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Biology

Caenorhabditis elegans में सेलुलर संरचनाएं और Organelle Morphology के अध्ययन के लिए मात्रात्मक दृष्टिकोण

Published: July 5, 2019 doi: 10.3791/59978
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1
1Neuroscience Program, Monash Biomedicine Discovery Institute and Department of Anatomy and Developmental Biology, Monash University, Melbourne VIC 3800, Australia.
* These authors contributed equally

Summary

इस अध्ययन synaptic आकार और स्थानीयकरण की मात्रात्मक माप की रूपरेखा, मांसपेशियों की आकृति विज्ञान, और सी elegans में mitochondrial आकार स्वतंत्र रूप से उपलब्ध छवि प्रसंस्करण उपकरण का उपयोग कर. इस दृष्टिकोण सी elegans में भविष्य के अध्ययन की अनुमति देता है मात्रात्मक आनुवंशिक उत्परिवर्तनों का एक परिणाम के रूप में ऊतक और organelle संरचनात्मक परिवर्तन की सीमा की तुलना करें.

Abstract

सेलुलर तंत्र अंतर्निहित रोग परिभाषित उपन्यास चिकित्सा के विकास के लिए आवश्यक है. एक रणनीति अक्सर इन तंत्र को जानने के लिए इस्तेमाल किया उम्मीदवार जीन में उत्परिवर्तन परिचय और गुणात्मक ऊतकों और सेलुलर organelles की आकृति विज्ञान में परिवर्तन का वर्णन है. हालांकि, गुणात्मक विवरण सूक्ष्म phenotypic मतभेद पर कब्जा नहीं हो सकता है, एक जनसंख्या में व्यक्तियों में phenotypic विविधताओं गलत बयानी हो सकता है, और अक्सर व्यक्तिपरक मूल्यांकन कर रहे हैं. यहाँ, मात्रात्मक दृष्टिकोण के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध जैव छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर के साथ संयुक्त लेजर स्कैनिंग confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर सूत्रकृमि Caenorhabditis elegans में ऊतकों और organelles की आकृति विज्ञान का अध्ययन करने के लिए वर्णित हैं. synapse अखंडता (आकार और एकीकृत फ्लोरोसेंट के स्तर), मांसपेशियों के विकास (मांसपेशी कोशिका आकार और मायोसिन फिलामेंट लंबाई) को प्रभावित करने वाले फीनोटाइप का एक मात्रात्मक विश्लेषण, और माइटोकोंड्रियाल आकारिकी (सर्कुलरिटी और आकार) को समझने के लिए किया गया था इन सेलुलर संरचनाओं पर आनुवंशिक उत्परिवर्तनों के प्रभाव. ये मात्रात्मक दृष्टिकोण यहाँ वर्णित अनुप्रयोगों तक ही सीमित नहीं हैं, क्योंकि वे आसानी से सूत्रकृमि में अन्य ऊतकों और organelles की आकृति विज्ञान का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, साथ ही अन्य मॉडल जीवों में.

Introduction

सूत्रकृमि कैनोरहैब्डिस एलिगेन्स (सी एलिगन) का उपयोग मानव रोग में शामिल जैविक और आणविक प्रक्रियाओं को उजागर करने के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में तेजी से किया जाता है। एक वयस्क सूत्रकृमि की शरीर की लंबाई केवल 1 मिमी से अधिक होती है और यह 300 अंडे1तक का एक बड़ा अंड उत्पन्न कर सकता है। अंडे से निकलने के बाद, सी elegans केवल वयस्कता तक पहुँचने के लिए 3-4 दिनों की आवश्यकता होती है, और लगभग 2 से 3 सप्ताह2के लिए रहते हैं। culturing की अपनी आसानी के कारण, सी elegans वर्तमान में मानव रोगों के लिए चिकित्सा की पहचान करने के लिए लागत प्रभावी, तेजी से दवा स्क्रीनिंग के संचालन के लिए vivo पशु मॉडल में सबसे अधिक मांग के बाद में से एक है. इसके अतिरिक्त, इसके आनुवंशिक संरक्षण, अच्छी तरह से परिभाषित व्यवहार प्रतिमान, फ्लोरोसेंट या प्रकाश माइक्रोस्कोपी के लिए पारदर्शी शरीर, और आनुवंशिक हेरफेर की आसानी सेलुलर और आनुवंशिक उत्परिवर्तनों के आणविक परिणामों का अध्ययन आसानी से प्राप्त करने योग्य 3. सी एलिगन जीनोम मानव जीनों के साथ लगभग 60-80% ऑर्थोलॉजी का हिस्सा है, और उन जीनों में से लगभग 40% रोग से संबंधित माने जाते हैं। मानव रोगों में से कुछ है कि मॉडलिंग की गई है और सी elegans में अध्ययन किया गया है neurodegenerative विकार (अल्जाइमर रोग, पार्किंसंस रोग, amyotrophic पार्श्व स्क्लेरोसिस, Charcot-मैरी-टूथ रोग), मांसपेशियों से जुड़े रोगों में शामिल हैं ( Duchenne मांसपेशियों dystrophy), और चयापचय रोगों (hyperglycemia)2,4. अधिकांश मानव विकारों में, रोग-प्रेरित सेलुलर और ऑर्गेनेल स्थानीयकरण और आकृतिक परिवर्तन होते हैं, जिन्हें आसानी से सूत्रकृमि मॉडल में मूल्यांकन किया जा सकता है।

फ्लोरोसेंट मार्कर ों का उपयोग सूक्ष्मदर्शी के अंतर्गत गतिशील दृश्य के लिए ऊतकों और आर्गेनाले को लेबल करने के लिए व्यापक रूप से किया गया है। हालांकि, सी elegansमें, पारंपरिक तरीकों कि आनुवंशिक उत्परिवर्तनों के कारण आकृतिक अनियमितताओं का आकलन काफी हद तक दृश्य विवरण पर भरोसा किया है. जबकि गुणात्मक आकलन phenotypic विवरण की व्यापक श्रेणियों को कवर कर सकते हैं (synaptic आकारिकी, GFP clumping, विशिष्ट axonal आकार, मांसपेशी फाइबर मोटाई, आदि) और रूपात्मक परिवर्तन के एक पक्षी की आंख दृश्य प्रदान करते हैं, वे कम अच्छी तरह से अनुकूल हैं के लिए विभिन्न समूहों में छोटी विविधताओं की तुलना करना. इसके अलावा, गुणात्मक मूल्यांकन दृश्य, व्यक्तिपरक मूल्यांकन पर आधारित होते हैं, जिससे रूपात्मक असामान्यताओं के अधिक या कम-अनुमान हो सकते हैं। अंत में, गुणात्मक टिप्पणियों भी व्यक्तियों के बीच बहुत भिन्न हो सकते हैं, डेटा प्रतिकृति के साथ कठिनाइयों का निर्माण.

हाल के वर्षों में, उपयोगकर्ता के अनुकूल, आसानी से उपलब्ध कम्प्यूटेशनल एल्गोरिदम है कि मात्रात्मक विश्लेषण छवियों का विश्लेषण कर सकते हैं की एक संख्या विकसित किया गया है. हालांकि, कुछ आकृतिक अध्ययन के लिए इस तरह के छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग, विशेष रूप से शरीर की दीवार की मांसपेशियों और mitochondria के संबंध में, सी elegans अनुसंधान में पीछे lagged है. सी elegansमें अंतर्निहित संरचनात्मक विश्लेषण में सुधार करने के लिए, आसानी से उपलब्ध में से कुछ, खुला स्रोत छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर मात्रात्मक मांसपेशियों mitochondria पर आनुवंशिक उत्परिवर्तनों के प्रभाव की तुलना करने के लिए परीक्षण किया गया, शरीर की दीवार की मांसपेशियों और synaptic Morphology. इन प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं विस्तार से रूपरेखा कैसे इन कार्यक्रमों (फिजी, ilastik, CellProfiler, SQUASSH) synaptic आकार और synaptic प्रोटीन स्थानीयकरण में परिवर्तन का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, शरीर की दीवार मांसपेशी क्षेत्र और फाइबर लंबाई, और mitochondrial आकार और सूत्रकृमि में आनुवंशिक उत्परिवर्तनों के परिणामस्वरूप वृत्ताकारता।

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Protocol

1. सी elegans उपभेदों के विकास और रखरखाव

  1. बीज नेमाटोड विकास मध्यम (एनजीएम, सामग्री की तालिकादेखें) एक लेमिनर प्रवाह कैबिनेट में धीमी गति से बढ़ रही ई. कोलाई तनाव OP50 के 300 डिग्री सेल्सियस के साथ आगर प्लेटें।
  2. NGM agar प्लेटों को सूखे के लिए स्तरीय प्रवाह कैबिनेट में छोड़ दें।
    नोट: लेमिनर फ्लो कैबिनेट के अभाव में, प्लेटों को बेंच पर सूखने के लिए छोड़ दिया जा सकता है, लेकिन वे संदूषण से अधिक प्रवण होते हैं।
  3. काम कर स्टॉक है करने के लिए दो OP50-seeded एनबीएम आगर प्लेटों में से प्रत्येक के लिए कम से कम 20 जानवरों को स्थानांतरित। जानवरों को स्थानांतरित करने के दो मुख्य तरीके हैं।
    1. उठा: धीरे से एक गर्मी बाँझ लेने का उपयोग कर जानवरों उठा. इस विधि एक agar प्लेट से व्यक्तिगत या कई जानवरों के चयन के लिए प्रभावी है. टिप पर बैक्टीरिया का एक छोटा सा परिमार्जन होने जब उठा हस्तांतरण में मदद करता है.
      नोट: एक लेने के बारे में प्लैटिनम तार का एक छोटा सा टुकड़ा से बना है 4 सेमी लंबी है कि एक गिलास पाइपेट में एम्बेडेड है, तार टिप के साथ चपटा 'स्पियर की तरह'. क्रॉस-संदूषण को रोकने के लिए उठा के बीच पिक को गर्मी से बाँझ करें।
    2. चंकिंग: एक बाँझ spatula का उपयोग करना, एक थाली से जानवरों युक्त आगर के एक छोटे से वर्ग में कटौती और एक नई थाली के लिए उल्टा-नीचे स्थानांतरित.
      नोट: इस विधि आम तौर पर कीड़े की बड़ी संख्या के हस्तांतरण के लिए उपयोगी है, और chunking गैर दूषित agar के कई दौर के माध्यम से प्लेटों से संदूषण को दूर करने के लिए. कुछ सेकंड के लिए spatula ज्वलंत और स्थानान्तरण के बीच 100% इथेनॉल में spatula immersing द्वारा पार संदूषण से बचें. भूखे प्लेटों से स्थानांतरण भुखमरी और भीड़ के रूप में अनुशंसित नहीं है सेलुलर और subcellular संरचनाओं के स्वास्थ्य और आकृति विज्ञान को प्रभावित कर सकते हैं.
  4. मानक वृद्धि के तापमान (20 डिग्री सेल्सियस) पर कीड़े बनाए रखें। अच्छी तरह से खिलाया कीड़े की निरंतर आपूर्ति सुनिश्चित करने के लिए, नए OP50-सीड प्लेटों के लिए हर 2 से 3 दिन कीड़े हस्तांतरण.

