Summary
Vi præsenterer en protokol for anvendelse af et protein mikrosystem, der er konstrueret ved at udskrive influenza antigener på nitrocellulose belagte slides til samtidig sonde serum for flere antistof isotyper mod over 250 antigener fra forskellige virusstammer, således tillader måling af bredden af serumantistoffer på tværs af virusundertyper.
Abstract
Influenzavirussen er fortsat en væsentlig årsag til dødelighed på verdensplan på grund af den begrænsede effektivitet af de aktuelt tilgængelige vacciner. En central udfordring for udviklingen af universelle influenzavacciner er en høj antigen variation som følge af antigene drift. At overvinde denne udfordring kræver nye forskningsværktøjer til at måle bredden af serumantistoffer rettet mod mange virusstammer på tværs af forskellige antigene undertyper. Her præsenterer vi en protokol til analyse af bredden af serumantistoffer mod forskellige influenzavirusstammer ved hjælp af et protein mikroarray af influenza antigener.
Dette influenza antigen mikroarray er konstrueret ved at udskrive renset hemagglutinin og neuraminidaseantigener på en nitrocellulose belagt membran ved hjælp af en microarray printer. Humane sera inkuberet på mikrosystemet for at binde antistoffer mod influenza antigener. Quantum-dot-konjugerede sekundære antistoffer anvendes til samtidig påvisning af IgG-og IgA-antistoffer, der binder sig til hvert antigen på mikrosystemet. Kvantitativ antistof binding måles som fluorescens intensitet ved hjælp af en bærbar Imager. Repræsentative resultater viser, at analysen er reproducerbar ved måling af subtype-specifikke og krydsreaktive influenza antistoffer i humane sera.
Sammenlignet med traditionelle metoder som ELISA, giver influenza antigen microarray en høj gennemløb multiplexed tilgang i stand til at teste hundredvis af sera for flere antistof isotyper mod hundredvis af antigener i en kort tidsramme, og dermed har anvendelser inden for sero-overvågning og vaccine udvikling. En begrænsning er den manglende evne til at skelne bindende antistoffer fra neutraliserende antistoffer.
Introduction
Influenzavirus er ansvarlig for et tab på 20.000.000 leveår årligt ved døden eller handicap, herunder 1% af alle dødsfald på verdensplan hvert år, med uforholdsmæssige konsekvenser for ældre og befolkninger i troperne og udviklingslandene1, 2,3. Ud over sygdomsbyrden af sæsonmæssige epidemier, fremkomsten af nye influenzastammer via genetisk re-sortiment enten naturligt i fælles værter eller kunstigt for bioterrorisme kan føre til verdensomspændende pandemier med hurtig spredning og høj dødelighed 4 , 5. mens talrige influenzavacciner i øjeblikket er tilgængelige, er deres effektivitet begrænset af subtype specificitet6, hvilket skaber behovet for at udvikle universelle influenzavacciner, der giver langvarig immunitet mod flere virus stammer7.
En central udfordring for udviklingen af universelle influenzavacciner er høj antigen mangfoldighed på tværs af stammer. Den antigene specificitet af nuværende vacciner kombineret med antigene variation af cirkulerende vira skaber en uoverensstemmelse mellem vaccinestammer og cirkulerende stammer. Dette giver en evolutionær fordel favoriserer yderligere genetisk drift væk fra vaccinestammer under en epidemi, begrænse vaccinens effektivitet ofte til mindre end 50%8,9. En ekstra kilde til antigen mismatch er ægadaptiv viral mutationer genereret under vaccine fremstilling, som fører til antistoffer, der binder dårligt til cirkulerende vira10,11.
Overvinde denne udfordring af høj antigene mangfoldighed vil kræve nye forskningsværktøjer til at karakterisere bredden af præ-eksisterende og fremkaldt immunrespons på tværs af klinisk relevante antigene varianter i serum og slimhinde prøver. Aktuelt tilgængelige metoder, herunder hæmagglutinations hæmning (HAI), mikroneutralisering (MN) og traditionel ELISA, er begrænset til påvisning af antistoffer mod en enkelt virusstamme ad gangen, så deres anvendelse til påvisning af flere antistof isotyper mod flere virusstammer hurtigt udstøde tilgængelige kliniske prøve og laboratorieressourcer. Desuden, HAI og MN kræver levende virus kultur, der kun er tilgængelig i specialiserede laboratorier.
Protein mikrosystemer, der potentielt består af op til tusinder af antigener, som er trykt på nitrocellulose belagte slides som vist i figur 1, kan udfylde dette behov12. Disse mikroarrays kan produceres og probed i en høj gennemløb måde, mens forbrugende små mængder af klinisk prøve til at bestemme kvantitative antistof isotype/subtype niveauer mod hvert enkelt antigen på array. Denne tilgang til antigen opdagelse er blevet anvendt til diagnosticering og vaccine udvikling mod flere infektiøse patogener13. Til dato har vi produceret protein mikroarrays for over 35 patogener, herunder over 60.000 samlede udtrykte proteiner og brugte dem til at sonde over 30.000 humane sera fra inficerede og kontrol individer. En nyligt udviklet Portable Imaging platform for microarray slides har gjort denne metode mere tilgængelig for slutbrugeren14.
