Summary
该协议演示如何使用 Auto-CHO 软件进行寡糖的分层和可编程单罐合成。还介绍了RV测定实验和SSEA-4单罐糖基化的一般程序。
Abstract
本文介绍了一种可编程单罐寡糖合成的通用实验方案，并演示如何使用Auto-CHO软件生成潜在的合成解决方案。可编程单罐寡糖合成方法旨在利用硫糖苷积木 （BFL） 实现大量寡糖的快速合成，并具有相对反应值 （RRV） 的适当顺序。Auto-CHO 是一款具有图形用户界面的跨平台软件，通过搜索 BBL 库（包含约 150 个经过验证的和 >50，000 个虚拟 BFL）的可编程单罐寡糖合成提供了可能的合成解决方案通过支持向量回归准确预测 RrV。分层单罐合成算法已在 Auto-CHO 中实现，并使用单罐反应生成的片段作为新的 BLL。此外，Auto-CHO 允许用户为虚拟 BFL 提供反馈，以便保留有价值的 BFL 供进一步使用。一罐合成阶段特异性胚胎抗原4（SSEA-4），这是一个多能的人类胚胎干细胞标记，证明在这项工作。
Introduction
碳水化合物在自然界1、2中无处不在，但它们的存在和作用方式仍然是一个未知的领域，这主要是因为很难获得这种分子3。与寡肽和寡核苷酸的自动合成不同，寡糖的自动合成开发仍然是一项艰巨的任务，而且进展相对缓慢。
为了解决这个问题，Wong等人开发了第一个使用名为Optimer4的可编程软件程序合成寡糖的自动化方法，该程序指导从50个BBL库中选择低核糖核酸，用于顺序单罐反应。每个BBL都设计和合成了由各种保护组调谐的清晰的反应性。使用这种方法，在合成过程中可以最大限度地减少保护操作和中间纯化的复杂性，这被认为是开发自动化合成时最难克服的问题。尽管这个进步，该方法仍然相当有限，因为BBL的数量太少，并且Optimer程序只能处理某些小的寡糖。对于更复杂的寡糖，需要更多的低核和单罐反应和片段凝结的多次传递，软件程序的升级版本，Auto-CHO5，已经开发。
在 Auto-CHO 中，添加了 50，000 多个具有定义对 BBL 库的反应性的 BLL，包括 154 个合成和 50，000 个虚拟的 BLL。这些BBL是由机器学习基于基本特性设计的，计算了NMR化学偏移6，7，和分子描述符8，这些描述符影响BBL的结构和反应。有了这个升级的程序和新的一组低息，合成能力被扩展，正如所展示的，可以迅速准备几个感兴趣的寡糖。据认为，这一新发展将促进寡糖的合成，以研究其在各种生物过程中的作用及其对糖蛋白和糖脂的结构及功能的影响。还有人认为，鉴于这种方法可供研究界免费使用，这项工作将大大有利于糖科学界。合成人类胚胎干细胞标记物SSEA-45，在这项工作中得到了证明。
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Protocol
1. 自动CHO软件操作
- Java 运行时环境安装：确保已在设备中安装了 Java 运行时环境 （JRE）。如果已安装 JRE，请转到下一步"软件初始化";否则，请根据用户的操作系统下载并安装 JRE，网址为：
- 软件初始化：转到
- 对于 Windows 用户，解压缩自动 CHO_Windows.zip并双击"自动-CHO_Windows"文件夹中的"自动 CHO.jar"以启动程序。
注： 用户需要安装解压缩软件，如 7-Zip，在 - 对于 macOS 用户，右键单击Auto-CHO.jar并选择"打开"以启动程序。
- 对于 Ubuntu 用户：
- 使用以下命令安装 libcanberra-gtk：
$ sudo apt-get 安装 libcanberra-gtk* - 更改自动 CHO_Ubuntu.sh的访问权限 ：
$ chmod 755 自动 CHO_Ubuntu.sh - 运行自动 CHO 程序：
$ ./自动 CHO_Ubuntu.sh
- 使用以下命令安装 libcanberra-gtk：
- 对于 Windows 用户，解压缩自动 CHO_Windows.zip并双击"自动-CHO_Windows"文件夹中的"自动 CHO.jar"以启动程序。
- 输入所需的甘油结构。选择绘制甘油结构或读取现有结构文件。
- 通过绘图输入：
- 点击编辑甘油由甘油建设者9，10（图1，btn1;图 2A）或"单击此处"以编辑合成目标以绘制和编辑 GlycanBuilder 的查询结构的区域。联系和手性信息不应被忽略。点击Globo-H，SSEA-4，或OligoLacNAc按钮（图1，示例）来显示示例。
- 选择文件 |导出为序列格式 |导出到 GlycoCT 压缩以保存已编辑的结构（可选）。
- 关闭"甘油构建器"对话框以完成编辑。
- 通过读取文件输入：
- 单击"按甘油构建器编辑甘油"（图 1， btn1;图 2A）或"单击此处"以编辑合成目标以编辑查询结构的区域。
- 选择文件 |从序列格式导入以选择具有相应格式的查询结构文件。
- 通过绘图输入：
- 搜索参数设置（可选）。
- 在"参数设置"选项卡（图 1，tab2）中定义搜索参数，以获得合理的搜索结果。