2. आयु-सिंक्रनाइज़ेशन C. elegans

  1. 3-4 एनजीएम प्लेटों पर कीड़े बनाए रखें जब तक आबादी भीड़ है, लेकिन भूखे नहीं.
  2. M9 समाधान के साथ एनजीएम प्लेट से कीड़े को धीरे से धो लें। अंडे प्लेट पर रहेंगे क्योंकि वे ई कोलाई ओपी 50से चिपके रहेंगे . सभी सेनेड जानवरों को हटाने के लिए चार अतिरिक्त धोने के चरणों के साथ दोहराएँ।
  3. कीड़े 40 मिनट के लिए हैच करने के लिए अनुमति दें।
  4. प्लेट में M9 घोल का 1-2 एमएल जोड़ें और हाल ही में पैदा हुए कीड़े को ढीला करने के लिए धीरे-धीरे घूमता है।
  5. हाल ही में पैदा कीड़े के साथ M9 समाधान ले लीजिए और एक ताजा NGM प्लेट में कीड़े के साथ समाधान हस्तांतरण.
  6. एनजीएम प्लेट को हवा में उजागर करके M9 समाधान को वाष्पित होने दें। एनजीएम प्लेट के संदूषण से बचने के लिए इसे खुली लौ के निकट करें।
  7. तीसरे लार्वा (L3) चरण में विकास की अनुमति देने के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर 27 ज के लिए कीड़े बढ़ाएँ। सिंक्रनाइज़ 3 दिन पुराने वयस्क जानवरों के लिए, कीड़े लार्वा चरण 4 पर उठाया जाता है और एक और 3 दिनों के लिए 3 दिन पुराने वयस्क चरण तक पहुँचने के लिए बड़े हो जाते हैं।

3. इमेजिंग के लिए स्लाइड्स की तैयारी

  1. एक माइक्रोवेव-सुरक्षित बोतल में 3-4% w/v agarose स्टॉक तैयार करें (3-4 ग्राम अल्ट्राप्यूर पानी के 100 एमएल में)।
    नोट: आगर एक ही एकाग्रता में agarose के स्थान पर इस्तेमाल किया जा सकता है।
  2. एक माइक्रोवेव ओवन में ध्यान से agarose पिघल, ध्यान से उबाल पर ध्यान नहीं ले, जब तक सभी agarose भंग (स्पष्ट समाधान). ठोसीकरण को रोकने के लिए समाधान को 70 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    नोट: Agarose शेयर कई बार इस्तेमाल किया जा सकता है. यदि अगारोस ठोस हो गया है तो उपयोग करने से पहले पुन: गरम करें।
  3. एक पाश्चर पिपेट का उपयोग करना, एक माइक्रोस्कोप स्लाइड पर पिघल agarose की एक बूंद जगह है.
    नोट: आगर की बूंद में हवा के बुलबुले होने से बचें क्योंकि ये पैड की अखंडता को बाधित करते हैं।
  4. तुरंत एक और माइक्रोस्कोप स्लाइड के साथ agarose बूंद नीचे प्रेस, धीरे दो स्लाइड के बीच एक पैड में agarose समतल.
    नोट: किसी भी बचे हुए बुलबुले इस स्तर पर हटाया जाना चाहिए। यदि नहीं, तो नई स्लाइड के रूप में जानवरों को आसानी से बुलबुले में फंस सकता है बनाया जाना चाहिए. स्लाइड पर दबाने पर आगर के ओवरफ्लो से बचें।
  5. 1 मिनट के लिए सूखने के लिए agarose छोड़ दें.
  6. ध्यान से दो स्लाइड को अलग करने के लिए agarose को नुकसान से बचने के लिए, जबकि स्लाइड में से एक पर ठोस पैड छोड़ने.
    नोट: agarose पैड के साथ स्लाइड हमेशा वे बाहर शुष्क कर सकते हैं के रूप में प्रयोग से पहले ताजा तैयार किया जाना चाहिए. सुनिश्चित करें कि agarose पैड एक सुसंगत मोटाई है. पैड में कोई हवा के बुलबुले या दरारें नहीं होनी चाहिए क्योंकि यह इमेजिंग के साथ हस्तक्षेप कर सकता है।
  7. agarose पैड के केंद्र में 0.05% tetramisole हाइड्रोक्लोराइड (एनेस्थेटिक) की एक छोटी सी बूंद (5-10 $L) जोड़ें।
  8. गर्मी बाँझ लेने का उपयोग करना, जल्दी से समाधान से पहले बाहर सूख जाता है संवेदनाहारी छोटी बूंद के लिए स्टॉक प्लेट से 10 - 15 जानवरों के बारे में हस्तांतरण। बहुत अधिक OP50 बैक्टीरिया को स्थानांतरित करने से बचें क्योंकि यह समाधान बादल बनाता है, जो इमेजिंग के साथ हस्तक्षेप कर सकता है।
    नोट: यदि संवेदनाहारी समाधान उठा जबकि बाहर सूख जाता है, बस pippette जानवरों पर 0.05% tetramisole हाइड्रोक्लोराइड की एक दूसरी बूंद. जानवरों संवेदनाहारी समाधान में उनके पार्श्व पक्ष पर रखना करते हैं.
  9. इसे agarose पैड के ठीक ऊपर स्थित करके एक कवरस्लिप लागू करें और धीरे से इसे नीचे गिरा दें। यह बुलबुले के गठन को रोकने जाएगा. कवरस्लिप पर दबाव न लगाएं क्योंकि इससे जानवरों को कुचल दिया जा सकता है।
  10. स्ट्रेन नाम के साथ स्लाइड्स लेबल करें.

4. synaptic आकारिकी का आकलन

नोट: पीछे पार्श्व microtubule (PLM) स्पर्श रिसेप्टर न्यूरॉन्स में synapse अखंडता पर MEC-17 overexpression के प्रभाव synaptic आकार और स्थानीयकरण लाइन स्कैनिंग confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर मात्रा निर्धारित करके अध्ययन किया गया. PLM न्यूरॉन्स (synaptic क्षेत्रों सहित) uIs115 (Pmec-17::tagRFP) ट्रांसजीन (तनाव: TU40655) और synaptic क्षेत्र विशेष रूप से JsIs37 के साथ लेबल किया गया था (Pec-7:snb-1:GFP) (तनाव: NM664) 6) . यह अध्ययन सिंक्रनाइज़ L3 गैर-ट्रांसजेनिक और ट्रांसजेनिक जानवरों में किया गया था extrachromosomal MEC-17 overexpression तनाव BXN507 [cJnEx036 (Pmc-4:mec-17, Pmyo-2:mCherry); jsIs37; uIs115]7. इस अध्ययन में प्रयुक्त उपभेदों की एक पूरी सूची तालिका 1में शामिल है।

  1. स्पर्श रिसेप्टर न्यूरॉन synapses के confocal इमेजिंग
    1. synaptic क्षेत्रों छवि के लिए, एक लाइन स्कैनिंग confocal माइक्रोस्कोप का उपयोग करने के लिए एक 488 एनएम और 552 एनएम ऑप्टिकली पंप अर्द्ध कंडक्टर डायोड लेजर और छवि पर कब्जा सॉफ्टवेयर से लैस करने के लिए युग्मित.
    2. सबसे कम आवर्धन का उपयोग कर केड़े का पता लगाएँ.
    3. जब जानवरों को सफलतापूर्वक स्थित हैं, एक 40X आवर्धन के लिए स्विच और विसर्जन माध्यम लागू (इस अध्ययन में: एक 40X/1.10 एचसी PL एपीओ CS2 पानी विसर्जन के साथ बहु-विसर्जन उद्देश्य इस्तेमाल किया गया था).
    4. टैगआरएफपी फ्लोरोफोर के लिए GFP फ्लोरोफोर और 552 एनएम (1% शक्ति) के लिए एक 488 एनएम लेजर (2% शक्ति) के साथ फ्लोरोफोर रोमांचक द्वारा synaptic क्षेत्र कल्पना.
    5. पूरे synaptic क्षेत्र पर कब्जा करने के लिए इष्टतम एक्स और वाई फ्रेम का निर्धारण. फ्रेम का चयन करते समय इष्टतम पिक्सेल आकार पर विचार करने के लिए सुनिश्चित करें. इस अध्ययन में, 56 एनएम का एक सुसंगत पिक्सेल आकार प्राप्त किया गया था.
    6. एक संकर फोटो-डिटेक्टर का उपयोग कर छवियों पर कब्जा और फ्लोरोफोरके overexposure को रोकने के लिए लाभ सेट (100% 488 एनएम उत्तेजना के लिए और 15% के लिए 552 एनएम उत्तेजना).
    7. इस्तेमाल किया विशिष्ट उद्देश्य के आधार पर इष्टतम z-चरण आकार का उपयोग कर, पूरे synapse को कवर करने के लिए z-स्टैक छवियों लीजिए। इस अध्ययन में, 0.211 एनएम का एक इष्टतम z-चरण आकार का उपयोग किया गया था।
      नोट: सुनिश्चित करें कि सभी छवियों को कड़े शर्त के तहत लिया जाता है एकीकृत फ्लोरोसेंट परिमाणीकरण और तुलना की अनुमति देने के लिए. यह सभी पर कब्जा कर लिया छवियों भर में समान माइक्रोस्कोपी मापदंडों रखने के द्वारा किया जा सकता है (यानी, लेजर और डिटेक्टर सेटिंग्स, पिक्सेल आकार, स्कैनिंग गति, और इष्टतम z कदम आकार). इष्टतम सेटिंग्स उद्देश्य पर निर्भर करते हैं और इस तरह के NyQuist कैलकुलेटर (https://svi.nl/NyquistCalculator) के रूप में सुलभ bioinformatics कार्यक्रमों, का उपयोग कर गणना की जा सकती है. लेबल छवियों व्यवस्थित, यह उपयोगी होगा जब bioinformatics सॉफ्टवेयर है कि संगठित और फ़ाइल नाम के आधार पर फ़ाइलों को संसाधित करेगा का उपयोग कर.
  2. सिनैप्टिक क्षेत्र का परिमाणीकरण
    1. synaptic क्षेत्र का विश्लेषण करने के लिए, TIFF फ़ाइलों के रूप में छवियों को निर्यात करें। जावा आधारित इमेजिंग प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर जैसे ImageJ, इस्तेमाल किया जा सकता है (इस अध्ययन में, Mri छवि रूपांतरण मैक्रो ImageJ में इस्तेमाल किया गया था).
    2. आकार और synapses के एकीकृत फ्लोरोसेंट तीव्रता के स्तर CellProfiler-3.1.5 के साथ प्राप्त z-stacks की राशि तीव्रता से मापा गया. CellProfiler3.1.5 सॉफ्टवेयर में छवियों को लोड करें. यदि आवश्यक हो, तो छवि फ़ाइल नामों के आधार पर छवियों को फ़िल्टर किया जा सकता है.
    3. नाम और प्रकार मॉड्यूल सेट करें. वैकल्पिक रूप से, तदनुसार परिकलित डेटा व्यवस्थित करने के लिए छवि लेबल से मेटाडेटा निकालें.
    4. इस क्षेत्र की हाथ परिभाषा द्वारा synaptic क्षेत्र का निर्धारण uIs115 (Pmec-17::tagRFP) transgene से व्यक्त फैलाना टैगRFP का उपयोग कर। यह CellProfiler-3.1.5 पाइप लाइन के लिए संबंधित मॉड्यूल जोड़कर किया जा सकता है.
    5. आकार और हाथ परिभाषित synapse के फ्लोरोसेंट को मापने के लिए, उपाय वस्तु आकार और आकार और पाइप लाइन के लिए वस्तु तीव्रता मॉड्यूल को मापने जोड़ें।
    6. गणना गणित मॉड्यूल जोड़कर सापेक्ष एकीकृत फ्लोरोसेंट तीव्रता की गणना करें। UIs115(Pmec-17::tagRFP)के लिए प्राप्त एकीकृत इकाइयों द्वारा JsIs37 (Pmec-7::snb-1::GFP) से प्राप्त एकीकृत तीव्रता इकाइयों को विभाजित करें।
    7. निर्यात माप और परिकलन.

