Summary
Грызун квалифицированных достижения обычно используется для изучения ловких навыков, но требует значительного времени и усилий для реализации задачи и анализа поведения. Мы описываем автоматизированную версию квалифицированного достижения с отслеживанием движения и трехмерной реконструкцией траекторий охвата.
Abstract
Грызун квалифицированных достижения обычно используется для изучения ловких навыков, но требует значительного времени и усилий для реализации задачи и анализа поведения. Недавно было разработано несколько автоматизированных версий квалифицированного охвата. Здесь мы описываем версию, которая автоматически представляет гранулы крысам при записи видео высокой четкости с разных углов при высокой частоте кадров (300 кадров в секунду). Лапа и отдельные цифры отслеживаются с помощью DeepLabCut, алгоритма машинного обучения для оценки бесмаркерной позы. Эта система также может быть синхронизирована с физиологическими записями или использоваться для запуска физиологических вмешательств (например, электрической или оптической стимуляции).
Introduction
Люди сильно зависят от ловкого умения, определяемого как движения, требующие точно скоординированных многосовместных и цифровых движений. На эти навыки влияет целый ряд общих патологий центральной нервной системы, включая структурные поражения (например, инсульт, опухоль, демиелинизирующие поражения), нейродегенеративные заболевания (например, болезнь Паркинсона) и функциональные аномалии двигательных заболеваний схемы (например, дистония). Понимание того, как ловкие навыки изучаются и реализуются центральными автотранспортными схемами, поэтому имеет потенциал для улучшения качества жизни для большого населения. Кроме того, такое понимание, вероятно, улучшит двигательные показатели у здоровых людей за счет оптимизации стратегий обучения и реабилитации.
Вскрытие нейронных цепей, лежащих в основе ловких навыков в организме человека, ограничено технологическими и этическими соображениями, что требует использования моделей животных. Нечеловеческие приматы обычно используются для изучения ловких движений конечностей, учитывая сходство их двигательных систем и поведенческого репертуара с людьми1. Тем не менее, нечеловеческие приматы стоят дорого с длинным временем генерации, ограничивая количество испытуемых и генетических вмешательств. Кроме того, в то время как нейронаучный инструментарий, применимый к нечеловеческим приматам, больше, чем для людей, многие последние технологические достижения либо недоступны, либо значительно ограничены у приматов.
Родоводский охват является дополнительным подходом к изучению ловкого управления двигателем. Крысы и мыши могут быть обучены, чтобы достичь, понять, и получить сахарные гранулы в стереотипной последовательности движений гомологичным для человека достижения моделей2. Из-за их относительно короткого времени генерации и более низких расходов на жилье, а также их способности приобретать квалифицированных достижения в течение нескольких дней до нескольких недель, можно изучать большое количество предметов в течение обучения и навыков консолидации фаз. Использование грызунов, особенно мышей, также облегчает использование мощных современных нейронаучных инструментов (например, оптогенетика, изображения кальция, генетические модели болезни) для изучения ловких навыков.
Грызун квалифицированных достижения была использована в течение десятилетий для изучения нормального управления двигателем и как она зависит от конкретных патологий, как инсульт и болезнь Паркинсона3. Тем не менее, большинство версий этой задачи являются трудоемкими и трудоемкими, смягчая преимущества изучения грызунов. Типичные реализации включают размещение грызунов в камере достижения с полкой перед узким слотом, через который должен попасть грызун. Исследователь вручную помещает сахарные гранулы на полку, ждет, пока животное достигнет, а затем помещает еще один. Достижения забиваются как успехи или неудачи либо в режиме реального времени или видео-обзор4. Тем не менее, просто забил достигает, как успехи или неудачи игнорирует богатые кинематические данные, которые могут обеспечить понимание того, как (в отличие от просто ли) достижения нарушается. Эта проблема была решена путем осуществления подробного обзора достижения видео для выявления и полуколичественно оценка достичь submovements5. Хотя это добавило некоторые данные относительно достичь кинематики, это также значительно увеличило время и усилия экспериментаторов. Кроме того, высокий уровень вовлеченности экспериментаторов может привести к несоответствиям в методологии и анализе данных, даже в рамках одной лаборатории.
В последнее время было разработано несколько автоматизированных версий квалифицированного охвата. Некоторые прикрепляютсяк домашней клетке 6,7,устраняя необходимость переноса животных. Это как снижает нагрузку на животных и устраняет необходимость акклиматизации их в специализированной камере достижения. Другие версии позволяют отслеживать лапы, так чтокинематические изменения при конкретных вмешательствах могут быть изучены 8,9,10,или иметь механизмы, чтобы автоматически определить, если гранулы были сбиты с полки11. Автоматизированные квалифицированные задачи достижения особенно полезны для высокоинтенсивных тренировок, так как может потребоваться для реабилитации после травмы12. Автоматизированные системы позволяют животным выполнять большое количество достигает в течение длительных периодов времени, не требуя интенсивного участия исследователя. Кроме того, системы, позволяющие отслеживать лапы и автоматизированный подсчет результатов, сокращают время, затрачиваемые исследователем на проведение анализа данных.
Мы разработали автоматизированную систему квалифицированного охвата крыс с несколькими специализированными функциями. Во-первых, с помощью подвижного пьедестала довести гранулы в "достижение позиции" снизу, мы получаем почти беспрепятственный вид передних конечностей. Во-вторых, система зеркал позволяет несколько одновременных видов досягаемости с одной камерой, что позволяет трехмерной (3-D) реконструкции траекторий досягаемости с помощью высокой скорости (300 кадров в секунду) камеры. С недавней разработкой надежных алгоритмов машинного обучения для отслеживания маркеровдвижения 13, мы теперь отслеживаем не только лапу, но и отдельные костяшки пальцев, чтобы извлечь подробный охват и понять кинематику. В-третьих, захват кадра, выполняющий простую обработку видео, позволяет в режиме реального времени идентифицировать различные фазы достижения. Эта информация используется для запуска видео приобретения (непрерывное приобретение видео не практично из-за размера файла), а также может быть использован для запуска вмешательства (например, оптогенетика) в точные моменты. Наконец, отдельные видеокадры запускаются импульсами транзисторно-транзисторной логики (TTL), что позволяет точно синхронизировать видео с нейронными записями (например, электрофизиологией или фотометрией). Здесь мы описываем, как построить эту систему, обучить крыс выполнять задачу, синхронизировать аппарат с внешними системами и реконструировать трехмерные траектории охвата.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все методы, связанные с использованием животных, описанные здесь, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC) Мичиганского университета.
