Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Behavior

עכברוש אוטומטי-גלולה יחידה להגיע עם 3-מימדי שחזור של כפה ומסלולי ספרות

doi: 10.3791/59979 Published: July 10, 2019

Summary

מכרסם מיומנים להגיע משמש בדרך כלל כדי ללמוד כישורי מיומנות, אבל דורש זמן ומאמץ משמעותיים כדי ליישם את המשימה ולנתח את ההתנהגות. אנו מתארים גרסה אוטומטית של מיומנים להגיע עם מעקב תנועה ושחזור תלת מימדי של מסלולי הגעה.

Abstract

מכרסם מיומנים להגיע משמש בדרך כלל כדי ללמוד כישורי מיומנות, אבל דורש זמן ומאמץ משמעותיים כדי ליישם את המשימה ולנתח את ההתנהגות. מספר גרסאות אוטומטיות של הגעה מיומנים פותחו לאחרונה. כאן, אנו מתארים גרסה באופן אוטומטי מציג כדורי לחולדות תוך הקלטת וידאו בהבחנה גבוהה מזוויות מרובות בקצבי מסגרת גבוהה (300 fps). כף היד והספרות בודדים מסומנים עם DeepLabCut, אלגוריתם למידה מכונה עבור הערכה מרקרבלי. מערכת זו יכולה גם להיות מסונכרנת עם הקלטות פיזיולוגיות, או לשמש כדי להפעיל התערבויות פיזיולוגיים (למשל, גירוי חשמלי או אופטי).

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

בני האדם תלויים במיומנות מיומנות, המוגדרים כתנועות הדורשות מתואם בדיוק תנועות רב מפרקים וספרות. כישורים אלה מושפעים ממגוון הפתווגיות נפוצות מערכת העצבים כולל נגעים מבניים (g., שבץ, גידול, נגעים deמיאלואידית), מחלות ניווניות (למשל, מחלת פרקינסון), ומומים פונקציונליים של מנוע מעגלים (לדוגמה, דייסטוניה). להבין כיצד מיומנויות מיומנות לומדים ומיושמים על ידי מעגלים מוטוריים מרכזיים ולכן יש פוטנציאל לשפר את איכות החיים עבור אוכלוסיה גדולה. יתר על כן, הבנה כזו עשויה לשפר את ביצועי המנוע באנשים בריאים על ידי אופטימיזציה של אימונים ואסטרטגיות שיקום.

מבתר את המעגלים העצביים שבבסיס מיומנות המיומנות בבני אדם מוגבל על ידי שיקולים טכנולוגיים ואתיים, המחייב את השימוש במודלים של בעלי חיים. פרימטים שאינם אנושיים משמשים בדרך כלל כדי ללמוד תנועות הגפיים מיומן בהתחשב הדמיון של מערכות מוטוריות שלהם רפרטואר התנהגותי לבני אדם1. עם זאת, פרימטים לא אנושיים יקרים עם פעמים דור ארוך, הגבלת מספר נושאים לימוד התערבויות גנטיות. יתרה מזאת, בעוד שארגז הכלים הנוירודעי הרלוונטי לפרימטים לא אנושיים גדול יותר מבני אדם, מקדמות טכנולוגיות רבות אינן זמינות או מוגבלות באופן משמעותי בפרימטים.

מכרסם מיומנים להגיע היא גישה משלימה לימוד שליטה מוטורית מיומנת. חולדות ועכברים יכולים להיות מאומנים כדי להגיע, לתפוס, ולאחזר גלולה סוכר ברצף סטריאוטיפי של תנועות הומוולוגי לדפוסי ההגעה האנושית2. בשל הזמן שלהם הדור הקצר יחסית ועלויות דיור נמוכות יותר, כמו גם יכולתם לרכוש מיומנים להגיע במשך ימים עד שבועות, ניתן ללמוד מספר רב של נושאים במהלך שלבים למידה וקונסולידציה מיומנות. השימוש של מכרסמים, במיוחד עכברים, גם מקל על השימוש בכלים נוירודעיים מודרניים חזקים (למשל, אלקטרואופטיקה, הדמיית סידן, מודלים גנטיים של מחלות) כדי ללמוד מיומנות מיומן.

מכרסם מיומנים להגיע שימש במשך עשרות שנים כדי ללמוד שליטה רגילה מוטוריים וכיצד הוא מושפע הפתווגיות ספציפיות כמו שבץ מחלת פרקינסון3. עם זאת, רוב הגירסאות של משימה זו הן העבודה ואינטנסיבית הזמן, מקלים את היתרונות של לימוד מכרסמים. יישומים טיפוסיים כוללים הצבת מכרסמים בחדר להגיע עם מדף מול חריץ צר שדרכו מכרסם חייב להגיע. חוקר מציב באופן ידני כדורי סוכר על המדף, מחכה לבעל החיים להגיע ולאחר מכן מציב עוד אחד. מגיע הבקיע כהצלחות או כשלים או בזמן אמת או על ידי סקירת וידאו4. עם זאת, הבקיע פשוט מגיע כמו הצלחות או כישלונות מתעלמת מידע קימטי עשיר שיכול לספק תובנה לגבי איך (בניגוד רק אם) להגיע הוא לקוי. בעיה זו טופלה על-ידי יישום סקירה מפורטת של הגעה לקטעי וידאו כדי לזהות ולתת הציון למחצה להגיע לתנועות משנה5. בעוד זה הוסיף כמה נתונים לגבי הגעה kinאמאם, זה גם הגביר באופן משמעותי את הזמן והמאמץ להיכנס. יתרה מזאת, רמות גבוהות של ניסויים מעורבות יכולות להוביל לחוסר עקביות בניתוח מתודולוגיה ומידע, גם בתוך אותה מעבדה.

לאחרונה, מספר גרסאות אוטומטיות של הגעה מיומנים פותחו. כמה לצרף לכלוב הבית6,7, ביטול הצורך להעביר בעלי חיים. זה גם מפחית את הלחץ על בעלי החיים ומבטלת את הצורך למזג אותם לחדר מיוחד להגיע. גירסאות אחרות מאפשרות מעקב אחר כפה כך ששינויים קימטיים תחת התערבויות ספציפיות ניתן ללמוד8,9,10, או יש מנגנונים לקבוע באופן אוטומטי אם כדורי הפילו את המדף11. משימות מיומנות אוטומטיות שימושיות במיוחד להכשרה בעוצמה גבוהה, כפי שניתן לעשות לשיקום לאחר פציעה12. מערכות אוטומטיות מאפשרות לבעלי חיים לבצע מספר רב של הגעה לפרקי זמן ארוכים ללא צורך במעורבות חוקרת אינטנסיבית. יתרה מזאת, מערכות המאפשרות מעקב אחר כפה ותוצאות אוטומטיות מפחיתות את זמן החוקר שהושקע בביצוע ניתוח נתונים.