5. परिमाणकारी शरीर की दीवार मांसपेशियों की संरचना

  1. शरीर की दीवार मांसपेशियों की संरचना के फ्लोरोसेंट इमेजिंग
    1. एक तनाव प्राप्त करें (उदाहरण के लिए, RW1596) transgene stEx30 ले जाने (Pmyo-3::gfp::myo-3 + rol-6(su1006))8, जो GFP के साथ मायोसिन फाइबर लेबल.
      नोट: जानवरों में transgene का परिचय या तो जानवरों है कि पहले से ही transgene व्यक्त के साथ ब्याज की एक तनाव को पार करके प्राप्त किया जा सकता है, या gonad के distal हाथ में सूक्ष्म इंजेक्शन डीएनए. इस ट्रांसजीन में रोल-6 उत्परिवर्तन द्वारा प्रेरित 'रोलिंग' फीनोटाइप मांसपेशियों के दृश्य को सुविधाजनक बनाता है। शरीर की दीवार की मांसपेशियों पृष्ठीय और अधर पक्षों है कि आम तौर पर जंगली प्रकार जानवरों में देखने से precluded हैं क्योंकि वे आम तौर पर उनके पार्श्व पक्षों में से एक पर झूठ के साथ चला रहे हैं. rol-6 (su1006) एलील जानवरों के घुमा लाती है, जिससे इमेजिंग के लिए कुछ मांसपेशियों की कोशिकाओं को उजागर.
    2. छवि एक उच्च संकल्प चार्ज युग्मित डिवाइस कैमरा (सीसीडी), 40X उद्देश्य या उच्च, GFP फिल्टर और अधिग्रहण सॉफ्टवेयर के साथ मिलकर एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग कर जानवरों.
    3. अतिसंतृप्त छवियों को रोकने के लिए जोखिम समय और रोशनी तीव्रता समायोजित करें।
    4. कब्जा और मांसपेशियों की छवियों को बचाने (400X आवर्धन) कम से कम एक पूर्ण दिखाई तिरछी मांसपेशी सेल युक्त जानवर के एक वर्ग से. एक एकल मांसपेशी सेल है कि अधूरा है या वर्गों है कि ध्यान से बाहर हैं के साथ क्षेत्रों से बचें. इसके अलावा चरम पूर्वकाल और पीछे के क्षेत्रों से छवियों को बाहर, और योनी के निकट क्षेत्रों.
      नोट: यदि जानवर एक भी दिखाई पूरा मांसपेशियों की कोशिका नहीं है, धीरे एक पूर्ण सेल का पर्दाफाश करने के लिए इतनी के रूप में जानवर बारी करने के लिए कवरस्लिप स्लाइड।
  2. मांसपेशी कोशिका क्षेत्र का मापन
    1. फिजी सॉफ्टवेयर9 में छवि खोलें (संस्करण 2.0.0 इस अध्ययन में इस्तेमाल किया गया था).
    2. बहुभुज चयन का उपयोग ध्यान से एक एकल तिरछी मांसपेशी सेल के आसपास का पता लगाने के लिए. पता लगाएँ में सुधार करने के लिए लंगर डॉट खींचकर अंत में बहुभुज की रेखा समायोजित करें.
    3. सॉफ़्टवेयर के शीर्ष पर टैब का विश्लेषण करें पर जाएँ और चयन के क्षेत्र की गणना करने के लिए मापें क्लिक करें. क्षेत्र और अन्य माप युक्त एक अलग परिणाम तालिका दिखाई जाएगी. यदि क्षेत्र माप परिणाम तालिका से अनुपलब्ध है, तो विश्लेषण टैब के अंतर्गत माप सेट करें पर जाएँ और जाँचें कि क्षेत्र बॉक्स सही है. इसी तरह, अन्य माप है कि जरूरत नहीं कर रहे हैं untick.
    4. एक अपभ्रष्ट/मिसिंग क्षेत्र के साथ मांसपेशी कोशिकाओं के लिए, बहुभुज चयन उपकरण के साथ अनुपलब्ध क्षेत्र का पता लगाने और पुन: उपाय क्लिक करें। यदि कक्ष में एकाधिक अंतराल हैं, तो प्रत्येक अंतराल को अलग-अलग ट्रेस करें.
    5. पूरे एकल मांसपेशी सेल के लिए अंतराल क्षेत्र के अनुपात की गणना. एक उच्च अनुपात कोशिका के भीतर बड़े अंतराल के कारण मांसपेशियों के अध: पतन की एक उच्च सीमा को इंगित करता है. यदि कोई लापता क्षेत्र नहीं हैं, जैसा कि आमतौर पर जंगली-प्रकार के जानवरों में देखा जाता है, तो अनुपात की गणना शून्य के रूप में की जाएगी।
      नोट: एक नियंत्रण के रूप में, नेत्रहीन मांसपेशी संरचना दोष के लिए भी स्कोर और मात्रात्मक माप के साथ परिणामों की तुलना करें। यह विशेष रूप से उपयोगी है अगर तनाव प्रयोगशाला में पहली बार के लिए अध्ययन किया जा रहा है. phenotypic स्कोरिंग के लिए, खराब या नहीं के रूप में जानवरों का आकलन फिलामेंट की अखंडता के आधार पर दोषपूर्ण. उदाहरण के लिए, अलग फिलामेंट striations के नुकसान के साथ जानवरों, GFP clumping, या संरचनात्मक टूटने के कारण मांसपेशियों की कोशिकाओं के भीतर अंतराल, दोषपूर्ण के रूप में रन बनाए जाएंगे.
  3. मायोसिन फाइबर लंबाई का विभाजन और परिमाणीकरण
    1. यदि आवश्यक हो, तो पहले फ़ाइलों को में कनवर्ट करें. फिजी या किसी अन्य सॉफ़्टवेयर पैकेज का उपयोग कर tif. TIFF फ़ाइलों को इच्छित स्थान पर सहेजें.
    2. ओपन ilastik10 (नि: शुल्क सॉफ्टवेयर, संस्करण 1.3.2 https://www.ilastik.org/ से डाउनलोड किया जा सकता है).
    3. एक बार ilastik में, नई परियोजनाबनाएँ के तहत पिक्सेल वर्गीकरण का चयन करें। सॉफ्टवेयर परियोजना को सहेजा जा करने के लिए संकेत देगा। प्रोजेक्ट का नाम बदलें और किसी इच्छित स्थान पर सहेजें.
      नोट:: एक नया प्रोजेक्ट केवल एक बार बनाया जा करने के लिए की आवश्यकता है। अनुवर्ती विभाजन एक ही परियोजना का उपयोग कर के लिए किया जा सकता है। एक ही प्रोजेक्ट सेटिंग्स का उपयोग करने के लिए, शीर्ष पर प्रोजेक्ट टैब पर जाएँ, और प्रोजेक्ट फ़ाइल तक पहुँचने के लिए प्रोजेक्ट खोलें पर क्लिक करें।
    4. बाएं पैनल (इनपुट डेटा, फ़ीचर चयन, प्रशिक्षण, पूर्वानुमान निर्यात और बैच प्रोसेसिंग) पर 5 टैब होने चाहिए। इनपुट डेटा टैब में, नया जोड़ें पर क्लिक करें और फिर अलग छवि जोड़ें). TIFF फ़ाइलों वाले फ़ोल्डर के लिए पॉप-अप विंडो प्रत्यक्ष और खोलने के लिए छवि का चयन करें।
    5. नीचे दिए गए अगले टैब में (फ़ीचर चयन), सभी पिक्सेल सुविधाओं का चयन करने के लिए सुविधाओं का चयन करें, हरे रंग की टिक बक्से द्वारा इंगित पर क्लिक करें. इस चरण में पिक्सेल चयन का उपयोग अगले चरण में पिक्सेल के विभिन्न वर्गों को अलग करने के लिए किया जाता है.
      नोट: पिक्सेल सुविधा चयन छवि संकल्प पर निर्भर करता है। इसलिए, डेवलपर्स सभी या संभव के रूप में कई सुविधाओं का चयन करने के लिए सुझाव देते हैं, अगर प्रसंस्करण शक्ति और समय की अनुमति है।
    6. निम्न प्रशिक्षण फलक पिक्सेल पर आधारित विभिन्न ऑब्जेक्ट वर्गों के वर्गीकरण की अनुमति देता है। इस मामले में, दो वर्गों व्यक्तिगत GFP-व्यक्त मायोसिन फिलामेंट और अवांछित पृष्ठभूमि या धुंधला किनारों रहे हैं. पहला लेबल रखने के लिए लेबल जोड़ें पर क्लिक करें. वर्गीकृत प्रशिक्षण शुरू करने के लिए कई फिलामेंट पर घसीटना।
      नोट: लेबल को डबल-क्लिक करने से नाम परिवर्तन की अनुमति होती है (उदाहरण के लिए, 'लेबल 1' का नाम बदलकर 'फिलामेंट') कर देता है. रंगीन बॉक्स को डबल-क्लिक करने से आरेखण और प्रायिकता प्रदर्शित करने के लिए रंगों को बदला जा सकता है. तूलिका का डिफ़ॉल्ट आकार 1 है, हालांकि आकार को 61 तक बढ़ाया जा सकता है। गलत पिक्सेल तैयार किया गया है, तो बस ड्राइंग को हटाने के लिए रबड़ उपकरण का उपयोग करें। कुंजीपटल नियंत्रण (-) और (Shift +) में और छवि के बाहर, क्रमशः ज़ूम करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. तीर कुंजी छवि के आसपास नेविगेट करने के लिए उपयोग किया जाता है।
    7. दूसरा लेबल जोड़ें और पृष्ठभूमिमें उसका नाम बदलें. अवांछित पृष्ठभूमि और फिलामेंट के बीच रिक्त स्थान पर घसीटना।
    8. Live अद्यतन पर क्लिक करें और सुनिश्चित करें कि वर्गीकरण सॉफ्टवेयर द्वारा सही ढंग से किया गया है. यदि आवश्यक हो तो अधिक scrawls और ठीक धुन प्रशिक्षण जोड़ें.
      नोट: यह विलय फाइबर और blurry किनारों के लिए एक आँख बाहर रखने के लिए महत्वपूर्ण है (जैसे शरीर लाइन के रूप में) इस चरण में. माप की सटीकता को बढ़ाने के लिए जितना संभव हो उतना यहाँ भविष्यवाणी में सुधार. भविष्यवाणी सटीकता भी छवि संकल्प पर निर्भर करता है, के रूप में कम गुणवत्ता छवियों में पिक्सल के अलावा तंग करने के लिए और अधिक कठिन हैं. यह भी वैकल्पिक है, लेकिन लाइव अद्यतन नियंत्रण के बगल में सुविधाएँ सुझाएं समारोह में फ़िल्टर विधि को चलाने के लिए सिफारिश की है।
    9. एक बार प्रशिक्षण वर्गीकर पर्याप्त रूप से प्रदर्शन किया गया है, भविष्यवाणी निर्यात पैनल के पास जाओ. स्रोत के रूप में संभावनाओं के साथ छवि सेटिंग्स निर्यात करें चुनें पर क्लिक करें.
    10. निम्न सेटिंग्स का उपयोग करें. कट-आउट उपक्षेत्र x और y ticked, और c unticked. c के लिए प्रारंभ और विराम मान क्रमशः 0 और 1 होना चाहिए. अहस्ताक्षरित 8-बिट में डेटा प्रकार को अहस्ताक्षरित 8-बिट में टिक करें और परिवर्तित करें, [न्यूनतम, अधिकतम] को पुन: सामान्य ीकृत करें और डिफ़ॉल्ट मानों का उपयोग करें. PNG करने के लिए आउटपुट फ़ाइल वीडियो का स्वरूप परिवर्तित करें, और फ़ाइल और निर्देशिका के रूप में वांछित का नाम बदलें।
    11. निर्यात सेटिंग्स विंडो को बंद करें और अभी-अभी विभाजित की गई विशिष्ट छवि निर्यात करें.
    12. फिजी सॉफ़्टवेयर में सहेजी गई PNG छवि खोलें. छवि काले और सफेद में दिखाई देना चाहिए.
    13. डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स का उपयोग करके छवि की थ्रेशोल्ड समायोजित करें.
    14. Skeletonization प्लगइन लागू करें (Skeletonize 2D/ परिणामों की एक अलग तालिका प्रदर्शित की जाएगी, जिसमें शाखा लंबाई शामिल है. शाखा लंबाई फाइबर लंबाई का प्रतिनिधित्व करता है. परिणामों में अन्य डेटा भी उपयोगी हो सकता है, जैसे यूक्लिडीय दूरी.
      नोट: इन आकारों शारीरिक रूप से संभव नहीं हैं के रूप में 0 डिग्री मीटर या अधिक से अधिक 250 डिग्री की लंबाई के साथ Omit फाइबर,.