1. Настройка камеры достижения
ПРИМЕЧАНИЕ: Подробности и диаграммы аппарата можно узнать над лентой и диаграммами аппарата. Номера частей относятся к рисунку 1.
- Скрепление прозрачных поликарбонатных панелей с акриловым цементом для построения камеры достижения (15 см в ширину и 40 см в длину и 40 см в высоту) (часть #1). Одна боковая панель (часть #2) имеет навесную дверь (18 см в ширину и 15 см в высоту) с замком. Если крыса будет привязана к кабелю, вырежьте щель (5 см в ширину и 36 см в длину) в камерный потолок, чтобы вместить ее (часть #12). Панель пола имеет 18 отверстий (1.75 cm диаметр) (часть #13) отрезанная в ее и не скреплена к остальноям камеры.
- Монтировать и выравнивать инфракрасные датчики (часть #3) в боковых панелях на 4,5 см от задней части камеры и 3,8 см от пола. Поведенческое программное обеспечение имеет индикатор ('IR Back'), который является зеленым, когда инфракрасный луч непрерывный и красный, когда луч сломан. После настройки программного обеспечения это может быть использовано для проверки выравнивания датчиков.
- Установите зеркало (15 см х 5 см, часть #4) на 10 см выше протягивающего слота (часть #14). Угол зеркало так гранулы доставки стержень виден на камеру.
- Поместите камеру на санируемую опорную коробку (59 см в ширину и 67,3 см в длину и 30,5 см в высоту, часть #5). Камера лежит над отверстием в опорной коробке (12 см в ширину и 25 см в длину), что позволяет мусору падать через отверстия пола (часть #13) и из камеры достижения. Вырежьте второе отверстие (7 см в ширину и 6 см в длину, часть #15) в опорную коробку перед слотом для достижения, что позволяет стержню доставки гранул довести гранулы в достижение слота.
- Установите два зеркала (8,5 см в ширину х 18,5 см в высоту, часть #6) к полу с магнитами по обе стороны камеры, так что длинный край зеркала касается боковой панели 3 см от передней части коробки достижения. Угол зеркала так, что камера может видеть в поле и области перед достижением слот, где гранулы будут доставлены.
- Установите камеру высокой четкости (часть #7) 17 см от слота для достижения, обращенной к коробке.
- Установите черную бумагу (часть #18) по обе стороны от камеры, так что фон в боковых зеркалах темный. Это усиливает контраст для улучшения в режиме реального времени и в автономном режиме обнаружения лап.
- Смонтировать линейный актуатор (часть #16) на дезинфицирующую раму (25 см в ширину и 55 см в длину и 24 см в высоту, часть #8) винтами. Актуатор устанавливается вверх ногами, чтобы предотвратить накопление гранул ы внутри его позиционно-чувствеонного потенцомера.
- Вставьте пену O-кольцо в шею резервуара гранул (фуннел) (часть #9), чтобы предотвратить накопление пыли в сборке. Установите воронку ниже отверстия (диаметром 6 см, часть #17) в верхней части рамы, смещая края воронки над тремя винтами, просверленными в нижней части верха рамы. Вставьте направляющий трубку (часть #10) в шею воронки.
- Прикрепите пластиковый разъем T к концу стального стержня упорного. Вставьте конические конце гранулы доставки стержня в верхней части разъема и cupped конца через направляющей трубки в резервуар гранул.
- Поместите линейную сборку актуатора под квалифицированную камеру достижения, так что стержень доставки гранул может распространяться через отверстие (часть #15) перед достижением слота.
- Поместите весь достигающий аппарат в колесный шкаф (121 см х 119 см х 50 см) вентилируемые с компьютерными вентиляторами (интерьер нагревается при хорошо освещенном) и облицован акустической пеной.
- Постройте пять световых панелей (часть #11) путем прикрепивания светодиодных световых полос окнестей на 20,3 см на 25,4 см вспомогательных панелей. Гора диффузора пленки над световой полосы. Установите одну световую панель на потолок над областью стержня доставки гранул. Установите остальные четыре по бокам шкафов вдоль идущей камеры.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы осветить область вокруг достижения слот и гранулы доставки стержня для идентификации лапы в режиме реального времени.
2. Настройка компьютера и оборудования
- Установите FPGA рамку grabber и цифровые карты расширения в инструкции производителя (см. таблицу материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем не менее 16 ГБ оперативной памяти и внутренний твердотельный жесткий диск для хранения данных, так как потоковая передача высокоскоростного видео требует значительной буферизации. - Установите драйверы для камеры высокой четкости и подключите ее к framegrabber FPGA. Поведенческое программное обеспечение должно работать и пересекаться с камерой, чтобы использовать программное обеспечение, связанное с камерой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Включенный код (см. дополнительные файлы) получает доступ к программируемым регистрам в камере и может быть несовместим с другими брендами. Мы рекомендуем записывать не менее 300 кадров в секунду (fps); на 150 кадров в секунду мы обнаружили, что ключевые изменения в позе лапы часто пропустили. - Копируйте включенный код (проект) в "SR Automation-dig-ext-card-64bit" на компьютер.
3. Поведенческая подготовка
- Подготовьте крыс перед тренировкой.
- Дом Лонг-Эванс крыс (мужчины или женщины, в возрасте 10-20 недель) в группах 2-3 в клетку на обратном свет / темный цикл. За три дня до тренировки, место крыс на ограничение пищи для поддержания массы тела 10-20% ниже базового уровня.
- Обработка крыс в течение нескольких минут в день, по крайней мере 5 дней. После обработки, место 4-5 гранул сахара на крысу в каждой домашней клетке, чтобы ввести новую пищу.
- Привычка крысы к камере достижения (1-3 дней)
- Включите светодиодные фонари и поместите 3 сахарных гранулы в передней и задней части камеры.
