Summary
אנו מציגים פרוטוקול לשימוש מיקרוarray חלבון שנבנה על ידי הדפסת אנטיגנים שפעת על ניטרוצלולוזה מצופה שקופיות בו סרום בדיקה עבור נוגדנים מרובים isotypes נגד מעל 250 אנטיגנים מפני זנים וירוסים שונים, ובכך המאפשר מדידה של רוחב של נוגדנים סרום ברחבי תת וירוס.
Abstract
וירוס שפעת נשאר גורם משמעותי של התמותה ברחבי העולם בשל האפקטיביות המוגבלת של החיסונים הזמינים כעת. אתגר מפתח להתפתחות של חיסונים שפעת אוניברסלית הוא מגוון אנטיגניים גבוה הנובע הסחף העברה אנטיגנית. התגברות על האתגר הזה דורש כלי מחקר חדשניים כדי למדוד את היקף של נוגדנים סרום בבימויו של זנים וירוסים רבים ברחבי תת הגניים שונים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לניתוח היקף של נוגדנים נסיוב נגד זנים וירוס שפעת מגוונות באמצעות מיקרוarray חלבון של אנטיגנים שפעת.
זה אנטיגן שפעת מיקרוarray נבנה על ידי הדפסה מטוהרים hemagglutinin ו שימוש אנטיגנים עצביים על קרום ניטרוגליצרין מצופה תאית באמצעות מדפסת microarray. שרה האדם מודפה על המיקרומערך כדי לאגד נוגדנים נגד אנטיגנים שפעת. שימוש בנוגדנים משניים קוונטית-נקודה-מצומדת משמשים בו לזהות IgG וכריכת נוגדנים ל-IgA לכל אנטיגן במיקרו-מערך. כריכת נוגדנים כמותית נמדדת כאינטנסיביות של זריחה באמצעות imager נייד. תוצאות הנציג מוצגות כדי להדגים את השגות ביכולות המדידה במדידת נוגדנים מסוג תת-שפעת ספציפיים ומצולבים.
לעומת שיטות מסורתיות כגון אליסה, אנטיגן שפעת microarray מספק גישה מגובשת תפוקה גבוהה מסוגל לבדוק מאות סרה עבור נוגדנים מרובים isotypes נגד מאות אנטיגנים במסגרת זמן קצר, ולכן יש יישומים ב-sero-מעקב ופיתוח חיסונים. מגבלה היא חוסר היכולת להבדיל נוגדנים מחייב לנטרל נוגדנים.
Introduction
וירוס שפעת אחראי על אובדן של 20,000,000 חיים שנים בשנה על ידי מוות או נכות, כולל 1% של כל מקרי המוות ברחבי העולם בכל שנה, עם השפעות בלתי מידתית על קשישים ואוכלוסיות באזורים הטרופיים ומתפתחת בעולם1, 2,3. בנוסף על נטל המחלה של מגיפה עונתית, הופעתה של זנים שפעת הרומן דרך מחדש גנטית מבחר באופן טבעי במחשבים מארחים משותפים או מלאכותי עבור ביולוגי יכול להוביל לגיפות ברחבי העולם עם התפשטות מהירה והרמה גבוהה. ד , 5. בעוד חיסונים שפעת רבים זמינים כרגע, האפקטיביות שלהם מוגבלת על ידי מסוג המשנה ספציפיות6, יצירת הצורך לפתח חיסונים שפעת אוניברסלית המקנים חסינות ארוכת טווח נגד וירוסים מרובים זנים7.
אתגר מפתח להתפתחות של חיסונים שפעת אוניברסלית הוא מגוון העברה אנטיגנית גבוהה על פני זנים. הספציפיות האנטיגניים של חיסונים הנוכחי בשילוב עם וריאציה אנטיגניים של במחזור וירוסים יוצר חוסר התאמה בין זנים החיסון במחזור זנים. זה מהווה יתרון אבולוציוני העדפה נוספת להיסחף גנטית הרחק מן החיסון זנים במהלך מגיפה, הגבלת יעילות החיסון לעתים קרובות פחות מ 50%8,9. מקור נוסף של חוסר התאמה נגד הגניים הוא ביצה מוטציות נגיפי שנוצר במהלך ייצור החיסון, אשר להוביל נוגדנים כי לאגד גרוע למחזור וירוסים10,11.
התגברות על האתגר הזה של מגוון העברה אנטיגנית גבוהה ידרוש כלים מחקר הרומן לאפיין את היקף של תגובות החיסון טרום קיימים והוא מעורר באמצעות המשתנים הרלוונטיים קלינית הנסיוב ודגימות רירית. השיטות הזמינות כיום, כולל עיכוב המיגגלוצינציה (HAI), microneutralization (MN), ו-אליסה המסורתית, מוגבלות לזיהוי נוגדנים נגד זן וירוס יחיד בכל פעם, כך השימוש שלהם לאיתור של נוגדנים מרובים איזוסוגים נגד מספר זנים וירוסים מתיש במהירות זמין דגימה קלינית משאבי מעבדה. יתר על כן, חאי ו-MN דורשים תרבות וירוס חי זמין רק במעבדות מיוחדות.