注意：
高等级 RRV 的阈值必须为实数和 +0。
中等类 RRV 的阈值必须为实数和 +0。
高等级 RRV 的阈值应大于中类 RRV 的阈值。
最大片段数应为整数和 +1。
片段中的最小 BBL 编号必须为整数，介于 1 和 3 之间。
片段中的最大 BBL 编号必须是整数，介于 1 和 3 之间。
片段中的最大 BBL 编号必须为 =片段中的最小 BBL 编号。
最小捐赠者/接受者 RRV 差异必须为正实数。
最小捐赠者/接受者 RRV 比率必须为正实数。
最大捐赠者/接受者 RRV 比率必须为正实数。
最大捐赠者/接受方 RRV 比率必须大于;最小捐赠者/接受方 RRV 比率。 - 单击"确定"按钮以启用新设置。
- 在"参数设置"选项卡（图 1，tab2）中定义搜索参数，以获得合理的搜索结果。
- 选择构建基块库（图 1，tab5）。默认设置是仅搜索实验库。如果需要同时搜索实验库和虚拟库，请检查以下步骤。
- 选择虚拟构建基块库选项卡（图 2C，选项卡5）。实验和虚拟构建基块可以协同工作，提高自动CHO的搜索能力。目前，Auto-CHO 在库中提供了 50，000 多个具有预测 RrV 的虚拟构建基块。
- 选择"使用实验库"和"虚拟库"，然后应用筛选以显示具有特定条件的虚拟构建基块。单击"显示选定的虚拟 BBL"按钮（图2C， btn5） 仅显示所选虚拟构建基块。
- 单击显示筛选的虚拟 BBL（图2C， btn6） 以仅显示具有用户定义的特定条件的虚拟构建基块。
- 单击"显示所有虚拟 BBL"按钮（图2C， btn7） 以显示所有可用的虚拟构建基块并重置筛选器。
- 检查用户希望用于搜索的一个或多个所需虚拟构建基块。
- 选择"查询结构"选项卡（图1，tab1），然后单击"搜索构建基块库"按钮（图1，btn2）以查找查询结构的单罐综合解决方案。然后，确认参数设置。
- 搜索结果查看器。
注：搜索结果显示在"结果可视化"选项卡（图 1，tab6）。不同残渣数的末端接受器显示在"减少端接受器"列中（图1，查看器1）。- 选择一个减少端接受器，解决方案将显示在综合解决方案列表中（图1，查看器2）。片段列在片段列表（图1，viewer3）中，以表明合成中应使用多少片段。
注：系统提供每个片段的详细信息，包括片段的RRV、计算产量以及哪些保护组应取消保护，以便随后在单罐反应中使用片段。用于组装所选片段的构建基块如图 1 的查看器4所示。图 1的查看器5还显示片段连接信息。 - 分别查看和检查实验积木化学结构区域中选定构件的化学结构及详细信息（图1，选项卡4）。
- 选择一个减少端接受器，解决方案将显示在综合解决方案列表中（图1，查看器2）。片段列在片段列表（图1，viewer3）中，以表明合成中应使用多少片段。
- 将搜索结果输出到文本（可选）。
- 选择"结果文本"选项卡（图 1，选项卡7）。
- 单击保存结果文本（图 2B， btn4） 并选择文本文件目标。
- 虚拟构建基块的反馈（可选）。
注：可以通过在线调查问卷对虚拟构建基块提供反馈。反馈可以帮助社区保留有用的虚拟构建基块并删除无效的构建基块。- 选择虚拟构建基块选项卡（图 1，选项卡5）。
- 单击"反馈"列中需要对其的虚拟构建基块进行速率排序的链接。
- 在系统打开网页并提交后，填写反馈表。
注： 不要更改虚拟 BBL ID。
2. RRV测定实验
- 在10 mL圆底烧瓶中，将两个硫糖苷捐赠者（每瓶0.02毫摩尔）组合起来：Dr4是已知RRV的参考捐赠者;Dx1是未知 RRV、绝对甲醇 （0.10 mmol） 和二氯甲烷中的二甲醚（DCM，1.0 mL）的供体分子，然后在室温 （RT） 下搅拌 1 小时。
- 服用这种混合物（30 μL）的等分，在三次单独的注射中（每次注射10μL）中注入高性能液相色谱（HPLC）。测量在基线分离条件下（乙酸乙酯/n-己毒an = 20/80）下，吸收 （A ） 与供体分子浓度之间的系数（a）=D =。
- 在反应混合物中加入0.5M N-Iodosuccinimide（NIS）溶液（40μL，0.02 mmol），然后加入0.1M三氟甲酸（TfOH）溶液（20μL，0.002 mmol），并在RT处搅拌混合物2小时。
- 用DCM（4.0 mL）稀释反应混合物，过滤，用含有10%碳酸氢钠的饱和水硫硫酸钠（每个2倍，5 mL体积）清洗。使用 DCM 提取水层（3x，5 mL）。结合所有有机层，用5 mL的盐水洗涤，用约200毫克的无水硫酸镁干燥。
- 温和摇动混合物30s，用长笛滤纸过滤它，以去除硫酸镁，然后在25 mL圆底烧瓶中收集滤液。使用旋转蒸发器去除溶剂。
- 溶解 DCM （1.0 mL） 中的残留物。服用这种混合物（30μL）的等分，在三次单独的注射中（每次注射10μL）中注入HPLC。在相同的分离条件下（乙酸乙酯/n-六氧乙酯 = 20/80） （A参考）t = 24417.0， （Ax） t t） 测量剩余捐赠者的浓度 （=Dx= 和Dref=）• 23546.3.