- Поместите крысу в камеру и позвольте крысе исследовать в течение 15 мин. Монитор, если она ест гранулы. Повторите эту фазу, пока крыса ест все гранулы от пола.
- Очистите камеру этанолом между крысами.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните обучение и тестирование во время темной фазы. Поезд крыс в то же время ежедневно.
- Поезд крысы достичь и соблюдать лапы предпочтения (1-3 дней).
- Включите свет и поместите крысу в квалифицированную камеру достижения.
- Используя щипцы, держите гранулы через достижение слот в передней части коробки(Рисунок 1, Рисунок 2). Разрешить крысе съесть 3 гранулы из щипц.
- В следующий раз, когда крыса попытается съесть гранулы из щипц, потяните гранулы обратно. В конце концов, крыса будет пытаться достичь для гранул с лапой.
- Повторите это 11 раз. Лапа, что крыса использует большинство из 11 попыток крысы "лаппредпочтение".
ПРИМЕЧАНИЕ: Попытка определяется как лапа, протягивающаяся мимо идущего слота. Крысе не нужно успешно получать и есть гранулы.
- Поезд крысы, чтобы добраться до гранул ыродка (1-3 дней)
- Выровняйте стержень доставки гранул со стороной достижения слот аталоратеральной к предпочтительной лапе крысы (использовать руководство для обеспечения последовательного размещения 1,5 см от передней части камеры достижения). Верхняя часть стержня доставки должна выровняться с нижней частью слота(рисунок 2B). Поместите гранулы на штангу доставки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Позиционирование доставки стержня напротив крысы предпочтительным лапу делает его трудным для крысы, чтобы получить гранулы с его непредпочтительным лапой. У нас не было проблем с крысами, используя их непредпочтительную лапу. Тем не менее, в некоторых моделях (например, инсульт) это все еще может произойти, и ограничение на непредпочтительные достижения конечности могут быть добавлены. - Приманка крыса с гранулами провел с помощью щипцы, но направить крысу к доставке стержня так, что его лапа хитов гранулы на стержня. Если крыса сбивает гранулы с стержня, замените его. Некоторые крысы не могут первоначально выйти достаточно далеко. В этом случае, переместить гранулы доставки стержня ближе к достижению слот, а затем медленно переместить его дальше, как крыса улучшается.
- Примерно через 5-15 наживкой достигает крыса начнет тянуться к гранулы на доставку стержня спонтанно. После того, как крыса попыталась 10 достигает доставки стержня без приманки, он может перейти к следующему этапу.
- Выровняйте стержень доставки гранул со стороной достижения слот аталоратеральной к предпочтительной лапе крысы (использовать руководство для обеспечения последовательного размещения 1,5 см от передней части камеры достижения). Верхняя часть стержня доставки должна выровняться с нижней частью слота(рисунок 2B). Поместите гранулы на штангу доставки.
- Поезд крысы просить гранулы (2-8 дней).
ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя у нас было 100% успеха подготовки крыс для достижения гранулы, около 10% крыс не в состоянии научиться просить гранулы, перемещаясь в задней части камеры.- Позиция гранул доставки стержня на основе лапы крысы предпочтения и установить его на позицию 2 (Рисунок2A). Установите высотные позиции стержня доставки гранул с помощью пульта дистанционного управления. Удерживая кнопки 1 и 2 одновременно перемещает стержень доставки вверх, удерживая при этом кнопки 3 и 2 перемещает стержень доставки вниз. Когда родосна доставки находится на правильной высоте, удерживайте нужное число до тех пор, пока свет не мигает красным цветом.
- Поместите крысу в камеру и приманки крысы к спине с гранулами. Когда крыса движется достаточно далеко к задней части камеры, что она будет нарушать инфракрасный луч, если автоматизированная версия работает, переместить гранулы доставки стержня на позицию 3 (Рисунок 2B).
- Подождите, пока крыса, чтобы достичь для гранул, а затем переместить гранулы доставки стержня обратно в положение 2 (Рисунок2A). Поместите новый гранулы на стержень доставки, если он был сбит.
- Повторите эти шаги, постепенно травля крысы все меньше и меньше, пока крыса начинает: (i) двигаться к спине, чтобы просить гранулы без приманки, и (ii) сразу же перейти на фронт после запроса гранулы в спину. После того, как крыса сделала это 10 раз, она готова к обучению на автоматизированной задачи.
4. Обучение крыс с использованием автоматизированной системы
- Настройка автоматизированной системы.
- Включите свет в камере и пополнить резервуар гранул ы, если это необходимо.
- Позиция гранул доставки стержня в соответствии с лапой крысы предпочтения. Убедитесь, что позиции актуатора установлены правильно (как на рисунке 2A).
- Включите компьютер и откройте программу «Квалифицированная охвата» (SR'dig-extension-card)(HOST)-3.vi). Введите идентификационный номер крысы в соответствии с темой и выберите предпочтение лапы из меню выпадения руки. Укажите путь сохранения для видео.
- Установите время сеанса и видео Макса (количество видео, на котором можно закончить сеанс). Программа перестанет работать на крайнем уровне, который будет достигнут в первую очередь.
- Установите Pellet Lift Duration (длительность времени, что родосвод остается в положении "3" после того, как крыса просит гранулы). Включить или отключить штраф раннего достижения (доставка стержня сбрасывает на положение "1", а затем обратно в "2", если крыса достигает до запроса гранулы).
- Возьмите калибровочные изображения. Реконструкция трех-D траектории использует набор инструментов компьютерного зрения для определения соответствующих матриц преобразования, что требует определения соответствующих точек в каждом представлении. Для этого используйте небольшой кубик с шаблонами шашкой с каждой стороны(рисунок 3).
- Поместите руку помощи внутри камеры достижения и ткнуть клип аллигатора через достижение слот. Держите куб перед слотом достижения с клипом аллигатора.
- Расположите куб так, чтобы красная сторона появилась в верхнем зеркале, зеленая сторона в левом зеркале и синяя сторона в правом зеркале. Вся грань каждой из трех сторон должна быть видна в зеркалах(рисунок3).