פיתחנו עכברוש אוטומטי מיומנים להגיע למערכת עם מספר תכונות מיוחדות. ראשית, באמצעות המעמד הנייד כדי להביא את הגלולה לתוך "מיקום הגעה" מלמטה, אנחנו משיגים מבט כמעט ללא הכול של forelimb. שנית, מערכת של מראות מאפשרת תצוגות מרובות בו זמנית של ההישג עם מצלמה אחת, המאפשר שחזור תלת מימדי (3-D) של מסלולים להגיע ברזולוציה גבוהה, במהירות גבוהה (300 fps) מצלמה. עם הפיתוח האחרון של אלגוריתמים למידה מכונה חזקה עבור מעקב תנועה markerless13, אנחנו עכשיו מעקב לא רק את הכף אבל האצבעות הפרט כדי לחלץ הגישה המפורטת לתפוס את הקינמטיקה. שלישית, תופש מסגרת המבצע עיבוד וידאו פשוט מאפשר זיהוי בזמן אמת של שלבים המגיעים בנפרד. מידע זה משמש כדי להפעיל רכישת וידאו (רכישת וידאו רציפה אינה מעשית בשל גודל הקובץ), והוא יכול לשמש גם כדי להפעיל התערבויות (למשל, אלקטרואופטיקה) ברגעים מדויקים. לבסוף, מסגרות וידאו בודדות מופעלות על ידי פולסים לוגיקה טרנזיסטור-טרנזיסטור (TTL), המאפשר את הווידאו להיות מסונכרן בדיוק עם הקלטות עצביות (למשל, אלקטרופיזיולוגיה או פוטומטריקה). כאן, אנו מתארים כיצד לבנות את המערכת, להכשיר חולדות כדי לבצע את המשימה, לסנכרן את המנגנון עם מערכות חיצוניות, ולשחזר 3-D מסלולים להגיע.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

כל השיטות הכרוכות בשימוש בבעלי חיים שתוארו כאן אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) של אוניברסיטת מישיגן.

1. הקמת חדר הגעה

הערה: ראה אלבונס ואח '14 לפרטים ודיאגרמות של המנגנון. מספרי חלקים מתייחסים לאיור 1.

  1. בונד לוחות פוליקרבונט ברורים עם מלט אקריליק לבנות את החדר להגיע (15 ס מ רוחב על ידי 40 ס"מ ארוך על ידי 40 ס"מ גבוה) (חלק1). ללוח צד אחד (חלק2) יש דלת עם צירים (רוחב של 18 ס מ בגובה 15 ס מ) עם מנעול. אם העכברוש יהיה קשור לכבל, יחתוך חתך (ברוחב של 5 ס מ באורך 36 ס מ) לתוך תקרת החדר כדי לאכסן אותו (חלק12). בפאנל הרצפה יש 18 חורים (בקוטר 1.75 ס מ) (חלק13) והוא אינו מאוחד לשאר החדר.
  2. הר וליישר חיישנים אינפרא אדום (חלק3) בלוחות הצדדיים 4.5 ס מ מהחלק האחורי של החדר ו 3.8 ס"מ מהרצפה. לתוכנת ההתנהגות יש מחוון (' IR בחזרה ') הירוק כאשר קרן האינפרא-אדום נשברת ואדומה כאשר הקרן שבורה. לאחר הגדרת התוכנה, ניתן להשתמש באפשרות זו כדי לבדוק את יישור החיישן.
  3. הר מראה (15 ס"מ x 5 ס"מ, חלק4) 10 ס מ מעל חריץ להגיע (חלק14). להטות את המראה כך מוט המסירה הגלולה גלוי למצלמה.
  4. מניחים את התא על תיבת תמיכה sanitizable (59 ס מ רחב על ידי 67.3 ס"מ ארוך על ידי 30.5 ס"מ גבוה, חלק5). החדר מונח מעל חור בתיבת התמיכה (ברוחב 12 ס מ אורך 25 ס מ) המאפשר לפסולת ליפול דרך חורי הרצפה (חלק13) ומחוץ לחדר ההגעה. חותכים חור שני (7 ס"מ רחב על ידי 6 ס"מ ארוך, חלק15) לתוך תיבת התמיכה מול חריץ להגיע, אשר מאפשר מוט משלוח גלולה להביא כדורי לחריץ להגיע.
  5. הר שתי מראות (8.5 ס"מ רחב x 18.5 ס"מ גבוה, חלק6) על הרצפה עם מגנטים משני צדי החדר, כך את הקצה הארוך של המראה נוגעת בלוח הצדדי 3 ס מ מהחזית של התיבה להגיע. להטות את המראות כך המצלמה יכולה לראות לתוך התיבה ואת האזור מול החריץ להגיע שבו הגלולה תימסר.
  6. הר המצלמה high-definition (חלק7) 17 ס מ מחריץ להגיע, מול התיבה.
  7. הנייר השחור (חלק18) משני צדי המצלמה, כך שהרקע במראות הצדדיים כהה. זה משפר את הניגוד כדי לשפר בזמן אמת ו-off-שורה זיהוי כף.
  8. הר המפעיל הליניארי (חלק16) על מסגרת sanitizable (רוחב 25 ס"מ על 55 ס"מ ואורכו 24 ס"מ, חלק8) עם ברגים. המפעיל מותקן במהופך כדי למנוע מאבק כרוב לצבור בתוך הפוטנציאל חישה העמדה שלו.
  9. הכנס O-טבעת קצף לתוך הצוואר של מאגר הגלולה (משפך) (חלק9) כדי למנוע אבק מצבירת באסיפה. הר המשפך מתחת לחור (~ 6 ס"מ קוטר, חלק17) בראש המסגרת על ידי החלקה את קצות המשפך מעל שלושה ברגים קדח התחתון של המסגרת העליונה. הכנס את צינור העזר (חלק10) לתוך הצוואר של המשפך.
  10. חבר את מחבר ה-T מפלסטיק לקצה מוט הפלדה של המפעיל. הכנס את הקצה מחודדות של המוט המסירה הגלולה לתוך החלק העליון של המחבר ואת הקצה העובר דרך צינור מדריך לתוך מאגר הגלולה.
  11. מניחים את מכלול למפעיל ליניארי תחת החדר להגיע מיומנים כך מוט משלוח גלולה יכול להאריך דרך החור (חלק15) מול החריץ להגיע.
  12. מניחים את כל המנגנון להגיע בארון גלגלים (121 ס מ x 119 ס"מ x 50 ס מ) מאוורר עם אוהדי המחשב (הפנים מקבל חם כאשר מוארים היטב) ומצופה קצף אקוסטי.
  13. לבנות חמישה לוחות אור (חלק11) על ידי שמירה על רצועות אור LED על 20.3 ס מ על ידי 25.4 ס מ לוחות תמיכה. . מפזר הסרט על הפסים הקלים הר אחד בלוח האור על התקרה מעל האזור מוט משלוח כגלולה. השאר את ארבעת האחרים בצידי הארונות לאורך החדר המגיע.
    הערה: חשוב להאיר את האזור מסביב לחריץ להגיע מוט משלוח גלולה לזיהוי כף בזמן אמת.

2. התקנת המחשב והחומרה

  1. התקן את תופש מסגרת FPGA וכרטיסי הרחבה דיגיטלית לכל הוראות היצרן (עיין בטבלת החומרים).
    הערה: מומלץ לפחות 16 GB של זיכרון RAM וכונן קשיח פנימי של מצב אחיד עבור אחסון נתונים, כמו הזרמת וידאו במהירות גבוהה דורש קיבולת אגירה משמעותית.
  2. התקן מנהלי התקנים עבור המצלמה high-definition וחבר אותו FPGA framegrabber. התוכנה ההתנהגותית חייבת לפעול וממשק עם המצלמה כדי להשתמש בתוכנה המשויכת למצלמה.
    הערה: הקוד הנכלל (ראה קבצים משלימים) ניגש לקופות ניתנות לתיכנות במצלמה וייתכן שאינו תואם למותגים אחרים. אנו ממליצים הקלטה לפחות ב 300 מסגרות לשנייה (fps); ב 150 fps גילינו כי שינויי מפתח בתנוחת כפה החמיצו לעתים קרובות.
  3. העתק את הקוד הכלול (פרוייקט) ב-"SR Automation_dig_ext_card_64bit" למחשב.

