग्मी और Qdot 800 एनएम streptavidin संयुग्मी का मिश्रण इस अध्ययन में ग्रिड उन्मुख करने के लिए. लंबी छपाई रन के लिए, स्रोत प्लेट में एंटीजन को समय-समय पर ऊपर और नीचे पाइप िंग द्वारा फिर से निलंबित किया जा सकता है और फिर सेंट्रीफ्यूगिंग, या नई स्रोत प्लेट तैयार और उपयोग किया जा सकता है।
    3. एक lightproof बॉक्स में un-probed microarray स्लाइड प्लेस और लंबी अवधि के भंडारण के लिए कमरे के तापमान पर एक desicator कैबिनेट में रहते हैं.
      नोट: प्रोटोकॉल इस बिंदु पर अनिश्चित काल के लिए रोका जा सकता है।
  3. गुणवत्ता नियंत्रण जांच करें (पॉली-हिस्टिडीन टैग की आवश्यकता है)
    1. स्लाइड को कक्षों की जांच करने और बफर को अवरोधित करने के साथ पुनः हाइड्रेट करें जैसा कि चरण 2.1.1.1.1.2 में वर्णित है और चित्र 2में दिखाया गया है।
    2. फ़िल्टर्ड 1x अवरुद्ध बफर में माउस मोनोक्लोनल पॉली-हिस एंटीबॉडी 1:100 को विलेन करें।
      नोट: यदि गैर-शुद्ध प्रोटीन प्रतिजन (उदाहरण के लिए, इन विट्रो प्रतिलेखन और अनुवाद प्रणाली में व्यक्त) सीधे microarrays मुद्रित करने के लिए उपयोग किया जाता है, प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रणाली के घटकों को जोड़ने (जैसे, ई. कोलाई lysate) के साथ 1:10 के अनुपात में इन घटकों के खिलाफ निर्देशित किसी भी एंटीबॉडी को ब्लॉक करने के लिए सीरम कमजोर पड़ने के लिए इस्तेमाल किया बफर अवरुद्ध।
    3. आकांक्षा के बाद सरणी पैड युक्त प्रत्येक स्लाइड चैम्बर में पतला पॉली-हिस एंटीबॉडी का 100 डिग्री सेल्सियस जोड़ें और कमरे के तापमान पर 2 एच के लिए इनक्यूबेट या शकर पर 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर। चरण 2.2.1 में वर्णित के रूप में टी-टीबीएस बफर के साथ 3x धो। डिल्यूट बायोटिन-कंजुटेड बकरी एंटी-माउस आईजी माध्यमिक एंटीबॉडी 1:200 बफर को अवरुद्ध करने में, आकांक्षा के बाद अच्छी तरह से 100 $L जोड़ें, और शेकर पर कमरे के तापमान पर 1 एच के लिए इनक्यूबेट करें। टी-टीबीएस बफर के साथ 3x धो लें।
    4. डिल्यूट Qdot 585 एनएम streptavidin संयुग्मी बफर अवरुद्ध करने में 4 एनएम करने के लिए, आकांक्षा के बाद अच्छी तरह से 100 डिग्री सेल्सियस जोड़ने के लिए, और शेकर पर कमरे के तापमान पर 1 एच के लिए इनक्यूबेट। टी-टीबीएस बफर के साथ 3x धो लें, और फिर एक बार टीबीएस बफर (बिना ट्वीन के बिना) के साथ।
    5. 2.2.5 - 3.1.2 में वर्णित के रूप में अलग और परिमाणस्लाइड.
      नोट: प्रोटीन एंटीजन इस गुणवत्ता नियंत्रण प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए अपने10 टैग शामिल होना चाहिए. वैकल्पिक रूप से, यदि कोई भिन्न टैग शामिल है, तो उस टैग के लिए एंटीबॉडी या लिगन्ड के साथ गुणवत्ता नियंत्रण जाँच की जा सकती है.