6. परिमाणीकरण माइटोकोंड्रियाल आकारिकी

नोट: mitochondrial आकृति विज्ञान के परिमाणीकरण के लिए, इस अध्ययन का इस्तेमाल किया BXN0387 uIs115 युक्त तनाव (Pec-17::tagRFP)5 transgene PLM न्यूरॉन्स और JsIs609 कल्पना करने के लिए(Pec-4:MLS::GFP) 11 विशेष रूप से PLM न्यूरॉन्स के भीतर mitochondria कल्पना करने के लिए. यह अध्ययन सिंक्रनाइज़ 3 दिन पुराने वयस्क कीड़े में किया गया था, लेकिन सफलतापूर्वक अन्य उम्र में प्रदर्शन किया गया है, साथ ही अन्य ऊतकों में7.

  1. PLM न्यूरॉन्स के भीतर mitochondria के फ्लोरोसेंट इमेजिंग
    1. PLM न्यूरॉन्स के भीतर mitochondria के आकार और आकार परिवर्तन को मापने के लिए, फ्लोरोसेंट ट्रांसजीन का उपयोग कर दोनों पृष्ठभूमि न्यूरॉन और mitochondria कल्पना.
    2. PLM न्यूरॉन छवि के लिए, एक confocal माइक्रोस्कोप का उपयोग एक 488 एनएम और 552 एनएम ऑप्टिकली पंप अर्द्ध कंडक्टर डायोड लेजर और छवि पर कब्जा सॉफ्टवेयर के साथ सुसज्जित करने के लिए युग्मित.
    3. छवि के अनुसार कीड़ा कदम 4.1.1.4.1.4 ऊपर, गैर संतृप्त जोखिम की स्थिति सुनिश्चित करने के अनुसार.
    4. आदेश में पूरे न्यूरॉन कल्पना करने के लिए, एक टाइल छवि की जरूरत हो सकती है. इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए, एक टाइल स्कैन विकल्प के साथ सॉफ्टवेयर का उपयोग करने का पता लगाने और न्यूरॉन के एक कोने में एक मार्कर ड्रॉप और फिर विपरीत अंत का पता लगाने और अन्य मार्कर ड्रॉप. सॉफ्टवेयर आवश्यक क्षेत्र पर कब्जा करने के लिए आवश्यक टाइल्स की इष्टतम संख्या की गणना करेगा।
      नोट: स्कैनिंग समय को कम करने के लिए, यह अक्सर न्यूरॉन्स कि एक एकल विमान का पालन का पता लगाने के लिए आसान है, कम टाइल में जिसके परिणामस्वरूप.
    5. टाइल एक $-स्टैक के साथ स्कैन जोड़ी करने के लिए, टाइल स्कैन प्रारंभ करने से पहले कम और ऊपरी सीमा सेट, और इष्टतम टुकड़ा आकार सेट है कि यह सुनिश्चित करें।
    6. सुनिश्चित करें कि रिज़ॉल्यूशन ऑप्टिमाइज़ किया गया है, क्योंकि विभाजन उच्च रिज़ॉल्यूशन के साथ अधिक परिष्कृत किया जाएगा (यहाँ, 3224 x 3224 पिक्सेल का रिज़ॉल्यूशन उपयोग किया गया था).
      नोट: Whilst uIs115 (Pec-17::tagRFP) ट्रांसजीन पीएलएम चिह्नित करने के लिए प्रयोग किया जाता है और सफलतापूर्वक कैमरे की स्थिति, यह जरूरी नहीं कि मामूली पृष्ठभूमि fluorscence के कारण छवि की जरूरत है JsIs609 से मनाया (Pec-4::MLS::GFP) पीएलएम एक्सॉन के भीतर ही transgene. इस प्रकार, स्कैनिंग और इमेजिंग समय प्रयोग से 552 एनएम फिल्टर को हटाने के द्वारा कम किया जा सकता है.
  2. SQUASSH का उपयोग कर के ऑब्जेक्ट विभाजन
    1. छवि फ़ाइलों को .tiff छवियों में कनवर्ट करें और फिजी इमेजिंग सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके $-स्टैक से अधिकतम तीव्रता अनुमान उत्पन्न करें. अभी भी पूर्ण न्यूरॉन युक्त कम्प्यूटेशनल लोड को कम करने और पृष्ठभूमि शोर को कम करने के लिए कम से कम आकार के लिए छवियों फसल.
      नोट: प्रतिनिधि परिणामों के लिए, केवल लंबे axonal प्रक्रियाओं के भीतर mitochondria पर विचार किया गया था, तो सेल शरीर और किसी भी mitochondria के भीतर प्रत्येक छवि से बाहर रखा गया.
    2. ImageJ के लिए मोज़ेक सुइट SQUASSH मैक्रो का उपयोग करना, अधिकतम अनुमानों पर स्प्लिट ब्रेगमैन विभाजन12 प्रदर्शन करें। इस मैक्रो की स्थापना और अनुप्रयोग के लिए एक विस्तृत गाइड मोज़ेक वेबसाइट (http://mosaic.mpi-cbg.de/) पर उपलब्ध है और Rizk एट अल द्वारा वर्णित 201413. छवि विभाजन की प्रक्रिया को नीचे संक्षेप में वर्णित किया गया है।
      नोट: इस विभाजन वस्तुओं की पहचान करता है (इस मामले में व्यक्तिगत mitochondrion) फ्लोरोसेंट तीव्रता की एक सीमा पर, प्रत्येक व्यक्ति वस्तुओं के आकार और आकार का सही माप के लिए अनुमति देता है.
    3. रोलिंग बॉल विधि का उपयोग करके एक छवि से पृष्ठभूमि शोर निकालें, जिसमें एक उपयोगकर्ता परिभाषित विंडो छवि भर में ले जाता है, प्रत्येक विंडो में सबसे अक्सर होने वाली तीव्रता से स्थानीय पृष्ठभूमि तीव्रता अनुमान imuting. यह असमान पृष्ठभूमि तीव्रता को सही करता है।
    4. मोटे तौर पर प्रतिस्रोदी तीव्रता और पिक्सेल की संख्या के आधार पर ब्याज की वस्तुओं (mitochondria) होते हैं कि छवि के क्षेत्रों को खोजने के लिए वस्तु का पता लगाने का उपयोग करें। इस चरण को नियंत्रित पैरामीटर नियमितीकरण और न्यूनतम ऑब्जेक्ट तीव्रता हैं।
      नोट: नियमितीकरण छोटे तीव्रता, शोर प्रेरित चोटियों विभाजन से बचने के लिए प्रयोग किया जाता है, और न्यूनतम वस्तु तीव्रता सीमा पृष्ठभूमि ऊतक फ्लोरोसेंट से subcellular organelles को परिभाषित करने में मदद करता है। ये मुख्य दो पैरामीटर है कि mitochondria का एक इष्टतम विभाजन खोजने के लिए हेरफेर कर रहे हैं, और अनुकूलन प्रक्रिया परीक्षण और एक परीक्षण छवि के लिए विभिन्न मापदंडों की त्रुटि हो जाता है, मैनुअल निरीक्षण के बाद.
    5. इष्टतम विभाजन की गणना में सहायता करने के लिए प्रत्येक ऑब्जेक्ट के आस-पास स्थानीय पृष्ठभूमि तीव्रता का अनुमान लगाने के लिए सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें.
    6. आकार के लिए अलग-अलग वस्तुओं को मापने, परिधि, पिक्सेल संख्या के माध्यम से लंबाई, साथ ही संकेत तीव्रता और छवि पर x/ आकार (एनएम) में माप की गणना करने के लिए, मूल छवि के पिक्सेल आकार में कारक.
      नोट: प्रत्येक प्रयोग के लिए, इष्टतम पैरामीटर की पहले गणना की जानी चाहिए. विभाजन की सटीकता सुनिश्चित करने के लिए, यह एक परीक्षण छवि पर एक SQUASSH विश्लेषण प्रदर्शन और मैन्युअल रूप से विभाजन की सटीकता का निरीक्षण करने के लिए सलाह दी जाती है. मैक्रो आउटपुट फ़ाइलें प्रदान करता है जो मूल छवि पर पहचाने गए अलग-अलग ऑब्जेक्ट्स को दिखाते हैं, और इन का बारीकी से निरीक्षण करते हैं और सूट करने के लिए पैरामीटर समायोजित करने से सटीक विभाजन सुनिश्चित होगा। फिर परिभाषित पैरामीटर का उपयोग तुलना के लिए संपूर्ण प्रयोग के लिए किया जाना चाहिए. प्रतिनिधि परिणामों के लिए उपयोग किए जाने वाले पैरामीटर तालिका 2में शामिल किए गए हैं।