3. הכשרה התנהגותית

  1. . הכן חולדות לפני האימונים
    1. חולדות הבית לונג אוונס (זכר או נקבה, הגילאים 10 – 20 שבועות) בקבוצות של 2 – 3 לכל כלוב על אור הפוכה/מחזור כהה. שלושה ימים לפני האימונים, המקום חולדות על הגבלת מזון כדי לשמור על משקל הגוף 10 – 20% מתחת לקו הבסיס.
    2. לטפל חולדות במשך כמה דקות ביום לפחות 5 ימים. לאחר הטיפול, מקום 4 – 5 כדורי סוכר לכל חולדה בכל כלוב בית כדי להציג את האוכל הרומן.
  2. Habituate החולדה לחדר ההגעה (1 – 3 ימים)
    1. הפעל את נורות ה-LED ומניחים 3 כדורי סוכר בחזית ובגב החדר.
    2. מניחים את העכברוש בחדר ומאפשרים לעכברוש לחקור במשך 15 דקות. לעקוב אם הוא אוכל את כדורי. חזור על שלב זה עד שעכברוש יאכל את כל החבילות מהרצפה.
    3. לנקות את החדר עם אתנול בין חולדות.
      הערה: ביצוע אימונים ובדיקות בשלב האפל. הרכבת חולדות באותו הזמן מדי יום.
  3. הרכבת עכברוש כדי להגיע ולהתבונן העדפה כפה (1 – 3 ימים).
    1. הפעל את האורות ומניחים את החולדה בחדר ההגעה המיומן.
    2. באמצעות מלקחיים, להחזיק גלולה דרך חריץ להגיע בחזית התיבה (איור 1, איור 2). לאפשר לחולדה לאכול 3 כדורי מלקחיים.
    3. בפעם הבאה שהעכברוש ינסה לאכול את. הגלולה מהלקחיים, משוך את הגלולה חזרה בסופו של דבר, העכברוש ינסה. להגיע לגלולה עם כף הרגל
    4. . חזור על זה 11 פעמים כף היד כי העכברוש משתמש ביותר מתוך 11 ניסיונות הוא "העדפה כפה" של העכברוש.
      הערה: הניסיון מוגדר ככפה המגיעה מעבר לחריץ המגיע. העכברוש לא צריך בהצלחה להשיג ולאכול את הגלולה.
  4. להכשיר את העכברוש כדי להגיע אל המוט משלוח הגלולה (1 – 3 ימים)
    1. ליישר את המוט משלוח גלולה עם הצד של החריץ להגיע צלעות הרגל המועדפת של העכברוש (להשתמש במדריך כדי להבטיח מיקום עקבי 1.5 ס מ מקדמת החדר להגיע). העליון של מוט המסירה צריך להתיישר עם החלק התחתון של החריץ להגיע (איור 2B). . הנח את הגלולה על מוט המסירה
      הערה: מיקום מוט המסירה מול כף הרגל המועדפת של העכברוש מקשה על החולדה להשיג את הגלולה עם כף הרגל הלא מועדפת שלה. לא היו לנו בעיות עם חולדות באמצעות הכף הלא מועדף שלהם. עם זאת, בדגמים מסוימים (למשל, שבץ) זה עדיין יכול להתרחש ואיפוק על האיבר מגיע לא מועדף ניתן להוסיף.
    2. פיתיון עכברוש עם גלולה שנערך באמצעות מלקחיים, אבל לכוון את החולדה לכיוון המוט משלוח כך כפה שלה מכה את הגלולה על המוט. אם החולדה מפילה את הגלולה. מהכביש, מחליפה אותו ייתכן שחולדות לא. יגיעו בתחילה מספיק רחוק במקרה זה, להעביר את מוט המסירה גלולה קרוב לחריץ להגיע ולאחר מכן לאט להעביר אותו רחוק ככל החולדה משפרת.
    3. לאחר כ 5 – 15 שטות מגיע העכברוש יתחיל להגיע הגלולה על מוט המסירה באופן ספונטני. לאחר העכברוש ניסה 10 מגיע אל המוט משלוח בלי להיות בסדר, זה יכול להתקדם לשלב הבא.
  5. להכשיר את העכברוש כדי לבקש גלולה (2 – 8 ימים).
    הערה: למרות שיש לנו 100% הצלחות הכשרה חולדות להגיע כדורי, כ 10% חולדות לא ללמוד לבקש גלולה על ידי הזזת לחלק האחורי של החדר.
    1. מיקום מוט המסירה גלולה מבוסס על העדפה כפה של עכברוש ולהגדיר אותו למיקום 2 (איור 2a). קבעו עמדות גובה של מוט המסירה כגלולה באמצעות מרחוק למפעיל. החזקת כפתורים 1 ו- 2 בו מזיז את המוט המסירה למעלה, תוך החזקת כפתורים 3 ו- 2 מזיז את המוט המסירה למטה. כאשר מוט המסירה נמצא בגובה הנכון, החזק את המספר הרצוי עד שהאור מהבהב באדום כדי להגדיר.
    2. הניחו את החולדה בחדר והציבו את העכברוש על העכבר בגב בעזרת הגלולה. כאשר החולדה נעה מספיק רחוק לחלק האחורי של החדר זה ישבור את קרן האינפרא אדום אם הגרסה האוטומטית פעלה, להעביר את המוט משלוח גלולה למיקום 3 (איור 2b).
    3. לחכות החולדה להגיע לגלולה ולאחר מכן להעביר את המוט משלוח גלולה בחזרה למיקום 2 (איור 2a). מניחים גלולה חדשה על המוט. אם זה היה מכובה
    4. חזור על שלבים אלה, בהדרגה לפתה את העכברוש פחות ופחות, עד העכברוש מתחיל: (אני) לעבור לאחור כדי לבקש גלולה בלי להיות baited, ו (ii) מיד לעבור לחזית לאחר בקשת גלולה בגב. לאחר החולדה עשה את זה 10 פעמים, הוא מוכן לאימונים על המשימה האוטומטית.