På bygge på omfattende tidligere arbejde af flere bidragydere i feltet15,16,17,18,19, et influenza protein mikroarray blev for nylig udviklet, der indeholder over 250 renset hemagglutinin (ha) antigene varianter med repræsentation af alle 18 undertyper12,20. Ved hjælp af denne metode blev en naturlig influenza infektion påvist at generere stort set reaktive IgG-og IgA-antistoffer mod Phylogenetisk relaterede HA-undertyper, mens en intramuskulær influenzavaccination kun genererede subtype-specifik IgG antistoffer21. Det blev imidlertid påvist, at tilføjelse af et adjuvans, der aktiverer bompenge lignende receptorer for influenzavacciner, udvider det fremkaldte IgG-antistofrespons på tværs af HA-undertyper i dyrestudier22.
Dette mikroarray bruges i øjeblikket til at sonde sera indsamlet fra en prospektiv kohorteundersøgelse af universitetsstuderende, der blev fulgt for influenza infektion. Her rapporteres metodologien for influenza antigen-mikrosystemet med påvisning af analysens reproducerbarhed til påvisning af subtype-specifikke og krydsreaktive antistoffer i en delmængde af prøver fra dette studie.
Protocol
Alle humane sera håndteres og bortskaffes i henhold til godkendte institutionelle protokoller for Biosikkerhed med brug af personligt beskyttelsesudstyr. Alt laboratoriepersonale, der deltager i denne protokol, har fået undervisning i biosikkerhed og forskningsetik.
1. Fremstil influenza antigen mikroarrays
-
Design og opnå antigen sæt til mikroarray
- Få udtrykte og rensede protein antigener som frysetøreret pulver.
-
Udskriv antigener på mikroarray slides
- Hvert lyofiliseret antigen rekonstruere til en koncentration på 0,1 mg/mL i fosfat-bufferet saltvand (PBS) med 0,001% Tween-20 (T-PBS). 10 μL af hvert rekonstitueret antigen overføres til individuelle brønde af en ubehandlet 384-flad bundplade.
- Udskriv antigener ved hjælp af en microarray-printer (den mikroarray printer, der anvendes i dette studie, er ikke længere kommercielt tilgængelig, se diskussion) med mikroarray-spotting Pins med lav volumen, der aspirerer antigen ind i prøve kanalen og indbetaler via direkte Kontakt og kapillar handling på 16-pad nitrocellulose belagte glas skred.
- Program mere Udskrivningssoftwaren (f. eks. Gridder) med kilde pladens konfiguration og udskrivnings parametrene.
- Brug rullemenuen til at vælge navnet på den plade type, der skal bruges med denne udskrivningsmetode. Til denne undersøgelse, brug en ubehandlet 384-godt flad bundplade.
- Marker tekstboksen ud for antal plader , og skriv det antal prøveplader, der skal bruges i denne udskrivningsprotokol. For denne undersøgelse, brug 1 plade.
- Vælg en pinkode konfiguration, der skal bruges sammen med denne metode. Brug en 8-benet konfiguration til denne undersøgelse.
- Sørg for, at Origin-forskydningerne er distancerne (i X-og Y-retningen) mellem dias oprindelsen (som er kalibreret i den administrative sektion) og det sted, hvor trykkerierne begynder at udskrive på diasene.
- Brug fanen array design til at definere størrelsen og formen på matrixer (punkt afstand og antal prikker pr. under matrix). Til dette studie, udskrive 324 pletter (180 μm diameter med 300 μm afstand) på 16-pad slides i en 18x18 format ved hjælp af 8 Pins.
- Vælg parametrene for, hvordan udskrivnings Pins skal afhente og dispensere prøver. Til denne undersøgelse aspirerer hver stift 250 nL antigen opløsning og udskriver 1 nL på hver af 40 pletter (i alt 20 slides for alle 8 Pins)
- Konfigurer PIN Cleaning Protocol og blotting Protocol. Til denne undersøgelse, hver PIN udskriver antigen, er dyppet i steril ddH2O i soniseret vask container, og derefter aspirerer næste antigen.
- Definer den sekvens, hvori prøve blokkene udskrives på diasene. Array-softwaren vil konstruere en kommenteret Grid Index (. gal) fil til at beskrive arrangementet af antigener inden for hver mikroarray.