- В поведенческой программе убедитесь, что порог рентабельности инвестиций установлен на очень большое значение (например, 60000). Нажмите кнопку "Бег" (белая стрелка). Как только кнопка инициализированной камеры становится зеленой, нажмите СНВ. Обратите внимание, что видео приобретается.
- Нажмите Calрежиме . Затем, возьмите изображение, нажав Take Cal Image. Путь каталога изображений теперь будет отображаться под ".png путь" с .png файловое имя под форматируется как "GridCalibration-YYYMMDD'img.png".
- Переместите куб немного, и возьмите другое изображение. Повторите еще раз в общей сложности 3 изображения.
- Остановите программу, нажав STOP, а затем кнопку стоп-знака. Снимите руку помощи и куб из коробки.
- Будьте осторожны, чтобы не ударить что-нибудь в поведенческой камере после калибровки изображения были приняты в тот день. Если что-то движется, необходимо сделать новые калибровочные изображения.
- Запустите автоматизированную систему.
ПРИМЕЧАНИЕ: Определите настройки "RoI Threshold" (описанные ниже) для каждого зеркала перед запуском крыс для фактического приобретения данных. После того, как эти параметры были определены, заранее установить их перед началом программы и настроить во время приобретения, если это необходимо.- Поместите крысу в квалифицированную камеру достижения. Нажмите на белую стрелку, чтобы запустить программу.
- Перед нажатием на СНВ, установите положение рентабельности инвестиций для обнаружения лап путем регулировки x-Offset (x-координация верхнего левого угла прямоугольника ROI), y-Offset (y-координатор верхнего левого угла ROI), ROI Ширина и ROI Высота.
- Позиция рентабельности инвестиций в боковое зеркало, которое показывает стропту лапы, прямо перед слотом достижения(рисунок 2C). Убедитесь, что стержень доставки гранул не входит в рентабельность инвестиций и что рентабельность инвестиций не распространяется в поле, чтобы предотвратить гранулы или мех крысы от запуска видео, когда крыса не достигает.
- Нажмите НА START, чтобы начать программу.
- Отрегулируйте значение "Низкий порог рентабельности инвестиций" до тех пор, пока "Значение триггера live ROI" не колеблется между "0" и "1" (когда крыса не достигает). Это значение — количество пикселей в пределах рентабельности инвестиций со значениями интенсивности в пороговом диапазоне.
- Установите порог рентабельности инвестиций. Обратите внимание на Live ROI Триггер Значение, когда крыса тычет носом в рентабельность инвестиций и когда крыса тянется к гранулы. Установите порог рентабельности инвестиций, чтобы быть значительно больше, чем "Live ROI Триггер Значение" во время носа тыкает и ниже, чем "Live ROI Триггер Значение", когда крыса достигает. Отрегулируйте до тех пор, пока видео постоянно срабатывает, когда крыса достигает, но не тогда, когда она тычет носом через слот
ПРИМЕЧАНИЕ: Это предполагает, что лапа светлее, чем нос; корректировки будут отменены, если лапа темнее носа. - Мониторинг первых нескольких испытаний, чтобы убедиться, что все работает правильно. Когда крыса достигает, прежде чем запрашивать гранулы (род доставки в положении "2"), "Ранние достижения" число увеличивается. Когда крыса достигает после запроса гранулы (род доставки в положении "3"), число "Видео" увеличивается, и видео сохраняется в виде файла .bin с именем "RXXXX-YYYMMDD"HH-MM-SS'trial".
ПРИМЕЧАНИЕ: По умолчанию для видео, чтобы содержать 300 кадров (т.е., 1 с) до и 1000 кадров после триггера события (это настраивается в программном обеспечении), который достаточно долго, чтобы содержать весь охват к захвату движения, включая опровержение лапы. - После достижения времени сеанса или максимального видео программа останавливается. Нажмите кнопку знака стоп.
- Очистите камеру с этанолом и повторить с другой крысы, или, если сделать в течение дня приступить к преобразованию видео.
- Преобразование файлов .bin в файлы .avi.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сжатие видео во время приобретения вызывает падение кадров, поэтому двоичные файлы передаются на диск во время приобретения (использовать твердотельный диск из-за высоких скоростей передачи данных). Эти двоичные файлы должны быть сжаты в автономном режиме или требования к хранению непомерно велики.- Откройте программу "bin2avi-color"1473R-nocode.vi.
- В "File Path Control" нажмите кнопку папки, чтобы выбрать сеанс (например, R0235-20180119a), который вы хотите преобразовать. Повторите для каждого сеанса (до шести).
- Нажмите на белую стрелку (запуск), а затем "START", чтобы начать. Мониторинг видеосжатия можно в "Общий прогресс (%) Бар. Пусть программа работает в одночасье.
- Перед тем, как начать обучение животных на следующий день, убедитесь, что видео были преобразованы и удалить файлы .bin так что есть достаточно места для приобретения новых видео.
5. Анализ видео с DeepLabCut
ПРИМЕЧАНИЕ: Различные сети обучены для каждого лапового предпочтения (правая лапа и левая лапа) и для каждого вида (прямой вид и левое зеркало зрения для правых лапкрыс, прямой вид и правое зеркало зрения для левой лапы крыс). Вид верхнего зеркала не используется для 3D-реконструкции – просто для того, чтобы обнаружить, когда нос входит в слот, что может быть полезно для запуска вмешательств (например, оптогенетики). Каждая сеть затем используется для анализа набора видео обрезается для соответствующей лапы и просмотра.
- Обучите сети DeepLabCut (подробные инструкции приведены в документации DeepLabCut по https://github.com/AlexEMG/DeepLabCut).
- Создайте и назначьте новый проект в DeepLabCut, алгоритм машинного обучения для оценки бесмаркерной позы13.