4. הכשרת חולדות באמצעות המערכת האוטומטית

  1. הגדר את המערכת האוטומטית.
    1. להדליק את האורות בתא ולמלא את מאגר הגלולה במידת הצורך.
    2. מקמו את מוט המסירה של הגלולה. בהתאם להעדפה של העכברוש בדוק שמיקומי המפעיל מוגדרים כהלכה (כמו באיור 2A).
    3. הפעל את המחשב ופתח את תוכנית ההגעה המיומן (SR_dig_extension_card_64bit_ (מארח) _ 3. vi). הזן את מספר הזיהוי העכברוש תחת נושא ובחר את העדפת כף היד מהתפריט הנפתח ביד . ציינו את נתיב השמירה של סרטי הווידאו.
    4. הגדרת זמן הפעלה וסרטי וידאו מרבי (מספר סרטי הווידאו שבהם יש לסיים את ההפעלה ב-). התוכנית תפסיק לפעול בכל מגבלה הגיעה תחילה.
    5. להגדיר משך מתיחת גלולה (משך הזמן שמוט המסירה נשאר במיקום "3" לאחר החולדה מבקשת גלולה). אפשר או לנטרל קנס הגעה מוקדמת (מוט המסירה מתאפס למיקום "1" ולאחר מכן חזרה "2" אם העכברוש מגיע לפני בקשת גלולה).
  2. . קח את תמונות הכיול השחזור מסלול תלת-ממדי משתמש בארגז כלים לראיית מחשב כדי לקבוע את מטריצות השינוי המתאימות, הדורשות זיהוי נקודות תואמות בכל תצוגה. לשם כך, השתמש בקוביה קטנה עם תבניות לוח שחמט בכל צד (איור 3).
    1. הניחו את היד המסייעת בתוך חדר ההגעה, והיכנסו לחריץ התנין. החזיקו את הקוביה מול החריץ המגיע עם סרטון התנין.
    2. הצב את הקוביה כך שהצד האדום יופיע במראה העליון, בצד הירוק בשיקוף השמאלי, ובצד הכחול במראה הימני. כל הפנים של כל אחד משלושת הצדדים צריכים להיות גלויים במראות (איור 3).
    3. בתוכנית התנהגותית, ודא ROI הסף מוגדר ערך גדול מאוד (למשל, 60000). לחץ על לחצן ההפעלה (חץ לבן). לאחר שלחצן מאותחל המצלמה הופך לירוק, לחץ על התחל. שים לב שהווידאו הושג.
    4. לחץ על מצב Cal. לאחר מכן, צלם תמונה על-ידי לחיצה על צלם Cal image. נתיב ספריית התמונות יופיע כעת תחת "נתיב png" עם שם הקובץ. png המעוצב כ-"GridCalibration_YYYYMMDD_img. png".
    5. הזז מעט את הקוביה וצלם תמונה אחרת. חזור שוב על סך של 3 תמונות.
    6. עצור את התוכנית על-ידי לחיצה על עצור ולאחר מכן על לחצן התמרור עצור. הסר את יד העזרה והקוביה מהתיבה.
    7. היזהרו לא להקפיץ שום דבר בחדר התנהגותי לאחר תמונות כיול נלקחו באותו יום. אם משהו זז, יש לנקוט בתמונות כיול חדשות.
  3. . הפעל את המערכת האוטומטית
    הערה: קבע את הגדרות "ROI הסף" (המתוארות להלן) עבור כל מראה לפני הפעלת חולדות עבור רכישת נתונים בפועל. לאחר שנקבעו הגדרות אלה, הגדר אותם מראש לפני תחילת התוכנית והתאם במהלך הרכישה במידת הצורך.
    1. מניחים את החולדה. בחדר ההגעה המיומן לחץ על החץ הלבן כדי להפעיל את התוכנית.
    2. לפני לחיצה על התחל, להגדיר את המיקום של התשואה על ידי זיהוי כפה על-ידי כוונון x-היסט (קואורדינטת x של הפינה השמאלית העליונה של מלבן roi), y-אופסט (קואורדינטת y של הפינה השמאלית העליונה של roi), ROI רוחב ו ROI גובה.
    3. הצב את ההחזר במראה הצדדי המראה את הדורסום של כף היד, ישירות מול החריץ המגיע (איור 2C). להיות בטוח כי המוט משלוח גלולה לא להיכנס ROI וכי ההחזר אינו להאריך לתוך התיבה כדי למנוע את הגלולה או פרווה של העכברוש מפעיל וידאו כאשר העכברוש אינו מגיע.
    4. לחץ על התחל כדי להתחיל בתוכנית.
    5. כוונן את הערך "סף ההחזר הנמוך" עד שערך "הגורם המפעיל החי של העכבר" מנדנוד בין "0" ו-"1" (כאשר העכברוש אינו מגיע). ערך זה הוא מספר הפיקסלים בתוך ה-ROI עם ערכי עוצמה בטווח הסף.
    6. הגדר את סף ההחזר. שימו לב לערך הגורם המפעיל החי כאשר החולדה מושיטה את אפו לתוך התשואה וכאשר החולדה מגיעה לגלולה. הגדר את סף ההחזר להיות גדול באופן משמעותי מ-"ערך הגורם המפעיל החי של המילה" במהלך הנזלת והתחתון מאשר "ערך הגורם המפעיל החי של העכבר" כאשר העכברוש מגיע. כוונן עד שסרטוני הווידאו מופעלים בעקביות כאשר העכברוש מגיע אך לא כאשר הוא מושיט את אפו דרך החריץ
      הערה: ההנחה היא כי כף הרגל צבועה בהיר יותר מהאף; ההתאמות יהיה היפוך אם כפה כהה יותר מאשר האף.
    7. נטר את המבחנים הראשונים כדי לוודא שהכול פועל כראוי. כאשר עכברוש מגיע לפני שמבקש גלולה (מוט משלוח במיקום "2"), מספר "הגעה מוקדמת" עולה. כאשר עכברוש מגיע לאחר בקשת גלולה (מוט המסירה במיקום "3"), the "וידאו" מספר גדל וידאו נשמר כמו קובץ. bin עם השם "RXXXX_YYYYMMDD_HH_MM_SS_trial".
      הערה: ברירת המחדל היא לקטעי וידאו להכיל 300 מסגרות (כלומר, 1 s) לפני ו 1000 מסגרות לאחר האירוע ההדק (זה ניתן להגדרה בתוכנה), אשר מספיק זמן כדי להכיל את התנועה כולה להגיע לתפוס כולל הנסיגה כפה.
    8. לאחר שהגעת לזמן ההפעלה או לסרטי הווידאו המרבי, התוכנית נפסקת. לחץ על לחצן סימן העצירה.
    9. נקה את התא עם אתנול וחזור עם עכברוש אחר, או אם נעשה למשך היום כדי להמיר וידאו.
  4. המרת קבצי. bin לקבצי avi.
    הערה: דחיסת קטעי וידאו בעת הרכישה גורמת להשמטת מסגרות, כך שקבצים בינאריים מוזרמים לדיסק במהלך הרכישה (השתמש בכונן מצב מוצק עקב קצבי העברת נתונים גבוהים). קבצים בינאריים אלה חייבים להיות דחוסים מחוץ לשורה או שדרישות האחסון מסוימות גדולות באופן גמיש.
    1. פתח את התוכנית "bin2avi-color_1473R_noEncode. vi".
    2. תחת "בקרת נתיב קובץ" לחץ על לחצן התיקיה כדי לבחור את ההפעלה (למשל, R0235_20180119a) שברצונך להמיר. חזור על כל הפעלה (עד שש).
    3. לחץ על החץ הלבן (הפעל) ולאחר מכן "התחל" כדי להתחיל. באפשרותך לנטר את דחיסת הווידאו ב"התקדמות כוללת" (%) בר. תן לתוכנית לפעול. למשך הלילה
    4. לפני שתתחיל להתאמן בחיות ביום שלמחרת, ודא שסרטוני הווידאו הומרו ומחק את קבצי ה-. bin כך שיהיה מספיק מקום לרכישת קטעי וידאו חדשים.

5. ניתוח קטעי וידאו עם DeepLabCut

הערה: רשתות שונות מאומנים עבור כל העדפה כפה (רגל ימין ושמאל כפה) ועבור כל תצוגה (מבט ישיר המראה השמאלי להציג חולדות מימין, השקפה ישירה והמראה הימני לראות חולדות שמאל). התצוגה העליונה המראה אינו משמש לשחזור תלת-ממד-רק כדי לזהות כאשר האף נכנס לחריץ, אשר עשוי להיות שימושי כדי להפעיל התערבויות (למשל, אלקטרואופטיקה). כל רשת משמשת לניתוח ערכה של קטעי וידאו שנחתכו עבור כף היד והתצוגה המתאימים.

