Summary
このプロトコルは、オリゴ糖の階層的かつプログラム可能なワンポット合成のためにAuto-CHOソフトウェアを使用する方法を示しています。また、RRV判定実験およびSSEA-4のワンポットグリコシル化の一般的な手順についても説明する。
Abstract
この記事では、プログラマブルワンポットオリゴ糖合成のための一般的な実験プロトコルを紹介し、潜在的な合成ソリューションを生成するためにAuto-CHOソフトウェアを使用する方法を示します。プログラム可能な1ポットオリゴ糖合成アプローチは、チオグリコシドビルディングブロック(LLL)を使用して大量の高速オリゴ糖合成を、相対反応性値(RRV)の適切な順に与えるように設計されています。Auto-CHOは、BBLライブラリ(約150の検証済みおよび>50,000仮想BbLを含む)を検索することにより、プログラマブルワンポットオリゴ糖合成のための可能な合成ソリューションを提供するグラフィカルユーザーインターフェイスを備えたクロスプラットフォームソフトウェアです。サポートベクトル回帰によって正確に予測されたRRV。階層的なワンポット合成のアルゴリズムはAuto-CHOで実装されており、ワンポット反応によって生成されたフラグメントを新しいBbLとして使用しています。さらに、Auto-CHOは、ユーザーがさらなる使用のために貴重なものを保つために仮想Bblのためのフィードバックを与えることができます。本研究では、多能性ヒト胚性幹細胞マーカーであるステージ特異的胚性抗原4(SSEA-4)のワンポット合成が実証されている。
Introduction
炭水化物は、自然1、2ではユビキタスであるが、その存在と行動様式は、主に分子3のこのクラスへのアクセスが困難なため、未知の領域のままである。オリゴペプチドおよびオリゴヌクレオチドの自動合成とは異なり、オリゴ糖の自動合成の開発は依然として困難な作業であり、進歩は比較的遅い。
この問題に取り組むために、Wong et al.は、オプティマー4と呼ばれるプログラム可能なソフトウェアプログラムを使用して、オリゴ糖の合成のための最初の自動化された方法を開発し、約50のBbLのライブラリから連続したワンポットのBbLの選択を導きます。反応。各BBLは、様々な保護グループによって調整された明確に定義された反応性で設計され、合成されました。このアプローチを用いると、合成時の操作や中間精製の複雑さを最小限に抑えることができ、自動合成の開発において克服するのが最も困難な課題と考えられてきた。この進歩にもかかわらず、BbLの数が少なすぎて、Optimerプログラムは特定の小さなオリゴ糖しか扱うことができないので、この方法はまだかなり制限されています。より多くのBBLとワンポット反応と断片凝縮の複数のパスを必要とするより複雑なオリゴ糖のために、ソフトウェアプログラムのアップグレード版Auto-CHO5が開発されました。
Auto-CHO では、BBL ライブラリに対して定義された反応性を持つ 50,000 を超える BBL が追加され、154 の合成および 50,000 の仮想ライブラリが追加されました。これらのBblは、基本的な特性に基づいて機械学習によって設計され、計算されたNMR化学シフト6、7、および分子記述子8は、Bblの構造および反応性に影響を与える。このアップグレードされたプログラムと利用可能な新しいBbLのセットにより、合成容量が拡張され、実証されているように、関心のあるいくつかのオリゴ糖を迅速に準備することができます。この新しい開発は、様々な生物学的プロセスにおける役割の研究と糖タンパク質および糖脂質の構造と機能への影響を研究するためのオリゴ糖の合成を促進すると考えられている。また、この方法が研究コミュニティに無料で利用できる場合、この研究はグリコサイエンスコミュニティに大きな利益をもたらすと考えられています。本研究では、必須ヒト胚性幹細胞マーカーSSEA-45の合成が実証されている。
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Protocol
1. 自動チョーソフトウェア操作
- Java ランタイム環境のインストール: Java ランタイム環境 (JRE) がデバイスにインストールされていることを確認します。JRE がインストールされている場合は、次のステップである「ソフトウェア初期化」に進みます。それ以外の場合は、次の場所にあるユーザーのオペレーティング システムに従って JRE をダウンロードしてインストールしてください。
- ソフトウェアの初期化:
- Windows ユーザーの場合は、Auto-CHO_Windows.zipを解凍し、Auto-CHO_Windowsフォルダー内のAuto-CHO.jarをダブルクリックしてプログラムを起動します。
注: ユーザーは、zip ファイルを解凍するために、 - macOS ユーザーの場合は、Auto-CHO.jarを右クリックし、[開く]を選択してプログラムを起動します。
- Ubuntuユーザーの場合:
- 次のコマンドを使用して libcanberra-gtk をインストールします。