- Используйте программу для извлечения кадров из квалифицированных видеозаписей и изображений сельскохозяйственных культур, чтобы включить (прямое или зеркальное представление) в интерфейс программы. Урожай кадры достаточно большой, так что крыса и обе передние лапы видны.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сети обычно требуют 100-150 тренировочных кадров. Дополнительные учебные рамы необходимы, когда лапа внутри по сравнению с внешней камерой из-за освещения. Более жесткое обрезка сокращает время обработки, но будьте осторожны, что обрезанные регионы достаточно велики, чтобы обнаружить полную траекторию лапы для каждой крысы. Она должна быть достаточно широкой, чтобы все тело крысы вписывалось в раму (прямой вид), и чтобы увидеть как можно больше назад в камеру и перед дочкой доставки (зеркальный вид). - Используйте графический интерфейс программы для обозначения частей тела. Этикетка 16 точек в каждом кадре: 4 метакарпофаланга (MCP) суставов, 4 проксимальных межфаланговых (PIP) суставов, 4 цифры советы, dorsum достижения лапы, нос, сница неохватывая лапа, и гранулы (Рисунок 4).
- Следуйте инструкциям DeepLabCut (сокращенно DLC отныне) для создания набора обучаемых данных, обучения сети и оценки подготовленной сети.
- Проанализируйте видео и уточните сеть.
- Прежде чем анализировать все видео с помощью недавно обученной сети, проанализируйте 10 видео, чтобы оценить производительность сети. При наличии последовательных ошибок в определенных позах извлекайте дополнительные тренировочные кадры, содержащие эти позы, и переучивайте сеть.
- При анализе видео, убедитесь, что вывод .csv файлы, которые будут подаваться в код для 3D реконструкции траектории.
6. Калибровка коробки
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти инструкции используются для определения матриц преобразования для преобразования точек, определенных в прямых и зеркальных представлениях, в трех-D координаты. Для самой актуальной версии и более подробной информации о том, как использовать пакет boxCalibration, с https://github.com/LeventhalLab/boxCalibrationм.
- Соберите все калибровочные изображения в одной папке.
- Используя ImageJ/Fiji, вручную отметьте точки пропуска для каждого калибровообразуемого изображения. Сохраните это изображение под словам "GridCalibration"YYYMMD".tif", где 'YYYMMDD' является датой, которой соответствует калибровочное изображение, и '' - это номер изображения для этой даты.
- Используйте функцию измерения в ImageJ (в панели инструментов, выберите Анализ Мера). На этом будет отображаться таблица, содержащая координаты для всех отмеченных точек. Сохраните этот файл с именем "GridCalibration-YYYMMDD.csv", где дата и номер изображения совпадают с соответствующим файлом .tif.
- Из пакета калибровки коробки откройте файл 'setParams.m'. Этот файл содержит все необходимые переменные и их описание. Отожобье переменных по мере необходимости, чтобы соответствовать спецификациям проекта.
- Выполнить функцию калибровкиКоробки. В окне команды появится несколько запросов. Первый запрос спрашивает, следует ли анализировать все изображения в папке. Ввод Y закончится подсказки, и все изображения для всех дат будут проанализированы. Ввод N подскажет пользователю ввести даты для анализа.
ПРИМЕЧАНИЕ: В папке калибровочных изображений будут созданы два новых каталога: 'markedImages' содержит файлы .png с определенными знаками контрольной панели на изображении калибровки. Папка «Box Calibration» содержит файлы .mat с параметрами калибровки коробки. - Запустите функцию checkBoxКалибра. Это создаст новую папку ,проверить калибровку' в папке 'boxCalibration'. Каждая дата будет иметь субфолдер, содержащий изображения и несколько файлов .fig, которые используются для проверки того, что калибровка коробки была завершена точно.
7. Реконструкция 3D траекторий
- Соберите файлы .csv, содержащие выход учебной программы, в структуру каталога, описанную в сценарии reconstruct3Dtrajectories.
- Выполнить реконструкцию3Dtrajectories. Этот скрипт будет искать структуру каталога и сопоставлять прямые/зеркальные точки на основе их имен в наклонной программе (важно использовать одни и те же имена частей тела в обоих представлениях).
- Выполнить расчетКинематики. Этот скрипт извлекает простые кинематические элементы из трех-D реконструкций траектории, которые могут быть адаптированы к конкретным потребностям.
ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение оценивает положение окклюзионных частей тела на основе их соседей и их расположение в комплементарном представлении (например, расположение части тела в прямом представлении камеры ограничивает его возможные расположения в зеркальном представлении). В те моменты, когда лапа закрывается в зеркальном представлении, проходя через слот, координаты лап интерполируются на основе соседних кадров.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Крысы приобретают квалифицированную задачу достижения быстро после акклиматизации к аппарату, с производительностью плато с точки зрения как количество достигает и точность в течение 1-2 недель (Рисунок 5). На рисунке 6 показаны примеры видеокадров, указывающих на структуры, идентифицированные DeepLabCut, а на рисунке 7 показаны наложенные индивидуальные траектории достижения из одного сеанса. Наконец, на рисунке 8мы иллюстрируем, что произойдет, если триггер обнаружения лап (шаги 4.3.4-4.6)) не будет точно установлен. Существует значительная изменчивость в кадре, при котором лапа пробивает проем. Это не является серьезной проблемой с точки зрения анализа достичь кинематики. Тем не менее, это может привести к изменчивости, когда вмешательства (например, оптогенетика) срабатывают во время достижения движений.
Рисунок 1: Квалифицированная камера достижения.
По часовой стрелке сверху слева вид сбоку, вид спереди и выше, рама, в которой установлен актатор (см. шаг 1.8), и вид сбоку и выше. Умелая камера достижения (1) имеет дверь (2) разрезать на одну сторону, чтобы крысы должны быть помещены в и вывезены из камеры. Разрез разрезается на потолочной панели (12), чтобы животное было привязано и отверстия вырезать в панели пола (13), чтобы мусор провалиться. Два инфракрасных датчика (3) выровнены по обе стороны от задней части камеры. Зеркало (4) устанавливается над идущим слотом (14) в передней части камеры достижения, а два других зеркала (6) установлены по обе стороны от камеры достижения. Квалифицированная камера достижения сидит на вершине опорной коробки (5). Камера высокой четкости (7) установлена на опорном ящике перед слотом для достижения. Два куска черной бумаги (18) установлены по обе стороны от камеры (7) для повышения контрастности лапы в боковых зеркалах (6). Ниже опорной коробки находится рамка (8), которая поддерживает линейный актуатор (16) и резервуар гранул (9). Направляющая трубка, обусловливающая стержень гранул (10), помещается в резервуар гранул и контролируется линейным актуатором. Отверстия разрезаются в раму для актуатора (17) и опорную коробку (15) над резервуаром гранул, чтобы стержень доставки гранул свободно двигался вверх и вниз. Коробка освещается световыми панелями (11), установленными на стенах и потолке шкафа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Единая пробная структура.
