यहाँ हम Escherichia कोलाई या Nicotiana benthamianaमें जैव संश्लेषी एंजाइमों के combinatorial अभिव्यक्ति के माध्यम से diterpenoid चयापचयों के उत्पादन और शुद्ध करने के लिए प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए आसान मौजूद है , क्रोमैटोग्राफी उत्पाद के बाद शोधन. जिसके परिणामस्वरूप चयापचयों आणविक संरचना विशेषता सहित विभिन्न अध्ययनों के लिए उपयुक्त हैं, एंजाइम कार्यात्मक अध्ययन, और bioactivity assays.
Diterpenoids छोटे अणु प्राकृतिक उत्पादों है कि व्यापक रूप से जीवन के राज्यों में वितरित कर रहे हैं और विकास की प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण जैविक कार्य किया है की एक विविध वर्ग के रूप में, interorganismal बातचीत, और पर्यावरण अनुकूलन. इन विभिन्न bioactivities के कारण, कई diterpenoids फार्मास्यूटिकल्स, खाद्य additives, जैव ईंधन, और अन्य जैव उत्पादों के रूप में आर्थिक महत्व के भी हैं. उन्नत जीनोमिक्स और जैव रासायनिक दृष्टिकोण diterpenoid-मेटाबोलिक जीन, एंजाइमों, और रास्ते के ज्ञान में तेजी से वृद्धि सक्षम है. हालांकि, अक्सर केवल एक ही प्रजाति में diterpenoids की संरचनात्मक जटिलता और अलग-अलग यौगिकों के संकीर्ण वर्गीकरण वितरण उनके कुशल उत्पादन के लिए बाधा कारक रहते हैं। चयापचय एंजाइमों की एक व्यापक रेंज की उपलब्धता अब पर्याप्त titers और शुद्धता में diterpenoids के उत्पादन के लिए संसाधन प्रदान करने के लिए इस महत्वपूर्ण चयापचय समूह की गहरी जांच की सुविधा. माइक्रोबियल और संयंत्र आधारित एंजाइम सह-अभिव्यक्ति के लिए स्थापित उपकरणों पर ड्राइंग, हम या तो Escherichia कोलाई या Nicotiana benthamianaमें diterpenoids के एंजाइमी उत्पादन के लिए एक आसानी से संचालित और अनुकूलन प्रोटोकॉल पेश करते हैं, और सिलिका क्रोमैटोग्राफी और अर्द्ध-पूर्वार्ध HPLC के माध्यम से वांछित उत्पादों की शुद्धि। मक्का के समूह का उपयोग करना (जीए मई) एक उदाहरण के रूप में dolabralexin diterpenoids, हम प्रकाश डाला कैसे diterpene synthase के मॉड्यूलर संयोजन (diTPS) और साइटोक्रोम P450 monooxygenase (P450) एंजाइमों विभिन्न diterpenoid पाड़ उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. शुद्ध यौगिकों विभिन्न बहाव अनुप्रयोगों में इस्तेमाल किया जा सकता है, इस तरह के चयापचय संरचनात्मक विश्लेषण के रूप में, एंजाइम संरचना समारोह अध्ययन, और इन विट्रो में और planta bioactivity प्रयोगों में.