2. microarrays का उपयोग कर इन्फ्लूएंजा एंटीबॉडी के लिए जांच सेरा

  1. एंटीबॉडी बाइंडिंग के लिए माइक्रोरैनेस पर इनक्यूबेट सेरा
    1. चित्र 3में दर्शाए अनुसार क्लिप्स का उपयोग करके कक्षों में माइक्रोरे स्लाइड्स संलग्न करें और फ़्रेम में रखें.
      नोट: हमेशा हाथ और उपकरणों के साथ microarray पैड को छूने से बचें। सुनिश्चित करें कि स्लाइड पैड की ओर ऊपर और ऊपरी दाएँ कोने में छोटे पायदान के साथ उन्मुख कर रहे हैं.
    2. फ़िल्टर किए गए 1x अवरुद्ध बफर के प्रति अच्छी तरह से 100 $L के साथ माइक्रोहाइड्रे स्लाइड को पुनः हाइड्रेट करें, और बफर को अवरुद्ध करने के 100 डिग्री एल में सीरम 1:100 को पतला करें (अनुपचारित 96-वेल प्लेट या 2 एमएल ट्यूब का उपयोग कर सकते हैं)। कवर फ्रेम में दोनों rehydrated microarray स्लाइड और पतला सेरा कक्ष ीय ताशक पर कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए अलग से 100-250 आरपीएम पर इनक्यूबेट करें। शेकर पर इसी तरह सभी बाद ऊष्मायन चरणों प्रदर्शन.
      नोट: सेरा को लंबे समय तक भंडारण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर किया जाना चाहिए ताकि फ्रीज-थॉव चक्र को कम किया जा सके और उपयोग करने से पहले कणों को हटाने के लिए मिश्रण और centrifuged किया जाना चाहिए। स्लाइड कक्षों को फिर से इकट्ठा करने की आवश्यकता है कि किसी भी रिसाव का पता लगाने के लिए इस कदम के दौरान और बाद में ध्यान से स्लाइड कक्षों का निरीक्षण करें।
    3. माध्यमिक संग्रह फ्लास्क के साथ एक वैक्यूम लाइन से जुड़े पिपेट युक्तियों का उपयोग करना, ध्यान से aspirate पैड को छूने के बिना प्रत्येक कक्ष के कोने से बफर अवरुद्ध. सभी बाद की आकांक्षा चरणों को इसी तरह करें। पैड को सूखने की अनुमति न देने के लिए आकांक्षा के बाद जल्दी से पैड में पतला सेरा जोड़ें।
    4. एक माध्यमिक कंटेनर नम कागज तौलिए से घिरा हुआ है और वाष्पीकरण को रोकने के लिए सील के अंदर ट्रे में कवर फ्रेम रखें। रॉकिंग शेकर पर 4 डिग्री सेल्सियस पर रात में इनक्यूबेट करें (वैकल्पिक रूप से, 100-250 आरपीएम पर कक्षीय शेकर पर कमरे के तापमान पर 2 एच के लिए इनक्यूबेट कर सकते हैं)।
  2. क्वांटम-डॉट-कंजुटेड माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ लेबल बाध्य सीरम एंटीबॉडी
    1. ऊपर वर्णित के रूप में ध्यान से कक्षों से Aspirate सेरा, टी-टीबीएस बफर (20 एमएम Tris-HCl, 150 एम एम NaCl, 0.05% Tween-20 ddH2में 0.05% Tween-20 pH 7.5 करने के लिए समायोजित और फ़िल्टर्ड, वाणिज्यिक रूप से प्राप्त किया जा सकता है) और शकर कक्षक पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट जोड़ें 100-250 आर.पी.एम. इस धोने कदम 3x की कुल दोहराएँ (सभी बाद धोने कदम इसी तरह प्रदर्शन कर रहे हैं).
    2. बफर को अवरुद्ध करने में 1 डिग्री सेल्सियस तक पतला द्वितीयक एंटीबॉडी का मिश्रण तैयार करें और एकरूपता बनाए रखने के लिए उपयोग से पहले और दौरान पाइपटिंग द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण करें।
      नोट: परख reproducibility बनाए रखने के लिए, प्रत्येक माध्यमिक एंटीबॉडी के एक ही बैच सभी जांच प्रयोगों जिसके लिए प्रयोगों में डेटा की मात्रात्मक तुलना की योजना बनाई है के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए. माध्यमिक एंटीबॉडी की विशिष्ट एकाग्रता आत्मीयता के आधार पर विविध करने की आवश्यकता हो सकती है; निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करें जब भी उपलब्ध है.
    3. अंतिम धोने के बाद कक्षों से Aspirate बफर, माध्यमिक एंटीबॉडी मिश्रण की अच्छी तरह से प्रति 100 $L जोड़ें, और शेकर पर कमरे के तापमान पर 2 एच के लिए इनक्यूबेट करें।
    4. Aspirate माध्यमिक एंटीबॉडी मिश्रण टी-टीबीएस बफर के साथ 3x धोने, और फिर टीबीएस बफर के साथ एक बार धोने (बिना ट्वेन).
    5. ध्यान से छू पैड से बचने के लिए कक्षों से microarray स्लाइड अलग, फ़िल्टर ्डDDH2हे के साथ धीरे कुल्ला, और 50 एमएल ट्यूबों में रखकर सूखी और 10 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर centrifuging.
    6. एक lightproof बॉक्स में microarray स्लाइड की जांच प्लेस और लंबी अवधि के भंडारण के लिए कमरे के तापमान पर एक desicator कैबिनेट में रहते हैं.
      नोट: प्रोटोकॉल इस बिंदु पर 1 सप्ताह के लिए रोका जा सकता है।