Bemærk: den øverste række anvendes til fiducialer (med fluorescens ved alle bølgelængder, der anvendes i billeddannelse, fx blanding af Qdot 585 nm streptavidin konjugat og Qdot 800 nm streptavidin konjugat i dette studie) til at orientere gitre under billeddannelse. Ved lange tryk kørsler kan antigener i kilde pladen periodisk re-suspenderes ved pipettering op og ned og derefter centrifuger, eller ny kilde plade kan forberedes og anvendes.
- Program mere Udskrivningssoftwaren (f. eks. Gridder) med kilde pladens konfiguration og udskrivnings parametrene.
- Placer un-probed microarray slides i en lystæt box og holde i en ekssikkator kabinet ved stuetemperatur for langtidsopbevaring.
Bemærk: protokollen kan afbrydes på ubestemt tid på dette tidspunkt.
-
Udfør kvalitetskontrol kontrol (kræver poly-histidine Tags)
- Fastgør diaset til sonde kamre og rehydrerer med blokerende buffer som beskrevet i trin 2.1.1-2.1.2 og vist i figur 2.
- Fortynde musens monoklonale poly-hans antistof 1:100 i filtreret 1x blokerende buffer.
Bemærk: Hvis ikke-rensede protein antigener (f. eks. udtrykt i in vitro-transskription og oversættelsessystem) anvendes direkte til at udskrive mikroarrays, tilsættes komponenter i protein ekspressionssystemet (f. eks. e. coli -lysat) i et forhold på 1:10 med blokerende buffer, der anvendes til serumfortynding for at blokere eventuelle antistoffer mod disse komponenter. - Tilsæt 100 μL fortyndet poly-hans antistof til hvert dias kammer, der indeholder array pad efter aspiration og Inkuber i 2 timer ved stuetemperatur eller natten over ved 4 °C på shaker. Vask 3x med T-TBS buffer som beskrevet i trin 2.2.1. Fortyndet biotin-konjugeret ged anti-mus IgG sekundært antistof 1:200 i blokerende buffer, Tilsæt 100 μL per brønd efter aspiration, og Inkuber i 1 h ved stuetemperatur på shaker. Vask 3x med T-TBS buffer.
- Qdot 585 nm streptavidin konjugat fortyndes til 4 nM i blokerende buffer, Tilsæt 100 μL pr. brønd efter aspiration, og Inkuber i 1 time ved stuetemperatur på shaker. Vask 3x med T-TBS buffer, og derefter en gang med TBS buffer (uden Tween).
- Dissemble og kvantificere slides som beskrevet i trin 2.2.5-3.1.2.
Bemærk: protein antigener skal indeholde hans10 Tags for at bruge denne kvalitetskontrol protokol. Alternativt, hvis en anden tag er inkluderet, kvalitetskontrol kontrol kan udføres med antistof eller ligand for dette tag.
2. Probe sera for influenza antistoffer, som anvender mikroarrays
-
Inkuber sera på mikroarrays for antistof binding
- Fastgør mikroarray-slides til kamre ved hjælp af clips og Placer i rammer som vist i figur 3.
Bemærk: undgå altid at berøre microarray pad med hænder og instrumenter. Sørg for, at slides er orienteret med pad side op og den lille hak i øverste højre hjørne. - Rehydrere mikroarray-slides med 100 μL pr. brønd af filtreret 1x blokerende buffer og fortyndet serum 1:100 i 100 μL blokerende buffer (kan bruge ubehandlede 96-brønd plader eller 2 mL rør). Inkubér både rehydrerede mikroarray-slides i overdækkede rammer og fortyndet sera separat i 30 minutter ved stuetemperatur på orbital shaker ved 100-250 rpm. Udfør alle efterfølgende inkubations trin på samme måde på rysteapparatet.
Bemærk: sera bør citeres og nedfryses ved-80 °c for langtidsopbevaring for at minimere fryse-tø-cyklusser og bør være vortexes for at blande og centrifugeres for at fjerne partikler før brug. Overhold glide kamre omhyggeligt under og efter dette trin for at opdage eventuelle lækager, der kræver re-montering af slide kamre. - Ved hjælp af pipettespidser, der er sluttet til en vakuum linje med sekundær opsamlings kolbe, skal du forsigtigt indsuge blokerende buffer fra hjørnet af hvert kammer uden at røre ved puder. Udfør alle efterfølgende Aspirations trin på samme måde. Tilsæt fortyndede sera til puder hurtigt efter aspiration for ikke at lade puder tørre.
- Placer overdækkede rammer i bakker inde i en sekundær container omgivet af fugtige papirhåndklæder og forseglet for at forhindre fordampning. Inkubér natten over ved 4 °C på Rocking shaker (Alternativt kan det inkubere i 2 timer ved stuetemperatur på orbital shaker ved 100-250 rpm).
- Fastgør mikroarray-slides til kamre ved hjælp af clips og Placer i rammer som vist i figur 3.