  1. הרכבת הרשתות DeepLabCut (הוראות מפורטות מסופקים בתיעוד DeepLabCut על https://github.com/AlexEMG/DeepLabCut).
    1. צור וקבע את התצורה של פרוייקט חדש ב-DeepLabCut, אלגוריתם למידה של מכונה עבור שערוך מרקרבלי מערכת13.
    2. השתמש בתוכנית כדי לחלץ מסגרות מתוך קטעי וידאו מיומנים להגיע ולחתוך תמונות לתצוגה כדי לכלול (מבט ישיר או ראי) בממשק התוכנית. חיתוך מסגרות גדול מספיק כדי שהעכברוש ושני הכפות הקדמיות יהיו גלויים.
      הערה: רשתות דורשות בדרך כלל 100-150 מסגרות אימונים. מסגרות אימונים נוספים נחוצים כאשר כפה בפנים לעומת מחוץ לחדר בגלל תאורה. חיתוך הדוק יותר מפחית את זמן העיבוד, אבל להיזהר כי האזורים שנחתכו הם גדולים מספיק כדי לזהות את המסלול המלא של כפה על כל עכברוש. זה צריך להיות רחב מספיק עבור כל הגוף של החולדה להתאים את המסגרת (מבט ישיר), וכדי לראות את החלק הרחוק לתוך התא ככל האפשר, מול מוט המסירה (מבט ראי).
    3. השתמש בתוכנית GUI כדי לתייג חלקי גוף. תווית 16 נקודות בכל מסגרת: 4 מישקים (MCP) המפרקים, 4 המפרקים הבין-לחועיים (PIP), 4 טיפים, הדורסום של הכפה המגיעה, האף, הדורסום של הכפה הבלתי מושטת, והגלולה (איור 4).
    4. בצע את ההוראות DeepLabCut (מקוצר כמו מעתה DLC) הוראות כדי ליצור את ערכת הנתונים הדרכה, להכשיר את הרשת, ולהעריך את הרשת הכשרה.
  2. ניתוח סרטי וידאו ועידון הרשת.
    1. לפני שתנתח את כל סרטי הווידאו עם רשת חדשה שהוכשרה, נתח 10 סרטוני וידאו כדי להעריך את ביצועי הרשת. אם יש שגיאות עקביות תנוחות מסוימות, לחלץ מסגרות אימונים נוספים המכילים אלה תנוחות ולהכשיר מחדש את הרשת.
    2. בעת ניתוח סרטי וידאו, הקפד ליצור קבצי. csv, אשר ייאכלו לקוד עבור שחזור מסלול תלת-ממדי.

6. כיול קופסא

הערה: הוראות אלה משמשות לקביעת מטריצות ההמרה כדי להמיר נקודות המזוהות בתצוגות ישירות ובשיקוף לתוך קואורדינטות תלת-ממדית. לקבלת הגירסה העדכנית ביותר ופרטים נוספים על אופן השימוש בחבילת boxCalibration, ראה מעבדת לוונטל: https://github.com/LeventhalLab/boxCalibration, הכוללת הוראות צעד-אחר-צעד לשימוש שלהם.

  1. לאסוף את כל התמונות כיול באותה תיקיה.
  2. באמצעות ImageJ/פיג'י, סמן ידנית את נקודות לוח הדמקה עבור כל אחת מתמונות הכיול. שמור תמונה זו כ-"GridCalibration_YYYYMMDD_. tif" כאשר ' YYYYMMDD ' הוא התאריך שבו תמונת הכיול מתאימה ל-ו-' ' הוא מספר התמונה עבור תאריך זה.
    1. השתמש בפונקציית המדידה ב-ImageJ (בסרגל הכלים, בחר באפשרות ' נתח ' | מידה). פעולה זו תציג טבלה המכילה קואורדינטות עבור כל הנקודות המסומנות. שמור קובץ זה בשם "GridCalibration_YYYYMMDD_. csv", כאשר התאריך ומספר התמונה זהים לקובץ ה-tif המתאים.
  3. מתוך החבילה Boxcalibration , פתח את הקובץ ' setParams. m '. קובץ זה מכיל את כל המשתנים הדרושים ואת תיאורו. ערוך משתנים לפי הצורך כדי להתאים למפרטי הפרוייקט.
  4. הפעל את הפונקציה מכייל תיבות . מספר בקשות יופיעו בחלון הפקודה. הבקשה הראשונה שואלת אם יש לנתח את כל התמונות בתיקיה. הקלדה Y תסיים את ההנחיות וכל התמונות עבור כל התאריכים ייניתחו. הקלדה N יבקש מהמשתמש להזין את התאריכים לניתוח.
    הערה: שתי ספריות חדשות ייווצרו בתיקיית תמונות הכיול: ' שרקטמגים ' מכיל קבצי. png עם המשתמש מגדיר את סימוני לוח הדמקה בתמונת הכיול. התיקיה ' boxCalibration ' מכילה קבצי. mat עם הפרמטרים של כיול התיבה.
  5. הפעל את הפונקציה ' כיול ' של הביקורת. פעולה זו תיצור תיקיה חדשה, ' כיול ' בתיקיה ' כיול '. לכל תאריך תהיה תיקיית ממשנה המכילה את התמונות ומספר קבצי. תאנה, המשמשים לאימות שכיול התיבה הושלם במדויק.

7. שיחזור מסלולים תלת-ממדיים

  1. אסוף את קבצי ה-. csv המכילים פלט תוכנית למידה למבנה הספריות המתואר ב- reconstruct3Dtrajectories script.
  2. . הפעל reconstruct3Dtrajectories קובץ script זה יחפש במבנה הספריות ויתאים נקודות ישירות/מראה המבוססות על שמם בתוכנית הנשענת (חשוב להשתמש באותו שמות של חלק מהגוף בשתי התצוגות).
  3. . הפעל calculateKinematics סקריפט זה מחלץ תכונות קימטיות פשוטות מתוך שחזורים מסלול תלת-ממדי, אשר ניתן להתאים לצרכים ספציפיים.
    הערה: התוכנה מעריכה את מיקומו של חלקי גוף שאינם מבוססים על השכנים שלהם ועל מיקומם בתצוגה המשלימה (למשל, המיקום של חלק גוף בתצוגה ישירה של המצלמה מגביל את המיקומים האפשריים שלו בתצוגת המראה). לפעמים, כאשר כף הרגל הוא סגר בתצוגת המראה כפי שהוא עובר דרך החריץ, הקואורדינטות כפה הם אינטרפולציה מבוסס על מסגרות השכנות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

חולדות לרכוש את המשימה מיומנים להגיע במהירות לאחר הסתגלות למנגנון, עם ביצועים את במונחים של שני מספרי הגעה ודיוק מעל 1 – 2 שבועות (איור 5). איור 6 מציג מסגרות וידאו לדוגמה המציינות מבנים המזוהים על ידי DeepLabCut, ואיור 7 מראה על גבי מסלולים בודדים להגיע מהפעלה אחת. לבסוף, באיור 8, אנו ממחישים מה קורה אם הגורם לזיהוי כפה (שלבים 4.3.4 – 4.3.6) אינו מוגדר באופן מדויק. יש שינויים משמעותיים במסגרת שבה כפה המפר את החריץ המגיע. זו אינה בעיה רצינית מבחינת ניתוח להגיע לקינמטיקה. עם זאת, זה יכול להוביל להשתנות בעת התערבויות (למשל, אלקטרואופטיקה) מופעלות במהלך להגיע תנועות.