מיקרו מערכים חלבון, המורכב עד אלפי אנטיגנים המודפסים על מגלשות מצופי תאית כמוצג באיור 1, יכול למלא את הצורך12. מיקרו מערכים אלה ניתן לייצר ונחקר באופן תפוקה גבוהה תוך צריכת כמויות קטנות של דגימה קלינית כדי לקבוע נוגדן כמותי isotype/תת מסוג רמות נגד כל אנטיגן בודד על המערך. גישה זו לגילוי אנטיגן הוחל על פיתוח אבחון וחיסון נגד פתוגנים מרובים מרובי זיהומיות13. עד כה, הופקו מיקרומערכים חלבון עבור מעל 35 פתוגנים כולל מעל 60,000 הכולל חלבונים והשתמשו בהם כדי לחקור מעל 30,000 סרה של אדם מאנשים נגועים ושליטה. פלטפורמת דימות נייד שפותחה לאחרונה עבור שקופיות microarray הפכה מתודולוגיה זו לנגישה יותר למשתמש הקצה14.
בנייה על עבודה קודמת נרחבת של מספר משתתפים בתחום15,16,17,18,19, מיקרוarray חלבון שפעת פותחה לאחרונה המכילה מעל 250 מטוהרים המגגלוטין (HA) נוגדי האנטיגניים עם ייצוג של כל 18 תתי-הסוגים12,20. באמצעות מתודולוגיה זו, דלקת שפעת טבעית הוכיחה לייצר הרבה יותר מגיבים ונוגדנים לIgA נגד הקשורים phylogenetically הקשורות, בעוד חיסון שפעת תוך-שרירית שנוצר רק תת-סוג ספציפי IgG נוגדנים21. עם זאת, הוספת שדון המפעיל קולטנים כמו שפעת כדי חיסונים הוכח להרחיב את תגובת הנוגדן IgG התוצאה על פני תת HA במחקרים בעלי חיים22.
מיקרוarray זה משמש כיום כדי לחקור את סרה שנאסף ממחקר של הסטודנטים הפוטנציאליים המכללה שעקבו אחר זיהום שפעת. כאן, המתודולוגיה של מיקרומערך אנטיגן שפעת עם הדגמה של שיטת הפעולה כדי לזהות נוגדנים ספציפיים מסוג ו-תגובתי במערכת המשנה של דגימות ממחקר זה מדווחים.
Protocol
כל האדם מטופל ומסולק על פי פרוטוקולים מוסדיים מאושרים עבור אבטחה טיחות עם שימוש בציוד אישי מגן. כל אנשי המעבדה המשתתפים בפרוטוקול זה קיבלו הכשרה בנושאי בטיחות ואתיקה מחקרית.
1. הפקת אנטיגן שפעת מיקרומערכים
-
תכנון וקבלת ערכת אנטיגן למיקרו-מערך
- השיגו אנטיגנים חלבונים מבוטאים ומטוהרים כאבקה ליאופהולן.
-
הדפס אנטיגנים על שקופיות של מערך מיקרו
- מהווים מחדש את האנטיגן של ליאופהארט לריכוז של 0.1 מ"ג/mL בתמיסת מלח באגירה (PBS) עם 0.001% רצף-20 (T-PBS). העברה 10 μL של כל אנטיגן מחדש לבארות בודדות של לוחית מטופלת 384-ובכן שטוח למטה.
- הדפס אנטיגנים באמצעות מדפסת microarray (מדפסת המיקרו-מערך המשמשת במחקר זה כבר אינה זמינה מסחרית, ראה דיון) עם מערך מיקרו של נפח נמוך הרואה פינים המאכף אנטיגן לתוך הערוץ לדוגמה והפקדה באמצעות ישיר מגע ופעולה קפילר על 16-pad ניטרוגליצרין מצופה זכוכית שקופיות.
- תכנת את תוכנת ההדפסה (למשל, גרידר) עם התצורה של לוחית המקור ופרמטרי ההדפסה.
- השתמש בתפריט הנפתח כדי לבחור את שם סוג הלוח שישמש בשיטת הדפסה זו. עבור מחקר זה, השתמש בלוח מטופל 384-באר שטוח-תחתון.
- בחר בתיבת הטקסט שליד מספר הלוחות והקלד את מספר הלוחות לדוגמה שישמשו בפרוטוקול הדפסה זה. , בשביל המחקר הזה. תשתמשו בצלחת 1
- בחר בתצורת pin לשימוש עם שיטה זו. עבור מחקר זה, השתמש בתצורה של 8 פינים.
- ודא שהסטת המקור הם המרחקים (בכיוון ה-X ו-Y) בין מקור השקופית (המכויל במקטע הניהולי) והמיקום שבו סיכות ההדפסה יתחילו להדפיס על השקופיות.
- באמצעות הכרטיסיה עיצוב מערך , הגדר את הגודל והצורה של המערכים (ריווח נקודות ומספר נקודות לכל מערך משנה). עבור מחקר זה, להדפיס 324 כתמים (180 יקרומטר קוטר עם 300 יקרומטר מרווח) אל 16-pad שקופיות בפורמט 18x18 באמצעות 8 פינים.
- בחר את הפרמטרים עבור האופן שבו סיכות ההדפסה אוספים ומדבקות בדגימות. עבור מחקר זה, כל סיכה מוקצטים 250 nL של פתרון אנטיגן והדפסים 1 nL על כל אחד 40 נקודות (סך של 20 שקופיות עבור כל 8 פינים)
- קבע את התצורה של פרוטוקול ניקוי הפינים והפרוטוקול החוסם. עבור מחקר זה, כל סיכה הדפסה אנטיגן, הוא טבל ב-ddH סטרילי2O ב sonicated לשטוף מיכל, ולאחר מכן שטפי את האנטיגן הבא.
- הגדר את הרצף שבו מודפסים גושי המדגם על השקופיות. התוכנה במערך תבנה אינדקס רשת מוערת (. gal) כדי לתאר את הסידור של אנטיגנים בתוך כל microarray.