डाइटरपेनॉइडमें 12,000 से अधिक मुख्य रूप से बहुचक्रीय 20-कार्बन प्राकृतिक उत्पादों का रासायनिक विविध समूह होता है जो कई जीवों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं1. कवक और पौधे डाइटरपेनॉइड की सबसे बड़ी विविधता का उत्पादन करते हैं, लेकिन बैक्टीरिया को बायोएक्टिव डाइटरपेनोइड बनाने के लिए भी दिखाया गया है (समीक्षा2,3,4,5देखें)। उनके विशाल संरचनात्मक विविधता में निहित, diterpenoids जैविक कार्यों की एक भीड़ की सेवा. कुछ डाइटरपेनॉइड, जैसे जिबरेलिन वृद्धि हार्मोन, विकासात्मक प्रक्रियाओं में आवश्यक कार्यकरते हैं 5। हालांकि, diterpenoids के बहुमत रासायनिक रक्षा और interorganismal बातचीत के मध्यस्थों के रूप में सेवा करते हैं. इनमें से, कोनिफेरस पेड़ों और प्रजातियों के रोगजनक बचाव में डाइटरपेन राल एसिड प्रमुख खाद्य फसलों जैसे मक्का (जीए मई) और चावल (ओरीजा सैटाइवा) में एंटीमाइक्रोबियल डाइटरपेनॉइड के मिश्रण सबसे बड़े पैमाने पर रहे हैं । अध्ययनकिया 6,7. इन bioactivities वाणिज्यिक अनुप्रयोगों के लिए एक अमीर रासायनिक भंडार प्रदान करते हैं, और चुनिंदा diterpenoids महत्वपूर्ण फार्मास्यूटिकल्स, खाद्य additives, चिपकने वाला, और रोजमर्रा की आधुनिक जीवन8,9 के अन्य bioproducts के रूप में उपयोग किया जाता है ,10. प्राकृतिक विविधता और diterpenoids के जैविक कार्यों पर अनुसंधान अग्रिम और अंततः व्यापक वाणिज्यिक अनुप्रयोगों को बढ़ावा देने के लिए, शुद्ध यौगिकों की लागत कुशल तैयारी के लिए उपकरण की आवश्यकता है. संयंत्र सामग्री से बड़े पैमाने पर अलगाव कुछ diterpenoid जैव उत्पादों के लिए स्थापित किया गया है, जैसे diterpene राल एसिड है कि लुगदी और कागज उद्योग8के प्रतिफल के रूप में उत्पादित कर रहे हैं. तथापि, केवल विशिष्ट ऊतकों में और पर्यावरणीय उत्तेजनाओं द्वारा तंग विनियमन के अंतर्गत डाइटरपेनॉइडकाज का संचय प्रायः प्राकृतिक उत्पादक2से पर्याप्त उत्पाद मात्रा के पृथक्करण को सीमित करता है। इसके अतिरिक्त, डाइटरपेनॉइड्स की संरचनात्मक जटिलता रासायनिक संश्लेषण के माध्यम से उनके उत्पादन में बाधा डालती है, यद्यपि ऐसे दृष्टिकोण अनेक मामलों में11,12में सफल रहे हैं । उन्नत जीनोमिक और जैव रासायनिक प्रौद्योगिकियों की उपलब्धता के साथ, एंजाइमी उत्पादन प्लेटफार्मों diterpenoid यौगिकों की एक श्रृंखला के उत्पादन के लिए बढ़ती ध्यान प्राप्त की है (देखें समीक्षा13,14, 15,16,17,18)