$ sudo apt-get インストール libcanberra-gtk* - 自動 CHO_Ubuntu.shのアクセス許可を変更します。
$ chmod 755自動CHO_Ubuntu.sh - 自動 CHO プログラムを実行します。
$ ./自動チョ_Ubuntu.sh
- 次のコマンドを使用して libcanberra-gtk をインストールします。
- Windows ユーザーの場合は、Auto-CHO_Windows.zipを解凍し、Auto-CHO_Windowsフォルダー内のAuto-CHO.jarをダブルクリックしてプログラムを起動します。
- 所望のグリカン構造を入力します。グリカン構造を描画するか、既存の構造ファイルを読み取るかを選択します。
- 描画による入力:
- グリカンビルダー9,10(図1、btn1;図 2A)または、ここをクリックして合成ターゲットを編集し、GlycanBuilder によってクエリ構造を描画および編集します。リンケージとキラリティ情報は無視しないでください。例を表示するには、Globo-H、SSEA-4、またはOligoLacNAcボタン (図 1、 例) をクリックします。
- ファイルの選択|シーケンス形式にエクスポート |編集した構造体を保存するために、GlycoCT にコンデンスにエクスポートします(オプション)。
- GlycanBuilder ダイアログを閉じて編集を完了します。
- ファイルを読み取って入力する:
- グリカンビルダーによるグリカン編集をクリックしてください (図 1, btn1;図 2A)または[ここをクリック] の領域をクリックして合成ターゲットを編集し、クエリ構造を編集します。
- ファイルの選択|シーケンス形式からインポートして、対応する形式のクエリ構造ファイルを選択します。
- 描画による入力:
- パラメータ設定を検索します(オプション)。
- [パラメータ設定]タブ (図 1、 tab2) で検索パラメータを定義して、妥当な検索結果を得ます。
メモ：
ハイクラス RRV のしきい値は、実数と ≥0 である必要があります。
中クラス RRV のしきい値は、実数と ≥0 である必要があります。
ハイクラス RRV のしきい値は、中クラス RRV のしきい値である必要があります。
最大フラグメント番号は整数と ≥1 である必要があります。
フラグメント内の分 BBL 番号は整数で、1 ~ 3 の間でなければなりません。
フラグメント内の最大 BBL 番号は整数で、1 ~ 3 の間でなければなりません。
フラグメント内の最大 BBL 番号は、フラグメント内の最小 BBL 番号である必要があります。
分ドナー/受け入れ者 RRV 差異は正の実数でなければなりません。
分ドナー/受入者 RRV 比率は正の実数でなければなりません。
最大ドナー/受入者 RRV 比率は正の実数でなければなりません。
最大ドナー/受入者 RRV 比率は >最小ドナー/受諾者 RRV 比率である必要があります。 - [OK]ボタンをクリックして、新しい設定を有効にします。
- [パラメータ設定]タブ (図 1、 tab2) で検索パラメータを定義して、妥当な検索結果を得ます。
- ビルディング ブロック ライブラリを選択します (図 1、tab5)。既定の設定では、実験ライブラリのみを検索します。実験ライブラリと仮想ライブラリの両方を検索する場合は、次の手順を確認してください。
- 仮想ビルディング ブロック ライブラリタブ (図 2C、タブ5) を選択します。実験的なビルディングブロックと仮想ビルディングブロックは、Auto-CHOの検索能力を高めるために連携することができます。現在、Auto-CHO は、ライブラリ内の予測 RrV を含む 50,000 を超える仮想ビルディング ブロックを提供しています。
- [実験ライブラリと仮想ライブラリを使用]を選択し、フィルタリングを適用して、特定の条件を持つ仮想構成要素を表示します。選択した仮想 BBL を表示するボタン (図 2C、 btn5) をクリックすると、選択した仮想ビルディング ブロックのみが表示されます。
- [フィルタリングされた仮想 BBL の表示]ボタン (図 2C、 btn6) ボタンをクリックすると、ユーザーが定義した特定の条件を持つ仮想ビルディング ブロックのみが表示されます。
- [すべての仮想 BBL を表示]ボタン (図 2C、 btn7) をクリックして、使用可能なすべての仮想ビルディング ブロックを表示し、フィルタをリセットします。
- ユーザーが検索に使用する 1 つまたは複数の必要な仮想ビルディング ブロックを確認します。
- [クエリ構造]タブ (図 1、 tab1) を選択し、[検索ビルディング ライブラリ]ボタン (図 1、 btn2) をクリックして、クエリ構造の 1 ポット合成ソリューションを検索します。次に、パラメータ設定を確認します。
- 結果ビューアを検索します。
注: 検索結果は、結果の視覚化タブ (図 1、 tab6) に表示されます。異なる残量番号の削減終了受諾器は、リジェクションエンドインセプター列に表示されます (図 1, viewer1)。- リデュースエンドの受け入れ受諾者を選択すると、合成ソリューションリスト(図1、viewer2)にソリューションが表示されます。フラグメントリスト (図 1, viewer3) には、合成に使用するフラグメントの数を示します。