- 测量 Dx1与 Dr4、k x1/kr4 = 0.0932 之间的相对反应性。基于Dr4的相对反应值，Dx1的相对反应值为3。
注： a = A/=D=， （a参考）0 = 74530.1， （Ax）0 = 26143.0。kx/k参考= （ln=D=t =ln = d =x=0）/（ln=Dref=t = ln =Dref=0）= （ln=A） x=t - ln =Ax=0//（ln =aref=t = ln =aref=0）= 0.0932。
3. SSEA-4的单罐糖基化
- 将 10 mL 圆底烧瓶置于真空下，将其火焰干燥，让烧瓶在真空下冷却至 RT。取出橡胶隔膜，将脱钙剂1供体（38毫克，1.1分q，0.057毫摩尔）、第一受体2（40毫克，1.0分安，0.053毫摩尔）和一个特氟龙涂层磁搅拌棒的混合物加入烧瓶。
- 将100毫克粉末分子筛4+转移到5mL圆底烧瓶中。将此烧瓶保存在真空下，将其火焰干燥，并在真空下让烧瓶冷却至 RT。将新鲜干燥的 4 + 分子筛转移到包含起始材料的第一个烧瓶中。
- 将 1 mL 新鲜干燥的 DCM 转移到烧瓶中。在RT处搅拌反应混合物1小时，然后将其置于-40°C的温度下。将 NIS（13 毫克、1.1 个 eq.，0.057 mmol）转移到烧瓶中。
- 在-40°C下，使用微量注射器将TfOH（34 μL，0.3 eq.，0.017 mmol，0.5 M在乙醚中）通过隔膜注射到烧瓶中。在-40°C下搅拌3小时。
- 在第一个接受器2几乎被消耗后，通过隔膜将DCM中的接受器3的溶液注入烧瓶中。
- 将反应混合物加热至-20°C，并将NIS（19毫克，1.6分位，0.083毫摩尔）转移到烧瓶中。通过-20°C的隔膜将TfOH（34 μL，0.3 eq.，0.017 mmol，0.5 M在乙醚中）注入烧瓶。在-20°C下搅拌3小时。
- 消耗第一步反应产物后，通过注射两个等效的三乙酰胺来淬火反应。通过装有 Celite 的滤网漏斗去除分子筛，将滤液收集到 25 mL 圆底烧瓶中，然后用 10 mL 的 DCM 进一步清洗过滤器。
- 将滤液转移到分集漏斗中，用含有10%NaHCO 3（2x，每10mL）的饱和水性硫磺酸钠清洗。使用 DCM 提取水层（3x，10 mL）。结合有机层，用盐水（10 mL）清洗混合物，然后加入无水MgSO4干燥。过滤它，并在100 mL圆底烧瓶中收集滤液。
- 使用旋转蒸发器去除溶剂。用大约 1 mL 的 DCM 溶解原油混合物，并将其装载到硅床顶部。用乙酸乙酯和甲苯（EtOAc/甲苯，1/4至1/2）的混合物对产品进行洗化，并收集馏分。
- 使用旋转蒸发器去除溶剂。在减压下干燥残留物，使完全受保护的SSEA-4衍生物4（74毫克，50%基于接受者2）作为白色泡沫。
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Representative Results
基于默认参数设置的自动 CHO 搜索结果表明 SSEA-4 可以通过 [2 + 1 + 3] 一锅反应合成。图 3显示了 SSEA-4 搜索结果的软件屏幕截图。当选择三糖减少端接受器时（图3，标签1），程序显示查询的四个潜在解决方案。第一个解有一个片段（图3，标签2），其计算收益率约为94%。片段可以由两个BL合成（图3，标签3）。第一个脱糖BBL的RRV是1462，第二个单糖的RRV是32.0。图 3的标签 4 显示了在单锅反应中使用的第一个建议的 BBL 的化学结构。单锅实验表明，SSEA-4能成功地合成43%的收率（图4），在以前的工作5中也得到了证明。上述化合物的详细实验程序和特性，特别是SSEA-4，可在引用的参考文献5中找到。
图 1：自动 CHO 屏幕截图。用户可以编辑查询甘油结构，浏览实验和虚拟构建基块信息，并查看软件提供的一锅综合解决方案。请点击此处查看此图的较大版本。
图 2：自动 CHO 软件的部分屏幕截图。（A） 单击"查询结构"选项卡 （tab1） 中的"由甘油构建器编辑甘油"按钮 （btn1），系统会弹出"甘油构建器"对话框。（B） 选择"结果文本"（tab7），然后单击"保存结果文本"（btn4）以保存文本搜索结果。（C） 选择"虚拟构建基块库"（tab5），并检查所需的虚拟构建基块，以便通过筛选选项进行搜索。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：自动CHO程序给出的单罐合成蓝图。标签 1：减少末端接受器。标签 2：碎片。标签 3：片段的构建基块。标签 4：所选积木的化学结构。请点击此处查看此图的较大版本。