सभी terpenoids, diterpenoids सहित, दो आइसोरेनॉइड अग्रदूतों से प्राप्त कर रहे हैं, आइसोपेनिल डाइफॉस्फेट (आईपीपी) और dimethylallyl diphosphate (DMAPP)19 कि, बारी में, mevalonate (MVA) या के माध्यम से गठित कर रहे हैं मेथिलएरिथ्रिटॉल-5-फॉस्फेट (एमईपी) पथ। टेर्पेनॉइड बायोसिंथेसिस बैक्टीरिया में एमईपी मार्ग और कवक में एमवीए मार्ग के माध्यम से बढ़ता है, जबकि पौधों में साइटोसोलिक एमवीए और एक प्लास्टिडायल एमईपी मार्ग होता है, जिसके बाद डाइटरपेनॉइड गठन20की ओर प्राथमिक मार्ग होता है। प्रीनिल ट्रांसफरेस द्वारा आईपीपी और डीएपीएपी का संघनन सभी डाइटरपेनोइड्स के लिए केंद्रीय 20 कार्बन अग्रदूत पैदावार, geranylgeranyl diphosphate (GGPP)20. GGPP गठन के बहाव, दो एंजाइम परिवारों, terpene synthases (TPS) और साइटोक्रोम P450 monooxygenases (P450s) काफी हद तक terpenoid चयापचय21,22के विशाल रासायनिक विविधता के गठन को नियंत्रित . Diterpene synthases (diTPS) प्रतिबद्ध कार्बोकेशन संचालित cyclization और GGPP के पुनर्व्यवस्थित करने के लिए विभिन्न स्टीरियो विशिष्ट द्वि,, पाली, या मैक्रो-साइक्लिक diterpene पाड़1,3,23,बनाने के लिए उत्प्रेरित 24. ऑक्सीजन और इन पाड़ों के आगे कार्यात्मक सजावट तो P450 एंजाइमों द्वारा सुविधा और अन्य एंजाइम परिवारों का चयन22,25. TPSs और P450s आमतौर पर प्रजातियों के रूप में मौजूद हैं-विशिष्ट, बहु जीन परिवारों कि मॉड्यूलर biosynthetic नेटवर्क फार्म कर सकते हैं, जहां एक आम खाका के साथ विभिन्न एंजाइम मॉड्यूल के संयोजन यौगिकों की एक विस्तृत श्रृंखला के गठन में सक्षम बनाता है2, 26.हाल के वर्षों में मॉड्यूलर टेरपेनॉइड पथों में सक्रिय कार्यात्मक रूप से विशिष्ट एंजाइमों की तेजी से खोज ने आंशिक या पूर्ण पथों की चयापचय इंजीनियरिंग के लिए बहुमुखी भागों की सूची के रूप में उनके उपयोग के लिए विस्तार के अवसर प्रदान किए हैं दोनों माइक्रोबियल और संयंत्र आधारित उत्पादन प्लेटफार्मों. उदाहरण के लिए, खमीर(Saccharomyces cerevisiae) को सफलतापूर्वक terpenoid bioproducts के निर्माण के लिए बहु एंजाइम रास्ते इंजीनियर करने के लिए लागू किया गया है, जैसे antimalarial दवा artemisinin27, सेस्क्वेट्रेपेनॉइड जैव ईंधन बिसाबोलेन और फरनेसने28, लेकिन यह भी diterpenoids29,30,31का चयन करें . इसी तरह, औद्योगिक पैमाने पर निर्माण के लिए इंजीनियर Escherichia कोलाई प्लेटफार्मों कुछ diterpenoid चयापचयों के लिए स्थापित किया गया है, Taxol अग्रदूत taxadiene एक विरोधी कैंसर दवा और diterpene शराब के रूप में इस्तेमाल सहित, sclareol , खुशबू उद्योग में इस्तेमाल किया13,32,33,34. जेनेटिक इंजीनियरिंग और परिवर्तन प्रौद्योगिकियों में प्रगति ने संयंत्र मेजबान प्रणालियों को भी संयंत्र प्राकृतिक उत्पादों के उत्पादन के लिए तेजी से व्यवहार्य बना दियाहै 9,14,35,36. विशेष रूप से, करीब तंबाकू रिश्तेदार, Nicotiana benthamiana,terpenoid मार्ग विश्लेषण और इंजीनियरिंग के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया चेसिस बन गया है, कई जीन संयोजन के एग्रोबैक्टीरियम-मध्यस्थ परिवर्तन की आसानी के कारण , अंतर्जात अग्रदूतों के कुशल जैव संश्लेषण , और उच्च बायोमास14,35,36.