注: システムは、フラグメントの RRV、計算収率、および 1 ポット反応でフラグメントを後続的に使用するために保護する必要がある保護グループを含む、各フラグメントの詳細情報を提供します。選択したフラグメントの組み立てに使用する構成要素は、図 1 の viewer4 に示されています。図 1の viewer5 には、フラグメント接続情報も表示されます。 - 化学構造と、建物ブロックブラウザの化学構造の領域で選択した構成要素の詳細情報を表示および確認し、それぞれ実験的な構成要素(図)1,タブ4)。
- リデュースエンドの受け入れ受諾者を選択すると、合成ソリューションリスト(図1、viewer2)にソリューションが表示されます。フラグメントリスト (図 1, viewer3) には、合成に使用するフラグメントの数を示します。
- 検索結果をテキストに出力します (オプション)。
- [結果テキスト]タブ (図 1、 tab7) を選択します。
- 結果テキストの保存(図 2B,btn4) をクリックし、テキスト ファイルの宛先を選択します。
- 仮想ビルディング ブロックのフィードバック (オプション)。
注: フィードバックは、オンラインアンケートを通じて仮想ビルディングブロックに対して行うことができます。フィードバックは、コミュニティが有用な仮想ビルディングブロックを維持し、効果のあるブロックを削除するのに役立ちます。- [仮想ビルディング ブロック]タブ (図 1、タブ5) を選択します。
- [フィードバック]列で評価またはコメントを行う仮想構成要素の [評価先] リンクをクリックします。
- システムが Web ページを開いて送信した後、フィードバック フォームに入力します。
注: 仮想 BBL ID は変更しないでください。
2. RRV判定実験
- 10 mLの丸底フラスコで、2つのチオグリコシドドナー(それぞれ0.02 mmol:Dr4は既知のRRVを有する参照ドナーである。Dx1は、未知のRRVのドナー分子であり、絶対メタノール(0.10mmol)、およびジクロロメタン中のドリライト(DCM、1.0mL)、次いで室温(RT)で1時間撹拌する。
- この混合物(30 μL)のアリコートを取り、3つの別々の注射(各注入のための10 μL)で高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)に混合物を注入します。ベースライン分離条件下でのドナー分子(A)とドナー分子[D]の濃度との間の係数(a)を測定します(エーテル酢酸/n-ヘキサン=20/80)。
- アセトニトリル(40μL、0.02 mmol)中に0.5M N-イオドシュチニミド(NIS)の溶液を反応混合物に加え、続いて0.1Mトリフルオロメタンスルホン酸(TfOH)溶液(20 μL、0.002 mmol)を加え、RTで撹拌する。
- DCM(4.0mL)で反応混合物を希釈し、フィルター、炭酸水素ナトリウム10%を含む飽和水性チオサルフェート(それぞれ5mL量で2倍)で洗浄する。DCM(5 mLで3倍)で水層を抽出します。すべての有機層を組み合わせ、5 mLの塩水で洗い、約200mgの無水マグネシウム硫酸マグネシウムで乾燥させます。
- 混合物を30sのために軽く振り、硫酸マグネシウムを除去するためにフルートフィルターペーパーで漏斗を通して濾過し、25 mLの丸底フラスコで濾液を収集します。ロータリーエバポレーターを使用して溶媒を取り除く。
- 残渣をDCM(1.0mL)で溶解します。この混合物(30 μL)のアリコートを取り、3つの別々の注射(注射ごとに10 μL)でHPLCに注入します。同じ分離条件下でHPLCによる残りのドナーの濃度([Dx]および[D参照])を測定する(エーテル酢酸塩/n-ヘキサン=20/80)(Aref)t= 24417.0、(Ax) t= 23546.3。
- Dx1対 Dr4 、kx1/kr4 = 0.0932 の間の相対反応を測定します。Dr4の相対反応性値に基づいて、Dx1の相対反応性値は 3 です。
注: a = A/[D]、(Aref)0 = 74530.1、 (Ax)0 = 26143.0。kx/kref = (ln[Dx]t - ln [Dx]0)/(ln[Dref]t - ln [Dref]0) = ( ln [ x]t - ln [Ax]0)/(ln[Aref]t - ln [Aref]0) = 0.0932 。
3. SSEA-4のワンポットグリコシル化
- 10mLの丸底フラスコを真空下に置き、火炎乾燥させ、フラスコを真空中でRTに冷却させます。ゴム中隔を取り除き、二糖1ドナー(38mg、1.1 eq.、0.057 mmol)、最初のアクセプター2(40mg、1.0 eq.、0.053 mmol)とテフロンコーティングされた磁気攪拌バーをフラスコに加えます。
- 粉末分子篩4Åの100mgを5mLの丸底フラスコに移す。このフラスコを真空の下に保管し、火炎乾燥させ、フラスコを真空中でRTに冷却させます。乾燥させた4Å分子篩を出発物質を含む最初のフラスコに移します。
