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Chemistry

पदानुक्रमिक और प्रोग्रामेबल वन-पोट ओलिगोसैकराइड संश्लेषण

Published: September 6, 2019 doi: 10.3791/59987
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1, 4, 1,3
1Genomics Research Center, Academia Sinica, 2Institute of Biomedical Sciences, Academia Sinica, 3Department of Chemistry, Scripps Research Institute, 4Institute of Information Science, Academia Sinica

Summary

इस प्रोटोकॉल oligosaccharides के पदानुक्रमित और प्रोग्राम एक पॉट संश्लेषण के लिए ऑटो-चो सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए कैसे प्रदर्शित करता है। यह भी आरआरवी निर्धारण प्रयोगों और SSEA-4 के एक पॉट ग्लाइकोसिलिएशन के लिए सामान्य प्रक्रिया का वर्णन करता है।

Abstract

यह आलेख प्रोग्राम एक-पोट ओलिगोसैकराइड संश्लेषण के लिए एक सामान्य प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है और दर्शाता है कि संभावित सिंथेटिक समाधान उत्पन्न करने के लिए ऑटो-चो सॉफ्टवेयर का उपयोग कैसे करें। प्रोग्राम एक पॉट ओलिगोसैकराइड संश्लेषण दृष्टिकोण रिश्तेदार प्रतिक्रिया मूल्यों (RRVs) के उपयुक्त अनुक्रमिक क्रम के साथ थायोग्लाइकोसाइड बिल्डिंग ब्लॉक (BBLs) का उपयोग कर बड़ी मात्रा में तेजी से oligosaccharide संश्लेषण को सशक्त बनाने के लिए बनाया गया है। ऑटो-CHO एक ग्राफिकल यूजर इंटरफेस है कि एक BBL पुस्तकालय (के बारे में 150 मान्य और gt;gt;50,000 आभासी BBLs के साथ) खोज द्वारा प्रोग्राम एक पॉट oligosaccharide संश्लेषण के लिए संभव सिंथेटिक समाधान प्रदान करता है के साथ एक पार मंच सॉफ्टवेयर है समर्थन वेक्टर प्रतिगमन द्वारा सही भविष्यवाणी RRVs. पदानुक्रमित एक पॉट संश्लेषण के लिए एल्गोरिथ्म ऑटो-चॉ में लागू किया गया है और नए BBLs के रूप में एक पॉट प्रतिक्रियाओं द्वारा उत्पन्न टुकड़े का उपयोग करता है. इसके अलावा, ऑटो-CHO उपयोगकर्ताओं को आभासी BBLs के लिए प्रतिक्रिया देने के लिए आगे के उपयोग के लिए मूल्यवान लोगों को रखने के लिए अनुमति देता है. चरण-विशिष्ट भ्रूण प्रतिजन 4 (SSEA-4) का एक-पोट संश्लेषण, जो एक pluripotent मानव भ्रूण स्टेम सेल मार्कर है, इस काम में प्रदर्शन किया है.

Introduction

कार्बोहाइड्रेट प्रकृति में सर्वव्यापी हैं1,2, लेकिन उनकी उपस्थिति और कार्रवाई की विधा एक अज्ञात क्षेत्र है, मुख्य रूप से अणुओं के इस वर्ग के लिए मुश्किल पहुँच के कारण3. ओलिगोपेप्टाइड्स और ओलिगोन्यूक्लिओटाइड्स के स्वचालित संश्लेषण के विपरीत, ओलिगोसैकेराइड्स के स्वचालित संश्लेषण का विकास एक मजबूत कार्य बना हुआ है, और प्रगति अपेक्षाकृत धीमी रही है।

इस समस्या से निपटने के लिए, वोंग एट अल. एक प्रोग्राम सॉफ्टवेयर प्रोग्राम Optimer4कहा जाता है, जो अनुक्रमिक एक पॉट के लिए $ 50 BBLs के एक पुस्तकालय से BBLs के चयन गाइड का उपयोग कर oligosaccharides के संश्लेषण के लिए पहली स्वचालित विधि विकसित की है प्रतिक्रियाओं. प्रत्येक BBL डिजाइन और विभिन्न सुरक्षा समूहों द्वारा देखते अच्छी तरह से परिभाषित प्रतिक्रिया के साथ संश्लेषित किया गया था. इस दृष्टिकोण का उपयोग करना, हेरफेर और मध्यवर्ती शुद्धि की रक्षा की जटिलताओं संश्लेषण के दौरान कम से कम किया जा सकता है, जो सबसे कठिन मुद्दों को स्वचालित संश्लेषण के विकास में दूर माना गया है. इस अग्रिम के बावजूद, विधि अभी भी काफी प्रतिबंधित है, के रूप में BBLs की संख्या बहुत छोटा है और Optimer कार्यक्रम केवल कुछ छोटे oligosaccharides संभाल कर सकते हैं. अधिक जटिल oligosaccharides है कि अधिक BBLs और एक पॉट प्रतिक्रियाओं और टुकड़ा संघनन के कई गुजरता की आवश्यकता के लिए, सॉफ्टवेयर प्रोग्राम का एक उन्नत संस्करण, ऑटो-CHO5,विकसित किया गया है.