(A) Испытание начинается с стержня доставки гранул (контролируется линейным актуатором), расположенным в "готовом" положении (позиция 2 - на полпути между полом и нижней части идущего слота). (B) Крыса движется к задней части камеры, чтобы сломать инфракрасный (ИК) луч, который вызывает гранулы доставки стержня подняться до позиции 3 (выровнены с нижней части достижения слот). (C) Крыса достигает через достижение слот, чтобы захватить гранулы. Достижения обнаруживаются в режиме реального времени с помощью framegrabber FPGA, который обнаруживает изменения интенсивности пикселей в пределах интересуемых регионов (ROI) в представлении бокового зеркала прямо перед слотом. Когда достаточное количество пикселей соответствует пользователь указано "лап интенсивности", видео приобретение срабатывает. (D) Две секунды спустя гранулы опускается до позиции 1, собирание нового гранулы из резервуара гранул перед сбросом на позицию 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Образец калибровки изображения.
Рука помощи помещается внутри квалифицированной камеры достижения. Клип аллигатора тычет через достижение слот провести калибровки куба на месте за пределами охвата камеры. Три шаблона шашкой полностью видны в прямом представлении и соответствующих зеркальных видах (зеленый: левый; красный: верхний; и синий: справа). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Позиции маркера алгоритма обучения.
Левая колонка: прямое представление; правая колонка: зеркальный вид. Маркеры 1-4: суставы MCP; 5-8: PIP суставы; 9-12: цифры советы; 13: нисум достижения лапы; 14: нос; 15: нисум недостигающей лапы. Маркер 16 (пеллет) не виден. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Крысы быстро приобретают автоматизированную квалифицированную задачу достижения.
Средний показатель успеха первого достижения (зеленая, левая ось) и средняя общая сумма испытаний (синяя, правая ось) в течение первых 20 учебных занятий в автоматизированной квалифицированной задаче достижения (n No 19). Каждая тренировка длилась 30 мин. Ошибки баров представляют собой стандартную ошибку среднего. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6: Пример видеокадров, отмеченных учебной программой.
Левая колонка: зеркальный вид; правая колонка: прямое представление. Куиные, красные, желтые и зеленые точки отмечают цифры 1-4 соответственно. Белая точка отмечает нос, черная точка отмечает гранулы. Заполненные круги были идентифицированы DeepLabCut. Открытые круги отмечают положение объектов, оцениваемое по месту, где этот объект оказался в противоположном представлении. X's являются точки перепроектируется на видео кадры из оценок их 3-D местах. Это видео было срабатывает в кадре 300, как лапа прошла через слот. Верхние изображения с первого кадра, когда достижение лапы был обнаружен. Нижние изображения из кадра, на котором была максимально расширена вторая цифра. Эти кадры были идентифицированы программным обеспечением обработки изображений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 7: Пример 3-D траекторий из одного тестового сеанса.
Обе оси показывают одни и те же данные, но вращаются для удобства представления. Черные линии указывают на средние траектории. Cyan, красный, желтый и зеленый являются отдельными траекториями кончиков цифр 1-4, соответственно. Синие линии указывают на траекторию лапы dorsum. Большая черная точка указывает на сахарные гранулы, расположенные на уровне (0,0,0). Это представляет собой только первоначальное продвижение лапы для простоты представления (в том числе опровержения и несколько достигает делает фигуру почти неистолковано). Однако все кинематические данные доступны для анализа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 8: Гистограммы номеров кадров, в которых были определены конкретные этапы достижения для 2 различных сеансов.
В одном сеансе (темные твердые линии) значения триггера ROI были тщательно установлены, и была идентифицирована лапа, нарушающая слот в пределах одних и тех же нескольких кадров в каждом испытании. В другой сессии (легкие линии пунктирных), нос часто ошибочно идентифицировали как достигающую лапу, вызывая видео приобретение преждевременно. Обратите внимание, что это не окажет большого влияния на автономный кинематический анализ, если не будет получен полный охват. Тем не менее, потенциальные вмешательства, вызванные достижением лапы будет плохо приурочен. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Родоводство опытное достижение стало стандартным инструментом для изучения физиологии двигательной системы и патофизиологии. Мы описали, как реализовать автоматизированную крысу квалифицированных достижения задача, которая позволяет: обучение и тестирование с минимальным наблюдением, 3-D лапы и цифры реконструкции (во время достижения, захвата, и лапы опрокидывания), в режиме реального времени идентификации лапа во время достижения, и синхронизации с внешней электроникой. Он хорошо подходит для корреляции кинематики передних конечностей с физиологией или для выполнения точно-времени вмешательства во время достижения движений.
Так как мы первоначально сообщили эту конструкцию14, наша эффективность обучения улучшилась так, что почти 100% крыс приобрести задачу. Мы определили несколько важных факторов, которые приводят к последовательноуспешной подготовке. Как и многие задачи, мотивированные голодом, крысы должны быть тщательно проверены во время ограничения калорий для поддержания 80-90% от их ожидаемой массы тела. Обработка крыс ежедневно, даже до обучения, имеет решающее значение для акклиматизации их к людям. Крысы должны быть обучены, чтобы достичь, прежде чем научиться возвращаться в задней части камеры просить гранулы-это значительно сокращает время обучения и повышает вероятность того, что крысы приобрести задачу. Наконец, при передаче между, казалось бы, идентичные камеры, крысы часто выполняют меньше достигает. Это было особенно верно, когда камеры были использованы в первый раз. Мы полагаем, что это связано с различиями в запахе между камерами. Независимо от причины, важно поддерживать как стабильные учебные среды, как это возможно, или акклиматизировать крыс во всех коробках, в которых тестирование может произойти.