3. माइक्रोरेरे के भीतर एंटीजन के लिए बाध्यकारी एंटीबॉडी क्वांटिफी

  1. माइक्रोरे स्लाइड कल्पना करें और एंटीबॉडी बाइंडिंग को मापने के लिए स्पॉट फ्लोरोसेंट तीव्रता की मात्रा निर्धारित करें
    1. अंतर्निहित सॉफ़्टवेयर के साथ पोर्टेबल इमेजर का उपयोग करके माइक्रोरे स्लाइड्स की छवियों को प्राप्त करें.
      1. छविर कॉन्फ़िगर करें टैब में, उचित स्लाइड कॉन्फ़िगरेशन का चयन करें. इस अध्ययन के लिए, 16-पैड स्लाइड का उपयोग करें।
      2. छवि नियंत्रण टैब में, उचित फ्लोरोसेंट चैनल का चयन करें, और लाभ समायोजित, जोखिम समय, और प्राप्ति समय इष्टतम छवियों को प्राप्त करने के लिए सेरा की प्रतिक्रिया के आधार पर. इस अध्ययन के लिए, IgA और आईजीजी के लिए फ्लोरोसेंट चैनलों क्रमशः 585 एनएम और 800 एनएम थे, और इमेजिंग सेटिंग्स 50 का लाभ, 500 एमएस के जोखिम समय, और 1 s के अधिग्रहण समय थे.
      3. छवि प्राप्त करने की प्रक्रिया शुरू करने के लिए कैप्चर पर क्लिक करें.
        नोट: Microarray स्लाइड के रूप में लंबे समय के रूप में वे अंधेरे और शुष्क जमा हो जाती है संकेत की गिरावट के बिना कई सेटिंग्स पर फिर से छवि की जा सकती है. यदि स्लाइड्स के साथ संगत हो तो अन्य इमेजिंग सिस्टम का उपयोग किया जा सकता है.
    2. परिदय मार्करों के आधार पर उन्मुख ग्रिड का उपयोग कर सरणी स्पॉट का पता लगाने और स्पॉट के आसपास मापा पिक्सेल तीव्रता शून्य पृष्ठभूमि की औसत के रूप में स्थान तीव्रता को मापने। इस परिमाणीकरण एल्गोरिथ्म को अंतर्निहित इमेजर सॉफ्टवेयर का उपयोग करते हुए बैच में निष्पादित करें, जो प्रत्येक माइक्रोरे पर अलग-अलग प्रतिजनों को स्थान तीव्रता से कनेक्ट करने के लिए चरण 1.2.2 में निर्मित .gal फ़ाइल का उपयोग करता है।
      1. फ़ाइल जानकारी फलक में, कंप्यूटर पर अपने फ़ोल्डर से चयन करके .gal फ़ाइल अपलोड करें, और फ़ोल्डर निर्दिष्ट करें जहाँ विश्लेषण आउटपुट फ़ाइलें विश्लेषण विकल्प अनुभाग में सहेजी जानी हैं.
      2. छवि नियंत्रण टैब में, प्राप्त छवियों में से एक को खोलने के लिए मात्रा निर्धारित किया जा करने के लिए और ऊपरी दाएँ कोने में ऑटो बटन का चयन करें.
      3. निचले दाएँ कोने में सरणी विश्लेषण अनुभाग में, सॉफ़्टवेयर द्वारा निर्देश के रूप में एक fiducial टेम्पलेट बनाएँ।
      4. बैच विश्लेषणपर क्लिक करें, फ़ोल्डर है कि मात्रा निर्धारित किया जा करने के लिए छवियों में शामिल हैं का चयन करें, और पिछले चरण में बनाया गया था कि काल्पनिक टेम्पलेट का चयन करें। सॉफ्टवेयर प्रत्येक छवि का विश्लेषण करती है और जगह तीव्रता मात्रा निर्धारित करता है।
        नोट: यह चरण एक .csv फ़ाइल उत्पन्न करेगा जिसमें प्रत्येक सीरम नमूना के भीतर एंटीबॉडी को परिमाणित करने वाली स्पॉट तीव्रता होती है जो माइक्रोरे पर प्रत्येक व्यक्ति प्रतिजन से बांधती है जिसे बाद में स्प्रेडशीट हेरफेर या विश्लेषण सॉफ्टवेयर में हेरफेर किया जा सकता है।
    3. एंटीजन भर में और सीरम नमूनों भर में एंटीबॉडी बाध्यकारी तुलना करने के लिए कच्चे डेटा का विश्लेषण करें। इस अध्ययन के लिए, IgA और आईजीजी एंटीबॉडी 585 एनएम और 800 एनएम फ्लोरोसेंट स्थान तीव्रता के रूप में मापा विभिन्न दिनों पर विभिन्न स्लाइड का उपयोग कर प्रयोग के 2 स्वतंत्र रन के बीच सभी प्रतिजनों भर में तुलना की गई, और सहसंबंध विश्लेषण करने के लिए किया गया था उपाय परख पुन: उत्पादनीयता.
      नोट: अभिव्यक्ति मिश्रण के रूप में मुद्रित गैर शुद्ध प्रोटीन के लिए, डेटा विश्लेषण एक नहीं डीएनए नियंत्रण की पृष्ठभूमि घटाव के साथ शुरू करना चाहिए.