הערה: השורה העליונה משמשת עבור fiducials (עם זריחה בכל אורכי גל המשמשים הדמיה, למשל, שילוב של Qdot 585 nm streptavidin המשלים ו Qdot 800 nm streptavidin המשלים במחקר זה) כדי האוריינט רשתות במהלך הדמיה. לקבלת הדפסה ארוכה, אנטיגנים בצלחת המקור יכול להיות מדי פעם מושעה מחדש על ידי pipetting למעלה ולמטה ולאחר מכן תפרידו, או צלחת המקור חדש יכול להיות מוכן ומשומשים.
- תכנת את תוכנת ההדפסה (למשל, גרידר) עם התצורה של לוחית המקור ופרמטרי ההדפסה.
- מניחים שקופיות של מיקרוarray בלתי נחקר בקופסת אור ושומרים בארון מdesiccator בטמפרטורת החדר לאחסון לטווח ארוך.
הערה: ייתכן שהפרוטוקול הושהה בשלב זה ללא הגבלה.
-
לבצע בדיקת בקרת איכות (דורש תגיות פולי היסטידין)
- חבר את השקופית לחדרי גישוש והימה מחדש עם מאגר חוסם כמתואר בשלב 2.1.1-2.1.2 ומוצג באיור 2.
- לדלל את העכבר חד שבטיים פולי-הנוגדן שלו 1:100 במאגר מסוננים 1x חסימת.
הערה: אם לא מטוהרים אנטיגנים חלבון (למשל, המתבטאת בתמלול ומערכת תרגום) משמשים ישירות כדי להדפיס מיקרו מערכים, להוסיף רכיבים של מערכת ביטוי חלבון (למשל, e. coli ליפוסט) ביחס של 1:10 עם חסימת מאגר המשמש לדילול הנסיוב כדי לחסום נוגדנים שמכוונים לרכיבים אלה. - הוסף 100 μL של הנוגדן פולי שלו לכל תא שקופית המכיל את משטח המערך לאחר השאיפה ואת הדגירה עבור 2 h בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 ° c על שייקר. שטוף 3x עם מאגר T-TBS כמתואר בשלב 2.2.1. לדלל ביוטין מצומדת עז נגד עכבר IgG משנית הנוגדן 1:200 במאגר חסימת, להוסיף 100 μL עבור היטב לאחר השאיפה, ו דגירה עבור 1 h בטמפרטורת החדר על שייקר. שטוף 3x עם מאגר T-TBS.
- לדלל Qdot 585 nm streptavidin המשלים ל 4 ננומטר במאגר חסימת, להוסיף 100 μL לכל הטוב לאחר השאיפה, ו דגירה עבור 1 h בטמפרטורת החדר על שייקר. שטוף 3x עם מאגר T-TBS, ולאחר מכן פעם אחת עם מאגר TBS (ללא יצירת רצף).
- משקפים ומכמת כמתואר בשלב 2.2.5 – 3.1.2.
הערה: אנטיגנים חלבון חייב להכיל10 תגי שלו כדי להשתמש בפרוטוקול זה בקרת איכות. לחילופין, אם מדובר בתגית שונה, ניתן לבצע בדיקת בקרת איכות בעזרת נוגדן או ליגולי עבור תגית זו.
2. בדיקה סרה לנוגדנים שפעת באמצעות מיקרו מערכים
-
דגירה של מיקרו מערכים עבור כריכת נוגדנים
- צרף שקופיות microarray לתאים באמצעות קליפים ומקום במסגרות כפי שמוצג באיור 3.
הערה: תמיד להימנע מנגיעה בלוח המיקרו מערך עם הידיים והמכשירים. ודא שהשקופיות מכוונות עם צד הלוח כלפי מעלה והחריץ הקטן בפינה הימנית העליונה. - מימה מחדש של שקופיות microarray עם 100 μL לכל טוב של מאגר חסימת 1x מסוננים, ו לדלל סרום 1:100 ב 100 μL של חסימת מאגר (יכול להשתמש מטופל 96-צלחות לוחות או 2 מ"ל צינורות). דגירה הן מחדש מיקרוarray שקופיות מסגרות מכוסות מדולל סרה בנפרד עבור 30 דקות בטמפרטורת החדר על שייקר מסלולית ב 100-250 סל ד. בצע את כל שלבי הדגירה הבאים באופן דומה על שייקר.
הערה: סרה צריך להיות מצוטט ו קפואים ב-80 ° c לאחסון לטווח ארוך כדי למזער הקפאת ההפשרה מחזורים ויש להיות מצוטט כדי לערבב ולcentrifuged כדי להסיר את החלקיקים לפני השימוש. שימו לב לתאי השקופיות בקפידה במהלך ואחרי שלב זה כדי לזהות דליפה שדורשת הרכבה מחדש של תאי השקופיות. - באמצעות עצות הפיפטה המחוברים לקו ואקום עם בקבוקון אוסף משני, מחממים בזהירות מאגר חוסם מפינה של כל תא ללא משטחי מגע. בצע את כל צעדי השאיפה הבאים באופן דומה. הוסף מדולל סרה לרפידות במהירות לאחר השאיפה כדי לא לאפשר רפידות להתייבש.
- מניחים מסגרות מכוסות במגשים בתוך מכולה משנית מוקפת מגבות נייר לח אטום כדי למנוע אידוי. דגירה לילה ב 4 ° צ' על נדנדה שייקר (לחילופין, יכול הדגירה עבור 2 h בטמפרטורת החדר על שייקר מסלולית ב 100-250 rpm).