Описанный здесь аппарат легко адаптируется к конкретным потребностям. Мы описали крысиную версию задачи, но также реализовали версию мыши (хотя трудно определить отдельные цифры с DeepLabCut у мышей). Поскольку отдельные видеокадры отмечены импульсами TTL, видео можно синхронизировать с любой системой записи, которая принимает цифровые или аналоговые входы (например, усилители электрофизиологии или фотометрия). Наконец, головы фиксированной мышей легко выполнять квалифицированные достижения9, и голова фиксированной версии этой задачи могут быть реализованы для 2-фотона изображений или juxtacellular записей. Важно отметить, что мы использовали эту систему только с Long-Evans крыс, чей нос и лапы меха (черный и белый, соответственно) отличаются достаточно по цвету, что нос тыкает не принимают за достигает (с соответствующими настройками рентабельности инвестиций, Рисунок 8). Это может быть проблемой для крыс с аналогичной окраской на лапах и носах (например, крысы-альбиносы), но может быть решена путем окраски лапы с чернилами, лак для ногтей, или татуировки.
Представленная версия квалифицированного охвата имеет несколько отличительных особенностей, которые могут быть выгодными в зависимости от конкретного приложения. Относительно сложное оборудование и потребность в обработке видео врежиме реального времени делают его плохо подходящим для домашней подготовки клетки 6,7. С другой стороны, домашняя тренировка клетки делает его трудным приобрести высокоскоростное видео высокого разрешения от множественных углов, или привязывать животных для физиологических записей/интервенций. Карты для сбора данных и требование к одному компьютеру на камеру делают каждую камеру относительно дорогой, а видео требует значительного цифрового пространства для хранения данных (200 МБ на 4 с видео). Мы внедрили более простую версию на основе микроконтроллера стоимостью около $300 за камеру, хотя в ней нет обратной связи в режиме реального времени или возможности синхронизации с внешними устройствами. Эти коробки по существу идентичны описанным здесь, но используют коммерческий видеокамера и не требуют компьютера, кроме как запрограммировать микроконтроллер (детали этой настройки и связанного с ним программного обеспечения доступны по запросу). Особенно полезна обработка видео в режиме реального времени на кадровом захвате FPGA; мы находим, что он более надежно определяет достигает в режиме реального времени, чем инфракрасные лучи или датчики близости (которые могут ошибочно морда крысы для достижения лапы). Кроме того, несколько триггеров могут быть использованы для идентификации лапы на различных стадиях достижения (например, подход к слоту, подтяжка лап, расширение через слот). Это не только позволяет воспроизводимые, точно-приурочен нейронных возмущений, но может быть использован для запуска хранения коротких высокоскоростных видео.
Хотя наша автоматизированная версия квалифицированного достижения имеет несколько преимуществ для конкретных приложений, она также имеет некоторые ограничения. Как отмечалось выше, высокоскоростная камера с высоким разрешением является умеренно дорогой, но необходимо включить зеркальные и прямые виды в одном изображении и захватить очень быстрое движение. Использование одной камеры устраняет необходимость синхронизации и записи нескольких видеопотоков одновременно, или покупки нескольких камер и захватов кадров. Лапа в отраженном представлении фактически примерно в два раза дальше от камеры (по лучевой трассировке), чем в прямом представлении. Это означает, что одно из представлений всегда не в фокусе, хотя DLC по-прежнему надежно определяет отдельные цифры в обоих представлениях(рисунок 4, рисунок 6). Наконец, мы использовали цветную камеру, потому что, до наличия DLC, мы пытались цвет кодирования цифр с татуировками. Хотя вполне возможно, что эта учебная программа будет одинаково эффективной на черно-белом (или более низком разрешении) видео, мы можем только проверить эффективность оборудования, описанного здесь. Наконец, наш аналитический код (кроме DLC) написан в основном в коммерческом пакете программного обеспечения (см. Таблицаматериалов), но при необходимости должен быть простым в адаптации к языкам программирования с открытым исходным кодом (например, Python).
Есть несколько способов, с помощью которых мы работаем над улучшением этой системы. В настоящее время зеркальный вид частично окклюзионный передней панелью. Поэтому мы изучаем способы получения нескольких одновременных представлений о лапе, снижая при этом препятствия. Другим важным событием будет автоматически оценка достигает (система может отслеживать кинематики, но человек должен еще оценка успешной по сравнению с неудачными достигает). Методы были разработаны, чтобы определить, были ли гранулы были сбиты с полки / пьедестала, но не может определить, был ли гранулы были захвачены или пропустили полностью11. Отслеживая гранулы с помощью DLC, мы исследуем алгоритмы, чтобы определить количество достигает в ходе судебного разбирательства, а также ли гранулы были схвачены, сбил и не с пиломер, или пропустили полностью. В этом направлении мы также работаем над тем, чтобы полностью автоматизировать рабочий процесс от сбора данных с помощью преобразования видео, обработки DLC и автоматического подсчета очков. В конечном счете, мы представляем себе систему, в которой несколько экспериментов могут быть запущены в один день, и на следующее утро полное время года кинематики и достижения баллов за каждый эксперимент были определены.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Карунеша Гангули и его лабораторию за советы по квалифицированной задаче достижения, и Александра и Маккензи Матис за их помощь в адаптации DeepLabCut. Эта работа была поддержана Национальным институтом неврологических заболеваний и инсульта (грант номер K08-NS072183) и Мичиганского университета.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| clear polycarbonate panels | TAP Plastics | cut to order (see box design) | |