terpenoid biosynthesis के लिए इन स्थापित प्लेटफार्मों पर ड्राइंग, हम यहाँ का वर्णन करने के लिए आसान करने के लिए उपयोग और लागत कुशल तरीकों diterpenoids के एंजाइमी उत्पादन और एकल यौगिकों की शुद्धि के लिए. प्रस्तुत प्रोटोकॉल वर्णन कैसे ई. कोलाई और एन benthamiana प्लेटफार्मों बढ़ाया diterpenoid अग्रदूत ों के लिए इंजीनियर विभिन्न diTPSs और P450 एंजाइमों के combinatorial अभिव्यक्ति के लिए उपयोग किया जा सकता उत्पन्न करने के लिए वांछित डाइटरपेनॉइड यौगिक। संरचनात्मक रूप से अलग अलग diterpenoids का उत्पादन और शुद्ध करने के लिए इस प्रोटोकॉल के आवेदन मक्का से विशेष diterpenoids के उदाहरण के द्वारा दिखाया गया है (जीए mays), कहा जाता है dolabralexins, अंतर्जात biosynthesis जिनमें से दो diTPS और एक P450 भर्ती एंजाइम. olefins से oxygenated डेरिवेटिव को लेकर विभिन्न dolabralexins की शुद्धि तो बड़े पैमाने पर सिलिका स्तंभ क्रोमैटोग्राफी और तैयारी उच्च दबाव तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC) के साथ पृथकरी कीप निष्कर्षण के संयोजन के द्वारा हासिल की है। वर्णित प्रोटोकॉल diterpenoids के उत्पादन के लिए अनुकूलित कर रहे हैं, लेकिन यह भी आसानी से संबंधित terpenoid वर्गों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, साथ ही अन्य प्राकृतिक उत्पादों के लिए जो एंजाइम संसाधन उपलब्ध हैं. इस दृष्टिकोण का उपयोग कर उत्पादित यौगिकों विभिन्न बहाव अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त हैं, सहित, लेकिन सीमित नहीं, परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) विश्लेषण के माध्यम से संरचनात्मक लक्षण, एंजाइम कार्यात्मक अध्ययन के लिए substrates के रूप में उपयोग, और की एक श्रृंखला bioactivity परख.
व्यापक जांच और diterpenoid प्राकृतिक उत्पादों के आवेदन सरल, सस्ती प्रोटोकॉल सिंथेसाइज़ और वांछित यौगिकों की पर्याप्त मात्रा में शुद्ध करने के लिए आवश्यक है। प्रजातियों की एक विस्तृत श्रृंखला से उपलब्ध diterpenoid-मेटाबोलिक एंजाइमों की संख्या में तेजी से वृद्धि अब माइक्रोबियल और संयंत्र आधारित मेजबान प्रणालियों का उपयोग diterpenoids के एंजाइमी उत्पादन के लिए एक विशाल सूची प्रदान करता है. इसके अलावा, कई diterpenoid रास्ते की मॉड्यूलर वास्तुकला ‘प्लग एंड प्ले’ combinatorial इंजीनियरिंग दृष्टिकोण में एक ही या विभिन्न प्रजातियों से एंजाइमों के उपयोग के लिए प्राकृतिक और नए प्रकृति की तरह diterpenoid प्राकृतिक की एक सरणी उत्पन्न करने के लिए सक्षम बनाता है उत्पादों2,14,26,35.