Representative Results

प्रोटोकॉल के एक प्रदर्शन के रूप में, आधारभूत सेरा कॉलेज के छात्रों के एक संभावित सहगण अध्ययन के भीतर 16 व्यक्तियों से परख रहे थे इन्फ्लूएंजा प्रतिजन microarray पर इन्फ्लूएंजा संक्रमण के लिए पीछा किया. परख पुन: उत्पादन ीयता प्रदर्शित करने के लिए, इन नमूनों की दो बार जांच की गई, विभिन्न स्लाइडों और विभिन्न दिनों पर।

इस अध्ययन के लिए, शुद्ध इन्फ्लूएंजा एंटीजन अपने10 टैग युक्त वाणिज्यिक विक्रेता से प्राप्त किए गए थे (सामग्री की तालिकादेखें) और सहयोगियों. इन एंटीजन में शामिल हैं 251 कुल हा एंटीजन, 63 गोलाकार सिर डोमेन के साथ (HA1) और 186 पूर्ण लंबाई प्रोटीन (HA0), सहित 96 monomeric HA0 प्रोटीन और 90 trimerized HA0 प्रोटीन जुड़े trimerization युक्त ("foldon") डोमेन23. इस अध्ययन में प्रयुक्त प्रतिजनों और नियंत्रणों की एक पूरी सूची अनुपूरक फाइलके रूप में शामिल की जाती है . इस अध्ययन के लिए, इस्तेमाल किया माध्यमिक एंटीबॉडी थे बकरी विरोधी मानव IgG 800 एनएम पर क्वांटम डॉट उत्सर्जन करने के लिए संयुग्मी (GAH-IgG-Q800) और बकरी विरोधी मानव IgA कंजूस के रूप में 585 एनएम (GAH-IgA-Q585) पर उत्सर्जन क्वांटम डॉट उत्सर्जन के लिए IGG और IgA एंटीबॉडी के रूप में चित्र 3में दिखाया गया है। आईजीजी और आईजीए एंटीबॉडी विभिन्न उपप्रकारों और इन्फ्लूएंजा हा एंटीजन के आणविक रूपों के लिए बाध्यकारी सीरा ऊपर वर्णित नैदानिक सहगण से प्राप्त के लिए तुलना की गई.