-
Etiket bundne serumantistoffer med Quantum-dot-konjugerede sekundære antistoffer
- Aspirér sera fra kamre omhyggeligt som beskrevet ovenfor tilsættes 100 μL T-TBS buffer (20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,05% Tween-20 i ddH2O justeret til pH 7,5 og filtreret, kan fås kommercielt), og inkubere i 5 min på orbital shaker på 100-250 rpm. Gentag dette vaske trin i alt 3x (alle efterfølgende vaske trin udføres på samme måde).
- Tilbered blandingen af sekundære antistoffer fortyndet til 1 μM i blokerende buffer og bland grundigt ved pipettering før og under brug for at opretholde homogeniteten.
Bemærk: for at bevare analysens reproducerbarhed bør det samme parti af hvert sekundært antistof anvendes til alle prøve eksperimenter, for hvilke der er planlagt kvantitativ sammenligning af data på tværs af eksperimenter. Den specifikke koncentration af sekundært antistof kan være nødvendigt at variere afhængigt af affiniteten; Følg producentens protokoller, når de er tilgængelige. - Aspirér buffer fra kamre efter endelig vask, Tilsæt 100 μL pr. brønd af sekundær antistof blanding, og Inkuber i 2 timer ved stuetemperatur på shaker.
- Aspirere sekundær antistof-blanding vask 3x med T-TBS buffer, og vask derefter en gang med TBS buffer (uden Tween).
- Dissemble microarray slides fra kamre omhyggeligt for at undgå at røre puder, skyl forsigtigt med filtreret ddH2O, og tør ved at placere i 50 ml rør og centrifuger ved 500 x g i 10 min.
- Placer probed microarray slides i en lystæt boks og holde i en ekssikkator kabinet ved stuetemperatur for langtidsopbevaring.
Bemærk: protokollen kan sættes på pause i op til 1 uge på dette tidspunkt.
3. Kvantificer antistof binding til antigener inden for mikroarray
-
Visualiser mikroarray-slides, og Kvantificer spot fluorescens intensitet for at måle antistof binding
- Få billeder af microarray-slides ved hjælp af den bærbare Imager med indbygget software.
- Vælg den korrekte slide konfiguration under fanen Konfigurer Imager . Til denne undersøgelse skal du bruge 16-pad-slides.
- Under fanen billedkontrol skal du vælge den korrekte fluorescerende kanal og justere Gain, eksponeringstid og anskaffelsestidspunkt afhængigt af seraernes reaktivitet for at opnå optimale billeder. Til dette studie var de fluorescerende kanaler for IgA og IgG henholdsvis 585 nm og 800 nm, og billedbehandlings indstillingerne var gevinst på 50, eksponeringstid på 500 MS og anskaffelsestid på 1 s.
- Klik på Capture for at starte processen med at erhverve billedet.
Bemærk: Mikroarray slides kan re-imaged på flere indstillinger uden forringelse af signalet, så længe de er lagret mørkt og tørt. Andre billedbehandlingssystemer kan bruges, hvis de er kompatible med diasene.
- Registrer array spots ved hjælp af gitre orienteret baseret på de fiducial markører og måle spot intensitet som median af pixel intensitet minus baggrund målt omkring pletter. Udfør denne kvantificering algoritme i batch ved hjælp af den indbyggede Imager software, som udnytter den. gal fil konstrueret i trin 1.2.2 at forbinde spot intensiteter til individuelle antigener på hver mikroarray.
- I panelet Filoplysninger skal du uploade. gal-filen ved at vælge fra dens mappe på computeren og angive den mappe, hvor analyse output filerne skal gemmes, i afsnittet analyseindstillinger .
- På fanen billedkontrol skal du åbne et af de erhvervede billeder, der skal kvantificeres, og vælge knappen Auto i øverste højre hjørne.
- I afsnittet matrix analyse i nederste højre hjørne, oprette en fiducial skabelon som anvist af softwaren.
- Klik på batch analysen, Vælg den mappe, som indeholder de billeder, der skal kvantificeres, og vælg den fiducial skabelon, der blev oprettet i det foregående trin. Softwaren analyserer hvert billede og kvantificerer spot intensiteten.
Bemærk: dette trin genererer en. csv-fil, der indeholder spot intensiteter, der kvantificerer antistoffer inden for hvert serum præparat, som binder til hvert enkelt antigen på mikrosystemet, som efterfølgende kan manipuleres i regnearks manipulerings-eller analyse software.
- Analyser rå data for at sammenligne antistof binding på tværs af antigener og på tværs af serumprøver. Til dette studie blev IgA-og IgG-antistoffer målt som 585 nm og 800 nm fluorescerende spot intensiteter sammenlignet på tværs af alle antigener mellem 2 uafhængige kørsler af eksperimentet med forskellige dias på forskellige dage, og der blev udført korrelationsanalyse for at måle analysens reproducerbarhed.