- צרף שקופיות microarray לתאים באמצעות קליפים ומקום במסגרות כפי שמוצג באיור 3.
-
מתייג נוגדנים לסרום מאוגד עם נוגדנים משניים בעלי נקודה קוונטית
- לאחר שאתה מקבל את המידע הנכון, כמתואר לעיל, להוסיף 100 μl לכל טוב של מאגר T-TBS (20 מ"מ טריס-HCl, 150 מ"מ הנאל, 0.05% הרצף-20 ב ddh2O מותאם ל-pH 7.5 ומסונן, ניתן להשיג מסחרית), ו דגירה עבור 5 דקות על שייקר מ 100-250 סל ד. חזור על שלב השטיפה הכולל של 3x (כל שלבי הכביסה הבאים מתבצעים באופן דומה).
- להכין תערובת של נוגדנים משני מדולל 1 μM בתוך חסימת מאגר ולערבב ביסודיות על ידי ליטוף לפני ובמהלך השימוש כדי לשמור על הומוגניות.
הערה: כדי לשמור על שינוי הקיום, אותה אצווה של כל נוגדן משני יש להשתמש עבור כל הניסויים בדיקה שעבורם השוואה כמותית של נתונים על פני ניסויים מתוכננת. הריכוז הספציפי של הנוגדן המשני עשוי להזדקק למגוון בהתאם לזיקה; בצע את פרוטוקולי היצרן כאשר הם זמינים. - מבריק מאגר מלשכת לאחר לשטוף הסופי, להוסיף 100 μL לכל טוב של התערובת נוגדן משני, ו דגירה עבור 2 h בטמפרטורת החדר על שייקר.
- מנושף נוגדן משני תערובת לשטוף 3x עם מאגר T-TBS, ולאחר מכן לשטוף פעם אחת עם מאגר TBS (ללא רצף).
- מיקרוסמאלה שקופיות של המיקרו מערכת מתוך הלשכה בקפידה כדי למנוע מגע רפידות, לשטוף בעדינות עם מסוננים ddH2O, ויבש על ידי הצבת 50 mL צינורות ו תפרידו ב 500 x g עבור 10 דקות.
- מניחים שקופיות מיקרוarray בנחקר בקופסת אור ושומרים בארון desiccator בטמפרטורת החדר לאחסון לטווח ארוך.
הערה: ייתכן שהפרוטוקול הושהה עד לשבוע אחד בשלב זה.
3. כריכת נוגדן כריכה לאנטיגנים בתוך microarray
-
הדמיה מיקרוarray שקופיות ועוצמת ספוט פלואורסצנטית למדוד כריכת נוגדנים
- השג תמונות של שקופיות microarray באמצעות צמידה נייד עם תוכנה מובנית.
- בכרטיסיה קביעת תצורה של Imager , בחר את תצורת השקופית המתאימה. לצורך המחקר הזה, השתמש בשקופיות של 16 מקלדת.
- בכרטיסייה ' בקרת תמונה ', בחרו בערוץ הפלורסנט המתאים, והתאימו את הרווח, זמן החשיפה וזמן הרכישה בהתאם לפעילות החוזרת של סרה לקבלת תמונות אופטימליות. עבור מחקר זה, ערוצי פלורסנט עבור IgA ו-IgG היו 585 ננומטר ו 800 nm בהתאמה, והגדרות הדמיה היו להרוויח של 50, זמן חשיפה של 500 ms, וזמן הרכישה של 1 s.
- לחץ על לכידת כדי להתחיל את התהליך של רכישת התמונה.
הערה: ניתן ליצור מחדש שקופיות מיקרו-מערך בהגדרות מרובות ללא השפלה של אות כל עוד הן מאוחסנות כשהן כהות ויבשות. ניתן להשתמש במערכות דימות אחרות אם הן תואמות לשקופיות.
- לזהות מקומות מערך באמצעות רשתות מונחה על בסיס סמנים fiducial ומדידת עוצמת הספוט כחציון של עוצמת פיקסל מינוס הרקע נמדד סביב נקודות. לבצע את האלגוריתם כימות באצווה באמצעות תוכנת צמידה מובנה, אשר מנצל את הקובץ. gal שנבנה בשלב 1.2.2 כדי לחבר עוצמות ספוט אנטיגנים בודדים על כל מיקרוarray.
- בחלונית ' נתוני קובץ ', טען את קובץ ה-. gal על-ידי בחירה מהתיקייה שלו במחשב, וציין את התיקיה שבה יישמרו קבצי הפלט של הניתוח במקטע אפשרויות ניתוח .
- בכרטיסייה ' בקרת תמונה ', פתחו את אחת מהתמונות שנרכשו כדי לכמת ובחרו בלחצן ' אוטומטי ' בפינה הימנית העליונה.
- במקטע ניתוח מערך בפינה הימנית התחתונה, צור תבנית fiducial כפי שהומלץ על-ידי התוכנה.
- לחצו על ' ניתוח אצווה', בחרו בתיקייה המכילה את התמונות לכימות, ובחרו בתבנית הfiducial שנוצרה בשלב הקודם. התוכנה מנתחת כל תמונה ומכמת את עוצמת הספוט.
הערה: שלב זה יפיק קובץ. csv המכיל עוצמות ספוט המכילים נוגדנים בתוך כל אחד מדגימות הסרום התאגד לכל אנטיגן בודד במיקרו-מערך שניתן לבצע בהמשך מניפולציות בתוכנה לטיפול בגליונות אלקטרוניים או בתוכנות ניתוח.