परिणामस्वरूप ऊष्मा मानचित्र चित्र 4 में चित्र 5में आलेखीय निरूपण के साथ दर्शाया गया है। इन आंकड़ों में, केवल सरणी पर उच्च प्रतिनिधित्व के साथ नैदानिक रूप से प्रासंगिक उपप्रकारों को स्थान बचाने के लिए लेबल किया जाता है, साथ "+" उच्च संख्या के सभी शेष उपप्रकारों को दर्शाता है, और आदेश के रूप में शामिल छोटे या कम अच्छी तरह से प्रतिनिधित्व किए गए उपप्रकार (जैसे, H1 के बीच में H2 और H3). सरणी पर उपभेदों और उपप्रकारों की पूरी सूची अनुपूरक फ़ाइलके रूप में शामिल की जाती है. इन आंकड़ों से पता चलता है कि एचए के प्रमुख समूह के एंटीबॉडी नैदानिक रूप से प्रचलित उपभेदों (H1N1, H3N2, और बी) और अन्य उपभेदों के लिए एंटीबॉडी की कम मात्रा के लिए एंटीबॉडी की अपेक्षित उच्च मात्रा के साथ उप-विशिष्ट हैं। हालांकि, पूरे HA, जो डंठल डोमेन भी शामिल है करने के लिए एंटीबॉडी, उपप्रकारों में अधिक पार प्रतिक्रियाशील हैं, और इस प्रभाव को संवर्धित किया जा करने के लिए प्रकट होता है जब पूरे HA trimerized है. यह परिणाम अप्रत्याशित नहीं है, के रूप में पूरे HA स्टेम क्षेत्र है, जो अत्यधिक subtypes भर में संरक्षित है शामिल हैं. इसलिए, गैर-नैदानिक उपप्रकारों (जैसे, H5 और H7) से पूरे HA अणुओं के लिए एंटीबॉडी की संभावना मूल रूप से नैदानिक उपप्रकारों के खिलाफ प्राप्त विरोधी स्टेम एंटीबॉडी का प्रतिनिधित्व करते हैं (जैसे, H1 और H3) जो अन्य HA उपप्रकारों के स्टेम क्षेत्रों के साथ क्रॉस-प्रतिक्रिया कर रहे हैं सरणी पर. इस बिंदु दोनों सिर हा और पूरे अणु हा सहित के महत्व को दिखाता है सरणी पर सिर और स्टेम क्षेत्रों जो विभिन्न प्रतिक्रिया प्रोफाइल दिखाने के लिए एंटीबॉडी के बीच अंतर.

परख रन की जांच भर में अच्छा reproducibility दर्शाता है. दूसरे रन सभी उपभेदों भर में थोड़ा कम आईजीजी एंटीबॉडी दिखाता है, हालांकि उपभेदों के बीच पैटर्न अनुरूप है. यह बोर्ड भर में मामूली कमी माध्यमिक एंटीबॉडी में बैच-टू-बैच परिवर्तनशीलता के कारण होने की संभावना है, जो आईजीजी के लिए रन के बीच बदल गया था लेकिन आईजीए के लिए नहीं। इस प्रकार, जैसा कि प्रोटोकॉल में उल्लेख किया गया है, किसी भी प्रयोग के लिए प्रत्येक द्वितीयक एंटीबॉडी के एक ही बैच का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है जिसके बीच मात्रात्मक तुलना की योजना बनाई गई है। एंटीबॉडी के विभिन्न बैचों परीक्षण किया जा करने के लिए नमूनों की एक उच्च संख्या के कारण आवश्यक हैं, तो हम सुधार के साथ मात्रात्मक तुलना के लिए अनुमति देने के लिए विभिन्न एंटीबॉडी बैचों के साथ प्रयोगात्मक रन के बीच साझा नमूने सहित सिफारिश की।