Bemærk: for ikke-rensede proteiner trykt som udtryks blanding, bør dataanalyse begynde med baggrunds subtraktion af en ingen DNA-kontrol.
- Få billeder af microarray-slides ved hjælp af den bærbare Imager med indbygget software.
Representative Results
Som en demonstration af protokollen blev baseline sera analyseret fra 16 personer i et prospektivt kohortestudie af universitetsstuderende fulgt for influenza infektion på influenza antigen mikroarray. For at påvise analysens reproducerbarhed blev disse prøver probed to gange, på forskellige dias og forskellige dage.
Til denne undersøgelse blev der fremstillet rensede influenza antigener indeholdende hans10 Tags fra kommerciel leverandør (Se tabel over materialer) og samarbejdspartnere. Disse antigener omfatter 251 total HA antigener, med 63 globulære hoved domæner (HA1) og 186 fuld-længde proteiner (HA0), herunder 96 monomere HA0 proteiner og 90 trimerized HA0 proteiner, der indeholder smeltet trimerization ("foldon") domæne23. En komplet liste over antigener og kontroller, der anvendes i denne undersøgelse, er medtaget som en supplerende fil. Til dette studie blev der anvendt sekundære antistoffer som ged anti-humant IgG konjugeret til Quantum dot udsender ved 800 nm (GAH-IgG-Q800) og ged anti-Human IgA konjugeret til Quantum dot udsender ved 585 nm (GAH-IgA-Q585) for multiplex påvisning af IgG og IgA antistoffer som vist i figur 3. IgG-og IgA-antistof binding til forskellige undertyper og molekylære former af influenza-HA-antigener blev sammenlignet for sera fremstillet af den ovenfor beskrevne kliniske kohorte.
Det resulterende varmekort er vist i figur 4 med grafisk gengivelse i figur 5. I disse tal er det kun de klinisk relevante undertyper med høj repræsentation på array er mærket for at spare plads, med "+" angiver alle resterende undertyper af højere antal, og mindre eller mindre godt repræsenterede undertyper inkluderet som bestilt (f. eks H2 i mellem H1 og H3). En komplet liste over stammer og undertyper på arrayet er inkluderet som supplerende fil. Disse data viser, at antistoffer mod hovedgruppen af HA er subtype-specifikke med forventet høj mængde af antistoffer til klinisk udbredte stammer (H1N1, H3N2 og B) og lav mængde af antistoffer til andre stammer. Men, antistoffer mod hele ha, som omfatter stilk domæne, er mere kryds-reaktive på tværs af undertyper, og denne effekt synes at være forstærket, når hele ha er trimerized. Dette resultat er ikke uventet, da hele HA omfatter Stem-regionen, som er meget bevaret på tværs af undertyper. Derfor repræsenterer antistoffer mod hele HA-molekyler fra ikke-kliniske undertyper (f. eks. H5 og H7) sandsynligvis anti-Stem-antistoffer, der oprindeligt blev fremkaldt mod kliniske undertyper (f. eks. H1 og H3), som krydsreagerer med Stam områderne i de andre HA-undertyper. på arrayet. Dette punkt illustrerer vigtigheden af at medtage både hoved HA og hele molekyle HA på arrayet for at skelne mellem antistoffer til hovedet og stammen regioner, der viser forskellige reaktivitet profiler.
Analysen viser god reproducerbarhed på tværs af sondering kørsler. Den anden løbetur viser lidt lavere IgG-antistoffer på tværs af alle stammer, selv om mønsteret mellem stammerne er konsistent. Denne overdrevne lille nedgang skyldes sandsynligvis batch-til-batch variabilitet i det sekundære antistof, som blev ændret mellem kørsler for IgG, men ikke for IgA. Som anført i protokollen anbefales det således at anvende samme parti af hvert sekundært antistof til eksperimenter, der er planlagt til kvantitativ sammenligning. Hvis der er behov for forskellige partier af antistof på grund af et stort antal prøver, der skal testes, anbefalede vi at medtage fælles prøver mellem eksperimentelle kørsler med forskellige antistof partier for at muliggøre kvantitativ sammenligning med korrektion.