    7. फिजी या ImageJ विश्लेषण सॉफ्टवेयर खोलें, मोज़ेक मैक्रो कंटेनर पर नेविगेट करें और SQUASSH मेनू खोलें.
      1. पृष्ठभूमि घटाव सबमेनू खोलें और पृष्ठभूमि निकालें सुनिश्चित करें? विंडो आकार के लिए डिफ़ॉल्ट 10 है।
      2. इच्छित Regularization और न्यूनतम ऑब्जेक्ट तीव्रता, चैनल 1 मान सबसे अच्छा पहचान और खंड ऑब्जेक्ट्स (चरण 6.2.4 देखें) करने के लिए सेट करें। चैनल 2 मान एक एकल transgene के साथ चिह्नित वस्तुओं के लिए आवश्यक नहीं हैं.
      3. माइक्रोस्कोप की विशेषताओं के आधार पर प्वाइंट स्प्रेड फ़ंक्शन का अनुमान लगाने के लिए उद्देश्य गुणों से अनुमान PSF पर क्लिक करें। यह अपने पड़ोसी पिक्सेल पर प्रत्येक पिक्सेल के प्रभाव के लिए लेखांकन द्वारा निकट स्थित ऑब्जेक्ट्स के विभाजन में मदद करता है।
        नोट: कंप्यूटर प्रोसेसिंग पावर पर बढ़ते लोड के कारण इस प्रयोग में सबपिक्सेल विभाजन का उपयोग नहीं किया गया था. सेल मास्क भी axon आसानी से परिभाषित किया गया है के रूप में इस्तेमाल नहीं किया गया. ये सेटिंग्स अधिक जटिल ऊतकों के लिए और सेल के आधार पर एक सेल पर वस्तुओं को परिभाषित करने के लिए उपयोगी होते हैं।
      4. दृश्यावलोकों के लिए, सुनिश्चित करें कि ऑब्जेक्ट बाह्यरेखाएँ और ऑब्जेक्ट और छवि विशेषताओं को सहेजें चेक किए गए हैं. ग्राफिक्स और सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर में बाद में उपयोग के लिए, शर्तों की सही संख्या इनपुट कर रहे हैं सुनिश्चित करें.
    8. .tiff छवियों के साथ फ़ोल्डर की स्थिति जानें और मैक्रो चलाएँ। इस प्रक्रिया को एक व्यक्तिगत छवि पर या एक फ़ोल्डर के भीतर स्थित जीनोटाइप प्रति छवियों के एक बैच पर किया जा सकता है. आउटपुट फ़ाइलें मूल छवियों के साथ फ़ोल्डर में स्थित हो जाएगा.
  3. विश्लेषण और आकार की माप
    1. एक आइटमित ऑब्जेक्ट डेटा .csv फ़ाइल प्रदान करने के लिए SQUASSH से आउटपुट का उपयोग करें, जो ऊपर बताए गए अनुसार प्रत्येक प्रति पंक्ति सहित प्रत्येक व्यक्ति ऑब्जेक्ट प्रति पंक्ति प्रदान करता है.
      नोट: जबकि इस मैक्रो प्रक्रिया वस्तु माप स्वचालित, यह हमेशा मैन्युअल रूप से उत्पादन छवियों की जांच करने के लिए SQUASSH विभाजन के बाद मैक्रो ठीक से mitochondria की पहचान की है सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है.
    2. प्रत्येक माइटोकोंड्रिया के आकार का विश्लेषण करने के लिए, एक पूर्ण वृत्त से वस्तु के विचलन का अनुमान लगाने के लिए गोलाकारता, परिपत्रके लिए द्वि-आयामी माप का उपयोग करें।
      नोट: परिपत्र क्षेत्र और परिधि का एक समारोह है (सर्कुलरिटी ] (4 ग ]) x (एरिया/परिमाप2) जहां 1 ] एक पूर्ण वृत्त और 0 ] एक सीधी रेखा। यह ग्राफिक्स और सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर में एक सूत्र का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है.
    3. माइटोकोंड्रिया के पूल में आकार और आकार में विचरण का निर्धारण करने के लिए, ग्राफिक्स और सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर का उपयोग करके हिस्टोग्राम और एक फिट गॉसियन वितरण की गणना करें, माइटोकोंड्रियाल आकार के लिए 0.2 डिग्री मीकेंड के डिब्बे और 0.05 माइटोकोंड्रियाल परिपत्र के लिए।

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Representative Results

सी elegans अपनी सादगी, ज्ञात सेल वंश, पारदर्शिता, और उपलब्ध उपकरणों के कारण विभिन्न ऊतकों और organelles की आकृति विज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श मॉडल जीव है. यहाँ, हम organelles के अध्ययन के लिए मात्रात्मक दृष्टिकोण प्रदान (उदाहरण के लिए, mitochondria) और ऊतकों, synapses और मांसपेशियों सहित लाइव फ्लोरोसेंट इमेजिंग और मुक्त जैव छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर.

सामान्य synapse विकास के लिए MEC-17 अभिव्यक्ति के सख्त विनियमन की आवश्यकता है

आगे अल्फा-tubulin एसिटाइल-ट्रांसफरेस MEC-1714,15,16 तंत्रिका तंत्र में के समारोह को समझने के लिए, हम सी elegans में स्पर्श रिसेप्टर्स न्यूरॉन्स में synaptic आकृति विज्ञान का अध्ययन किया17प्रोटीन overexpressing . इन सेलुलर संरचनाओं न्यूरॉन समारोह के लिए आवश्यक हैं के रूप में वे संकेत पड़ोसी न्यूरॉन्स पर पारित करने की अनुमति. PLM synapse की छवियाँ एक लेजर स्कैनिंग confocal माइक्रोस्कोप का उपयोग कर एकत्र किए गए थे और मात्रात्मक आकृति विज्ञान विश्लेषण सुलभ जैव छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया था (चित्र 1A,बी). MEC-17 के overexpression पीएलएम में पूर्व synaptic संचय के क्षेत्र में महत्वपूर्ण कटौती में परिणाम और SNB-1 के सापेक्ष एकीकृत फ्लोरोसेंट तीव्रता कम::GFP मार्कर (चित्र 1C,D). एक साथ, इन परिणामों का सुझाव है कि MEC-17 के overexpression PLM स्पर्श रिसेप्टर न्यूरॉन्स में सामान्य synapse विकास बाधित.

presynaptic साइट और रिश्तेदार एकीकृत फ्लोरोसेंट के आकार मुक्त जैव छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर CellProfiler3.1.5 का उपयोग कर अध्ययन किया गया. उनके जटिल संरचना के कारण, synapses हाथ से फैलाना tagRFP प्रोटीन uIs115 (Pmec-17::tagRFP) transgene से व्यक्त का उपयोग कर परिभाषित किया गया. परिभाषित synapse के क्षेत्र निर्धारित क्षेत्र के भीतर पिक्सल की संख्या से गणना की गई थी. जंगली-प्रकार के नियंत्रण की तुलना में, एमईसी-17 को अधिक ाजोलाते हुए पशुओं ने पूर्व-सिन्नैप्टिक क्षेत्रों को काफी कम कर दिया है (च र् 0ण्0025; द र् 10) (चित्र 1ब्)। इसके अलावा, synaptic अखंडता का अध्ययन करने के लिए, रिश्तेदार एकीकृत फ्लोरोसेंट तीव्रता के स्तर की तुलना में थे. यह दोनों SNB-1 के लिए परिभाषित synapse के भीतर एकीकृत फ्लोरोसेंट तीव्रता के स्तर को मापने के द्वारा गणना की गई थी:GFP और diffusible tagRFP. बाद में, एसएनबी-1::जीएफपी फ्लोरोसेंट मान टैगआरएफपी मानों के सापेक्ष तुलना की गई जिसके लिए एक महत्वपूर्ण कमी (च $ 0.0479; द $ 10) एमईसी-17 के ओवरएक्सप्रेशन के साथ देखी गई (चित्र 1D)। साथ में, इन परिणामों का सुझाव है कि MEC-17 का सही विनियमन synapse विकास के लिए महत्वपूर्ण है.