ऑटो-सीएचओ में, BBL लाइब्रेरी के लिए परिभाषित प्रतिक्रिया के साथ 50,000 से अधिक BBLs 154 सिंथेटिक और 50,000 आभासी लोगों सहित जोड़ा गया है। इन बी बी एल को मूल गुणों, परिकलित एनएमआर रासायनिक पाली6,7, और आण्विक वर्णनकर्ता8के आधार पर मशीन लर्निंग द्वारा डिजाइन किया गया था, जो बीबीएल की संरचना और प्रतिक्रिया को प्रभावित करता है। इस उन्नत कार्यक्रम और उपलब्ध BBLs के नए सेट के साथ, संश्लेषण क्षमता का विस्तार किया है, और के रूप में प्रदर्शन किया, ब्याज की कई oligosaccharides तेजी से तैयार किया जा सकता है. यह माना जाता है कि इस नए विकास के विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं में उनकी भूमिका ओंकार के अध्ययन के लिए oligosaccharides के संश्लेषण और ग्लाइकोप्रोटीन और ग्लाइकोलिपिड के संरचनाओं और कार्यों पर उनके प्रभावों की सुविधा होगी. यह भी सोचा है कि इस काम ग्लाइकोसाइंस समुदाय काफी लाभ होगा, यह देखते हुए कि इस विधि से नि: शुल्क अनुसंधान समुदाय के लिए उपलब्ध है. आवश्यक मानव भ्रूण स्टेम सेल मार्कर का संश्लेषण, SSEA-45,इस काम में प्रदर्शन किया है.

