Denne artikkelen beskriver en metode for å generere funksjonelle tumor antigen-spesifikke indusert pluripotent stilk cellen-avledet CD8αβ+ singel positive T-celler ved hjelp OP9/DLL1 co-kultur system.
Generering og utvidelse av funksjonelle T-celler in vitro kan føre til et bredt spekter av kliniske applikasjoner. En slik bruk er for behandling av pasienter med avansert kreft. Adoptiv T celle overføring (ACT) av svært beriket tumor antigen-spesifikke T-celler har vist å forårsake varig regresjon av metastatisk kreft hos noen pasienter. Under utvidelsen kan imidlertid disse cellene bli oppbrukt eller senescent, og begrense deres effektor funksjon og utholdenhet i vivo. Indusert pluripotent stilk cellen (iPSC) teknologi kan overvinne disse hindringene ved å føre til in vitro generasjon av et stort antall mindre differensiert tumor antigen-spesifikke T-celler. Human iPSC (hiPSC) har kapasitet til å differensiere til alle typer somatiske celle, inkludert lymfocytter, som beholder den opprinnelige T celle reseptoren (TCR) genomisk omorganisering når en T-celle brukes som en start celle. Derfor omprogrammering av menneskelig tumor antigen-spesifikke T-celler til hiPSC etterfulgt av redifferentiation til T celle avstamning har potensial til å produsere fornyet tumor antigen-spesifikke T-celler. Beskrevet her er en metode for å generere tumor antigen-spesifikke CD8αβ+ singel positive (SP) T-celler fra HIPSC bruker OP9/DLL1 co-kultur system. Denne metoden er et kraftig verktøy for in vitro T celle avstamning generasjon og vil lette utviklingen av in vitro avledet T celler for bruk i regenererende medisin og celle-baserte terapier.
I tillegg til fysiologiske fordeler, T-celler har mange potensielle terapeutiske anvendelser. Generering og utvidelse av T-celler in vitro kan brukes til sykdoms modellering og terapeutisk validering, samt en kilde til behandling for arvelig og ervervet immunsvikt tilstander (dvs. viral immunodeficiencies og lymphodepletion sekundært til kjemoterapi eller transplantasjon) og for utryddelse av kreft. Denne sistnevnte kvaliteten har ført til utviklingen av adoptiv T celle overføring (ACT) for behandling av pasienter med avansert kreft1.
ACT består av resecting en pasients svulst, utpakking tumor-infiltrere lymfocytter (TILs), utvide TILs ex Vivo, deretter reinfusing de utvidede cellene inn i pasienten2. Det har vist seg å være en effektiv behandling modalitet for noen pasienter med metastatisk kreft. Dessverre svarer ikke alle pasientene på denne behandlingen. Tidligere rapporter har vist at differensiering staten overført celler3,4,5,6,7,8,9, bruk av store tall av høyt beriket kreft antigen-spesifikke t-celler10, og utholdenhet av T-celler etter overføring11,12 er alle korrelert med mer holdbare svar13,14. Derfor, når ACT unnlater å lokke fram en anti-tumor respons, kan det delvis skyldes en lav avkastning av kreft antigen-spesifikke T-celler, ineffektiv ex vivo ekspansjon fører til utmattelse og tap av reaktive kloner, eller mangel på utholdenhet etter overføring4 . Det har vært postulert at disse hindringene kan overvinnes ved generering av et stort antall mindre differensiert kreft antigen-spesifikke T celler in vitro15,16.
Blodkreft stem/stamceller (HSPCs) er en konvensjonell kilde for in vitro T celle generering, selv om denne metoden er begrenset av lite antall celler i stand til å bli utvunnet fra en enkelt donor1. Embryonale stamceller (ESCs) har også vist seg å produsere T-celler, men med lav avkastning17, noe som gjør det ineffektivt for kliniske anvendelser. Videre, siden T avstamning celler opplever Stokastisk genetisk rekombinasjon av deres T celle reseptorer (TCRs) i tidlige utviklingsmessige stadier, er det ikke mulig å bruke HSPCs eller ESCs å generere en ren populasjon av antigen-spesifikke T-celler uten videre genomisk modifikasjoner som TCR genet Transduction.