ई. कोलाई अपनी मजबूती, scalability की आसानी, कम उपोत्पाद संदूषण के लिए सीमित रासायनिक जटिलता, और डीएनए विधानसभा और अभिव्यक्ति के लिए उपलब्ध उपकरणों की संपत्ति के कारण प्राकृतिक उत्पाद biosynthesis के लिए एक पसंदीदा माइक्रोबियल मेजबान है अनुकूलन. हमारे अनुभव में, यहाँ वर्णित मंच यहाँ प्रस्तावित उन सहित कई downstream अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त है जो diterpene olefins और alcohols के कई सौ मिलीग्राम तक के उत्पाद पैदावार के उत्पादन के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है. औद्योगिक पैमाने पर बैठक नहीं करते हुए, यहाँ वर्णित उत्पादन मंच आगे मार्ग, मेजबान, और किण्वन अनुकूलन के लिए एक नींव के रूप में सेवा कर सकते हैं के रूप में सफलतापूर्वक ऐसे taxadiene और sclareol 33 के रूप में संबंधित diterpenoids के लिए प्रदर्शन किया गया है ,34. दर-सीमित एमवीए या एमईपी पथ जीनों का अधिक-अभिव्यक्ति सफलतापूर्वक डाइटरपेनॉइड जैव संश्लेषण के लिए उपज-सीमित कारकों को दूर करने के लिए स्थापित किया गया है, जैसे अपर्याप्त अग्रदूत आपूर्ति और प्रतिस्पर्धी रास्ते में अग्रदूत प्रवाह13, 32,33,39. हालांकि कई अध्ययनों में सफल साबित, गरीब अभिव्यक्ति और terpenoid-मेटाबोलिक यूकैरियोटिक P450s और ई. कोलाई में अन्य झिल्ली बाध्य एंजाइमों की उत्प्रेरक गतिविधि एक संभावित सीमित कारकहै 33,39 48,49,50,51,52. कोडोन-अनुकूलित दृश्यों और प्रोटीन संशोधनों का उपयोग, जैसे एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम सिग्नल पेप्टाइड को हटाने या प्लास्टिडायल सिग्नल पेप्टाइड की शुरूआत, घुलनशील P450 अभिव्यक्ति14को बढ़ाने के लिए उपयोगी साबित हुआ है14 ,38 ,49,50,53. इस तरह के संशोधनों को भी इस अध्ययन में एक उदाहरण मार्ग के रूप मेंइस्तेमाल मक्का CYP71 के माइक्रोबियल सह-अभिव्यक्ति के लिए नियोजित किया गया. वर्णित प्रोटोकॉल प्लाज्मिड के उपयोग पर आधारित हैं जो एक या दो जीन प्रति निर्माण ले जाते हैं, सभी एक ही प्रेरक प्रमोटर के तहत। जहां बड़े पैमाने पर जीन संयोजन वांछित हैं, यह कई प्लाज्मिड और एंटीबायोटिक दवाओं के उपयोग के कारण कम परिवर्तन दक्षता और संस्कृति विकास को कम करने के लिए विभिन्न उपलब्ध बहु जीन कैसेट या जीन स्टैकिंग प्रणालियों का उपयोग करने के लिए सलाह दी जाती है13 .
आनुवंशिकी और जीनोमिक्स संसाधनों की व्यापक उपलब्धता के साथ, संयंत्र मेजबान प्रणाली भी प्राकृतिक उत्पादों के निर्माण के लिए तेजी से उपयुक्त हो जाते हैं. लाभ में प्रकाश संश्लेषण द्वारा संचालित आवश्यक प्राकृतिक अग्रदूतों का उत्पादन करने के लिए पौधों की क्षमता शामिल है , इस प्रकार पूर्ववर्ती अणुओं के पूरक की आवश्यकता के बिना उत्पाद के गठन को सक्षम करने54,55. एन benthamiana पहले से ही व्यापक रूप से vivo कार्यात्मक लक्षण और terpenoid और अन्य प्राकृतिक उत्पाद रास्ते14,35,36,40 के संयोजन अभिव्यक्ति में के लिए प्रयोग किया जाता है . एक मेजबान प्रणाली के रूप में एन benthamiana का उपयोग करने के उल्लेखनीय लाभ diterpenoid अग्रदूतों के अंतर्जात उत्पादन शामिल हैं, देशी जीन दृश्यों का उपयोग, यूकैरियोटिक P450s की सरलीकृत अभिव्यक्ति, combinatorial जीन परिवर्तन की आसानी (के रूप में अलग एंटीबायोटिक दवाओं