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Protocol

1. ऑटो-सीएचओ सॉफ्टवेयर हेरफेर

  1. जावा रनटाइम वातावरण स्थापना: सुनिश्चित करें कि जावा रनटाइम वातावरण (JRE) डिवाइस में स्थापित किया गया है। JRE स्थापित किया गया है, तो अगले चरण पर जाएँ, "सॉफ़्टवेयर प्रारंभ"; अन्यथा, डाउनलोड और उपयोगकर्ता के ऑपरेटिंग सिस्टम के अनुसार JRE स्थापित पर पाया: lt;https://www.oracle.com/technetwork/जावा/जावाज़/downloads/index.html और
  2. सॉफ्टवेयर प्रारंभिक: पर ऑटो-CHO वेबसाइट पर जाएँ [lt;https://sites.google.com/view/auto-cho/home]gt; और ऑपरेटिंग सिस्टम के अनुसार सॉफ्टवेयर डाउनलोड करें। वर्तमान में, ऑटो-CHO विंडोज, macOS, और Ubuntu का समर्थन करता है। नवीनतम पीडीएफ उपयोगकर्ता गाइड ऑटो-CHO वेबसाइट पर प्रदान की जाती है.
    1. Windows उपयोगकर्ताओं के लिए, ऑटो-CHO$Windows.zip को अनज़िप करें और प्रोग्राम प्रारंभ करने के लिए Auto-CHO.Cho.zar पर स्वत:-CHO$Windows फ़ोल्डर में डबल-क्लिक करें.
      नोट: उपयोगकर्ता ज़िप फ़ाइल unpacking के लिए, इस तरह के 7-ज़िप के रूप में, खोलना सॉफ्टवेयर स्थापित करने की जरूरत है, पर पाया [lt;https://www.7-zip.org]gt;. उपयोगकर्ता भी जावा-zar स्वत:-CHO.zar आदेश Windows कमांड प्रॉम्प्ट द्वारा प्रोग्राम प्रारंभ करने के लिए उपयोग कर सकते हैं।
    2. MacOS उपयोगकर्ताओं के लिए, ऑटो-CHO.zar पर राइट-क्लिक करें और कार्यक्रम शुरू करने के लिए खोलें चुनें।
    3. Ubuntu उपयोगकर्ताओं के लिए:
      1. निम्न आदेश का उपयोग कर libcanberra-gtk स्थापित करें:
        [ sudo उपयुक्त-get install libcanberra-gtk*
      2. ऑटो-CHO$Ubuntu.shकी पहुँच अनुमति बदलें:
        [chmod 755 ऑटो-चॉ$Ubuntu.sh
      3. ऑटो-CHO प्रोग्राम चलाएँ:
        $ ./ऑटो-चॉ$Ubuntu.sh
  3. वांछित ग्लिकन संरचना इनपुट करें। ग्लाइकैन संरचना आरेखित करने या किसी मौजूदा संरचना फ़ाइल को पढ़ने के लिए चुनें।
    1. ड्राइंग द्वारा इनपुट:
      1. GlycanBuilder9,10 द्वारा संपादित Glycan पर क्लिक करें (चित्र 1, btn1; चित्र 2A) या GlycanBuilder द्वारा क्वेरी संरचना को आरेखित और संपादित करने के लिए सिंथेटिक लक्ष्य संपादित करने के लिए यहाँ क्लिक करें का क्षेत्र. लिंकेज और चिरावेदी जानकारी को नजरअंदाज नहीं किया जाना चाहिए। उदाहरण प्रदर्शित करने के लिए Globo-H, SSEA-4,या OligoLacNAc बटन पर क्लिक करें (चित्र 1, उदाहरण).
      2. फ़ाइल का चयन करें ] अनुक्रम स्वरूपों के लिए निर्यात करें | संपादित संरचना (वैकल्पिक) को बचाने के लिए GlycoCT संघनित करने के लिए निर्यात करें।
      3. संपादन पूर्ण करने के लिए GlycanBuilder संवाद बंद करें.
    2. कोई फ़ाइल पढ़कर इनपुट करें:
      1. GlycanBuilder द्वारा संपादित Glycan पर क्लिक करें (चित्र 1, btn1; चित्र 2A) या क्वेरी संरचना को संपादित करने के लिए सिंथेटिक लक्ष्य संपादित करने के लिए यहाँ क्लिक करें का क्षेत्र.
      2. फ़ाइल का चयन करें ] संबंधित स्वरूप के साथ क्वेरी संरचना फ़ाइल का चयन करने के लिए अनुक्रम स्वरूपों से आयात करें.
  4. खोज पैरामीटर सेटिंग्स (वैकल्पिक).
    1. उचित खोज परिणाम प्राप्त करने के लिए "पैरामीटर सेटिंग्स" टैब (चित्र 1, टैब2) में खोज पैरामीटर निर्धारित करें.
      नोट:
      उच्च वर्ग RRV की सीमा एक वास्तविक संख्या और $0 होना चाहिए.
      मध्यम वर्ग आरआरवी की थ्रेसहोल्ड एक वास्तविक संख्या और $0 होनी चाहिए।
      उच्च श्रेणी के आरआरवी की थ्रेसहोल्ड मध्यम वर्ग आरआरवी की थ्रेसहोल्डहोनी चाहिए।
      अधिकतम खंड संख्या एक पूर्णांक और $ 1 होना चाहिए.
      एक खंड में मिन BBL संख्या एक पूर्णांक और 1 और 3 के बीच होना चाहिए.
      एक खंड में अधिकतम BBL संख्या एक पूर्णांक और 1 और 3 के बीच होना चाहिए.
      एक खंड में अधिकतम BBL संख्या एक खंड में $ मिन BBLसंख्याहोना चाहिए .
      मिन दाता / स्वीकारकर्ता RRV अंतर एक सकारात्मक वास्तविक संख्या होना चाहिए.
      मिन दाता/स्वीकारकर्ता आरआरवी अनुपात एक सकारात्मक वास्तविक संख्या होना चाहिए।