- 乾燥させたてのDCMを1mLのフラスコに移します。RTで1時間の反応混合物をかき混ぜ、-40°Cの温度の下に置きます。NIS(13mg、1.1 eq.、0.057 mmol)をフラスコに移します。
- TfOH(34 μL、0.3 eq.、0.017 mmol、0.5 M in エーテル)を-40 °Cのマイクロ体積シリンジを使用して中隔を通してフラスムに注入します。-40 °Cで3時間撹拌を続けます。
- 最初の受け入れ器2がほぼ消費された後、中隔を通してフラスコにDCM中の受理器3の溶液を注入する。
- 反応混合物を-20 °Cまで温め、NIS(19mg、1.6 eq.、0.083 mmol)をフラスコに移します。TfOH(34 μL、0.3 eq.、0.017 mmol、0.5 M in エーテル)を-20 °Cで中隔を通してフラスコに注入します。-20 °Cで3時間撹拌を続けます。
- 第1工程反応の産物が消費された後、トリエチルアミンの2つの同等物を注入して反応をクエンチする。セライトを詰めたフィルター漏斗を通して分子ふるいを取り出し、25 mLの丸底フラスコに濾液を集め、さらにDCMの10 mLでフィルターを洗浄します。
- 濾液を分離漏斗に移し、10%NaHCO3(それぞれ10mLで2倍)を含む飽和水性チオサルフェートで洗浄する。DCM(10 mLで3倍)で水層を抽出します。有機層を組み合わせ、塩水(10 mL)で混合物を洗浄し、無水MgSO 4を追加して乾燥させます。それをフィルタリングし、100 mLの丸底フラスコで濾液を収集します。
- ロータリーエバポレーターを使用して溶媒を取り除く。DCMの約1 mLで粗混合物を溶解し、シリカベッドの上にロードします。酢酸エチルとトルエン(EtOAc/トルエン、1/4~1/2)を混ぜて溶出し、画分を回収します。
- ロータリーエバポレーターを使用して溶媒を取り除く。減圧下で残渣を乾燥し、完全に保護されたSSEA-4誘導体4(74mg、50%、インセプター2に基づく50%)を白い泡として与える。
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Representative Results
デフォルトのパラメータ設定に基づく自動CHO検索結果は、SSEA-4が[2 + 1 + 3]ワンポット反応によって合成できることを示しています。図 3は、SSEA-4 検索結果のソフトウェアスクリーンショットを示しています。三糖類削減エンドアクセプターが選択されている場合(図3、ラベル1)、プログラムはクエリの4つの潜在的な解決策を示します。最初の解は1つのフラグメント(図3、ラベル2)を有し、その計算された収率は約94%である。フラグメントは、2つのBbL(図3、ラベル3)によって合成することができる。最初の二糖 BBL の RRV は 1462 で、2 番目の単糖の RRV は 32.0 です。図3の標識4は、ワンポット反応に用いられる最初の提案BBLの化学構造を示す。ワンポット実験は、SSEA-4がこの提案によって43%の収率で合成できることを示し(図4)、前作5でも実証されている。詳細な実験手順および前述の化合物の特性、特にSSEA-4は引用された文献5に見出すことができる。
図 1: 自動 CHO のスクリーンショット。ユーザーは、クエリグリカン構造を編集し、実験的および仮想ビルディングブロック情報を参照し、ソフトウェアが提供するワンポット合成ソリューションを表示することができます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:自動CHOソフトウェアの部分的なスクリーンショット。(A)「クエリ構造」タブ(tab1)の「グリカンビルダーでグリカンを編集」ボタン(btn1)をクリックすると、システムがGlycanBuilderダイアログをポップアップ表示します。(B)「結果テキスト」(tab7)を選択し、「結果テキストを保存」(btn4)をクリックしてテキスト検索結果を保存します。(C)「仮想ビルディングブロックライブラリ」(tab5)を選択し、フィルタオプションで検索するための望ましい仮想ビルディングブロックを確認します。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3: Auto-CHO プログラムによって与えられたワンポット合成青写真。ラベル 1: エンド エンダを減らす。ラベル 2: フラグメント。ラベル 3: フラグメントの構成要素。ラベル 4: 選択したビルディング ブロックの化学構造。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:SSEA-4の[2 + 1 + 3]ワンポット合成戦略。SSEA-4 は、Auto-CHO によって提案された 3 つの単位(シアルリル二糖ビルディングブロック 1(RRV=1,462)、単糖ビルディング ブロック 2(RRV=32.0)、およびエンド アクセプタ3(RRV=0)の削減によって合成できます。 この数字は、以前の出版物5から許可を受けて変更されました(クリエイティブ・コモンズ・アトリビューション4.0国際ライセンス:http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