शरीर की दीवार मांसपेशी सेल क्षेत्र और फाइबर लंबाई के मात्रात्मक माप CMT2 से संबंधित जीन में उत्परिवर्तन का एक परिणाम के रूप में महत्वपूर्ण दोष से पता चलता है

जीन MFN2, DNM2 और KIF5A में उत्परिवर्तन के कारण दिखाया गया है Charcot-मैरी-टूथ प्रकार 2 (CMT2), सबसे आम विरासत में मिला परिधीय न्यूरोपैथी18,19के एक axonal रूप . CMT2 आमतौर पर धीरे धीरे प्रगतिशील distal मांसपेशियों में कमजोरी और शोष, distal संवेदी हानि, पैर विकृति और माध्यमिक steppage चाल के साथ जुड़ा हुआ है. एक परिणाम के रूप में, रोगियों को अक्सर दुर्बल आजीवन गतिशीलता हानि पीड़ित हैं. वर्तमान में रोग के लिए कोई इलाज नहीं है, आंशिक रूप से CMT219के साथ जुड़े आनुवंशिक और नैदानिक विषमता के कारण, साथ ही पशु मॉडल की कमी रोग pathophysiology का अध्ययन करने के लिए. इसलिए, अंतर्निहित सेलुलर दोषों को समझने के लिए पशु मॉडल का उपयोग अज्ञात CMT2 रोग तंत्र के जवाब प्रदान कर सकते हैं.

इस प्रकार अब तक, प्रकाशित अध्ययन सी elegans में शरीर की दीवार मांसपेशियों दोष का मूल्यांकन मात्रात्मक माप20के बजाय दृश्य स्कोरिंग पर भरोसा किया है. आदेश में व्यक्तिपरक पूर्वाग्रह है कि गुणात्मक मूल्यांकन के दौरान हो सकता है से बचने के लिए, शरीर की दीवार मांसपेशी क्षेत्र और मायोसिन फाइबर लंबाई की मात्रात्मक माप उपलब्ध छवि प्रसंस्करण कार्यक्रमों का उपयोग कर परीक्षण किया गया. हमने इन विधियों का उपयोग एफज़ो-1/एमएफएन2में उत्परिवर्तन ों वाले जानवरों में मांसपेशी आकृतिविज्ञान का आकलन करने के लिए किया , डाइन-1/DNM2 और 3 दिन पुराने वयस्क सी एलिगनमें unc-116/KIF5A जीन . दोनों माप के लिए, शर्तों की एक संख्या लागू किए गए थे, इस तरह है कि कम से कम एक पूर्ण तिरछी मांसपेशी सेल को देखने के भीतर था, मांसपेशियों की कोशिकाओं है कि फजी या ध्यान से बाहर थे बाहर रखा गया था, और चरम पूर्वकाल और पीछे के क्षेत्रों, साथ ही क्षेत्रों के लिए आसन्न योनी को छोड़ दिया गया। CMT2-संबद्ध जीन में उत्परिवर्तन के अलावा, जानवरों को भी stEx30 किया (Pmyo-3::gfp::myo-3 + rol-6(su1006)) transgene कि लेबल एक सी elegans myosin भारी श्रृंखला GFP के साथ subunit (चित्र 2A-E) . फिजी सॉफ्टवेयर9 (संस्करण 2.0.0) में सरल बहुभुज उपकरण एक एकल मांसपेशी सेल के क्षेत्र को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया था. यदि एक जानवर अनुभवी शरीर की दीवार की मांसपेशी संरचना टूटने, मांसपेशियों की कोशिकाओं के भीतर खाली स्थान के पीछे छोड़ने, कुल एकल मांसपेशी सेल क्षेत्र के लिए अंतराल क्षेत्र के अनुपात की गणना की और जंगली प्रकार नियंत्रण की तुलना में किया गया था (चित्र 3A). मायोसिन फाइबर लंबाई की माप प्राप्त करने के लिए, प्रत्येक छवि को पहले इलैस्टिक सॉफ्टवेयर10 (संस्करण 1.3.0) (चित्र3B)का उपयोग करके विभाजित किया गया था। विभाजन एक प्रक्रिया है कि व्यक्तिगत मांसपेशी फाइबर वर्गीकृत किया जा करने के लिए और इस तरह की पृष्ठभूमि के रूप में अवांछित वर्गों से अलग करने की अनुमति देता है. विभाजन के बाद, छवि एक असाइन नहीं किया गया 8-बिट बाइनरी छवि के रूप में निर्यात किया गया था। फिजी (संस्करण 2.0.0) अगले सीमा पिक्सल बाहर फिल्टर करने के लिए द्विआधारी छवि Skeletonize करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, मूल फाइबर का प्रतिनिधित्व टुकड़े पीछे छोड़ने. कंकाल, या व्यक्तिगत मायोसिन फिलामेंट की शाखा लंबाई, तो फिजी में विश्लेषण किया गया. की लंबाई माप 0 या अधिक से अधिक 250 डिग्री, जो भी मांसपेशियों खींच के साथ एक फिलामेंट के लिए अधिकतम उचित लंबाई है, बाहर रखा गया. कुल मिलाकर, 2000 से 3000 मायोसिन फाइबर लंबाई के बीच मापा गया. विभाजन कार्यप्रवाह का सारांश चित्र 3Bमें दिखाया गया है। मात्रात्मक विश्लेषण से परिणाम आगे शरीर की दीवार मांसपेशियों दोष है, जहां 3 दिन पुराने जानवरों दोषपूर्ण या नहीं दोषपूर्ण मांसपेशी संरचना अखंडता के आधार पर के रूप में वर्गीकृत किया गया था के दृश्य स्कोरिंग के साथ तुलना में थे.

शरीर की दीवार की मांसपेशी आकृति विज्ञान में दोष 2.5 से 3.5 गुना अधिक fzo-1 (cJn020), dyn-1(ky51) और unc-116(e2310) जानवरों के बीच दृश्य मूल्यांकन के दौरान जंगली प्रकार जानवरों में मनाया गया (चित्र 4A) . fzo-1 और unc-116 में उत्परिवर्तन के साथ अधिकांश जानवरों मांसपेशियों striations के विशिष्ट नुकसान का अनुभव, सेलुलर मलबे के संचय के कारण बड़े GFP clumping, और मांसपेशी फाइबर अध: पतन कि मांसपेशियों की कोशिकाओं के भीतर दूरी अंतरिक्ष छोड़ दिया ( चित्र 2C, ई) . इसके विपरीत, जबकि 60% से अधिक dyn-1 म्यूटेंट नेत्रहीन दोषपूर्ण रन बनाए गए थे, दोष की हद तक अन्य दो आनुवंशिक म्यूटेंट की तुलना में कम था. वहाँ striations के केवल मामूली नुकसान था, कोई GFP समुच्चय और केवल मामूली मांसपेशी अध: पतन जब अन्य दो म्यूटेंट की तुलना में (चित्र 2 D और चित्र 4A) . अन्य phenotypic स्कोरिंग के साथ के रूप में, दोषों की हद पर विचार नहीं किया जा सकता है, और पूर्वाग्रह के लिए एक प्रवृत्ति दोष के एक उच्च अनुपात के लिए पंजीकृत हो सकता है. इसलिए, मांसपेशियों की कोशिका क्षेत्र और फाइबर लंबाई की मात्रात्मक माप अकेले दृश्य मूल्यांकन से मांसपेशियों दोष की हद तक एक अधिक सटीक प्रतिनिधित्व प्रदान करेगा. दृश्य स्कोरिंग के साथ मनाया बड़े अंतराल के साथ लाइन में, कुल एकल सेल क्षेत्र के लिए अंतराल क्षेत्र का अनुपात 5 से 6 बार जंगली प्रकार समूह है, जो केवल नगण्य अनुभव की तुलना में fzo-1 और unc-116 उत्परिवर्ती जानवरों में उच्च होना दिखाया गया था पेशी संरचना टूटन (चित्र 4ख) डाइन-1 म्यूटेंट में संरचनात्मक पतन की कमी के परिणामस्वरूप मांसपेशी कोशिका क्षेत्र अनुपात के अंतर में एक गैर-महत्वपूर्ण, 3 गुना वृद्धि हुई (चित्र4ख)। यह यह भी इंगित करता है कि प्रयोगकर्ता पूर्वाग्रह गुणात्मक मूल्यांकन द्वारा सौंपे गए दोषों के उच्च अनुपात में योगदान करने वाला कारक हो सकता है। फिर भी, छोटे अंतराल जंगली प्रकार में 24 डिग्री मीटर से 22 डिग्री मीटर के लिए dyn-1 म्यूटेंट में औसत फाइबर लंबाई में कमी आई (चित्र 4C) . औसत फाइबर लंबाई नाटकीय रूप से fzo-1 और unc-116 उत्परिवर्ती में कम था, इन जानवरों में मांसपेशियों की कोशिकाओं degenerating के भीतर बड़े अंतराल की उपस्थिति के साथ संबंधित (चित्र 2C,ई और चित्रा 4C ). ये परिणाम हमारे हाल के निष्कर्षों के अनुरूप हैं जो सी एलिगेंस20में CMT2-ascoiated जीनों को परिवर्तित करने के प्रभावों का अध्ययन कर रहे हैं। इसके अलावा, वे अकेले दृश्य स्कोरिंग की तुलना में इन मात्रात्मक तरीकों का उपयोग मांसपेशियों आकृति विज्ञान के अधिक सटीक मूल्यांकन पर प्रकाश डाला, और सबूत है कि fzo-1 और unc-116 सामान्य मांसपेशी आकृति विज्ञान के लिए आवश्यक हैं प्रदान करते हैं.

SQUASSH वस्तु विभाजन का उपयोग कर mitochondrial आकारिकी के मात्रात्मक माप

यह समझने के लिए कि माइटोकोंड्रियाल विखंडन की अनुपस्थिति सी एलिगेंस न्यूरॉन्स में माइटोकोंड्रिल आकारिकी को कैसे प्रभावित करती है, हमने पीएलएम मेकेनोसेंसरी न्यूरॉन्स में मात्रात्मक विश्लेषण किया। डीआरपी-1, स्तनधारी Dynamin से संबंधित प्रोटीन 1 (DRP1) के सी elegans ऑर्थोलॉग, mitochondrial विखंडन को नियंत्रित करता है, जहां सक्रियण साइटोसोल से भर्ती किया जाता है mitochondria के आसपास एक सर्पिल फार्म, constricting और अंत में दोनों को तोड़ने आंतरिक और बाह्य माइटोकोंड्रियाल झिल्ली21,22| हम fluorcently PLM न्यूरॉन्स में एक ऊतक विशिष्ट ट्रांसजीन के साथ mitochondria लेबल, जो एक लंबी axonal प्रक्रिया है कि आसानी से epifluorscence माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर कल्पना की जा सकती है. विखंडन की हानि समग्र mitochondrial गतिशीलता को बाधित करने के लिए hypothesized है, और इसलिए एक नवोदित23के रूप में जाना जाता है एक प्रक्रिया के माध्यम से नए, छोटे mitochondria के निर्माण में कमी.