      अधिकतम दाता/स्वीकारकर्ता आरआरवी अनुपात एक सकारात्मक वास्तविक संख्या होना चाहिए।
      अधिकतम दाता/स्वीकारकर्ता आरआरवी अनुपात होना चाहिए औरन्यूनतम दाता/स्वीकारकर्ता आरआरवी अनुपात|
    2. नई सेटिंग्स को सक्षम करने के लिए ठीक बटन पर क्लिक करें.
  5. बिल्डिंग ब्लॉक लाइब्रेरी का चयन करें (चित्र 1, टैब5)। डिफ़ॉल्ट सेटिंग केवल प्रयोगात्मक लायब्रेरी खोज करने के लिए है। यह प्रयोगात्मक और आभासी पुस्तकालयों दोनों खोज करने के लिए वांछित है, तो निम्न चरणों की जाँच करें।
    1. वर्चुअल बिल्डिंग ब्लॉक लाइब्रेरी टैब का चयन करें (चित्र 2C, टैब5)। प्रायोगिक और आभासी इमारत ब्लॉकों ऑटो-CHO की खोज की क्षमता को बढ़ाने के लिए एक साथ काम कर सकते हैं। वर्तमान में, ऑटो-सीएचओ पुस्तकालय में अनुमानित आरआरवी के साथ 50,000 से अधिक आभासी इमारत ब्लॉक प्रदान करता है।
    2. प्रायोगिक और वर्चुअल लाइब्रेरीज़ का उपयोग करें का चयन करें और कुछ मानदंडों के साथ वर्चुअल बिल्डिंग ब्लॉक्स प्रदर्शित करने के लिए फ़िल्टरिंग लागू करें. केवल चयनित वर्चुअल बिल्डिंग ब्लॉक्स (ओं) को दिखाने के लिए चयनित वर्चुअल BBL (s) बटन पर क्लिक करें (चित्र 2C,btn5).
    3. उपयोगकर्ता द्वारा निर्धारित कुछ मानदंडों के साथ केवल आभासी इमारत ब्लॉकों को दिखाने के लिए फ़िल्टर किए गए वर्चुअल BBL(s) बटन ( चित्र2C,btn6) पर क्लिक करें।
    4. सभी उपलब्ध आभासी इमारत ब्लॉकों को दिखाने और फिल्टर रीसेट करने के लिए सभी वर्चुअल BBL (s) बटन (चित्र 2C,btn7) दिखाएँ पर क्लिक करें।
    5. एक या एकाधिक वांछित आभासी इमारत ब्लॉकों है कि उपयोगकर्ता खोज के लिए उपयोग करना चाहते हैं की जाँच करें।
  6. क्वेरी संरचना टैब का चयन करें (चित्र 1, टैब 1) और क्वेरी संरचना के लिए एक-पोट सिंथेटिक समाधान ढूँढने के लिए खोज बिल्डिंग ब्लॉक लाइब्रेरी बटन (चित्र 1, btn2) पर क्लिक करें। उसके बाद, पैरामीटर सेटिंग्स की पुष्टि करें।
  7. परिणाम दर्शक खोजें.
    नोट: खोज परिणाम परिणाम दृश्यावलोकन टैब में दिखाया गया है (चित्र 1, टैब6)। विभिन्न अवशेष संख्याओं के कम करने वाले अंतिम स्वीकारकर्ताओं को समाप्त स्वीकारकर्ता स्तंभ(चित्र 1, व्यूअर1) में प्रदर्शित किया जाता है.
    1. कम करने के अंत स्वीकारकर्ता का चयन करें, और समाधान सिंथेटिक समाधान सूची ( चित्र 1, व्यूअर2) पर प्रदर्शित किएजातेहैं. खंड सूची में अंश दिखाए गए हैं (चित्र 1, दर्शक3) यह सुझाव देने के लिए कि संश्लेषण में कितने टुकड़ों का उपयोग किया जाना चाहिए।
      नोट: प्रणाली टुकड़ा के RRV सहित प्रत्येक टुकड़ा की विस्तृत जानकारी प्रदान करता है, कम्प्यूटेशनल उपज के रूप में के रूप में अच्छी तरह से जो सुरक्षा समूह एक पॉट प्रतिक्रिया में टुकड़ा के बाद के उपयोग के लिए deprotected किया जाना चाहिए. चयनित खंड को इकट्ठा करने के लिए उपयोग किए जाने वाले बिल्डिंग ब्लॉक चित्र 1 के दर्शक4 में दिखाए जातेहैं। चित्र 1 का viewer5 भी खंड कनेक्शन जानकारी प्रदर्शित करता है।
    2. प्रयोगात्मक भवन ब्लॉकों के लिए क्रमशः बिल्डिंग ब्लॉक और बिल्डिंग ब्लॉक ब्राउज़रकी रासायनिक संरचना के क्षेत्रों में रासायनिक संरचनाओं और विस्तृत जानकारी देखें और जांच करें(चित्र 1, टैब4)।
  8. पाठ (वैकल्पिक) के लिए खोज परिणाम आउटपुट.
    1. परिणाम पाठ टैब का चयन करें (चित्र 1, टैब7).
    2. परिणाम पाठ सहेजें पर क्लिक करें (चित्र 2B, btn4) और पाठ फ़ाइल गंतव्य का चयन करें।
  9. वर्चुअल बिल्डिंग ब्लॉक्स (वैकल्पिक) के लिए प्रतिक्रिया.
    नोट: प्रतिक्रिया ऑनलाइन प्रश्नावली के माध्यम से आभासी इमारत ब्लॉकों पर दिया जा सकता है। प्रतिक्रिया समुदाय उपयोगी आभासी इमारत ब्लॉकों रखने के लिए और अप्रभावी लोगों को दूर करने के लिए मदद कर सकते हैं।
    1. वर्चुअल बिल्डिंग ब्लॉक टैब का चयन करें (चित्र 1, टैब5)।
    2. वर्चुअल बिल्डिंग ब्लॉक की दर लिंक पर क्लिक करें जिसमें से यह प्रतिक्रिया स्तंभ में रेट या टिप्पणी करने के लिए वांछित है।
    3. सिस्टम के वेबपेज को खोलने और उसे सबमिट करने के बाद फ़ीडबैक फ़ॉर्म भरें.
      नोट: वर्चुअल BBL ID परिवर्तित न करें।