- ניתוח נתונים גולמיים כדי להשוות את כריכת הנוגדנים על גבי אנטיגנים ומעבר לדגימות הנסיוב. עבור מחקר זה, הנוגדנים IgA ו igg שנמדדו כמו 585 ננומטר ו 800 ננומטר ספוט פלורסנט כוונות השוו על כל אנטיגנים בין 2 מסלולים עצמאיים של הניסוי באמצעות שקופיות שונות בימים שונים, ניתוח מתאם בוצע ל למדוד את שיטת התוכסות.
הערה: עבור חלבונים לא מטוהרים המודפסים כתערובת ביטויים, ניתוח נתונים צריך להתחיל עם חיסור רקע של בקרת דנ א.
- השג תמונות של שקופיות microarray באמצעות צמידה נייד עם תוכנה מובנית.
Representative Results
כהדגמה של הפרוטוקול, סרה בסיסית הועמד מ 16 אנשים בתוך המחקר הפרוספקטיבי פוטנציאליים של תלמידי המכללה בעקבות זיהום שפעת על מיקרוarray אנטיגן שפעת. כדי להפגין את שיטת התיראות, הדגימות האלה היו בונות פעמיים, בשקופיות שונות ובימים שונים.
עבור מחקר זה, אנטיגנים שפעת מטוהרים המכיל10 תגי שלו הושגו מספק מסחרי (ראה טבלת חומרים) ומשתפי פעולה. אנטיגנים אלה כוללים 251 הכולל של ההא אנטיגנים, עם 63 הראשי תחומים הראש (HA1) ו 186 באורך מלא חלבונים (HA0), כולל 96 מונומאריק HA0 חלבונים ו90 trimerized HA0 חלבונים המכילים trimerized התמזגו ("foldon") תחום23. רשימה מלאה של אנטיגנים ופקדים המשמשים במחקר זה נכלל כקובץ משלים. עבור מחקר זה, נוגדנים משנית בשימוש היו עז אנטי-אדם IgG מעלה מצותת על מעלה הקוונטים נקודה ב 800 ננומטר (מג-IgG-Q800) ומצוגה אנטי-אנושית של עז מעלה מעלה ב-Q585 הקוואנטים בשנת 585 nm (מג-IgA-האדם) לאיתור מולטיפלקס של IgG מוצג באיור 3. IgG ו-IgA מאגד נוגדן לתתי סוגים שונים וצורות מולקולריות של ה-HA שפעת הושוו על סרה שהתקבל מתוך המחזור הקליני המתואר לעיל.
מפת החום הנוצרת מוצגת באיור 4 עם ייצוג גרפי באיור 5. באיורים אלה, רק תת-סוגי הרלוונטיים קלינית עם ייצוג גבוה על המערך מתויגים כדי לחסוך במרחב, עם "+" המציין את כל סוגי המשנה הנותרים של מספר גבוה יותר, מינורי או פחות מיוצגים היטב כלולים כפי שהוזמנו (למשל, H2 בין H1 ו-H3). רשימה מלאה של זנים ותתי-סוגי על המערך נכלל כקובץ משלים. נתונים אלה מדגימים כי נוגדנים לקבוצה הראש של HA הם ספציפיים לסוג עם צפוי כמות גבוהה של נוגדנים לזנים נפוצים קלינית (H1N1, H3N2, ו-B) וכמות נמוכה של נוגדנים לזנים אחרים. עם זאת, נוגדנים לכל HA, אשר כולל את תחום הקנה, הם יותר צולבות תגובתי על פני תת-סוגי, ואפקט זה נראה להיות מוגבר כאשר הHA כולה היא מטריזציה. תוצאה זו אינה צפויה, כמו HA כולל את אזור הגזע, אשר שמרו במידה רבה על פני תת-סוגי. לכן, נוגדנים מולקולות HA השלם מסוגי שאינם קליניים (g., H5 ו H7) סביר להניח לייצג נוגדנים נגד גזע במקור מעורר נגד תת קליניים (g., H1 ו H3) כי הם מגיבים עם אזורי הגבעול של תת HA אחרים במערך. נקודה זו ממחישה את החשיבות של כולל מולקולה הראש ואת המולקולה השלמה HA על המערך כדי להבדיל בין נוגדנים לראש ואת אזורי הגזע אשר מציגים פרופילים שונים של פעילות מחדש.
הבדיקה ממחישה את השגות הטוב באמצעות הפעלת החיטוט. ההפעלה השנייה מראה נוגדנים הigg מעט נמוך יותר בכל הזנים, למרות הדפוס בין הזנים הוא עקבי. זו ירידה קלה לאורך הלוח סביר בגלל השתנות אצווה-to-אצווה השונות של הנוגדן המשני, אשר השתנה בין הרצפים עבור IgG אך לא עבור IgA. כך, כפי שצוין בפרוטוקול, מומלץ להשתמש באותה החבילה של כל נוגדן משני לכל ניסויים שביניהם מתוכננת השוואה כמותית. אם סוגים שונים של נוגדנים נחוצים בשל מספר גבוה של דגימות כדי להיבדק, המלצתי כולל דגימות משותפות בין מפעיל ניסיוני עם קבוצות נוגדנים שונים כדי לאפשר השוואה כמותית עם תיקון.