हम जंगली प्रकार और drp-1 उत्परिवर्ती जानवरों में mitochondrial आकारिकी की तुलना करने के लिए SQUASSH विभाजन प्रदर्शन किया। हम जीनोटाइप प्रति 6 PLM न्यूरॉन्स से mitochondria विश्लेषण किया, अधिक से अधिक है कि 200 प्रत्येक के लिए mitochondria के एक n मूल्य में जिसके परिणामस्वरूप. Schematic और प्रतिनिधि छवियों चित्र 5A,Bमें दिखाए जाते हैं। हमने पाया कि डीआरपी-1 की कमी वाले उत्परिवर्ती लोगों में बड़ा और लम्बी माइटोकों (चित्र 5 बी-एफ) था। Drp-1 उत्परिवर्ती पृष्ठभूमि में Mitochondria जंगली प्रकार से 32% बड़ा थे (पी $ 0.0006, चित्रा 5C), और 14% अधिक लम्बी (एक परिपूर्ण चक्र से आगे) (पी और 0.0001, चित्रा 5D)। आकार और आकार में विचरण के अधिक विस्तृत मूल्यांकन के लिए, हमने प्रत्येक माप के लिए हिस्टोग्राम की योजना तैयार की, डेटा को गॉसियन वितरण के लिए उपयुक्त किया गया (चित्र 5E,F)। हमने पाया है कि दोनों आकार और परिपत्र के लिए, विखंडन प्रोटीन की कमी म्यूटेंट एक बड़ा विचरण था (p और 0.0001 दोनों के लिए), बड़े और अधिक लम्बी mitochondria/mitochondrial नेटवर्क की उपस्थिति से प्रकाश डाला (उदाहरण के लिए चित्र 5Bii देखें ). कुल मिलाकर, हम सबूत के लिए सुझाव है कि drp-1 के उत्परिवर्तन PLM न्यूरॉन्स के भीतर विखंडन की कमी का कारण बनता है पाया, बड़े और अधिक लम्बी mitochondria में जिसके परिणामस्वरूप. हमने यह भी प्रदर्शित किया कि माइटोकोंड्रियाल विखंडन के विघटन से माइटोकोंड्रियाल आकारिकी के प्रसरण में वृद्धि होती है।

Figure 1
चित्रा 1: PLM न्यूरॉन्स में synapse अखंडता की मात्रा. (क) छवियाँ एक गैर-ट्रांसजेनिक जानवर में पीएलएम synaptic क्षेत्र के अधिकतम z-प्रक्षेप हैं। बाएं पैनल टैगआरएफपी के साथ लेबल पीएलएम न्यूरॉन से पता चलता है, दूसरे पैनल SNB-1 के साथ लेबल पूर्व synaptic क्षेत्र प्रदर्शित करता है::GFP, तीसरी छवि सह-स्थानीयकरण पीले रंग में प्रतिनिधित्व के साथ एक ओवरले है, और चौथे पैनल ओवरले छवि का एक योजनाबद्ध है. (बी) अधिकतम z-प्रक्षेप confocal छवियों में synaptic क्षेत्र जानवरों में mec-17 overexpressing. छवियाँ पैनल ए (सी) एमईसी-17 overexpressing एमईसी-17 overexpressing ट्रांसजेनिक जानवरों की तुलना में गैर-ट्रांसजेनिक में पूर्व synaptic क्षेत्र के आकार परिमाणीकरण के अनुसार प्रदर्शित कर रहे हैं। (डी) एमईसी-17 को अतिसंवदेषित पशुओं के मामले में एसएनबी-1:जीएफपी बनाम ट्रांसजेनिक पशुओं के सापेक्ष एकीकृत फ्लोरोसेंट स्तरों का परिमाणीकरण। के लिए (सी) और (डी), विश्लेषण व्यक्तिगत synapses हलकों द्वारा प्रतिनिधित्व कर रहे हैं; द ] 10; मतलब - काले रंग में दिखाया गया एस.ई. P मान * और lt; 0.05, * * और lt; 0.01 unpaired t-परीक्षण से; पैमाने की बार ्स2 m का प्रतिनिधित्व करते हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: C. elegans शरीर की दीवार की मांसपेशियों का दृश्य| (ए) एक जानवर stEx30 व्यक्त (Pmyo-3::gfp::myo-3 + rol-6(su1006)) transgene, जो शरीर की दीवार की मांसपेशियों में GFP के साथ myosin भारी श्रृंखला लेबल. सरणी भी जानवर है कि शरीर के पृष्ठीय और अधर पक्षों के साथ व्यवस्था की मांसपेशियों की कोशिकाओं के दृश्य की सुविधा में एक रोलिंग phenotype लाती है. प्रतिनिधि में मायोसिन फाइबर के विचारों को बढ़ाया (बी) जंगली प्रकार, (सी) fzo-1 (cJn020), (डी) dyn-1(ky51) और (ई) unc-116 (e2310) जानवरों. सभी जानवरों को 3 दिन पुराने वयस्क चरण में छवि थे. स्केल बार (A) में 60 डिग्री मी और 30 डिग्री मी (B-E) का प्रतिनिधित्व करता है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: शरीर की दीवार मांसपेशी क्षेत्र और फाइबर लंबाई उपलब्ध कम्प्यूटेशनल एल्गोरिदम का उपयोग कर मापने| (क) उदाहरण छवि यह प्रदर्शित करता है कि किस प्रकार एकल मांसपेशी सेल (लाल संलग्न) के भीतर आंतरिक अंतराल स्थान, और संपूर्ण सेल (पीला संलग्न) का क्षेत्रफल, मांसपेशी क्षेत्र अनुपात प्राप्त करने के लिए फिजी में खींचा जाता है और परिकलित किया जाता है। (बी) फिजी और ilastik के संयोजन का उपयोग कर एक उदाहरण छवि पर विभाजन प्रोटोकॉल की रूपरेखा. स्केल बार 30 m का प्रतिनिधित्व करता है. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: योग्यता और शरीर की दीवार मांसपेशियों दोष का परिमाणीकरण| (क) शरीर की दीवार की मांसपेशी दोषों का दृश्य मूल्यांकन। (बी) डब्ल्यूटी और संकेत म्यूटेंट के बीच कुल मांसपेशी सेल क्षेत्र अनुपात के लिए रिक्त स्थान क्षेत्र की तुलना। (सी) मायोसिन फाइबर लंबाई का मापन। के लिए (बी) और (सी), केवल छवियों के साथ कम से कम एक पूर्ण दृश्य तिरछी मांसपेशी सेल विश्लेषण के लिए शामिल किए गए थे. 0 डिग्री मीटर या 250 डिग्री मीटर से अधिक की लंबाई वाले फाइबर को भी बाहर रखा गया था। बार्स (A) में प्रतिशत दोषपूर्ण जानवरों का प्रतिनिधित्व करते हैं और मतलब है - S.E.M. में (B) और (C); द प्रत्येक बार में सूचीबद्ध मान. झूठी खोज दर के साथ ची-वर्ग परीक्षण में दृश्य दोषों की तुलना करने के लिए प्रदर्शन किया गया (ए), जबकि कई तुलना के लिए Dunnett के बाद तदर्थ परीक्षण के साथ एक तरह से ANOVA (बी) और (सी) में मात्रात्मक माप का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया. *पी एंड टी; 0.05, * * *पी एंड एलटी; 0.0001, एन एस - महत्वपूर्ण नहीं है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: PLM न्यूरॉन्स के एक्सॉन के भीतर Mitochondrial आकारिकी. (क) सी एलिगेंसकी पूंछ में पश् च पार्श्व माइक्रोट्युबल (पीएलएम) मेकेनोसेंसरी न्यूरॉन का स्केमेटिक। लाल बॉक्स में हाइलाइट किए गए वर्गों के अनुमानित स्थान को इंगित करता है (B), जो PLM एक्सॉन के भीतर GFP लेबल mitochondria (Pec-4:MLS::GFP) के प्रतिनिधि छवियों को दिखाने के. चमकीला हरा तीखा संकेत माइटोकोंड्रिया. WT की तुलना में (i), drp-1 (tm1108) म्यूटेंट (ii) बड़ा, अधिक लम्बी mitochondria दिखा. छवियाँ n के प्रतिनिधि हैं - 6 PLM axons से 6 कीड़े प्रति जीनोटाइप; पैमाने सलाखों ] 15 डिग्री मी. (C) 3 दिनपुराने वयस्क (3DOA) कृमियों में SQUASSH ऑब्जेक्ट विभाजन द्वारा परिमाणित के रूप में व्यक्तिगत माइटोकोन्ड्रिऑन का माध्य आकार ($m 2)। (डी) पीएलएम एक्सॉन के भीतर व्यक्तिगत माइटोकोन्ड्रिऑन का माध्य परिपत्र, 3डीओए में SQUASSH ऑब्जेक्ट माप से मात्रा निर्धारित के रूप में। (ई) हिस्टोग्राम और गाऊसी वितरण माइटोकोंड्रियाल आकार के विचरण को दर्शाता है। एफ परीक्षण (पी एंड 0001) से पता चलता है कि प्रसरण drp-1 और WT. (एफ) हिस्टोग्राम और गाऊसी वितरण के बीच काफी अलग हैं mitochondrial परिपत्र की प्रसरण दिखा. डेटा मतलब +/- SEM. * * पी और lt; 0.001, * * * P और lt; Welch के t-परीक्षण से 0.0001 के रूप में प्रतिनिधित्व किया है; द द 6 कृमियों से मात्रात्मक विश्लेषण के लिए 204 माइटोकोंड्रिया। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तनाव का नाम जीनोटाइप स्रोत संदर्भ #
BXN038 uIs115(पीएमसी-17:::tagRFP); JsIs609(पीएमके-4::MLS::GFP) न्यूमन प्रयोगशाला 7
BXN366 fzo-1(cJn020); मायो-3(st386); zdIs5(पीएमसी-4::GFP); stEx30(Pmyo-3::gfp::myo-3 + rol-6(su1006)) न्यूमन प्रयोगशाला 20
BXN419 drp-1 (tm1108); JsIs609(पीएमसी-4::MLS::GFP); uIs115(पीएमसी-17::टैगआरएफपी) न्यूमन प्रयोगशाला 7
BXN507 cJnEx036(पीएमईसी-4::mec-17, Pmyo-2::mCherry); JsIs37(पीएमसी-7::snb-1::GFP); लिन-15B और लिन-15A(n765); uIs115(पीएमसी-17::टैगआरएफपी) न्यूमन प्रयोगशाला 17
BXN675 unc-116(e2310); मायो-3(st386); stEx30(Pmyo-3::gfp::myo-3 + rol-6(su1006)) न्यूमन प्रयोगशाला 20
BXN685 dyn-1(ky51); मायो-3(st386); stEx30(Pmyo-3::gfp::myo-3 + rol-6(su1006)) न्यूमन प्रयोगशाला 20
एनएम664 JsIs37(पीएमसी-7::snb-1::GFP); लिन-15बी और लिन-15A(n765) केनोरब्डिटिस जेनेटिक्स सेंटर 6
आरडब्ल्यू1596 मायो-3(st386); stEx30(Pmyo-3::gfp::myo-3 + rol-6(su1006)) केनोरब्डिटिस जेनेटिक्स सेंटर 8
टीयू 4065 uIs115(पीएमसी-17::टैगआरएफपी) मार्टिन चल्फी 5