2. आरआरवी निर्धारण प्रयोग

  1. एक 10 एमएल दौर नीचे फ्लास्क में, दो थायोग्लाइकोसाइड दाताओं गठबंधन (0.02 प्रत्येक के mmol: डीआर4 ज्ञात RRV के साथ संदर्भ दाता है; डीएक्स1 अज्ञात आरआरवी का दाता अणु है, निरपेक्ष मेथनॉल (0.10 एममोल), और डाइक्लोरोमेथेन में ड्रीराइट (डीसीएम, 1.0 एमएल), फिर 1 ज के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर हलचल।
  2. इस मिश्रण (30 डिग्री सेल्सियस) के एक alicot ले लो और तीन अलग इंजेक्शन में उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC) में मिश्रण इंजेक्ट (10 प्रत्येक इंजेक्शन के लिए $L). अवशोषण के बीच गुणांक (ं) को मापें (क) और दाता अणु की सांद्रता [द] आधारभूत पृथक्करण स्थितियों के अंतर्गत (ईथर ऐसीटेट/द-हेक्सेने ] 20/80) का उपयोग करें।
  3. प्रतिक्रिया मिश्रण में 0.5 एम एन-आइडोसुसिनिमाइड (एनआईएस) (एनआईएस) का एक समाधान जोड़ें, इसके बाद प्रतिक्रिया मिश्रण में 0.1 एम ट्राइफ्लोरोमेथेनसल्फोनिक एसिड (टीएफएएच) समाधान (20 डिग्री सेल्सियस, 0.002 एममोल) के अलावा, और 2 एच के लिए आर टी पर मिश्रण हलचल।
  4. डीसीएम (4.0 एमएल) के साथ प्रतिक्रिया मिश्रण को पतला करें, फिल्टर, और संतृप्त जलीय सोडियम थायोसल्फेट के साथ धोने 10% सोडियम हाइड्रोजन कार्बोनेट (2x 5 एमएल मात्रा प्रत्येक के साथ) युक्त। DCM के साथ जलीय परत निकालें (3x के साथ 5 एमएल). सभी कार्बनिक परत का मिश्रण, यह नमकीन के 5 एमएल के साथ धो लें, और यह लगभग के साथ सूखी 200 anhydrous मैग्नीशियम सल्फेट की मिलीग्राम.
  5. 30 s के लिए हल्के मिश्रण हिला, मैग्नीशियम सल्फेट को दूर करने के क्रम में एक बांसुरी फिल्टर कागज के साथ एक कीप के माध्यम से फिल्टर, तो एक 25 एमएल दौर नीचे फ्लास्क में छानना इकट्ठा। एक रोटरी वाष्पित्र का उपयोग कर विलायक निकालें।
  6. डीसीएम (1.0 एमएल) में अवशेषों को भंग करें। इस मिश्रण (30 डिग्री सेल्सियस) का एक एलिकोट लें और इसे तीन अलग-अलग इंजेक्शनों (प्रत्येक इंजेक्शन के लिए 10 डिग्री एल) में एचपीएलसी में इंजेक्ट करें। शेष दाताओं की सांद्रता को मापने के लिए ([डीएक्स] और [डीref]) एक ही जुदाई शर्तों के तहत HPLC द्वारा (ईथर एसीटेट/n-Hexane ] 20/80) (Aref)t $ 24417.0, (Ax)t $ 23546.3.
  7. Dx1 बनाम Dr4के बीच सापेक्ष प्रतिक्रिया को मापें, kx1/kr4 ] 0.0932. Dr4के सापेक्ष अभिक्रियाशीलता मान के आधार पर, Dx1 का सापेक्ष अभिक्रियाशीलता मान 3 है.
    नोट: एक $ एक/ [डी], (एकref)0 $ 74530.1, (एकएक्स)0 $ 26143.0. के x/kref ] (ln]Dx]t - ln]Dx]0)/ ग]t - ln]Ax]0 )/