Figure 1
चित्र 1: प्रोटीन microarray के Schematic. प्रत्येक स्लाइड में एक एकल सरणी के साथ प्रत्येक कई पैड होते हैं, जिसमें सैकड़ों एंटीजन होते हैं जो ग्रिड में व्यवस्थित स्पॉट पर मुद्रित होते हैं, प्रत्येक स्थान के साथ एक एंटीजन को नाइट्रोसेलुलोस सतह के 3-आयामी स्थलाकृति पर adsorbed होता है जिसके लिए सीरम से एंटीबॉडी बाध्य कर रहे हैं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: इन्फ्लूएंजा प्रतिजन microarray मुद्रण और जांच प्रोटोकॉल के Schematic. बाएं से दाएं, माइक्रोरे को नाइट्रोसेल्यूलोस-कोटेड स्लाइड्स पर उपयोग करके मुद्रित किया जाता है, जिसका उपयोग आईजीजी और आईजीए एंटीबॉडी के लिए सीरा की जांच करने के लिए किया जाता है, क्वांटम-डॉट-कंजुगेट्ड सेकेंडरी एंटीबॉडी का उपयोग करके, एक पोर्टेबल इमेजर का उपयोग करके छवि वाली स्लाइडों के साथ, और परिणामों का विश्लेषण किया जाता है एक गर्मी नक्शा उत्पन्न करते हैं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: माइक्रोरेस्लाइड स्लाइड की जांच कक्ष को संलग्न करने की प्रक्रिया। ए से एफतक, जांच कक्ष को सही अभिविन्यास में स्लाइड के शीर्ष पर रखा गया है, जो पक्षों पर क्षैतिज क्लिप का उपयोग करके स्लाइड से जुड़ा हुआ है, और जांच ट्रे में रखा गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: इन्फ्लूएंजा प्रतिजन microarray के प्रतिनिधि परिणाम. हीट नक्शे प्रतिजन-विशिष्ट एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं, प्रत्येक पंक्ति के साथ एक एकल प्रतिजन का प्रतिनिधित्व अणु द्वारा व्यवस्था की, उपप्रकार, और तनाव, और प्रत्येक स्तंभ एक एकल नमूना की एक जांच रन का प्रतिनिधित्व, एंटीबॉडी isotype और रन द्वारा व्यवस्था की (ए, सफेद ] 0, काले ] 20000, लाल $ 40000 फ्लोरोसेंट तीव्रता). 1 से 18 तक के सभी हेमग्लूटिनिन उपप्रकारों सहित प्रतिजन उपप्रकार और 1 से 10 तक सभी न्यूरेमिनिडेस उपप्रकारों को खड़ी और बाईं ओर लेबल किया जाता है। दो रनों के बीच फ्लोरोसेंट तीव्रता की तुलना आईजीए (बी) और आईजीजी (सी) के लिए रैखिक प्रतिगमन द्वारा अच्छी परख पुनरुत्पादन को दर्शाती है . कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: इन्फ्लूएंजा प्रतिजन microarray पर मापा सीरम एंटीबॉडी की Breadth. सीरम आईजीए (ए) और आईजीजी (बी) को हा और एनए आणविक रूपों और उपप्रकारों द्वारा समूहीकृत किया जाता है ताकि नैदानिक उपप्रकारों के लिए हा हेड ग्रुप एंटीबॉडी की उच्च विशिष्टता को प्रदर्शित किया जा सके और पूरे हा के उच्च पार-प्रतिक्रिया और पूरे हा ए के उच्च पार-प्रतिक्रिया को कम किया जा सके . डंठल क्षेत्र का समावेश. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक फाइल: इन्फ्लूएंजा प्रतिजन माइक्रोरेरे पर एंटीजन की सूची। सामग्री रिक्त स्थान, fiducials, नियंत्रण (मानव आईजीजी और IgA और विरोधी मानव IgG और IGA पर 0.1 mg/mL और 0.3 mg/mL) सहित सरणी पर सभी 324 स्थानों के लिए दिखाया गया है, और स्रोत पर जानकारी के साथ एंटीजन, आणविक रूप, उपप्रकार, और तनाव. संक्षिप्त नाम इस प्रकार हैं: स्रोत के लिए, चीन - चीन जैविक इंक, FKL - फ्लोरियन Krammer प्रयोगशाला; आण्विक रूप के लिए, एचए1 सिर हा, ह0 ] संपूर्ण हा, एचए2 डंठल हा, एनपी - न्यूक्लिओप्रोटीन। चीन जैविक इंक से स्रोत प्रतिजनों के लिए, सूची संख्या दिखाए जाते हैं; Krammer प्रयोगशाला से स्रोत एंटीजन के लिए, प्रतिजन आईडी सूचीबद्ध हैं. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

Discussion

इन्फ्लूएंजा प्रतिजन microarray प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित किसी भी परियोजना है कि कई प्रतिजनों के लिए एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण करने की आवश्यकता के लिए अनुकूलनीय है. माइक्रोरेरे प्लेटफार्म का उपयोग किसी भी प्रणाली में व्यक्त प्रोटीन प्रतिजनों के किसी भी वांछित सेट के साथ किया जा सकता है जो 0.1 मिलीग्राम/एमएल या अधिक उपज को प्राप्त कर सकता है जो पहले वर्णित12के रूप में शुद्धि के साथ या बिना अधिक उपज प्राप्त कर सकता है। यदि गैर-शुद्ध प्रोटीन प्रतिजन (उदाहरण के लिए, इन विट्रो प्रतिलेखन और अनुवाद प्रणाली में व्यक्त) सीधे microarrays मुद्रित करने के लिए उपयोग किया जाता है, प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रणाली के घटकों (जैसे, ई. कोलाई lysate) के लिए इस्तेमाल बफर अवरुद्ध करने के लिए जोड़ा जाना चाहिए 1:10 इन घटकों के खिलाफ निर्देशित किसी भी एंटीबॉडी को ब्लॉक करने के लिए सीरा और गुणवत्ता नियंत्रण एंटीबॉडी का कमजोर पड़ने। स्लाइड विन्यास सरणी प्रति प्रति प्रति प्रति प्रति जनन की एक उच्च संख्या को समायोजित करने के लिए प्रत्येक स्लाइड पर बड़े पैड की एक कम संख्या के साथ उपलब्ध हैं. इस अध्ययन के लिए, हम एक GeneMachines OmniGrid 100 microarray प्रिंटर है कि पिन है कि सीधे नाइट्रोसेलुलोस सतह से संपर्क करने के लिए सरणी पर धब्बे जमा का इस्तेमाल किया. हालांकि इस microarray प्रिंटर अब व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं है, अन्य व्यावसायिक रूप से उपलब्ध microarray प्रिंटर इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन कस्टम पिन की आवश्यकता हो सकती है (या तो संपर्क या गैर संपर्क) और सॉफ्टवेयर और पर्याप्त स्थान संकल्प होना चाहिए और स्लाइड और इमेजर के साथ संगतता। सीरा की सक्रियता के आधार पर, 1:50 से 1:400 तक कमजोर पड़ने का उपयोग किया जा सकता है। सीरम मुक्त बफर एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, जबकि एंटीजन के लिए बाध्य करने के लिए जाना जाता मोनोक्लोनल एंटीबॉडी एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।