| infrared source/detector | Med Associates | ENV-253SD | 30" range |
| camera | Basler | acA2000-340kc | 2046 x 1086 CMV2000 340 fps Color Camera Link |
| camera lens | Megapixel (computar) | M0814-MP2 | 2/3" 8mm f1.4 w/ locking Iris & Focus |
| camera cables | Basler | #2000031083 | Cable PoCL Camera Link SDR/MDR Full, 5 m - Data Cables |
| mirrors | Amazon | ||
| linear actuator | Concentrics | LACT6P | Linear Actuator 6" Stroke (nominal), 110 Lb Force, 12 VDC, with Potentiometer |
| pellet reservoir/funnel | Amico (Amazon) | a12073000ux0890 | 6" funnel |
| guide tube | ePlastics | ACREXT.500X.250 | 1/2" OD x 1/4" ID Clear. Extruded Plexiglass Acrylic Tube x 6ft long |
| pellet delivery rod | ePlastics | ACRCAR.250 | 0.250" DIA. Cast Acrylic Rod (2' length) |
| plastic T connector | United States Plastic Corp | #62065 | 3/8" x 3/8" x 3/8" Hose ID Black HDPE Tee |
| LED lights | Lighting EVER | 4100066-DW-F | 12V Flexible Waterproof LED Light Strip, LED Tape, Daylight White, Super Bright 300 Units 5050 LEDS, 16.4Ft 5 M Spool |
| Light backing | ePlastics | ACTLNAT0.125X12X36 | 0.125" x 12" x 36" Natural Acetal Sheet |
| Light diffuser films | inventables | 23114-01 | .007x8.5x11", matte two sides |
| cabinet and custom frame materials | various (Home Depot, etc.) | 3/4" fiber board (see protocol for dimensions of each structure) | |
| acoustic foam | Acoustic First | FireFlex Wedge Acoustical Foam (2" Thick) | |
| ventilation fans | Cooler Master (Amazon) | B002R9RBO0 | Rifle Bearing 80mm Silent Cooling Fan for Computer Cases and CPU Coolers |
| cabinet door hinges | Everbilt (Home Depot | #14609 | continuous steel hinge (1.4" x 48") |
| cabinet wheels | Everbilt (Home Depot | #49509 | Soft rubber swivel plate caster with 90 lb. load rating and side brake |
| cabinet door handle | Everbilt (Home Depot | #15094 | White light duty door pull (4.5") |
| computer | Hewlett Packard | Z620 | HP Z620 Desktop Workstation |
| Camera Link Frame Grabber | National Instruments | #781585-01 | PCIe-1473 Virtex-5 LX50 Camera Link - Full |
| Multifunction RIO Board | National Instruments | #781100-01 | PCIe-17841R |
| Analog RIO Board Cable | National Instruments | SCH68M-68F-RMIO | Multifunction Cable |
| Digital RIO Board Cable | National Instruments | #191667-01 | SHC68-68-RDIO Digital Cable for R Series |
| Analog Terminal Block | National Instruments | #782536-01 | SCB-68A Noise Rejecting, Shielded I/O Connector Block |
| Digital Terminal Block | National Instruments | #782536-01 | SCB-68A Noise Rejecting, Shielded I/O Connector Block |
| 24 position relay rack | Measurement Computing Corp. | SSR-RACK24 | Solid state relay backplane (Gordos/OPTO-22 type relays), 24-channel |
| DC switch | Measurement Computing Corp. | SSR-ODC-05 | Solid state relay module, single, DC switch, 3 to 60 VDC @ 3.5 A |
| DC Sense | Measurement Computing Corp. | SSR-IDC-05 | solid state relay module, single, DC sense, 3 to 32 VDC |
| DC Power Supply | BK Precision | 1671A | Triple-Output 30V, 5A Digital Display DC Power Supply |
| sugar pellets | Bio Serv | F0023 | Dustless Precision Pellets, 45 mg, Sucrose (Unflavored) |
| LabVIEW | National Instruments | LabVIEW 2014 SP1, 64 and 32-bit versions | 64-bit LabVIEW is required to access enough memory to stream videos, but FPGA coding must be performed in 32-bit LabVIEW |
| MATLAB | Mathworks | Matlab R2019a | box calibration and trajectory reconstruction software is written in Matlab and requires the Computer Vision toolbox |
References
- Chen, J., et al. An automated behavioral apparatus to combine parameterized reaching and grasping movements in 3D space. Journal of Neuroscience Methods. , (2018).
- Sacrey, L. A. R. A., Alaverdashvili, M., Whishaw, I. Q. Similar hand shaping in reaching-for-food (skilled reaching) in rats and humans provides evidence of homology in release, collection, and manipulation movements. Behavioural Brain Research. 204, 153-161 (2009).
- Whishaw, I. Q., Kolb, B. Decortication abolishes place but not cue learning in rats. Behavioural Brain Research. 11, 123-134 (1984).
- Klein, A., Dunnett, S. B. Analysis of Skilled Forelimb Movement in Rats: The Single Pellet Reaching Test and Staircase Test. Current Protocols in Neuroscience. 58, 8.28.1-8.28.15 (2012).
- Whishaw, I. Q., Pellis, S. M. The structure of skilled forelimb reaching in the rat: a proximally driven movement with a single distal rotatory component. Behavioural Brain Research. 41, 49-59 (1990).
- Zeiler, S. R., et al. Medial premotor cortex shows a reduction in inhibitory markers and mediates recovery in a mouse model of focal stroke. Stroke. 44, 483-489 (2013).
- Fenrich, K. K., et al. Improved single pellet grasping using automated ad libitum full-time training robot. Behavioural Brain Research. 281, 137-148 (2015).
- Azim, E., Jiang, J., Alstermark, B., Jessell, T. M. Skilled reaching relies on a V2a propriospinal internal copy circuit. Nature. , (2014).
- Guo, J. Z. Z., et al. Cortex commands the performance of skilled movement. Elife. 4, e10774 (2015).
- Nica, I., Deprez, M., Nuttin, B., Aerts, J. M. Automated Assessment of Endpoint and Kinematic Features of Skilled Reaching in Rats. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 11, 255 (2017).
- Wong, C. C., Ramanathan, D. S., Gulati, T., Won, S. J., Ganguly, K. An automated behavioral box to assess forelimb function in rats. Journal of Neuroscience Methods. 246, 30-37 (2015).
- Torres-Espín, A., Forero, J., Schmidt, E. K. A., Fouad, K., Fenrich, K. K. A motorized pellet dispenser to deliver high intensity training of the single pellet reaching and grasping task in rats. Behavioural Brain Research. 336, 67-76 (2018).
- Mathis, A., et al. DeepLabCut: markerless pose estimation of user-defined body parts with deep learning. Nature Neuroscience. 21, 1281-1289 (2018).
- Ellens, D. J., et al. An automated rat single pellet reaching system with high-speed video capture. Journal of Neuroscience Methods. 271, 119-127 (2016).