3. SSEA-4 के एक पॉट ग्लाइकोसिलेशन

  1. वैक्यूम के तहत एक 10 एमएल गोल-नीचे फ्लास्क रखें, लौ-सूखा, और फ्लास्क को वैक्यूम के तहत अभी भी आरटी को ठंडा करने की अनुमति दें। disaccharide 1 दाता का एक मिश्रण जोड़ने के लिए रबर पट निकालें (38 मिलीग्राम, 1.1 eQ., 0.057 mmol), पहले स्वीकारकर्ता 2 (40 मिलीग्राम, 1.0 eQ., 0.053 mmol) और एक Teflon लेपित चुंबकीय हलचल पट्टी फ्लास्क में.
  2. स्थानांतरण 100 मिलीग्राम पाउडर आणविक छलनी 4 $ एक 5 एमएल गोल नीचे फ्लास्क में. इस फ्लास्क को वैक्यूम के नीचे रखें, लौ-ड्राई करें, और फ्लास्क को वैक्यूम के तहत अभी भी आरटी को ठंडा करने की अनुमति दें। पहले फ्लास्क में ताजा सूखे 4 - आणविक छलनी को स्थानांतरित करें जिसमें प्रारंभिक सामग्री शामिल है।
  3. फ्लास्क में ताजा सूखे डीसीएम के 1 एमएल स्थानांतरण। RT पर 1 h के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण हिलाओ और फिर यह -40 डिग्री सेल्सियस के तापमान के नीचे जगह है। एनआईएस (13 मिलीग्राम, 1.1 ई., 0.057 एममोल) को फ्लास्क में स्थानांतरित करें।
  4. -40 डिग्री सेल्सियस पर एक सूक्ष्म मात्रा सिरिंज का उपयोग करपटा के माध्यम से फ्लास्क में TfOH (34 डिग्री सेल्सियस, 0.3 eQ., 0.017 mmol, 0.5 M) को पट के माध्यम से फ्लास्क में इंजेक्ट करें। 3 ज के लिए -40 डिग्री सेल्सियस पर हिलाते रहें।
  5. पहले स्वीकारकर्ता 2 के लगभग सेवन करने के बाद, ग्राही 3 का समाधान डीसीएम में पट के माध्यम से फ्लास्क में इंजेक्ट करें।
  6. फ्लास्क में प्रतिक्रिया मिश्रण को -20 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें और एनआईएस (19 मिलीग्राम, 1.6 ईक्यू, 0.083 एममोल) को स्थानांतरित करें। -20 डिग्री सेल्सियस पर पट के माध्यम से फ्लास्क में TfOH (34 डिग्री सेल्सियस, 0ण्3 ईक्यू., 0ण्017 ममोल, 0ण्5 म) को फ्लास्क में इंजेक्ट करें। 3 ज के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर हिलाते रहें।
  7. पहले कदम प्रतिक्रिया के उत्पाद का सेवन किया जाता है के बाद, triethyl amine के दो समकक्ष इंजेक्शन द्वारा प्रतिक्रिया बुझाने. सेलाइट के साथ पैक एक फिल्टर कीप के माध्यम से आणविक छलनी निकालें, एक 25 एमएल गोल नीचे फ्लास्क में छानना इकट्ठा करने और आगे डीसीएम के 10 एमएल के साथ फिल्टर धोने।
  8. छान एक विभाजक कीप में निस्पंदन स्थानांतरण और संतृप्त जलीय सोडियम thiosulfate युक्त 10% NaHCO3 (2x 10 एमएल प्रत्येक के साथ) के साथ धो लें। DCM के साथ जलीय परत निकालें (3x के साथ 10 एमएल). कार्बनिक परतों को मिलाकर मिश्रण को लवणीय (10 एमएल) से धो लें और इसे हाइड्रोस MgSO4डालकर सुखा लें। यह फ़िल्टर और एक 100 एमएल दौर नीचे फ्लास्क में छानना इकट्ठा.
  9. एक रोटरी वाष्पित्र का उपयोग कर विलायक निकालें। लगभग 1 एमएल डीसीएम के साथ कच्चे मिश्रण को भंग करें और इसे सिलिका बिस्तर के शीर्ष पर लोड करें। एथिल एसीटेट और टॉलूईन के मिश्रण के साथ उत्पाद को एथिल एथियोट (EtOAc/toluene, 1/4 से 1$2) के मिश्रण के साथ एल्यूट करें और भिन्नों को एकत्र करें।
  10. एक रोटरी वाष्पित्र का उपयोग कर विलायक निकालें। कम दबाव के तहत अवशेषों सूखी पूरी तरह से संरक्षित SSEA-4 व्युत्पन्न 4 (74 मिलीग्राम, 50% स्वीकारकर्ता के आधार पर देने के लिए 2)सफेद फोम के रूप में.