उपयोगकर्ताओं को कुछ समस्या निवारण समस्याओं के बारे में पता होना चाहिए। अपने टैग के लिए एंटीबॉडी का उपयोग कर गुणवत्ता नियंत्रण की जांच का उद्देश्य किसी भी प्रतिजनों जिसके लिए मुद्रण सफल नहीं था के लिए जाँच करने के लिए है। किसी भी स्थान है कि लगातार कई सरणियों की गुणवत्ता नियंत्रण की जांच में कम संकेत देने की संभावना अपर्याप्त प्रतिजन मुद्रित प्रतिनिधित्व करते हैं. संभावित कारणों में एकत्रीकरण या वर्षण या स्रोत प्लेट में प्रतिजन या नाइट्रोसेलुलोस पैड की चर मोटाई के कारण प्रिंटिंग पिन और माइक्रोरे स्लाइड के बीच खराब संपर्क शामिल हैं। इस बिंदु पर, हम गुणवत्ता नियंत्रण की जांच के मात्रात्मक परिणामों के आधार पर परख सामान्यीकरण नहीं करते हैं, यह देखते हुए कि एंटी-हिस एंटीबॉडी का पता लगाया गया बाइंडिंग इस टैग की उपलब्धता से प्रभावित हो सकता है, जो 3-आयामी अनुरूपता पर निर्भर करता है प्रत्येक प्रतिजन के लिए विशिष्ट.

इन्फ्लूएंजा प्रतिजन microarray ऐसे एलिसा के रूप में पारंपरिक तरीकों पर कई लाभ प्रदान करता है और ऐसे HAI और MN के रूप में कार्यात्मक परख के लिए पूरक है. 16-पैड प्रोटीन microarray एक नमूना-sparing प्रौद्योगिकी के साथ कई आइसोटाइप के एंटीबॉडी को मापने के लिए क्षमता के साथ एक साथ लगभग 300 प्रतिजनों से 1 $L सीरम के. प्रति स्लाइड पैड की संख्या कम करके प्रति एंटीजन की संख्या हजारों करने के लिए बढ़ाया जा सकता है. बहुसंकेतित परख भी कर्मियों के समय और उपभोग्य संसाधनों को छोड़ देता है, यह देखते हुए कि सीरा के सैकड़ों 2 दिनों में एंटीबॉडी के लिए जांच की जा सकती है, और स्लाइड और अभिकर्मकों के अलावा अन्य सभी सामग्री फिर से उपयोगी हैं तो प्लास्टिक कचरे की बड़ी मात्रा उत्पन्न नहीं करते हैं।

जबकि microarray प्रिंटर व्यापक रूप से वितरित नहीं किया जा सकता है, microarray स्लाइड एक केंद्रीकृत स्थान पर मुद्रित किया जा सकता है और फिर जांच के लिए अंत उपयोगकर्ता के लिए ले जाया. केवल जांच के लिए आवश्यक उपकरण कम लागत और पोर्टेबल imager है. इस प्रोटोकॉल के प्रसार का लक्ष्य इस तकनीक का अधिक व्यापक उपयोग करना है।