Figure 1
איור 1: חדר ההגעה המיומן.
בכיוון השעון משמאל למעלה יש תצוגה צדדית, תצוגה מהחזית ומעלה, המסגרת שבה מותקן המפעיל (ראה שלב 1.8), ותצוגה מהצד ומעלה. לחדר המגיע (1) יש דלת (2) לחתוך לתוך צד אחד כדי לאפשר לחולדות להיכנס ונלקח מתוך החדר. סדק נחתך לתוך לוח התקרה (12) כדי לאפשר את החיה להיות קשור וחורים חתוכים לתוך לוח הרצפה (13) כדי לאפשר המלטה ליפול. שני חיישני אינפרא-אדום (3) מיושרים באחד מצדי החלק האחורי של החדר. מראה (4) מותקן מעל החריץ המגיע (14) בחזית החדר המגיע ושתי מראות נוספות (6) מופרשים משני צדי החדר המגיע. חדר הגעה מיומן יושב על גבי תיבת תמיכה (5). המצלמה high-definition (7) מותקן על תיבת התמיכה מול החריץ להגיע. שתי חתיכות של נייר שחור (18) מורכבים משני צדי המצלמה (7) כדי לשפר את הניגודיות של כפה במראות צדדיות (6). מתחת לתיבת התמיכה מסגרת (8) התומכת במפעיל ליניארי (16) ומאגר הגלולה (9). צינור מדריך מפעיל את מוט המסירה הגלולה (10) הוא מתאים לתוך מאגר גלולה נשלט על ידי המפעיל ליניארי. חורים חתוכים לתוך מסגרת למפעיל (17) ותיבת התמיכה (15) מעל מאגר הגלולה כדי לאפשר את המוט משלוח גלולה לנוע למעלה ולמטה בחופשיות. הקופסא מוארת בפאנלים בהירים (11) החצובה לקירות הקבינט ולתקרה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: מבנה ניסיון יחיד.
(A) המשפט מתחיל עם מוט משלוח גלולה (נשלט על ידי מפעיל ליניארי) ממוקם בעמדה "מוכן" (מיקום 2 – באמצע הדרך בין הרצפה לתחתית של חריץ להגיע). (ב) העכברוש עובר לחלק האחורי של התא כדי לשבור את הקרן אינפרא אדום (IR), מה שגורם מוט משלוח הגלולה לעלות למיקום 3 (מיושר עם התחתון של חריץ להגיע). (ג) העכברוש מגיע דרך החריץ להגיע כדי לתפוס את הגלולה. מגיע מזוהה בזמן אמת באמצעות FPGA framegrabber המזהה שינויים בעוצמת הפיקסלים בתוך אזור מעניין (ROI) בתצוגת המראה הצדדית ישירות מול החריץ. כאשר מספיק פיקסלים מתאימים למשתמש שהוגדר "עוצמת כפה", רכישת וידאו מופעלת. (ד) שתי שניות מאוחר יותר את הגלולה הוא הוריד למיקום 1, להרים גלולה חדשה ממאגר הגלולה לפני איפוס למיקום 2. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: תמונת כיול לדוגמה.
יד מסייעת ממוקמת בתוך חדר ההגעה המיומן. קליפ תנין מחטט דרך חריץ להגיע כדי להחזיק את קוביית הכיול במקום מחוץ לחדר להגיע. שלושת דפוסי לוח הדמקה גלויים לחלוטין בתצוגה הישירה ובתצוגות השיקוף המתאימות (ירוק: שמאל; אדום: למעלה; וכחול: ימין). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: האלגוריתם למידה סמן עמדות.
עמודה שמאלית: תצוגה ישירה; עמודה ימנית: תצוגת שיקוף. סמנים 1 – 4: מפרקים MCP 5 – 8: המפרקים פיפס; 9 – 12: טיפים לספרות; 13: דורסום של כף יד; 14: אף; 15: דורסום של כף יד שאינה מגיעה. סמן 16 (גלולה) אינו גלוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: חולדות לרכוש במהירות משימה מיומנים להגיע.
הממוצע הראשון להגיע לשיעור הצלחה (ירוק, ציר שמאל) ומבחנים הכולל הממוצע (כחול, הציר הימני) על 20 הפעלות האימון האוטומטי המשימה מיומנים (n = 19). כל הפעלה של תרגול נמשכה 30 דקות. קווי שגיאה מייצגים שגיאה סטנדרטית של הממוצע. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: מסגרות וידאו לדוגמה המסומנות על-ידי תוכנית הלמידה.
עמודה שמאלית: תצוגת שיקוף; עמודה מימין: תצוגה ישירה. צבע ציאן, אדום, צהוב וירוק מציינים ספרות 1 – 4, בהתאמה. , הנקודה הלבנה מסמנת את האף. הנקודה השחורה מסמנת את הגלולה מעגלים מלאים זוהו על ידי DeepLabCut. עיגולים פתוחים מציינים את מיקומי האובייקטים המוערכים לפי המיקום שבו אובייקט זה הופיע בתצוגה הנגדית. X הם נקודות מוקרן מחדש על מסגרות וידאו מן האומדנים של מיקומים תלת-ממדיים שלהם. וידאו זה הופעל על מסגרת 300, כמו כפה עבר דרך החריץ. תמונות העליון הם מן המסגרת הראשונה כאשר כפה להגיע זוהה. התמונות התחתונות הן מהמסגרת שבה הספרה השנייה הורחבה באופן מקסימאלי. מסגרות אלה זוהו על ידי תוכנת עיבוד התמונה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 7
איור 7: לדוגמה, מסלולים תלת-ממדיים מהפעלת בדיקה אחת.
שני הצירים מציגים את אותם הנתונים, אך מסובבים כדי להקל על המצגת. קווים שחורים מציינים מסלולים מסוימים. ציאן, אדום, צהוב וירוק הם מסלולים בודדים של קצות הספרות 1 – 4, בהתאמה. קווים כחולים מצביעים. על מסלול הכפה הנקודה השחורה הגדולה מציינת את גלולה הסוכר הממוקמת ב (0, 0, 0). הדבר מייצג רק את ההתקדמות הראשונית בשביל להקל על הצגת המצגת (כולל retractions ומספר מגיע הופך את הדמות כמעט ללא מתרגם). עם זאת, כל הנתונים הקימטיים זמינים לניתוח. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 8
איור 8: היסטגרמות של מספרי מסגרת בהם זוהו שלבים ספציפיים עבור 2 מפגשים שונים.
בהפעלה אחת (קווים מוצקים כהים), ערכי הגורם המפעיל של ROI הוגדרו בקפידה, והכפה זוהה כשפורצים את החריץ בתוך אותן מסגרות בודדות בכל משפט. בהפעלה השנייה (קווים מקווקווים בהירים), האף לעתים קרובות הגיע לידי ביצוע כף היד המגיעה, והמפעיל רכישת וידאו בטרם עת. שימו לב כי לפעולה זו לא תהיה השפעה מועטה על ניתוח קימטי מקוון אלא אם כן ההישג המלא לא נלכד. עם זאת, התערבויות פוטנציאליות המופעלות על ידי כפה להגיע יהיה מתוזמן גרוע. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

מכרסם מיומנים להגיע הפך כלי סטנדרטי ללמוד פיזיולוגיה מערכת מוטורית פתופסולוגיה. יש לנו לתאר כיצד ליישם עכברוש אוטומטי מיומנים להגיע משימה המאפשרת: הדרכה ובדיקות עם פיקוח מינימלי, כף יד תלת-ממדי שחזור המסלול הספרה (במהלך ההגעה, אוחז, ו כפה הנסיגה), זיהוי בזמן אמת של כפה במהלך ההגעה, וסנכרון עם האלקטרוניקה החיצונית. הוא מתאים היטב כדי לתאם את הקינמטיקה עם הפיזיולוגיה או לבצע התערבויות בדיוק בזמן הגעה לתנועות.