तालिका 1. इस अध्ययन में प्रयुक्त सी एलिगन उपभेदों की सूची।

PLM एक्सॉन छवियों
उद्देश्य 40x
छवि संकल्प (टाइल्सकैन के लिए प्रति पैनल) 3224 x 3224
पृष्ठभूमि हटाने खिड़की का आकार 20
पीएसएफ xy 0.78
पीएसएफ z 0.68
नियमितीकरण 0.15
GFP की न्यूनतम फ्लोरोसेंट तीव्रता 0.4

तालिका 2. माइटोकोंड्रिया के विभाजन के लिए SQUASSH पैरामीटर।

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Discussion

Morphological विविधताओं अक्सर ध्यान देने योग्य मतभेद ों की मैनुअल गिनती या मनमाने ढंग से सीमा का उपयोग करने के लिए एक जंगली प्रकार phenotype की तुलना में दोष निर्धारित करने के माध्यम से मूल्यांकन किया गया है. हाल ही में, तथापि, मात्रात्मक तरीकों को सही ढंग से मापने के लिए और एक निष्पक्ष फैशन में एक सेलुलर और subcellular स्तर पर परिवर्तन का वर्णन करने के लिए आकृति विज्ञान के तुलनात्मक अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया है. फिनोटाइप्स के बीच सूक्ष्म अभी तक जैविक रूप से प्रासंगिक मतभेदों की पहचान करने की क्षमता अंतर्निहित आणविक तंत्र को समझने के लिए एक शक्तिशाली साधन है जो पर्यावरणीय कारकों या आनुवंशिक रोगों के कारण आकृति विज्ञान में परिवर्तन को नियंत्रित करता है। गणना शक्ति और माइक्रोस्कोपी इमेजिंग संकल्प में निरंतर वृद्धि, विकास की आसानी और सी elegans आनुवंशिकी की बहुमुखी प्रतिभा के साथ मिलकर परिष्कृत अभी तक मुक्त इमेजिंग सॉफ्टवेयर के संयोजन के लिए एकदम सही मंच प्रदान की गई है ठीक विस्तृत confocal छवियों के साथ. यहाँ, हम का मूल्यांकन करने के लिए तरीकों का प्रदर्शन किया है और synaptic आकार और प्रोटीन स्थानीयकरण, शरीर की दीवार मांसपेशी क्षेत्र और फाइबर लंबाई, और आनुवंशिक पृष्ठभूमि की एक श्रृंखला में mitochondrial आकारिकी की मात्रा.

हालांकि इन विश्लेषणों सूक्ष्म रूपात्मक मतभेदों को परिमाणित करने की क्षमता का प्रदर्शन किया है, वहाँ सीमाएं हैं. हालांकि इन विश्लेषणों में से प्रत्येक खुला स्रोत और आसानी से उपलब्ध सॉफ्टवेयर का उपयोग करते हैं, वे उच्च गुणवत्ता पर भरोसा करते हैं, तेज छवियों को सही सेलुलर संरचनाओं और subcellular organelles हल करने के लिए. यह अक्सर एक सीमित कदम हो सकता है, संवेदनशील उच्च अंत उपकरण के रूप में, उन्नत डिटेक्टरों के साथ confocal माइक्रोस्कोप के रूप में, संतोषजनक संकल्प के साथ छवियों पर कब्जा करने के लिए आवश्यक हैं. ये हमेशा प्रयोगशालाओं के लिए सुलभ नहीं हैं, और उप-पार प्रौद्योगिकी के साथ विश्लेषण गलत और unrepeatable परिणाम के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. इसके अलावा, जबकि प्रत्येक तकनीक कंप्यूटर एल्गोरिदम का उपयोग करके प्रयोगकर्ता पूर्वाग्रह को कम करना है, वहाँ अभी भी कदम है कि मानव त्रुटि का एक तत्व शामिल कर सकते हैं. हाथ से synapse की मैनुअल परिभाषा, मांसपेशी सेल क्षेत्र की रूपरेखा, आंख से mitochondrial विभाजन के पैरामीटर अनुकूलन सभी क्षेत्रों है कि इस संबंध में सुधार किया जा सकता है. मानव त्रुटि के लिए मौका कम करने के लिए, अध्ययन एक अंधा फैशन या वैकल्पिक छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर में आयोजित किया जा सकता है ब्याज के क्षेत्र को परिभाषित करने के लिए ही इस्तेमाल किया जा सकता है. सेल मास्क का उपयोग करना, जिसमें विश्लेषण के लिए वांछित क्षेत्र एक अलग तरंगदैर्ध्य में फ्लोरोसेंट द्वारा परिभाषित किया गया है, इस मदद कर सकते हैं. इसका उपयोग विश्लेषण को एक निर्धारित थ्रेशोल्ड के ऊपर फ्लोरोसेंट प्रदर्शित करने वाली छवि के अनुभाग तक सीमित करने के लिए किया जाता है, जैसे कि सेल का नाभिक या ट्रांसफेक्टेड सेल13,24. इसके अलावा, एकल समय बिंदु छवियों का उपयोग सवाल इन तकनीकों को संबोधित कर सकते हैं सीमा. प्रक्रियाओं है कि organelle आकारिकी को नियंत्रित, synapse गठन और मांसपेशियों की संरचना सबसे अधिक संभावना गतिशील हैं, और मतभेद विकास या जैविक स्थिति के आधार पर एक ही सेल के भीतर देखा जा सकता है. एक विशिष्ट अंत बिंदु पर इन संरचनाओं का विश्लेषण इसलिए सीमित किया जा सकता है और समय चूक इमेजिंग समय के साथ संरचनात्मक परिवर्तन की निगरानी के लिए फायदेमंद होगा. अंत में, जबकि आकृति परिवर्तन सेलुलर प्रक्रियाओं में व्यवधान का एक अच्छा संकेत हो सकता है, सहसंबंध हमेशा अंतर्निहित नहीं है. उदाहरण के लिए, विभिन्न प्रजातियों में हाल के निष्कर्षों से पता चला है कि माइटोकोंड्रियाल फलन और रूप वास्तव में7,25को अलग किया जा सकता है । इसलिए, अतिरिक्त परख ध्यान में रखा जाना चाहिए जब morphological मतभेद के परिणाम के रूप में कार्यात्मक परिवर्तन का अनुमान.

हम ऊतकों और आनुवंशिक पृष्ठभूमि के एक विशेष सेट में इन मात्रात्मक तकनीकों के उपयोग को प्रदर्शित करने में सक्षम रहे हैं; हालांकि, उनके उपयोग और अधिक मोटे तौर पर लागू किया जा सकता है. इमेजिंग सॉफ्टवेयर के माध्यम से फ्लोरोसेंट परिमाणीकरण इस तरह के नाभिक और endosomes के रूप में विभिन्न subcellular organelles की एक श्रृंखला का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, या न्यूरॉन्स और उपकला कोशिकाओं के रूप में विभिन्न संरचनाओं, सभी विभिन्न उत्परिवर्ती या रोग के संदर्भ में पृष्ठभूमि.

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनका कोई प्रतिस्पर्धी हित नहीं है।

Acknowledgments

हम मूल्यवान विचार विमर्श और इनपुट के लिए न्यूमन प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद. कुछ उपभेदों सीजीसी, जो अनुसंधान बुनियादी ढांचा कार्यक्रम (P40 OD010440) के NIH कार्यालय द्वारा वित्त पोषित है द्वारा प्रदान की गई. लेखक सी elegansपर जानकारी के अपने धन के लिए WormBase धन्यवाद, और साधना, प्रशिक्षण और तकनीकी सहायता के प्रावधान के लिए मोनाश माइक्रो इमेजिंग, मोनाश विश्वविद्यालय, स्वीकार करते हैं। इस कार्य को सीएमटीए अनुसंधान अनुदान (2015 और 2018) द्वारा समर्थित किया गया था, और एनएचएमआरसी परियोजना अनुदान 1101974 और 1099690 को बी.एन.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar-agar Merck 1.01614.1000
Agarose Invitrogen 16500-500
Confocal microscope Leica TCS SP8 Inverted platform
Fluorescence microscope Carl Zeiss AG Zeiss Axio Imager M2
Glass coverslips #1 Thermo scientifique MENCS22221GP
Glass coverslips #1.5 Zeiss 474030-9000-000 Made by SCHOTT
Glass slides Thermo scientifique MENS41104A/40
Light LED Schott KL 300 LED
Stereo Microscope Olympus SZ51
Tryptone (Peptone from casein) Merck 107213 Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium
Yeast Extract Merck 103753 Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium
Sodium chloride Merck 106404 Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium
Peptone (Peptone from meat) Merck 107214 Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Agar Sigma A1296 Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Sodium chloride Merck 106404 Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Cholesterol Sigma C8667-25G Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Calcium chloride Merck 102382 Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Magnesium sulfate Merck 105886 Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Dipotassium phosphate Merck 105101 Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Potassium dihydrogen phosphate Merck 104873 Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Disodium phosphate Merck 106586 Ingredients for M9 buffer
Sodium chloride Merck 106404 Ingredients for M9 buffer
Potassium dihydrogen phosphate Merck 104873 Ingredients for M9 buffer
Magnesium sulfate Merck 105886 Ingredients for M9 buffer
Pasteur pipette Corning CLS7095D5X-200EA
Petri dishes Corning CLS430589-500EA
Platinum wire Sigma 267201-2G
Spatula Met-app 2616
Tetramisole hydrochloride Sigma L9756-5G

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References

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Chapter 3: The Cellular Level of Organization

The Cell Membrane
The Cytoplasm and Cellular Organelles
The Nucleus and DNA Replication
Protein Synthesis
Cell Growth and Division
Cellular Differentiation

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