Figur 1: skematisk protein mikroarray. Hver slide indeholder flere puder hver med en enkelt array, som består af hundredvis af antigener trykt på pletter anbragt i et gitter, med hver plet indeholder en antigen adsorbetet på den 3-dimensionelle topografi af nitrocellulose overflade, som antistoffer fra serum er bundet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: skematisk af influenza antigen microarray Printing og sondering Protocol. Fra venstre til højre trykkes mikroarray ved hjælp af nitrocellulose belagte slides, som bruges til at sonde sera for IgG-og IgA-antistoffer ved hjælp af Quantum-dot-konjugerede sekundære antistoffer, med billeder, der er afbildet ved hjælp af en bærbar Imager, og resultater analyseret til Generer et varmekort. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: procedure for fastgørelse af sonde kammer til microarray slide. Fra A til Fanbringes sonde kammeret oven på diaset i korrekt retning, fastgjort til diaset ved hjælp af vandrette clips på siderne og anbragt i sonde bakken. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: repræsentative resultater af influenza antigen mikroarray. Varmekort repræsenterer antigen-specifikke antistofrespons, hvor hver række repræsenterer et enkelt antigen arrangeret af molekyle, subtype og stamme, og hver kolonne, der repræsenterer en prøvens kørsel af en enkelt prøve, arrangeret af antistof isotype og køre (a, hvid = 0, sort = 20000, rød = 40000 fluorescens intensitet). Antigen-undertyperne, herunder alle hemagglutinin-undertyper fra 1 til 18 og alle neuraminidasetypen-undertyper fra 1 til 10, er anbragt vertikalt og mærket til venstre. En sammenligning af fluorescens intensiteten mellem to kørsler viser en god kvantitativ reproducerbarhed ved lineær regression for IgA (B) og IgG (C). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: bredde af serumantistoffer målt på influenza antigen mikroarray. Serum IgA (A) og IgG (B) er GRUPPERET efter ha og na molekylære former og undertyper for at påvise høj specificitet af ha-hovedgruppe antistoffer for kliniske undertyper og høj tvær reaktivitet af hele ha og trimerized hele ha-antistoffer med inddragelse af stilk-regionen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende fil: liste over antigener på influenza antigen microarray. Indholdet vises for alle 324 pletter på arrayet, herunder blanktegn, fiducialer, kontrol (humant IgG og IgA og anti-humant IgG og IgA ved 0,1 mg/mL og 0,3 mg/mL) og antigener med oplysninger om kilde, molekyl form, subtype og stamme. Forkortelser er som følger: for source, Sino = Sino Biological Inc., FKL = Florian krammer laboratorium; for molekyle form, HA1 = hoved ha, HA0 = hele ha, HA2 = stilk ha, NP = nucleoprotein. For antigener indkøbt fra Sino Biological Inc., vises katalognumre; antigen-id'er er angivet for antigener, der stammer fra krammer laboratorium. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Discussion
Den influenza antigen microarray protokol beskrevet her er tilpasningsdygtig til ethvert projekt, der kræver at analysere antistofrespons på mange antigener. Microarray platformen kan anvendes med alle ønskede sæt af protein antigener udtrykt i ethvert system, der kan opnå 0,1 mg/mL eller højere udbytte med eller uden rensning som tidligere beskrevet12. Hvis ikke-rensede protein antigener (f. eks. udtrykt i in vitro-transskription og oversættelsessystem) anvendes direkte til at udskrive mikroarrays, bør komponenter af protein ekspressionssystemet (f. eks. e. coli -lysat) tilsættes 1:10 til blokerende buffer, der anvendes til fortynding af sera og kvalitetskontrol antistoffer for at blokere eventuelle antistoffer mod disse komponenter. Slide konfigurationer er tilgængelige med et lavere antal større puder på hver slide til at rumme et højere antal antigener per array. Til denne undersøgelse, vi brugte en GeneMachines OmniGrid 100 microarray printer, der udnytter stifter, der direkte kontakt nitrocellulose overflade til at deponere pletter på arrayet. Mens denne microarray printer ikke længere er kommercielt tilgængelig, kan andre kommercielt tilgængelige mikroarray printere bruges i denne protokol, men kan kræve brugerdefinerede Pins (enten kontakt eller ikke-kontakt) og software og bør have tilstrækkelig spot opløsning og kompatibilitet med slides og Imager. Afhængigt af reaktivitet af sera kan der anvendes fortyndinger fra 1:50 til 1:400. Serum-fri buffer kan bruges som en negativ kontrol, mens monoklonale antistoffer, der vides at binde til antigen, kan bruges som en positiv kontrol.
Brugerne skal være opmærksomme på nogle få fejlfindingsproblemer. Formålet med kvalitetskontrol kontrollen ved hjælp af antistoffer til hans tag er at kontrollere for eventuelle antigener, som udskrivningen ikke lykkedes. Enhver pletter, der konsekvent giver lavt signal i kvalitetskontrol kontrol af flere arrays sandsynligvis repræsenterer utilstrækkelige antigen trykt. Mulige årsager omfatter sammenlægning eller udfældning eller antigen i kilde pladen eller dårlig kontakt mellem trykning PIN og microarray slide på grund af variabel tykkelse af nitrocellulose pad. På dette tidspunkt udfører vi ikke analyse normalisering baseret på kvantitative resultater af kvalitetskontrol kontrollen, da den detekterede binding af anti-hans antistoffer kan påvirkes af tilgængeligheden af dette tag, som afhænger af den 3-dimensionelle kropsbygning specifikke for hvert antigen.