क्षणिक सह परिवर्तन के लिए आवश्यक नहीं हैं), और पत्ती सामग्री से लक्ष्य उत्पादों की सरल निष्कर्षण. जहां जरूरत हो, डिटेरपेनॉइड उत्पादन को प्रमुख एमईपी मार्ग जीनों के सह-अभिव्यक्ति के माध्यम से बढ़ाया जा सकता है ताकि पूर्ववर्ती आपूर्ति36,41में वृद्धि हो सके। एन benthamiana में स्केलेबल diterpenoid उत्पादन के लिए प्रतिबंध पर्याप्त संयंत्र बायोमास पैदा करने के लिए की आवश्यकता के कारण तरल माइक्रोबियल संस्कृतियों की तुलना में अधिक जटिल हैं, रासायनिक जटिल से अधिक श्रम गहन उत्पाद शुद्धि संयंत्र ऊतक, और लक्ष्य उत्पादों के संभावित अवांछित चयापचय के माध्यम से, उदाहरण के लिए, ऑक्सीकरण, ग्लाइकोसिलेशन या अंतर्जात एंजाइमों द्वारा dephosphorlation36,43,44,45 ,46,47. तथापि, इस प्रक्रिया को एग्रोघुसपैठ56के लिए उपयोग किए जाने वाले पौधों की संख्या में वृद्धि करके उत्पाद की मात्रा तक बढ़ाया जा सकता है।
यहाँ वर्णित उत्पाद निष्कर्षण और शुद्धि प्रोटोकॉल ई. कोलाई और एन benthamianaके साथ संगत कर रहे हैं, साथ ही एस cerevisiae और अन्य संयंत्र या माइक्रोबियल मेजबान प्रणाली, और एक लागत कुशल दृष्टिकोण है कि आसान है प्रदान दोनों जीव विज्ञान और रसायन विज्ञान प्रयोगशालाओं में स्थापित करने और महंगा शुद्धि उपकरण की आवश्यकता नहीं है. एक विभाजक कीप का उपयोग चयापचय निष्कर्षण क्रोमैटोग्राफी शुद्धि करने से पहले कुशल निष्कर्षण और चरण जुदाई के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है। फ़नल आकार आसानी से बड़े संस्कृति संस्करणों के लिए अनुमति देते हैं और बड़ी संस्कृतियों से निकालने के लिए आवश्यक प्रयोगात्मक समय को कम करने के लिए समायोजित किया जा सकता है। हमने पाया कि हेक्सान/एथिल ऐसीटेट ग्रेडिएंट का उपयोग विभिन्न ध्रुवता के डाइटरपेनोइडों को निकालने के लिए आदर्श है जैसा कि यहाँ हाइड्रोकार्बन और ऑक्सीजनित यौगिकों दोनों को शामिल करने वाले डोलेब्रालेक्सिन के समूह के लिए दिखाया गया है(चित्र 3)। लक्ष्य उत्पादों के गुणों पर निर्भर करता है, अन्य विलायक मिश्रण फायदेमंद हो सकता है. हालांकि, सॉल्वैंट्स को अलग-अलग कीप तकनीक का उपयोग करके सफल निष्कर्षण और चरण जुदाई सुनिश्चित करने के लिए पानी के साथ मिश्रित नहीं होना चाहिए। इसके अलावा, वाष्पीकरण के माध्यम से उत्पाद हानि को ध्यान में रखा जाना चाहिए जब अस्थिर कार्बनिक यौगिकों के उत्पादन के लिए इस दृष्टिकोण का उपयोग कर (VOCs), इस तरह के कम आणविक वजन मोनो के रूप में- और सेस्क्वी-terpenoids और अन्य VOCs. यह बेहतर उत्पाद जुदाई प्रदान करता है और पुनरावर्ती शुद्धिकरण के लिए की जरूरत को कम करता है, क्योंकि यह हमारे अनुभव में फायदेमंद रहा है एक बड़े पैमाने पर ($ 2 एल) सिलिका स्तंभ का उपयोग कर ऑक्सीजन के विभिन्न स्तरों के diterpenoids के Chromatographic जुदाई, हमारे अनुभव में फायदेमंद रहा है छोटे स्तंभ वॉल्यूम का उपयोग करते समय चरण. स्तंभ मात्रा और matrices वांछित