מאז אנו דיווחו בתחילה על עיצוב זה14, יעילות ההכשרה שלנו השתפרה כך כמעט 100% של חולדות לרכוש את המשימה. זיהינו מספר גורמים חשובים שמובילים להכשרה מוצלחת בעקביות. כמו עם משימות רבות מונעים על ידי רעב, חולדות יש לפקח בזהירות במהלך הגבלת קלוריק כדי לשמור על 80 – 90% ממשקל הגוף הצפוי שלהם. הטיפול בחולדות מדי יום, אפילו לפני האימון, הוא חשוב באופן ביקורתי כדי התאקלם אותם לבני אדם. חולדות צריך להיות מאומן להגיע לפני ללמוד לחזור לחלק האחורי של החדר כדי לבקש כדורי — זה מפחית במידה ניכרת את זמן ההכשרה ומשפר את הסבירות כי חולדות לרכוש את המשימה. לבסוף, כאשר מועברים בין תאים זהים לכאורה, חולדות מבצעות לעתים קרובות פחות מגיע. זה היה נכון במיוחד כאשר צ'יימברס שימשו בפעם הראשונה. אנו משערים כי זה נובע הבדלים בריח בין התאים. לא משנה מה הסיבה, חשוב לשמור כסביבה יציבה הכשרה ככל האפשר, או התאקלם את החולדות לכל הארגזים שבו בדיקות עלול להתרחש.

המנגנון המתואר כאן הוא ישימה בקלות לצרכים ספציפיים. תיארנו גרסת חולדה של המשימה, אבל יש גם ליישם את גרסת העכבר (אם כי קשה לזהות ספרות בודדות עם DeepLabCut בעכברים). מאחר שמסגרות וידאו נפרדות מסומנות בפולסים מאורך TTL, ניתן לסנכרן סרטוני וידאו עם כל מערכת הקלטה המקבלת כניסות דיגיטליות או אנלוגיות (לדוגמה, אלקטרופיזיולוגיה מגברים או פוטומטריקה). לבסוף, הראש קבוע עכברים בקלות לבצע מיומנים להגיע9, ואת הראש קבוע גרסה של משימה זו יכול להיות מיושם עבור 2-פוטון הדמיה או juxtacellular הקלטות. חשוב לעשות זאת, יש לנו רק להשתמש במערכת זו עם חולדות ארוכות-אוונס, שאפו ופרווה כפה (שחור ולבן, בהתאמה) שונים מספיק בצבע כי הנזלת לא טועה מגיע (עם הגדרות ROI המתאים, איור 8). זו עשויה להיות בעיה עבור חולדות עם צבע דומה על כפות הרגליים והאפים שלהם (למשל, חולדות לבקן), אבל יכול להיפתר על ידי צביעה כפה עם דיו, לק ציפורניים, או קעקועים.

הגרסה המוצגת של להגיע מיומנים יש כמה תכונות נפרדות, אשר עשוי להיות יתרון בהתאם ליישום ספציפי. החומרה המורכבת יחסית והצורך עיבוד וידאו בזמן אמת לעשות את זה מתאים בצורה גרועה לאימונים בבית כלוב6,7. מצד שני, הכשרה כלוב הבית מקשה על רכישת וידאו במהירות גבוהה ברזולוציה גבוהה מזוויות מרובות, או לקשור את החיות עבור הקלטות פיזיולוגית/התערבויות. כרטיסי רכישת הנתונים והדרישה עבור מחשב אחד לכל תא הופך כל תא יקר יחסית, וקטעי וידאו דורשים שטח אחסון דיגיטלי משמעותי (~ 200 MB לכל 4 s וידאו). הצלחנו ליישם גרסה פשוטה יותר מבוססת-קונטרולר שעולה כ-$300 לכל חדר, למרות שהוא חסר משוב בזמן אמת או את היכולת להסתנכרן עם התקנים חיצוניים. תיבות אלה זהים ביסודו לאלה המתוארים כאן, אבל להשתמש מצלמת וידאו מסחרי לא דורשים מחשב למעט תוכנית מיקרו בקר (פרטים של הגדרת תוכנה זו משויכת זמינים לפי בקשה). עיבוד וידאו בזמן אמת על חוטף מסגרת FPGA שימושי במיוחד; אנו מוצאים כי זה יותר מכבש מזהה מגיע בזמן אמת מאשר קרני אינפרא אדום או חיישני קירבה (אשר עלול לטעות חוטם של עכברוש עבור כפה להגיע). יתר על כן, מפעילים מרובים עשויים לשמש כדי לזהות את הכף בשלבים שונים להגיע (למשל, גישה לחריץ, מתיחת כפה, הרחבה דרך חריץ). זה לא רק מאפשר להיות בלתי מתוזמן, בדיוק בעיתוי עצבי רטבאליות, אבל יכול לשמש כדי להפעיל את האחסון של קטעי וידאו קצרים במהירות גבוהה.

בעוד הגרסה האוטומטית שלנו של מיומנים להגיע יש מספר יתרונות עבור יישומים ספציפיים, יש לו גם כמה מגבלות. כפי שצוין לעיל, המצלמה במהירות גבוהה, ברזולוציה גבוהה הוא יקר למדי, אבל הכרחי לכלול מראה ותצוגות ישירות בתמונה אחת וללכוד את התנועה מהירה מאוד להגיע. שימוש במצלמה אחת מבטלת את הצורך לסנכרן ולהקליט זרמי וידאו מרובים בו, או לרכוש מצלמות מרובות ומסגרות. כף היד בתצוגה המשתקף היא באופן יעיל כפול מאשר המצלמה (על ידי מעקב קרני) כמו בתצוגה ישירה. משמעות הדבר היא כי אחת התצוגות היא תמיד מחוץ לפוקוס, למרות DLC עדיין מכבש מזהה ספרות בודדות בשתי התצוגות (איור 4, איור 6). לבסוף, השתמשנו מצלמה צבע כי, לפני הזמינות של DLC, ניסינו צבע קידוד הספרות עם קעקועים. אמנם ייתכן כי תוכנית זו מבוססת למידה יהיה יעיל באותה מידה על שחור ולבן (או רזולוציה נמוכה) וידאו, אנחנו יכולים רק לוודא את האפקטיביות של החומרה המתוארת כאן. לבסוף, קוד הניתוח שלנו (מלבד DLC) נכתב בעיקר בחבילת תוכנה מסחרית (ראה טבלת חומרים) אבל צריך להיות פשוט להסתגל לקוד פתוח שפות תכנות (למשל, פייתון) לפי הצורך.

ישנן מספר דרכים בהן אנו פועלים כדי לשפר את המערכת. כיום, תצוגת השיקוף מקודלת חלקית באמצעות הפנל הקדמי. לפיכך, אנו חוקרים דרכים להשגת מספר צפיות בו זמנית של כף היד תוך מזעור החסימות. פיתוח חשוב נוסף יהיה להבקיע באופן אוטומטי את המגיע (המערכת יכולה לעקוב אחר הקינמטיקה, אבל האדם חייב עדיין להבקיע מוצלח לעומת כישלון מגיע). שיטות פותחו כדי לקבוע אם כדורי הפילו את המדף/המעמד, אבל לא יכול לקבוע אם הגלולה נתפס או החמיץ לחלוטין11. על ידי מעקב אחר הגלולה עם DLC, אנחנו חוקרים אלגוריתמים כדי לקבוע את מספר מגיע למשפט, כמו גם אם הגלולה נתפס, הפיל את המעמד, או החמיץ לחלוטין. לאורך הקווים הללו, אנו פועלים גם כדי להפוך את זרימת העבודה לאוטומטית לחלוטין מאיסוף נתונים באמצעות המרת וידאו, עיבוד DLC, והבקיע אוטומטית. בסופו של דבר, אנו מסוגלים לדמיין מערכת שבה ניתן להריץ ניסויים מרובים ביום אחד, ולמחרת בבוקר, הקינמטיקה המלאה וההגעה לתוצאות לכל ניסוי נקבע.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