Influenza antigen microarray giver flere fordele i forhold til traditionelle metoder som ELISA og supplerer funktionelle assays som HAI og MN. Det 16-pad protein mikroarray er en prøve besparende teknologi med kapacitet til at måle antistoffer af flere isotyper samtidig mod ca. 300 antigener fra 1 μL serum. Antallet af antigener kan øges til de tusinder ved at reducere antallet af puder pr dias. Den multiplexed assay sparer også personale tid og forbrugs ressourcer, da hundredvis af sera kan probed for antistoffer i 2 dage, og alle andre materialer end lysbilleder og reagenser er genanvendelige så ikke genererer store mængder af plastaffald.
Mens microarray-printere ikke kan distribueres bredt, kan mikroarray-slides udskrives på et centralt sted og derefter transporteres til slutbrugeren til sondering. Det eneste nødvendige udstyr til sondering er den billige og bærbare Imager. Målet med at udbrede denne protokol er at gøre udnyttelsen af denne teknik mere udbredt.
De vigtigste begrænsninger af influenza antigen microarray er den manglende evne til at karakterisere funktion og kinetik af de fundne antistoffer. Mikrosystemet detekterer et polyklonal sæt bindende antistoffer for hvert antigen. Disse antistoffer kan eller kan ikke være funktionelle i neutraliserende virus i HAI og MN assays. Men HAI og MN assays kræver levende virus kultur med tilhørende behov for specialiserede faciliteter med højt niveau biosikkerhedskabinetter at teste for antistoffer mod aviær undertyper af influenza, hvorimod protein mikrosystemet ikke involverer levende virus komponenter, så kan udnyttes i ethvert grundlæggende laboratorium. Med hensyn til bindende kinetik, en enkelt fortynding af serum probed med en matrix, der indeholder en enkelt koncentration af hvert antigen giver et enkelt datapunkt, som repræsenterer en sammensat mængde og affinitet summeres over alle antistoffer, der binder sig til antigen . For fuldt ud at løse antigen-antistof-bindings kinetikken kræves der flere antigen koncentrationer og/eller serielle fortyndinger af sera.
På trods af disse begrænsninger, influenza antigen microarray er et nyttigt redskab til at karakterisere bredden af influenza antistoffer på tværs af det antigene landskab, der kan supplere funktionelle assays, der er mere begrænset i gennemløb og tilgængelighed.
Disclosures
Forfatterne har ingen oplysninger.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne anerkende Prof. Don Milton (Institute of Applied Public Health, University of Maryland, College Park, MD, USA) til indsamling af humane sera under University of Maryland IRB-protokollen #313842 finansieret af DARPA N66001-18-2-4015 P00001. Forfatterne vil også gerne anerkende Prof. Florian krammer (Icahn School of Medicine, MT. Sinai, NY, USA) for at levere trimerized HA og NA antigener finansieret af ODNI IARPA DJF-15-1200-K-0001725. S. Khan er delvist støttet af det nationale center for forskning ressourcer og National Center for fremme translational Sciences, nationale institutter for sundhed, gennem Grant KL2 TR001416. Indholdet er udelukkende ansvaret for forfatterne og ikke nødvendigvis repræsenterer de officielle synspunkter af NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16-pad nitrocellulose-coated glass slides | Grace Bio Labs | 305016 | |
| 1x GVS FAST blocking buffer | Fischer Scientific | 10485356 | |
| ArrayCam portable imager | Grace Bio Labs | 400S | Other imaging devices can be used to visualize slides if capable of achieving the resolution of the microarray spots and the excitation and emission wavelengths of the quantum dots. |
| Biotin-conjugated goat anti-mouse-IgG antibody | Thermo Fischer | 31800 | |
| HiBase 384-well plate | Greiner Bio-One | T-3037-11 | |
| Microarray pins | ArrayIt | GMP2 | Each different microarray printer may require its own custom microarray pins. |
| Mouse monoclonal poly-His antibody | Sigma-Aldrich | H1029 | |
| OmniGrid 100 microarray printer | GeneMachines | The version of the microarray printer used in this work is no longer commercially available, but the updated similar equipment is the OmniGrid Accent microarray printer from Digilab (Hopkinton, MA), and the same protocol can be carried out with most commercially available microarray printers. | |
| ProPlate slide chambers | Grace Bio Labs | 246890 | |
| ProPlate slide clips | Grace Bio Labs | 204838 | |
| ProPlate slide frames | Grace Bio Labs | 246879 | |
| Quantum dot 585 nm conjugated goat anti-human-IgA antibody | Grace Bio Labs | 110620 | |
| Quantum dot 585 nm streptavidin conjugate | Thermo Fischer | Q10111MP | |
| Quantum dot 800 nm conjugated goat anti-human-IgG antibody | Grace Bio Labs | 110610 |
References
- Murray, C. J., et al. Disability-adjusted life years (DALYs) for 291 diseases and injuries in 21 regions, 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet. 380 (9859), 2197-2223 (2010).