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Representative Results

डिफ़ॉल्ट पैरामीटर सेटिंग्स के आधार पर ऑटो-चॉ खोज परिणाम SSEA-4 एक द्वारा संश्लेषित किया जा सकता इंगित करता है [2 + 1 + 3] एक पॉट प्रतिक्रिया. चित्रा 3 SSEA-4 खोज परिणाम के सॉफ्टवेयर स्क्रीनशॉट से पता चलता है. जब एक trisaccharide कम करने के अंत स्वीकारकर्ता का चयन किया जाता है (चित्र 3, लेबल 1), प्रोग्राम क्वेरी के लिए चार संभावित समाधान दिखाता है. पहले समाधान में एक खंड है(चित्र 3, लेबल 2) और इसकी परिकलित उपज लगभग 94% है। खंड दो BBLs द्वारा संश्लेषित किया जा सकता है (चित्र 3, लेबल 3). पहले डिसकैरिड बीबीएल की आरआरवी 1462 और दूसरी मोनोसैकराइड की आरआरवी 32.0 है। चित्र 3 का लेबल 4 एक-पोट अभिक्रिया में प्रयुक्त प्रथम सुझाई गई बीबीएल की रासायनिक संरचना को दर्शाता है। एक-पोट प्रयोग से पता चलता है कि SSEA-4 को इस सुझाव द्वारा सफलतापूर्वक 43% उपज में संश्लेषित किया जा सकता है (चित्र 4) और यह भी पिछलेकार्य5 में प्रदर्शित किया गया है . विस्तार प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं और उल्लेख यौगिकों की विशेषता, विशेष रूप से SSEA-4 उद्धृत संदर्भ5में पाया जा सकता है.

Figure 1
चित्रा 1: ऑटो-चो स्क्रीनशॉट. उपयोगकर्ता क्वेरी ग्लिकन संरचना को संपादित कर सकते हैं, प्रयोगात्मक और आभासी इमारत ब्लॉक जानकारी ब्राउज़ कर सकते हैं, और सॉफ्टवेयर द्वारा प्रदान किए गए एक पॉट सिंथेटिक समाधान देख सकते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र2: ऑटो-सीएचओ सॉफ्टवेयर के आंशिक स्क्रीनशॉट। (A) "Query Structure" टैब (tab1) में "GlycanBuilder द्वारा Glycan संपादित करें" बटन (btn1) क्लिक करें और सिस्टम GlycanBuilder संवाद पॉप अप करता है. (B) "परिणाम पाठ" (tab7) का चयन करें और पाठ खोज परिणामों को सहेजने के लिए "परिणाम पाठ सहेजें" (btn4) पर क्लिक करें। (सी)"वर्चुअल बिल्डिंग ब्लॉक लाइब्रेरी" (tab5) का चयन करें और विकल्पों को फ़िल्टर करके खोज के लिए वांछनीय आभासी इमारत ब्लॉकों की जांच करें। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: ऑटो-सीएचओ कार्यक्रम द्वारा दिया गया एक-पोट सिंथेटिक खाका। लेबल 1: अंतिम स्वीकारकर्ता को कम करना. लेबल 2: खंड. लेबल 3: टुकड़ा के बिल्डिंग ब्लॉक. लेबल 4: चयनित बिल्डिंग ब्लॉक की रासायनिक संरचना. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: [2 + 1 + 3] SSEA-4 के लिए एक पॉट सिंथेटिक रणनीति. SSEA-4 ऑटो-चॉ द्वारा सुझाए गए तीन इकाइयों द्वारा संश्लेषित किया जा सकता है: sialyl disaccharide इमारत ब्लॉक 1 (RRV $1,462), monosaccharide इमारत ब्लॉक 2 (RRV $32.0), और अंत स्वीकारकर्ता को कम करने 3 (RRV$0). यह आंकड़ा अनुमति के साथ हमारे पिछले प्रकाशन5 से संशोधित किया गया था (एक क्रिएटिव कॉमन्स रोपण 4.0 अंतर्राष्ट्रीय लाइसेंस के तहत: http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

ऑटो-सीएचओ सॉफ्टवेयर को ऑलिगोसैकेराइड्स5के पदानुक्रमित और प्रोग्रामेबल वन-पोट संश्लेषण को आगे बढ़ाने के लिए केमिस्टों की सहायता के लिए विकसित किया गया था। ऑटो-CHO जावा प्रोग्रामिंग भाषा द्वारा बनाया गया था. यह एक जीयूआई सॉफ्टवेयर और पार मंच है, जो वर्तमान में विंडोज, macOS, और Ubuntu का समर्थन करता है. सॉफ्टवेयर पर ऑटो-चो वेबसाइट के लिए नि: शुल्क डाउनलोड किया जा सकता है lt;https://sites.google.com/view/auto-cho/home;, और एमआईटी लाइसेंस के साथ अपने स्रोत कोड पर GitHub से पहुँचा जा सकता है;https://github.com/CW-Wayne/Auto-CHO-gt;