המחברים רוצים להודות Karunesh Ganguly והמעבדה שלו לקבלת ייעוץ על המשימה להגיע מיומנים, אלכסנדר ומקנזי מאטיס על עזרתם בהתאמת DeepLabCut. עבודה זו היתה נתמכת על ידי המכון הלאומי למחלות נוירולוגיות שבץ (גרנט מספר K08-NS072183) ו אוניברסיטת מישיגן.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
clear polycarbonate panels TAP Plastics cut to order (see box design)
infrared source/detector Med Associates ENV-253SD 30" range
camera Basler acA2000-340kc 2046 x 1086 CMV2000 340 fps Color Camera Link
camera lens Megapixel (computar) M0814-MP2 2/3" 8mm f1.4 w/ locking Iris & Focus
camera cables Basler #2000031083 Cable PoCL Camera Link SDR/MDR Full, 5 m - Data Cables
mirrors Amazon
linear actuator Concentrics LACT6P Linear Actuator 6" Stroke (nominal), 110 Lb Force, 12 VDC, with Potentiometer
pellet reservoir/funnel Amico (Amazon) a12073000ux0890 6" funnel
guide tube ePlastics ACREXT.500X.250 1/2" OD x 1/4" ID Clear. Extruded Plexiglass Acrylic Tube x 6ft long
pellet delivery rod ePlastics ACRCAR.250 0.250" DIA. Cast Acrylic Rod (2' length)
plastic T connector United States Plastic Corp #62065 3/8" x 3/8" x 3/8" Hose ID Black HDPE Tee
LED lights Lighting EVER 4100066-DW-F 12V Flexible Waterproof LED Light Strip, LED Tape, Daylight White, Super Bright 300 Units 5050 LEDS, 16.4Ft 5 M Spool
Light backing ePlastics ACTLNAT0.125X12X36 0.125" x 12" x 36" Natural Acetal Sheet
Light diffuser films inventables 23114-01 .007x8.5x11", matte two sides
cabinet and custom frame materials various (Home Depot, etc.) 3/4" fiber board (see protocol for dimensions of each structure)
acoustic foam Acoustic First FireFlex Wedge Acoustical Foam (2" Thick)
ventilation fans Cooler Master (Amazon) B002R9RBO0 Rifle Bearing 80mm Silent Cooling Fan for Computer Cases and CPU Coolers
cabinet door hinges Everbilt (Home Depot #14609 continuous steel hinge (1.4" x 48")
cabinet wheels Everbilt (Home Depot #49509 Soft rubber swivel plate caster with 90 lb. load rating and side brake
cabinet door handle Everbilt (Home Depot #15094 White light duty door pull (4.5")
computer Hewlett Packard Z620 HP Z620 Desktop Workstation
Camera Link Frame Grabber National Instruments #781585-01 PCIe-1473 Virtex-5 LX50 Camera Link - Full
Multifunction RIO Board National Instruments #781100-01 PCIe-17841R
Analog RIO Board Cable National Instruments SCH68M-68F-RMIO Multifunction Cable
Digital RIO Board Cable National Instruments #191667-01 SHC68-68-RDIO Digital Cable for R Series
Analog Terminal Block National Instruments #782536-01 SCB-68A Noise Rejecting, Shielded I/O Connector Block
Digital Terminal Block National Instruments #782536-01 SCB-68A Noise Rejecting, Shielded I/O Connector Block
24 position relay rack Measurement Computing Corp. SSR-RACK24 Solid state relay backplane (Gordos/OPTO-22 type relays), 24-channel
DC switch Measurement Computing Corp. SSR-ODC-05 Solid state relay module, single, DC switch, 3 to 60 VDC @ 3.5 A
DC Sense Measurement Computing Corp. SSR-IDC-05 solid state relay module, single, DC sense, 3 to 32 VDC
DC Power Supply BK Precision 1671A Triple-Output 30V, 5A Digital Display DC Power Supply
sugar pellets Bio Serv F0023 Dustless Precision Pellets, 45 mg, Sucrose (Unflavored)
LabVIEW National Instruments LabVIEW 2014 SP1, 64 and 32-bit versions 64-bit LabVIEW is required to access enough memory to stream videos, but FPGA coding must be performed in 32-bit LabVIEW
MATLAB Mathworks Matlab R2019a box calibration and trajectory reconstruction software is written in Matlab and requires the Computer Vision toolbox

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chen, J., et al. An automated behavioral apparatus to combine parameterized reaching and grasping movements in 3D space. Journal of Neuroscience Methods. (2018).
  2. Sacrey, L. A. R. A., Alaverdashvili, M., Whishaw, I. Q. Similar hand shaping in reaching-for-food (skilled reaching) in rats and humans provides evidence of homology in release, collection, and manipulation movements. Behavioural Brain Research. 204, 153-161 (2009).
  3. Whishaw, I. Q., Kolb, B. Decortication abolishes place but not cue learning in rats. Behavioural Brain Research. 11, 123-134 (1984).
  4. Klein, A., Dunnett, S. B. Analysis of Skilled Forelimb Movement in Rats: The Single Pellet Reaching Test and Staircase Test. Current Protocols in Neuroscience. 58, 8.28.1-8.28.15 (2012).
  5. Whishaw, I. Q., Pellis, S. M. The structure of skilled forelimb reaching in the rat: a proximally driven movement with a single distal rotatory component. Behavioural Brain Research. 41, 49-59 (1990).
  6. Zeiler, S. R., et al. Medial premotor cortex shows a reduction in inhibitory markers and mediates recovery in a mouse model of focal stroke. Stroke. 44, 483-489 (2013).
  7. Fenrich, K. K., et al. Improved single pellet grasping using automated ad libitum full-time training robot. Behavioural Brain Research. 281, 137-148 (2015).
  8. Azim, E., Jiang, J., Alstermark, B., Jessell, T. M. Skilled reaching relies on a V2a propriospinal internal copy circuit. Nature. (2014).
  9. Guo, J. Z. Z., et al. Cortex commands the performance of skilled movement. Elife. 4, e10774 (2015).
  10. Nica, I., Deprez, M., Nuttin, B., Aerts, J. M. Automated Assessment of Endpoint and Kinematic Features of Skilled Reaching in Rats. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 11, 255 (2017).
  11. Wong, C. C., Ramanathan, D. S., Gulati, T., Won, S. J., Ganguly, K. An automated behavioral box to assess forelimb function in rats. Journal of Neuroscience Methods. 246, 30-37 (2015).
  12. Torres-Espín, A., Forero, J., Schmidt, E. K. A., Fouad, K., Fenrich, K. K. A motorized pellet dispenser to deliver high intensity training of the single pellet reaching and grasping task in rats. Behavioural Brain Research. 336, 67-76 (2018).
  13. Mathis, A., et al. DeepLabCut: markerless pose estimation of user-defined body parts with deep learning. Nature Neuroscience. 21, 1281-1289 (2018).
  14. Ellens, D. J., et al. An automated rat single pellet reaching system with high-speed video capture. Journal of Neuroscience Methods. 271, 119-127 (2016).
עכברוש אוטומטי-גלולה יחידה להגיע עם 3-מימדי שחזור של כפה ומסלולי ספרות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bova, A., Kernodle, K., Mulligan, K., Leventhal, D. Automated Rat Single-Pellet Reaching with 3-Dimensional Reconstruction of Paw and Digit Trajectories. J. Vis. Exp. (149), e59979, doi:10.3791/59979 (2019).More

Bova, A., Kernodle, K., Mulligan, K., Leventhal, D. Automated Rat Single-Pellet Reaching with 3-Dimensional Reconstruction of Paw and Digit Trajectories. J. Vis. Exp. (149), e59979, doi:10.3791/59979 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter