Automatizado Rat single-pellet atingindo com 3-dimensional reconstrução de pata e dígitos trajetórias
Summary
O alcance hábil do roedor é comumente usado para estudar habilidades destosas, mas requer tempo e esforço significativos para implementar a tarefa e analisar o comportamento. Nós descrevemos uma versão automatizada do alcance hábil com seguimento do movimento e reconstrução tridimensional de trajetórias do alcance.
Abstract
O alcance hábil do roedor é comumente usado para estudar habilidades destosas, mas requer tempo e esforço significativos para implementar a tarefa e analisar o comportamento. Várias versões automatizadas de alcance hábil foram desenvolvidas recentemente. Aqui, descrevemos uma versão que automaticamente apresenta pelotas para ratos durante a gravação de vídeo de alta definição a partir de vários ângulos em altas taxas de quadros (300 fps). A pata e os dígitos individuais são rastreados com o deeplabcut, um algoritmo de aprendizado de máquina para estimativa de pose alinhamento. Este sistema também pode ser sincronizado com gravações fisiológicas, ou ser usado para desencadear intervenções fisiológicas (por exemplo, estimulação elétrica ou óptica).
Introduction
Os seres humanos dependem fortemente da habilidade destreza, definida como movimentos que exigem movimentos multiarticulares e de dígitos precisamente coordenados. Essas habilidades são afetadas por uma série de patologias comuns do sistema nervoso central, incluindo lesões estruturais (por exemplo, acidente vascular cerebral, tumor, lesões desmielinantes), doença neurodegenerativa (por exemplo, doença de Parkinson) e anormalidades funcionais do motor circuitos (por exemplo, distonia). Entender como habilidades destosas são aprendidas e implementadas por circuitos motores centrais, portanto, tem o potencial de melhorar a qualidade de vida de uma grande população. Além disso, tal entendimento é susceptível de melhorar o desempenho motor em pessoas saudáveis, otimizando estratégias de treinamento e reabilitação.
A dissecação dos circuitos neurais subjacentes à habilidade destreza em humanos é limitada por considerações tecnológicas e éticas, necessitando do uso de modelos animais. Os primatas não humanos são comumente usados para estudar movimentos de membros dexterosos, dada a semelhança de seus sistemas motores e repertório comportamental para os seres humanos1. No entanto, os primatas não humanos são caros com tempos de geração longos, limitando números de sujeitos de estudo e intervenções genéticas. Além disso, enquanto a caixa de ferramentas neurocientífica aplicável aos primatas não humanos é maior do que para os seres humanos, muitos avanços tecnológicos recentes estão indisponíveis ou significativamente limitados em primatas.
O alcance hábil do roedor é uma aproximação complementar a estudar o controle de motor Dexterous. Ratos e camundongos podem ser treinados para alcançar, agarrar e recuperar uma pelota de açúcar em uma seqüência estereotipada de movimentos homous aos padrões de alcance humano2. Devido ao seu tempo de geração relativamente curto e menor custo de habitação, bem como a sua capacidade de adquirir qualificados atingindo ao longo de dias a semanas, é possível estudar um grande número de assuntos durante as fases de aprendizagem e de consolidação de habilidades. O uso de roedores, especialmente camundongos, também facilita o uso de poderosas ferramentas neurocientíficas modernas (por exemplo, optogenética, imagem de cálcio, modelos genéticos da doença) para estudar habilidade destreza.
O alcance hábil do roedor foi usado por décadas para estudar o controle normal do motor e como é afetado por patologias específicas como o curso e a doença de Parkinson3. No entanto, a maioria das versões desta tarefa são de trabalho e tempo intensivo, mitigando os benefícios de estudar roedores. As implementações típicas envolvem a colocação de roedores em uma câmara de alcance com uma prateleira na frente de um entalhe estreito através de que o roedor deve alcangar. Um pesquisador coloca manualmente pelotas de açúcar na prateleira, aguarda o animal chegar e, em seguida, coloca um outro. Atinge são marcados como sucessos ou falhas em tempo real ou por vídeo revisão4. No entanto, simplesmente marcar atinge como sucessos ou falhas ignora dados cinemáticos ricos que podem fornecer informações sobre como (ao contrário de simplesmente se) atingindo é prejudicada. Este problema foi abordado através da implementação de uma revisão detalhada do alcance dos vídeos para identificar e pontuar os submovimentos do alcance do escore5. Enquanto isso acrescentou alguns dados sobre a cinemática de alcance, também aumentou significativamente o tempo e o esforço do experimentador. Além disso, altos níveis de envolvimento experimentador podem levar a inconsistências na metodologia e análise de dados, mesmo dentro do mesmo laboratório.
Mais recentemente, várias versões automatizadas de alcance hábil foram desenvolvidas. Alguns atribuem à gaiola de casa6,7, eliminando a necessidade de transferir animais. Isto reduz o stress nos animais e elimina a necessidade de aclimatar os a uma câmara de alcance especializada. Outras versões permitem o seguimento da pata de modo que as mudanças cinemáticas intervenções específicas possam ser estudadas8,9,10, ou têm mecanismos para determinar automaticamente se as pelotas foram derrubados fora da prateleira11. As tarefas de alcance hábil automatizadas são especialmente úteis para o treinamento de alta intensidade, como pode ser exigido para a reabilitação após uma lesão12. Os sistemas automatizados permitem que os animais realizem um grande número de alcances sobre longos períodos de tempo sem exigir a participação intensiva do investigador. Além disso, os sistemas que permitem rastreamento de pata e pontuação de resultado automatizada reduzem o tempo de pesquisador gasto realizando a análise de dados.
Nós desenvolvemos um sistema automatizado de alcance hábil do rato com diversas características especializadas. Primeiramente, usando um suporte móvel para trazer o pellet em “alcançando a posição” de abaixo, nós obtemos uma vista quase desobstruída do forelimb. Em segundo lugar, um sistema de espelhos permite múltiplas visões simultâneas do alcance com uma única câmera, permitindo a reconstrução tridimensional (3-D) de trajetórias de alcance usando uma câmera de alta resolução, de alta velocidade (300 fps). Com o desenvolvimento recente de algoritmos de aprendizado de máquina robustos para rastreamento de movimento alinhamento13, agora rastreamos não só a pata, mas os Knuckles individuais para extrair o alcance detalhado e compreender a cinemática. Em terceiro lugar, um frame-grabber que executa o processamento de vídeo simples permite a identificação em tempo real de distintas fases de alcance. Essas informações são usadas para acionar a aquisição de vídeo (a aquisição contínua de vídeo não é prática devido ao tamanho do arquivo) e também pode ser usada para acionar intervenções (por exemplo, optogenética) em momentos precisos. Finalmente, os frames video individuais são disparados pelos pulsos da lógica do transistor-transistor (TTL), permitindo que o vídeo seja sincronizado precisamente com as gravações neural (por exemplo, eletrofisiologia ou fotometria). Aqui, descrevemos como construir este sistema, treinar ratos para executar a tarefa, sincronizar o aparelho com sistemas externos, e reconstruir as trajetórias de alcance 3-D.
Protocol
Representative Results
Discussion
O alcance hábil do roedor transformou-se uma ferramenta padrão para estudar a fisiologia e a patofisiologia do sistema motor. Nós descrevemos como implementar uma tarefa de alcance hábil de rato automatizado que permite: treinamento e teste com supervisão mínima, a reconstrução da trajetória da pata 3-D e do dígito (durante alcangando, agarrando, e retração da pata), identificação do tempo real do pata durante o alcance, e sincronização com eletrônica externa. É adequado para correlacionar a cinemática…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer a Karunesh Ganguly e seu laboratório por conselhos sobre a tarefa de alcance hábil, e Alexander e Mackenzie Mathis por sua ajuda na adaptação DeepLabCut. Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de doença neurológica e acidente vascular cerebral (número de subvenção K08-NS072183) e da Universidade de Michigan.
Materials
| clear polycarbonate panels | TAP Plastics | cut to order (see box design) | |
| infrared source/detector | Med Associates | ENV-253SD | 30" range |
| camera | Basler | acA2000-340kc | 2046 x 1086 CMV2000 340 fps Color Camera Link |
| camera lens | Megapixel (computar) | M0814-MP2 | 2/3" 8mm f1.4 w/ locking Iris & Focus |
| camera cables | Basler | #2000031083 | Cable PoCL Camera Link SDR/MDR Full, 5 m – Data Cables |
| mirrors | Amazon | ||
| linear actuator | Concentrics | LACT6P | Linear Actuator 6" Stroke (nominal), 110 Lb Force, 12 VDC, with Potentiometer |
| pellet reservoir/funnel | Amico (Amazon) | a12073000ux0890 | 6" funnel |
| guide tube | ePlastics | ACREXT.500X.250 | 1/2" OD x 1/4" ID Clear. Extruded Plexiglass Acrylic Tube x 6ft long |
| pellet delivery rod | ePlastics | ACRCAR.250 | 0.250" DIA. Cast Acrylic Rod (2' length) |
| plastic T connector | United States Plastic Corp | #62065 | 3/8" x 3/8" x 3/8" Hose ID Black HDPE Tee |
| LED lights | Lighting EVER | 4100066-DW-F | 12V Flexible Waterproof LED Light Strip, LED Tape, Daylight White, Super Bright 300 Units 5050 LEDS, 16.4Ft 5 M Spool |
| Light backing | ePlastics | ACTLNAT0.125X12X36 | 0.125" x 12" x 36" Natural Acetal Sheet |
| Light diffuser films | inventables | 23114-01 | .007×8.5×11", matte two sides |
| cabinet and custom frame materials | various (Home Depot, etc.) | 3/4" fiber board (see protocol for dimensions of each structure) | |
| acoustic foam | Acoustic First | FireFlex Wedge Acoustical Foam (2" Thick) | |
| ventilation fans | Cooler Master (Amazon) | B002R9RBO0 | Rifle Bearing 80mm Silent Cooling Fan for Computer Cases and CPU Coolers |
| cabinet door hinges | Everbilt (Home Depot | #14609 | continuous steel hinge (1.4" x 48") |
| cabinet wheels | Everbilt (Home Depot | #49509 | Soft rubber swivel plate caster with 90 lb. load rating and side brake |
| cabinet door handle | Everbilt (Home Depot | #15094 | White light duty door pull (4.5") |
| computer | Hewlett Packard | Z620 | HP Z620 Desktop Workstation |
| Camera Link Frame Grabber | National Instruments | #781585-01 | PCIe-1473 Virtex-5 LX50 Camera Link – Full |
| Multifunction RIO Board | National Instruments | #781100-01 | PCIe-17841R |
| Analog RIO Board Cable | National Instruments | SCH68M-68F-RMIO | Multifunction Cable |
| Digital RIO Board Cable | National Instruments | #191667-01 | SHC68-68-RDIO Digital Cable for R Series |
| Analog Terminal Block | National Instruments | #782536-01 | SCB-68A Noise Rejecting, Shielded I/O Connector Block |
| Digital Terminal Block | National Instruments | #782536-01 | SCB-68A Noise Rejecting, Shielded I/O Connector Block |
| 24 position relay rack | Measurement Computing Corp. | SSR-RACK24 | Solid state relay backplane (Gordos/OPTO-22 type relays), 24-channel |
| DC switch | Measurement Computing Corp. | SSR-ODC-05 | Solid state relay module, single, DC switch, 3 to 60 VDC @ 3.5 A |
| DC Sense | Measurement Computing Corp. | SSR-IDC-05 | solid state relay module, single, DC sense, 3 to 32 VDC |
| DC Power Supply | BK Precision | 1671A | Triple-Output 30V, 5A Digital Display DC Power Supply |
| sugar pellets | Bio Serv | F0023 | Dustless Precision Pellets, 45 mg, Sucrose (Unflavored) |
| LabVIEW | National Instruments | LabVIEW 2014 SP1, 64 and 32-bit versions | 64-bit LabVIEW is required to access enough memory to stream videos, but FPGA coding must be performed in 32-bit LabVIEW |
| MATLAB | Mathworks | Matlab R2019a | box calibration and trajectory reconstruction software is written in Matlab and requires the Computer Vision toolbox |
References
- Chen, J., et al. An automated behavioral apparatus to combine parameterized reaching and grasping movements in 3D space. Journal of Neuroscience Methods. , (2018).
- Sacrey, L. A. R. A., Alaverdashvili, M., Whishaw, I. Q. Similar hand shaping in reaching-for-food (skilled reaching) in rats and humans provides evidence of homology in release, collection, and manipulation movements. Behavioural Brain Research. 204, 153-161 (2009).
- Whishaw, I. Q., Kolb, B. Decortication abolishes place but not cue learning in rats. Behavioural Brain Research. 11, 123-134 (1984).
- Klein, A., Dunnett, S. B. Analysis of Skilled Forelimb Movement in Rats: The Single Pellet Reaching Test and Staircase Test. Current Protocols in Neuroscience. 58, 8.28.1-8.28.15 (2012).
- Whishaw, I. Q., Pellis, S. M. The structure of skilled forelimb reaching in the rat: a proximally driven movement with a single distal rotatory component. Behavioural Brain Research. 41, 49-59 (1990).
- Zeiler, S. R., et al. Medial premotor cortex shows a reduction in inhibitory markers and mediates recovery in a mouse model of focal stroke. Stroke. 44, 483-489 (2013).
- Fenrich, K. K., et al. Improved single pellet grasping using automated ad libitum full-time training robot. Behavioural Brain Research. 281, 137-148 (2015).
- Azim, E., Jiang, J., Alstermark, B., Jessell, T. M. Skilled reaching relies on a V2a propriospinal internal copy circuit. Nature. , (2014).
- Guo, J. Z. Z., et al. Cortex commands the performance of skilled movement. Elife. 4, e10774 (2015).
- Nica, I., Deprez, M., Nuttin, B., Aerts, J. M. Automated Assessment of Endpoint and Kinematic Features of Skilled Reaching in Rats. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 11, 255 (2017).
- Wong, C. C., Ramanathan, D. S., Gulati, T., Won, S. J., Ganguly, K. An automated behavioral box to assess forelimb function in rats. Journal of Neuroscience Methods. 246, 30-37 (2015).
- Torres-Espín, A., Forero, J., Schmidt, E. K. A., Fouad, K., Fenrich, K. K. A motorized pellet dispenser to deliver high intensity training of the single pellet reaching and grasping task in rats. Behavioural Brain Research. 336, 67-76 (2018).
- Mathis, A., et al. DeepLabCut: markerless pose estimation of user-defined body parts with deep learning. Nature Neuroscience. 21, 1281-1289 (2018).
- Ellens, D. J., et al. An automated rat single pellet reaching system with high-speed video capture. Journal of Neuroscience Methods. 271, 119-127 (2016).