इन्फ्लूएंजा प्रतिजन microarray की मुख्य सीमाओं का पता चला एंटीबॉडी के समारोह और गतिजता की विशेषता करने में असमर्थता कर रहे हैं. microarray प्रत्येक प्रतिजन के लिए बाध्यकारी एंटीबॉडी के एक polyclonal सेट का पता लगाने है. ये एंटीबॉडी हो सकता है या HAI और MN assays में वायरस को निष्क्रिय करने में कार्यात्मक नहीं हो सकता है. हालांकि, HAI और MN परख ोंलुएंजा के एवियन उपप्रकारों के खिलाफ एंटीबॉडी के लिए परीक्षण करने के लिए उच्च स्तरीय जैव सुरक्षा अलमारियाँ के साथ विशेष सुविधाओं के लिए संबद्ध की जरूरत के साथ लाइव वायरस संस्कृति की आवश्यकता है, जबकि प्रोटीन microarray लाइव वायरस शामिल नहीं है घटक तो किसी भी बुनियादी प्रयोगशाला में उपयोग किया जा सकता है. बाध्यकारी गतिकी के संबंध में, प्रत्येक प्रतिजन की एक एकल एकाग्रता युक्त एक सरणी के साथ जांच सीरम का एक कमजोर पड़ने एक एकल डेटा बिंदु पैदावार, जो मात्रा और आत्मीयता का एक समग्र सभी एंटीबॉडी है कि प्रतिजन के लिए बाध्य पर summated का प्रतिनिधित्व करता है . पूरी तरह से एंटीजन-एंटीबॉडी बंधन गतिकी को हल करने के लिए, कई एंटीजन सांद्रता और /

इन सीमाओं के बावजूद, इन्फ्लूएंजा प्रतिजन microarray एक उपयोगी उपकरण के लिए एंटीजेनिक परिदृश्य है कि कार्यात्मक परख है कि अधिक थ्रूपुट और उपलब्धता में सीमित हैं पूरक कर सकते हैं भर इन्फ्लूएंजा एंटीबॉडी की चौड़ाई की विशेषता है.

Disclosures

लेखकों कोई खुलासे नहीं है.

Acknowledgments

लेखकों को प्रो डॉन मिल्टन स्वीकार करना चाहते हैं (एप्लाइड सार्वजनिक स्वास्थ्य संस्थान, मैरीलैंड विश्वविद्यालय, कॉलेज पार्क, एमडी, संयुक्त राज्य अमेरिका) मैरीलैंड आईआरबी प्रोटोकॉल के विश्वविद्यालय के तहत मानव सीरा इकट्ठा करने के लिए #313842 DARPA N66001-18-2-4015 P00001 द्वारा वित्त पोषित. लेखकों को भी प्रो फ्लोरियन Krammer स्वीकार करना चाहते हैं (Icahn स्कूल ऑफ मेडिसिन, माउंट Sinai, NY, संयुक्त राज्य अमेरिका) TRIMerized हा और NA एंटीजन ODNI IARPA DJF-15-1200-K-0001725 द्वारा वित्त पोषित प्रदान करने के लिए. एस खान आंशिक रूप से अनुदान KL2 TR001416 के माध्यम से राष्ट्रीय अनुसंधान संसाधन के लिए राष्ट्रीय केंद्र और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान, स्वास्थ्य के लिए राष्ट्रीय केंद्र द्वारा समर्थित है। सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी NIH के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व नहीं करता है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16-pad nitrocellulose-coated glass slides Grace Bio Labs 305016
1x GVS FAST blocking buffer Fischer Scientific 10485356
ArrayCam portable imager Grace Bio Labs 400S Other imaging devices can be used to visualize slides if capable of achieving the resolution of the microarray spots and the excitation and emission wavelengths of the quantum dots.
Biotin-conjugated goat anti-mouse-IgG antibody Thermo Fischer 31800
HiBase 384-well plate Greiner Bio-One T-3037-11
Microarray pins ArrayIt GMP2 Each different microarray printer may require its own custom microarray pins.
Mouse monoclonal poly-His antibody Sigma-Aldrich H1029
OmniGrid 100 microarray printer GeneMachines The version of the microarray printer used in this work is no longer commercially available, but the updated similar equipment is the OmniGrid Accent microarray printer from Digilab (Hopkinton, MA), and the same protocol can be carried out with most commercially available microarray printers.
ProPlate slide chambers Grace Bio Labs 246890
ProPlate slide clips Grace Bio Labs 204838
ProPlate slide frames Grace Bio Labs 246879
Quantum dot 585 nm conjugated goat anti-human-IgA antibody Grace Bio Labs 110620
Quantum dot 585 nm streptavidin conjugate Thermo Fischer Q10111MP
Quantum dot 800 nm conjugated goat anti-human-IgG antibody Grace Bio Labs 110610

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References

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