संस्कृति की मात्रा और प्राकृतिक उत्पाद के प्रकार के लिए आवश्यक के रूप में समायोजित किया जा सकता है. लक्ष्य उत्पादों है कि इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता की शुद्धता कई downstream अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त है, जैसे bioactivity assays या एंजाइम गतिविधि विश्लेषण में उपयोग के लिए. हालांकि, जहां उच्च शुद्धता के स्तर की आवश्यकता होती है, जैसे एनएमआर के माध्यम से संरचनात्मक विश्लेषण, उत्पाद शुद्धता को अतिरिक्त शुद्धिकरण द्वारा कुशलतापूर्वक बढ़ाया जा सकता है (अर्द्ध)-पूर्वानुमेय एचपीएलसी का उपयोग करके।
इस प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित diterpenoid प्राकृतिक उत्पादों के उत्पादन के लिए अनुकूलित किया गया है, लेकिन यह भी आसानी से संबंधित मोनो के लिए अनुकूलित किया जा सकता है-, सेस्क्वी- और त्रि-terpenoids, साथ ही अन्य प्राकृतिक उत्पाद वर्गों बस वांछित एंजाइम पैदा करके संयोजी अभिव्यक्ति14,57के लिए मॉड्यूल . हालांकि, उत्पाद निष्कर्षण और शुद्धि के लिए प्रक्रियाओं के संशोधनों को उच्च अस्थिरता वाले यौगिकों के लिए ध्यान में रखा जाना चाहिए, जैसे मोनो- और सेस्क्वी-टेरपेनोइड, या उच्च ध्रुवता और कार्यात्मक संशोधन द्वारा उदाहरण के रूप में कई triterpenoids, फ़ेनिलप्रोपेनोइड, और अन्य प्राकृतिक उत्पाद वर्गों के ग्लिकोसिलेशन।
हालांकि प्राकृतिक उत्पादों के निर्माण के लिए औद्योगिक पैमाने पर प्लेटफार्मों उपलब्ध हैं, यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल एक सस्ती, अनुकूलन उपकरण है कि आसानी से सबसे प्रयोगशालाओं में स्थापित किया जा सकता है प्रदान करते हैं. के रूप में मक्का dolabralexins के उत्पादन द्वारा प्रदर्शन यहाँ और कहीं और39, उत्पाद मात्रा और शुद्धता है कि इस दृष्टिकोण का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है आम तौर पर विभिन्न बहाव विश्लेषण और उपयोग करता है, सहित की सुविधा के लिए पर्याप्त हैं, लेकिन नहीं तक सीमित, विभिन्न bioactivity अध्ययन, जीवों के बीच बातचीत का विश्लेषण, साथ ही एंजाइम substrates के रूप में उपयोग के लिए या अर्द्ध संश्लेषण दृष्टिकोण के लिए सामग्री शुरू के रूप में.
The authors have nothing to disclose.
हम आभारी डॉ Reuben पीटर्स (Iowa राज्य विश्वविद्यालय, संयुक्त राज्य अमेरिका) pIRS और pGGx-mAN2 निर्माण प्रदान करने के लिए स्वीकार करते हैं. एनएसएफ संयंत्र-बायोटिक इंटरेक्शन्स प्रोग्राम द्वारा इस कार्य के लिए वित्तीय सहायता (पी.जेड.) के लिए अनुदान 1758976, डीईओ अर्ली कैरियर रिसर्च प्रोग्राम (अनुदान] डे-एससी0019178 से पी.जेड.), डीईओ संयुक्त जीनोम संस्थान सामुदायिक विज्ञान कार्यक्रम (अनुदान ] सीएसपी 2568 को पी.जेड.), एनएसएफ स्नातक अनुसंधान फैलोशिप कार्यक्रम (के.एम.एम.) के लिए, और एक यूसी डेविस डीन मेंटरशिप पुरस्कार फैलोशिप (के.एम.एम.) आभार स्वीकार कर रहे हैं.