ऑटो-सीएचओ के BBL पुस्तकालय में 154 प्रयोगात्मक BBLs और 50,000 से अधिक आभासी BBLs के साथ सही भविष्यवाणी RRVs. वर्तमान में, आभासी BBLs के चीनी प्रकार लड़की, Glc, आदमी, GalNAc, GlcN, और GlcA शामिल हैं. सभी लायब्रेरी खोज स्थानीय मशीन में संसाधित किए जाते हैं और हम उपयोगकर्ताओं से कोई क्वेरी संरचना एकत्रित नहीं करते। चूंकि ऑटो-CHO कार्यक्रम द्वारा दिए गए आभासी BBLs के बीच उच्च उपज संश्लेषण की सफलता की गारंटी नहीं दे सकता (कई संरचनात्मक बाधाओं या रासायनिक प्रतिक्रियाओं में अज्ञात कारकों के कारण), ऑटो-CHO आभासी BBLs के लिए ऑनलाइन प्रतिक्रिया प्रश्नावली प्रदान करता है. यह माना जाता है कि अनुसंधान समुदाय से उपयोगकर्ता प्रतिक्रिया मूल्यवान आभासी BBLs रखने में मदद कर सकते हैं और अनुपयुक्त लोगों को खत्म. एक ईमेल पता सॉफ्टवेयर उपयोगकर्ता गाइड में तकनीकी सहायता के लिए प्रदान की जाती है. उपयोगकर्ता तकनीकी प्रश्नों या समस्याओं का सामना अगर वे इस पते से संपर्क कर सकते हैं।

दो खोज रणनीतियों यहाँ प्रदान की जाती हैं. पैरामीटर सेटिंग्स (अनुभाग 1.4) के लिए, यह शुरुआत में सख्त मापदंड के साथ पैरामीटर सेट करने के लिए सुझाव दिया है। ऑटो-CHO संतुष्ट सिंथेटिक समाधान वापस नहीं करता है, तो यह अगले खोज रन में और अधिक लचीला पैरामीटर का उपयोग करने के लिए सलाह दी जाती है। BBL पुस्तकालय (अनुभाग 1.5) के चयन के लिए, यह केवल पहली बार में प्रयोगात्मक पुस्तकालय खोज करने के लिए सुझाव दिया है. यदि सॉफ्टवेयर किसी भी उपयुक्त समाधान वापस नहीं करता है, यह निम्नलिखित पुनरावृत्तियों में प्रयोगात्मक और आभासी पुस्तकालयों खोज करने के लिए सलाह दी जाती है.

सारांश में, इस प्रोटोकॉल ऑटो-चॉ सॉफ्टवेयर के संचालन और SSEA-4 अणु के एक पॉट संश्लेषण के लिए ऑटो-चॉ का उपयोग दर्शाता है। इसके अलावा, प्रोग्राम एक पॉट प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है. ऑटो-CHO पुस्तकालय के साथ जीयूआई और खुला स्रोत सॉफ्टवेयर मान्य और आभासी BBLs भी शामिल है, और यह oligosaccharides के पदानुक्रमित एक पॉट संश्लेषण का समर्थन करता है। यह माना जाता है कि इस सॉफ्टवेयर अनुसंधान समुदाय को लाभ कर सकते हैं और अधिक आवश्यक oligosaccharides आगे अनुसंधान के लिए ऑटो-चो के माध्यम से एक पॉट प्रतिक्रियाओं द्वारा संश्लेषित किया जा सकता है.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

इस कार्य को शिखर सम्मेलन कार्यक्रम, विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय [सबसे 104-0210-01-09-02, सबसे 105-0210-01-13-01, सबसे 106-0210-01-15-02], और एनएसएफ (1664283) सहित एकेडमिया साइना द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetonitrile Sigma-Aldrich 75-05-8
Anhydrous magnesium sulfate Sigma-Aldrich 7487-88-9
Cerium ammonium molybdate TCI C1794
Dichloromethane Sigma-Aldrich 75-09-2
Drierite Sigma-Aldrich 7778-18-9
Ethyl acetate Sigma-Aldrich 141-78-6
Methanol Sigma-Aldrich 67-56-1
Molecular sieves 4 Å Sigma-Aldrich
n-Hexane Sigma-Aldrich 110-54-3
N-Iodosuccinimide Sigma-Aldrich 516-12-1
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich 144-55-8
Sodium thiosulfate Sigma-Aldrich 10102-17-7
Toluene Sigma-Aldrich 108-88-3
Trifluoromethanesulfonic acid Sigma-Aldrich 1493-13-6

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References

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रसायन विज्ञान अंक 151
पदानुक्रमिक और प्रोग्रामेबल वन-पोट ओलिगोसैकराइड संश्लेषण
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Cheng, C. W., Zhou, Y., Pan, W. H.,… More

Cheng, C. W., Zhou, Y., Pan, W. H., Dey, S., Wu, C. Y., Hsu, W. L., Wong, C. H. Hierarchical and Programmable One-Pot Oligosaccharide Synthesis. J. Vis. Exp. (151), e59987, doi:10.3791/59987 (2019).

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