איור 1: סכמטית של מיקרוarray חלבון. כל שקופית מכילה רפידות מרובות כל אחד עם מערך יחיד, אשר מורכב מאות אנטיגנים המודפסים על כתמים מסודרים ברשת, עם כל מקום המכיל אנטיגן אחד על הטופוגרפיה 3-מימדי של משטח הניטרוצלולוזה ש נוגדנים מסרום מאוגדים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: סכימטי של הדפסה של מיקרוarray אנטיגן שפעת ופרוטוקול גישוש. משמאל לימין, microarray מודפס באמצעות באמצעות ניטרוצלולוזה מצופה שקופיות, אשר משמשים כדי לחקור את סרה עבור igg ונוגדנים IgA באמצעות נוגדנים משני מעלה-נקודה מצומדת, עם שקופיות התמונה באמצעות imager נייד, ותוצאות שנותחו כדי ל יצור מפת חום אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הליך לחיבור תא גישוש לשקופית microarray. מתוך ל- F, תא הגישוש ממוקם על גבי שקופית בכיוון הנכון, מוצמד לשקופית באמצעות סרטונים אופקיים בצדדים וממוקם במגש הגישוש. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: תוצאות הנציג של מיקרוarray אנטיגן שפעת. מפות חום מייצגים התגובות נוגדנים ספציפיים אנטיגן, עם כל שורה המייצג אנטיגן יחיד מסודרים על ידי מולקולה, סוג המשנה, ומתח, וכל עמודה המייצגת הפעלה בדיקה של דגימה אחת, מסודרים על ידי נוגדן isotype ולהפעיל (a, לבן = 0, שחור = 20000, אדום = 40000 עוצמה פלואורסצנטית. תת האנטיגן כולל את כל תת הסוגי hemagglutinin מ 1 עד 18 וכל סוגי המשנה עצבי מ 1 עד 10 מסודרים אנכית מתויג משמאל. השוואה בין עוצמת הקרינה הפלואורסצנטית בין שני מסלולים ממחישה את הטוב ביותר באמצעות רגרסיה לינארית עבור IgA (ב) ו-igg (C). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: לרוחב של נוגדנים בסרום הנמדד על מיקרוarray אנטיגן שפעת. סרום IgA (A) ו Igg (ב) מקובצים לפי הצורות המולקולריות ha ו-NA כדי להדגים ספציפיות של הקבוצה העליונה נוגדנים בקבוצת הראש עבור תתי-מחזור גבוה של הפעילות הצולבת השלמה של ה-ha ו trimerized המלא של הנוגדנים עם הכללה של אזור הגבעול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
קובץ משלים: רשימה של אנטיגנים על מיקרוarray אנטיגן שפעת. התוכן מוצג עבור כל 324 כתמים על המערך, כולל ריקים, fiducials, פקדים (האדם IgG ו IgA ו-אנטי אדם IgG ו-IgA ב 0.1 mg/mL ו 0.3 mg/mL), ו אנטיגנים עם מידע על המקור, הצורה המולקולרית, סוג המשנה, ואת המתח. קיצורים הם כדלקמן: עבור המקור, סין = סין ביולוגית Inc., FKL = מעבדה פלורינה קראמר; עבור צורה מולקולרית, HA1 = ראש HA, HA0 = שלם HA, HA2 = הגבעול HA, NP = נואופלפרוטאין. עבור אנטיגנים ממקור סין ביולוגית Inc., מספרי קטלוג מוצגים; עבור אנטיגנים ממקור קראמר מעבדה, מזהי אנטיגן מפורטים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Discussion
הפרוטוקול המיקרו-מערך של אנטיגן השפעת המתואר כאן הוא להתאמה לכל פרוייקט הדורש ניתוח התגובות נוגדנים אנטיגנים רבים. פלטפורמת microarray ניתן להשתמש עם כל קבוצה רצויה של אנטיגנים חלבון מבוטא בכל מערכת שיכולה להשיג 0.1 mg/mL או תשואה גבוהה יותר עם או ללא טיהור כפי שתוארה בעבר12. אם לא מטוהרים אנטיגנים חלבון (למשל, מבוטא בתמלול ומערכת התרגום) משמשים ישירות כדי להדפיס מיקרו מערכים, רכיבי מערכת ביטוי חלבון (למשל, e. coli ליפוסט) יש להוסיף 1:10 כדי חסימת המאגר המשמש דילול סרה של נוגדנים לבקרת איכות על מנת לחסום את כל הנוגדנים המכוונים נגד רכיבים אלה. תצורות שקופיות זמינות עם מספר נמוך יותר של רפידות גדולות בכל שקופית כדי להכיל מספר גבוה יותר של אנטיגנים לכל מערך. עבור מחקר זה, השתמשנו במדפסת המיקרו-מחשבים של מדפסת מיקרורשת 100, העושה שימוש בפינים שבמישרין המגע עם משטח הניטרוגליצרין כדי להפקיד נקודות על המערך. בעוד שמדפסת מיקרוarray זו כבר אינה זמינה מסחרית, ניתן להשתמש במדפסות מיקרו מסחריות אחרות בפרוטוקול זה אך עשויות לדרוש פינים מותאמים אישית (אנשי קשר או אי-מגע) ותוכנה והיא צריכה להיות בעלת רזולוציית ספוט מספקת ותאימות עם שקופיות ו-imager. בהתאם לפעילות מחדש של סרה, דילול מ 1:50 אל 1:400 ניתן להשתמש. מאגר ללא סרום יכול לשמש כפקד שלילי, בעוד נוגדנים חד שבטיים ידוע לאגד אנטיגן ניתן להשתמש כפקד חיובי.
משתמשים צריכים להיות מודעים לבעיות בפתרון בעיות. המטרה של בדיקת בקרת איכות באמצעות נוגדנים תג שלו הוא לבדוק אם כל אנטיגנים שבהם הדפסה לא היה מוצלח. כל המקומות שנותנים בעקביות אות נמוך בדיקת בקרת איכות של מערכים מרובים צפויים לייצג אנטיגן מספיק מודפס. סיבות אפשריות כוללות צבירה או משקעים או אנטיגן בלוחית המקור או במגע המסכן בין סיכת הדפסה ושקופית microarray עקב עובי משתנה של משטח הניטרוצלולוזה. בשלב זה, אנחנו לא מבצעים נרמול שיטת מבוסס על תוצאות כמותיים של בדיקת בקרת איכות, בהתחשב בכך שהכריכה המזוהה של הנוגדנים נגד שלו יכולה להיות מושפעת על-ידי זמינות של תגית זו, התלויה בקונפורמציה תלת-ממדית ספציפי לכל אנטיגן.
המיקרו אנטיגן שפעת מספק מספר יתרונות על פני שיטות מסורתיות כגון אליסה והוא משלים בחני פונקציונלי כגון HAI ו-MN. 16-pad חלבון מיקרוarray היא טכנולוגיה מחוסך לדוגמה עם קיבולת למדוד נוגדנים של איזוסוגים מרובים בו נגד כ 300 אנטיגנים מ 1 μL של סרום. ניתן להגדיל את מספר האנטיגנים לאלפים על-ידי הקטנת מספר הפדים לכל שקופיות. הנתון המבוקר גם חוסך זמן ומשאבים מתכלים, בהינתן כי מאות סרה יכולה להיות בנחקר עבור נוגדנים ב 2 ימים, וכל החומרים שונים מאשר מגלשות וריאגנטים הם מחדש לשימוש כך לא לייצר כמויות גדולות של פסולת פלסטיק.
בעוד שמדפסות microarray עשויות שלא להיות מופצות באופן נרחב, ניתן להדפיס שקופיות microarray במיקום מרוכז ולאחר מכן להעביר למשתמש הקצה לצורך בדיקה. הציוד היחיד הדרוש לבדיקה הוא האיג'ר בעלות נמוכה וניידת. המטרה של הפצת הפרוטוקול הזה היא להפוך את הניצול של טכניקה זו לנפוצה יותר.
המגבלות העיקריות של המיקרומערך אנטיגן שפעת הם חוסר יכולת לאפיין את הפונקציה ואת הקינטיקה של הנוגדנים שזוהו. המיקרו-מערך מזהה מערך רב-שבטים של נוגדנים מחייבים עבור כל אנטיגן. נוגדנים אלה עשויים או לא יכולים להיות פונקציונליים בנטרול וירוסים ב HAI ו-MN assays. עם זאת, HAI ו-MN בחני דורשים תרבות וירוס חי עם הצורך מתקנים מיוחדים עם ארונות ביולוגי ברמה גבוהה לבדוק נוגדנים נגד תת העופות של שפעת, ואילו מיקרוarray חלבון אינו כרוך וירוס חי רכיבים כך יכול להיות מנוצל בכל מעבדה בסיסית. ביחס לקינטיקה מחייבת, דילול בודד של נסיוב הנחקר עם מערך המכיל ריכוז יחיד של כל אנטיגן ומניב נקודת נתונים אחת, המייצגת את הכמות המורכבת של כמות ואהדה על כל הנוגדנים שתאגד את האנטיגן . כדי לפתור באופן מלא את הקינטיקה של הנוגדן אנטיגן מחייב, ריכוזי אנטיגן מרובים ו/או מדלל סדרתי של סרה נדרשים.
למרות מגבלות אלה, המיקרו אנטיגן שפעת הוא כלי שימושי כדי לאפיין את הרוחב של נוגדנים שפעת על פני הנוף האנטיגניים שיכול להשלים מאמר פונקציונלי כי הם מוגבלים יותר בתפוקה וזמינות.
Disclosures
למחברים אין כל גילוי.
Acknowledgments
המחברים רוצים להכיר בפרופ ' דון מילטון (המכון לבריאות הציבור היישומי, אוניברסיטת מרילנד, המכללה פארק, MD, ארה ב) לאיסוף האדם סרה תחת אוניברסיטת מרילנד IRB פרוטוקול313842 ממומן על ידי DARPA N66001-18-2-4015 P00001. המחברים גם רוצים להכיר בפרופ ' פלוריאן קראמר (Icahn הספר לרפואה, הר סיני, NY, ארצות הברית) לספק trimerized ההא ו-NA אנטיגנים במימון של ODNI-15-1200-K-0001725. ס. חאן נתמך באופן חלקי על ידי המרכז הלאומי למשאבי מחקר והמרכז הלאומי לקידום מדעים טרנסלtional, המכון הלאומי לבריאות, באמצעות מענק KL2 TR001416. התוכן הוא רק באחריות המחברים ואינו מייצג בהכרח את ההשקפות הרשמיות של ה-NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16-pad nitrocellulose-coated glass slides | Grace Bio Labs | 305016 | |
| 1x GVS FAST blocking buffer | Fischer Scientific | 10485356 | |
| ArrayCam portable imager | Grace Bio Labs | 400S | Other imaging devices can be used to visualize slides if capable of achieving the resolution of the microarray spots and the excitation and emission wavelengths of the quantum dots. |
| Biotin-conjugated goat anti-mouse-IgG antibody | Thermo Fischer | 31800 | |
| HiBase 384-well plate | Greiner Bio-One | T-3037-11 | |
| Microarray pins | ArrayIt | GMP2 | Each different microarray printer may require its own custom microarray pins. |
| Mouse monoclonal poly-His antibody | Sigma-Aldrich | H1029 | |
| OmniGrid 100 microarray printer | GeneMachines | The version of the microarray printer used in this work is no longer commercially available, but the updated similar equipment is the OmniGrid Accent microarray printer from Digilab (Hopkinton, MA), and the same protocol can be carried out with most commercially available microarray printers. | |
| ProPlate slide chambers | Grace Bio Labs | 246890 | |
| ProPlate slide clips | Grace Bio Labs | 204838 | |
| ProPlate slide frames | Grace Bio Labs | 246879 | |
| Quantum dot 585 nm conjugated goat anti-human-IgA antibody | Grace Bio Labs | 110620 | |
| Quantum dot 585 nm streptavidin conjugate | Thermo Fischer | Q10111MP | |
| Quantum dot 800 nm conjugated goat anti-human-IgG antibody | Grace Bio Labs | 110610 |
References
- Murray, C. J., et al. Disability-adjusted life years (DALYs) for 291 diseases and injuries in 21 regions, 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet. 380 (9859), 2197-2223 (2010).
- Renegar, K. B., Crouse, D., Floyd, R. A., Krueger, J. Progression of influenza viral infection through the murine respiratory tract: the protective role of sleep deprivation. Sleep. 23 (7), 859-863 (2000).
- Li, L., et al. Heterogeneity in Estimates of the Impact of Influenza on Population Mortality: A Systematic Review. American Journal of Epidemiology. 187 (2), 378-388 (2018).
- Fauci, A. S. Seasonal and pandemic influenza preparedness: science and countermeasures. Journal of Infectious Diseases. 194 Suppl 2, S73-S76 (2006).
- Duggal, A., Pinto, R., Rubenfeld, G., Fowler, R. A. Global Variability in Reported Mortality for Critical Illness during the 2009-10 Influenza A(H1N1) Pandemic: A Systematic Review and Meta-Regression to Guide Reporting of Outcomes during Disease Outbreaks. PLoS One. 11 (5), 2009-2010 (2016).
- Demicheli, V., Jefferson, T., Ferroni, E., Rivetti, A., Di Pietrantonj, C. Vaccines for preventing influenza in healthy adults. Cochrane Database Systematic Reviews. 2, CD001269 (2018).
- Erbelding, E. J., et al. A Universal Influenza Vaccine: The Strategic Plan for the National Institute of Allergy and Infectious Diseases. Journal of Infectious Diseases. , (2018).
- Xie, H., et al. H3N2 Mismatch of 2014-15 Northern Hemisphere Influenza Vaccines and Head-to-head Comparison between Human and Ferret Antisera derived Antigenic Maps. Scientific Reports. 5, 15279 (2015).
- Tricco, A. C., et al. Comparing influenza vaccine efficacy against mismatched and matched strains: a systematic review and meta-analysis. BMC Medicine. 11, 153 (2013).
- Katz, J. M., Webster, R. G. Efficacy of inactivated influenza A virus (H3N2) vaccines grown in mammalian cells or embryonated eggs. Journal of Infectious Disease. 160 (2), 191-198 (1989).
- Zost, S. J., et al. Contemporary H3N2 influenza viruses have a glycosylation site that alters binding of antibodies elicited by egg-adapted vaccine strains. Proceedings of the National Academy of Science. 114 (47), 12578-12583 (2017).
- Davies, D. H., et al. Profiling the humoral immune response to infection by using proteome microarrays: high-throughput vaccine and diagnostic antigen discovery. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 102 (3), 547-552 (2005).
- Liang, L., Felgner, P. L. A systems biology approach for diagnostic and vaccine antigen discovery in tropical infectious diseases. Current Opinion in Infectious Diseases. 28 (5), 438-445 (2015).
- Jain, A., et al. Evaluation of quantum dot immunofluorescence and a digital CMOS imaging system as an alternative to conventional organic fluorescence dyes and laser scanning for quantifying protein microarrays. Proteomics. 16 (8), 1271-1279 (2016).
- Desbien, A. L., et al. Development of a high density hemagglutinin protein microarray to determine the breadth of influenza antibody responses. Biotechniques. 54 (6), 345-348 (2013).
- Mace, C. R., et al. Label-free, arrayed sensing of immune response to influenza antigens. Talanta. 83 (3), 1000-1005 (2011).
- Koopmans, M., et al. Profiling of humoral immune responses to influenza viruses by using protein microarray. Clinical and Microbiology Infections. 18 (8), 797-807 (2012).
- Bucukovski, J., Latorre-Margalef, N., Stallknecht, D. E., Miller, B. L. A Multiplex Label-Free Approach to Avian Influenza Surveillance and Serology. PLoS One. 10 (8), e0134484 (2015).
- Meade, P., Latorre-Margalef, N., Stallknecht, D. E., Krammer, F. Development of an influenza virus protein microarray to measure the humoral response to influenza virus infection in mallards. Emerging Microbes and Infection. 6 (12), e110 (2017).
- Vigil, A., Davies, D. H., Felgner, P. L. Defining the humoral immune response to infectious agents using high-density protein microarrays. Future Microbiology. 5 (2), 241-251 (2010).
- Nakajima, R., et al. Protein Microarray Analysis of the Specificity and Cross-Reactivity of Influenza Virus Hemagglutinin-Specific Antibodies. mSphere. 3 (6), (2018).
- Van Hoeven, N., et al. A Formulated TLR7/8 Agonist is a Flexible, Highly Potent and Effective Adjuvant for Pandemic Influenza Vaccines. Scientific Reports. 7, 46426 (2017).
- Krammer, F., et al. A carboxy-terminal trimerization domain stabilizes conformational epitopes on the stalk domain of soluble recombinant hemagglutinin substrates. PLoS One. 7 (8), e43603 (2012).