1020 Trays | Greenhouse Megastore | CN-FLHD | |
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid | Sigma | M8250-500g | MES |
4" Tech Square Pot | McConkey Wholesale Grower's Supply | JMCTS4 | |
5977 Extractor XL MS | Agilent | – | |
7890B GC | Agilent | – | |
Acetonitrile | Sigma | 271004 | |
Agar | Fisher | BP1423-2 | |
Bacterial yeast extract | Fisher | BP9727-2 | |
Beaker | CTechGlass | BK-2001-015B | |
Cap, 9 mm blue screw, PFTE | Agilent | 5185-5820 | GC vial cap |
Carbenicillin | Genesee | 25-532 | Carb |
Chloramphenicol | Fisher | 50247423 | Chlor |
Chromatography column | CTechGlass | CL-0015-022 | |
Clear humidity dome | Greenhouse Megastore | CN-DOME | |
ColiRollers Plating Beads | Sigma | 71013 | Glass beads |
CoorsTek Porcelain Mortars | Fisher | 12-961A | mortar |
CoorsTek Porcelain Pestles | Fisher | 12-961-5A | pestle |
Delta-Aminolevulinic acid hydrochloride | Sigma | 50981039 | Aminoleuvolinic acid |
Ethanol | Fisher | A962-4 | EtOH |
Ethyl acetate | Fisher | E1454 | |
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher | 14-432-22 | Falcon tubes |
Fisherbrand Disposable Cuvettes | Fisher | 14-955-127 | cuvette |
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid | Fisher | FB0875713 | petri dish |
Fisherbrand Polypropylene Microtube Storage Racks | Fisher | 05-541 | microtube rack |
Glucose | Sigma | G7021 | |
Glycerol | Fisher | G33-500 | |
Hexanes | Fisher | H292-4 (CS) | |
HP-5MS | Agilent | 19091S-433 | GC column |
Inlet adapter | CTechGlass | AD-0006-003 | glass inlet adapter |
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Fisher | BP1755-100 | IPTG |
Kanamycin | Fisher | BP9065 | Kan |
KIM-KAP Caps, Disposable, Polypropylene, Kimble Chase | VWR | 60825-798 | breathable test tube lids |
Magnesium chloride | Acros | 223210010 | MgCl2 |
Magnesium sulfate | Sigma | M7506-500g | MgSO4 |
Miracle-Gro Water Soluble All Purpose Plant Food | Miracle-Gro | 2756810 | |
Mixer Mill MM 200 | Retsch | 20.746.0001 | tissue mill |
Nalgene Fernbach culture flask | Sigma | Z360236 | 2.8 L flask |
New Brunswick I26 | Eppendorf | M1324-0000 | Shaking incubator |
Nicotiana benthamiana seed | USDA Germplasm Repository | Accession TW16 | N. benthamiana |
OverExpress C41(DE3) Chemically Competent Cells | Lucigen | 60442 | C41-DE3 cells |
Parafilm M wrapping film | Fisher | S37440 | Parafilm |
Potassium chloride | Sigma | P-9541 | KCl |
Potassium phosphate dibasic anhydrous | Fisher | P288-3 | Dipotassium phosphate |
Potassium phosphate monobasic | Monopotassium phosphate | ||
Pyrex disposable culture tubes, rimless | Sigma | CLS9944516 | test tubes |
Pyruvate Acid Sodium Salt | Fisher | 501368477 | Sodium pyruvate |
Retort Ring Stands | CTechGlass | ST00 | ring stand |
Riboflavin | Amresco | 0744-250g | |
Rifampicin | Sigma | R7382 | Rif |
Rotovap | |||
Sand, 50-70 mesh particle size | Sigma | 274739-1KG | |
Silica | Fisher | AC241660010 | silica gel |
Sodium chloride | Fisher | 5271-3 | NaCl |
Sodum hydroxide | Fisher | SS266-1 | NaOH |
Spectinomycin | Fisher | 501368607 | Spec |
Squibb Separatory Funnel | CTechGlass | FN-1060-006 | Separatory funnel |
Sunshine Mix #1 | Sungro Horticulture | Potting soil | |
Thermo Scientific Snap Cap Low Retention Microcentrifuge Tubes | Fisher | 21-402-902 | microtube |
Triangle funnel | CTechGlass | FN-0035 | funnel |
Tryptone | Fisher | BP14212 | |
Vial, screw, 2 mL, amber, WrtOn | Agilent | 5182-0716 | GC vial |
visible spectrophotometer, V-1200 | VWR | 634-6000P | spectrophotometer |
ZORBAX Eclipse XDB-C18 | Agilent | 990967-202 | HPLC column |
ZORBAX Eclipse XDB-CN | Agilent | 990967-905 | HPLC column |