- Renegar, K. B., Crouse, D., Floyd, R. A., Krueger, J. Progression of influenza viral infection through the murine respiratory tract: the protective role of sleep deprivation. Sleep. 23 (7), 859-863 (2000).
- Li, L., et al. Heterogeneity in Estimates of the Impact of Influenza on Population Mortality: A Systematic Review. American Journal of Epidemiology. 187 (2), 378-388 (2018).
- Fauci, A. S. Seasonal and pandemic influenza preparedness: science and countermeasures. Journal of Infectious Diseases. 194 Suppl 2, S73-S76 (2006).
- Duggal, A., Pinto, R., Rubenfeld, G., Fowler, R. A. Global Variability in Reported Mortality for Critical Illness during the 2009-10 Influenza A(H1N1) Pandemic: A Systematic Review and Meta-Regression to Guide Reporting of Outcomes during Disease Outbreaks. PLoS One. 11 (5), 2009-2010 (2016).
- Demicheli, V., Jefferson, T., Ferroni, E., Rivetti, A., Di Pietrantonj, C. Vaccines for preventing influenza in healthy adults. Cochrane Database Systematic Reviews. 2, CD001269 (2018).
- Erbelding, E. J., et al. A Universal Influenza Vaccine: The Strategic Plan for the National Institute of Allergy and Infectious Diseases. Journal of Infectious Diseases. , (2018).
- Xie, H., et al. H3N2 Mismatch of 2014-15 Northern Hemisphere Influenza Vaccines and Head-to-head Comparison between Human and Ferret Antisera derived Antigenic Maps. Scientific Reports. 5, 15279 (2015).
- Tricco, A. C., et al. Comparing influenza vaccine efficacy against mismatched and matched strains: a systematic review and meta-analysis. BMC Medicine. 11, 153 (2013).
- Katz, J. M., Webster, R. G. Efficacy of inactivated influenza A virus (H3N2) vaccines grown in mammalian cells or embryonated eggs. Journal of Infectious Disease. 160 (2), 191-198 (1989).
- Zost, S. J., et al. Contemporary H3N2 influenza viruses have a glycosylation site that alters binding of antibodies elicited by egg-adapted vaccine strains. Proceedings of the National Academy of Science. 114 (47), 12578-12583 (2017).
- Davies, D. H., et al. Profiling the humoral immune response to infection by using proteome microarrays: high-throughput vaccine and diagnostic antigen discovery. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 102 (3), 547-552 (2005).
- Liang, L., Felgner, P. L. A systems biology approach for diagnostic and vaccine antigen discovery in tropical infectious diseases. Current Opinion in Infectious Diseases. 28 (5), 438-445 (2015).
- Jain, A., et al. Evaluation of quantum dot immunofluorescence and a digital CMOS imaging system as an alternative to conventional organic fluorescence dyes and laser scanning for quantifying protein microarrays. Proteomics. 16 (8), 1271-1279 (2016).
- Desbien, A. L., et al. Development of a high density hemagglutinin protein microarray to determine the breadth of influenza antibody responses. Biotechniques. 54 (6), 345-348 (2013).
- Mace, C. R., et al. Label-free, arrayed sensing of immune response to influenza antigens. Talanta. 83 (3), 1000-1005 (2011).
- Koopmans, M., et al. Profiling of humoral immune responses to influenza viruses by using protein microarray. Clinical and Microbiology Infections. 18 (8), 797-807 (2012).
- Bucukovski, J., Latorre-Margalef, N., Stallknecht, D. E., Miller, B. L. A Multiplex Label-Free Approach to Avian Influenza Surveillance and Serology. PLoS One. 10 (8), e0134484 (2015).
- Meade, P., Latorre-Margalef, N., Stallknecht, D. E., Krammer, F. Development of an influenza virus protein microarray to measure the humoral response to influenza virus infection in mallards. Emerging Microbes and Infection. 6 (12), e110 (2017).
- Vigil, A., Davies, D. H., Felgner, P. L. Defining the humoral immune response to infectious agents using high-density protein microarrays. Future Microbiology. 5 (2), 241-251 (2010).
- Nakajima, R., et al. Protein Microarray Analysis of the Specificity and Cross-Reactivity of Influenza Virus Hemagglutinin-Specific Antibodies. mSphere. 3 (6), (2018).
- Van Hoeven, N., et al. A Formulated TLR7/8 Agonist is a Flexible, Highly Potent and Effective Adjuvant for Pandemic Influenza Vaccines. Scientific Reports. 7, 46426 (2017).
- Krammer, F., et al. A carboxy-terminal trimerization domain stabilizes conformational epitopes on the stalk domain of soluble recombinant hemagglutinin substrates. PLoS One. 7 (8), e43603 (2012).