Auto-CHOソフトウェアは、化学者がオリゴ糖5の階層的かつプログラム可能なワンポット合成を進めるのを支援するために開発されました。自動 CHO は Java プログラミング言語によって構築されました。現在、Windows、macOS、および Ubuntu をサポートしている GUI ソフトウェアとクロスプラットフォームです。ソフトウェアは、
Auto-CHOのBBLライブラリには、154の実験的なBLLと50,000以上の仮想BLLが含まれており、正確に予測されたRrVが含まれています。すべてのライブラリ検索はローカル マシンで処理され、ユーザーからクエリ構造は収集されません。Auto-CHOは、プログラムによって与えられた仮想BLL間の高収率合成の成功を保証できないため(化学反応における多くの構造的制約または未知の要因のために)、自動CHOは仮想BLLのためのオンラインフィードバックアンケートを提供します。研究コミュニティからのユーザーからのフィードバックは、貴重な仮想Bblを維持し、不適切なものを排除するのに役立つと考えられています。ソフトウェア ユーザー ガイドのテクニカル サポート用に電子メール アドレスが提供されています。技術的な質問や問題が発生した場合は、このアドレスに問い合わせることができます。
ここでは、2 つの検索戦略を提供します。パラメータ設定 (セクション 1.4) では、最初に厳密な条件を持つパラメータを設定することをお勧めします。Auto-CHO が満足のいく合成ソリューションを返さない場合は、次の検索実行でより柔軟なパラメータを使用することをお勧めします。BBLライブラリ(セクション1.5)の選択については、最初にのみ実験ライブラリを検索することを推奨します。ソフトウェアが適切なソリューションを返さない場合は、次のイテレーションで実験ライブラリと仮想ライブラリを検索することをお勧めします。
要約すると、このプロトコルは、SSEA-4分子のワンポット合成のための自動CHOソフトウェアの動作と自動CHOの使用を示す。さらに、プログラム可能なワンポットプロトコルについて説明する。Auto-CHOは、ライブラリを備えたGUIおよびオープンソースソフトウェアで、検証済みおよび仮想LLLを含み、オリゴ糖の階層的なワンポット合成をサポートしています。このソフトウェアは、研究コミュニティに利益を与えることができると考えられており、より本質的なオリゴ糖は、さらなる研究のためにAuto-CHOを介してワンポット反応によって合成することができると考えられています.
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Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
この研究は、サミットプログラム、科学技術省[MOST 104-0210-01-09-02、MOST 105-0210-01-13-01、MOST 106-0210-01-15-02]、およびNSF(1664283)を含むアカデミア・シニカによって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 75-05-8 | |
| Anhydrous magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| Cerium ammonium molybdate | TCI | C1794 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 75-09-2 | |
| Drierite | Sigma-Aldrich | 7778-18-9 | |
| Ethyl acetate | Sigma-Aldrich | 141-78-6 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 67-56-1 | |
| Molecular sieves 4 Å | Sigma-Aldrich | ||
| n-Hexane | Sigma-Aldrich | 110-54-3 | |
| N-Iodosuccinimide | Sigma-Aldrich | 516-12-1 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 144-55-8 | |
| Sodium thiosulfate | Sigma-Aldrich | 10102-17-7 | |
| Toluene | Sigma-Aldrich | 108-88-3 | |
| Trifluoromethanesulfonic acid | Sigma-Aldrich | 1493-13-6 |
References
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