图 4：SSEA-4 的 [2 + 1 + 3] 单罐合成策略。SSEA-4 可以由 Auto-CHO 建议的三个单元合成：sialyl 脱糖构建基块1 （RRV=1，462）、单糖构建基块2 （RRV=32.0） 和减少端接受器3 （RRV=0）。此图经我们之前的出版物5中进行了修改，并经许可（根据知识共享归因 4.0 国际许可证：http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/）。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
Auto-CHO软件的开发是帮助化学家进行分层和可编程的单罐合成寡糖5。自动CHO是由Java编程语言构建的。它是一个 GUI 软件和跨平台，目前支持 Windows、macOS 和 Ubuntu。该软件可以免费下载的自动CHO网站在
自动CHO的BBL库包含154个实验性BBL和超过50，000个虚拟BBL，具有准确预测的RV。 目前，虚拟BBL的糖类包括Gal、Glc、Man、GalNAc、GlcN、GlcN和GlcA。所有库搜索都在本地计算机中处理，我们不会从用户那里收集任何查询结构。由于 Auto-CHO 不能保证程序给出的虚拟 BL 之间的高产合成成功（由于化学反应中的许多结构约束或未知因素），因此 Auto-CHO 为虚拟 BFL 提供在线反馈问卷。相信来自研究界的用户反馈可以帮助保持有价值的虚拟BFL，并消除不合适的。在软件用户指南中提供了一个电子邮件地址以提供技术支持。如果遇到技术问题或问题，可以联系此地址。
此处提供了两种搜索策略。对于参数设置（第 1.4 节），建议在开始时设置具有更严格条件的参数。如果 Auto-CHO 未返回满意的合成解决方案，建议在下一次搜索运行中使用更灵活的参数。对于BBL库的选择（第1.5节），建议只首先搜索实验库。如果软件不返回任何合适的解决方案，建议在以下迭代中搜索实验库和虚拟库。
总之，该协议演示了自动CHO软件的操作和自动CHO对SSEA-4分子的单罐合成的使用。此外，还介绍了可编程单罐协议。Auto-CHO 是 GUI 和开源软件，具有库包括经过验证的和虚拟的 BFL，并且支持寡糖的分层单罐合成。相信该软件可以造福于研究界，更基本的寡糖可以通过自动CHO的单罐反应合成，供进一步研究。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了中国学术界的支持，包括科学科学和技术部首脑会议计划[MOST 104-0210-09-02，MOST 105-0210-01-13-01，MOST 106-0210-01-01-15-02]和NSF（1664283）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 75-05-8 | |
| Anhydrous magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| Cerium ammonium molybdate | TCI | C1794 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 75-09-2 | |
| Drierite | Sigma-Aldrich | 7778-18-9 | |
| Ethyl acetate | Sigma-Aldrich | 141-78-6 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 67-56-1 | |
| Molecular sieves 4 Å | Sigma-Aldrich | ||
| n-Hexane | Sigma-Aldrich | 110-54-3 | |
| N-Iodosuccinimide | Sigma-Aldrich | 516-12-1 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 144-55-8 | |
| Sodium thiosulfate | Sigma-Aldrich | 10102-17-7 | |
| Toluene | Sigma-Aldrich | 108-88-3 | |
| Trifluoromethanesulfonic acid | Sigma-Aldrich | 1493-13-6 |
References
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