En tilnærming til å overvinne disse begrensningene er å programmere TILs til menneskelig indusert Pluripotent stamceller (hiPSCs), som kan gi en ubegrenset kilde for in vitro T celle generasjon. Det har vist seg at kreft antigen-spesifikke TILs kan omprogrammeres inn hiPSCs og re-differensiert til T celle avstamning, som beholder den samme t celle reseptor (TCR) genet omorganisering som den opprinnelige t celle18,19. Denne detaljen er betydelig for gjerning fordi individ pasient svulst ha enestående mutational profiler, og svært få kreften antigener ha blitt vist å bli delt blant pasienter20. Derfor, ved hjelp av kreft antigen-spesifikke TILs som en kilde for in vitro generasjon av hiPSC-avledede T-celler kan gi en ny strategi for personlig behandling av pasienter med metastatisk kreft.
Presentert her i detalj er en protokoll for å skille hiPSC-avledet T avstamning celler til funksjonell antigen-spesifikke CD8αβ+ singel positive (SP) T celler ved hjelp OP9/DLL1 co-kultur system. Denne metoden er et kraftig verktøy for in vitro T celle differensiering av hiPSCs, blodkreft forfedre, og embryonale stamceller, så vel som deres videre søknader i regenererende medisin og celle-baserte terapier.
Co-kulturen i OP9 murine stromal celler er et veletablert system for in vitro generasjon av lymfocytter (dvs. NK, B og T celler) fra HSPCs og Pluripotent stamceller. Hakk signalering er nødvendig for å indusere T avstamning forpliktelse og kan oppnås ved svangerskap/utvikling uttrykk for hakk ligand DLL1 eller DLL4, som har sammenlignbar effekt for T celle generasjon1. Derfor har OP9/DLL1 co-kultur systemet blitt en mye brukt metode for å produsere T-celler in vitro. Videre er denne metoden gjelder for bruk med flere typer og kilder til menneskelige celler, inkludert ledningen blod, benmarg HSPCs og ESCs. Imidlertid er generering av T-celler fra disse kildene begrenset enten ved utilstrekkelig gjenfinning av kilde celler eller ineffektiv differensiering til T-celler1. I tillegg kan ikke et T-cellers produkt med en enkelt TCR rekombinasjon genereres fra disse åpne repertoar kildene. Ved å bruke regenererende medisin teknikker, nemlig indusert pluripotent stilk cellen (iPSC) teknologi, kan det være mulig å produsere massive antall antigen-spesifikke T-celler for bruk i celle-baserte legemiddel-15.
hiPSCs ligner pluripotent ESCs i sin kapasitet for selv-fornyelse, ubegrensede ekspansjon, og potensial til å differensiere til alle typer somatiske celle i kroppen; men de mangler de etiske bekymringene rundt bruk av produkter av embryonale opprinnelse for kliniske applikasjoner. Videre kan hiPSCs produseres fra en hvilken som helst somatiske celle, slik at utviklingen av celle produkter for personlig medisin. I tidligere rapporter, hiPSCs har blitt produsert fra Human T celler ved hjelp av hele perifere mononukleære celler, CD3+ celler, eller isolerte cytotoksisk T-lymfocytter (CTLer) som en kilde18,19,22, 26. Når hiPSCs er generert fra en t-celle kilde (t-iPSCs), den opprinnelige TCR genet omorganisering er arvet. Derfor, pasient T-iPSC avledet T-celler kan gi en modell for personlig ACT behandling ved å målrette en pasientens distinkte kreft antigener.
Differensiering av menneskelige Pluripotent stamceller i T avstamning celler er delt inn i to trinn: generering av blodkreft stamceller (HPCs)27 og deres videre differensiering i t avstamning celler21. Begge trinnene kan oppnås ved hjelp av OP9/DLL1 co-kultur system. Viktigere er kvaliteten på OP9/DLL1 mater celler avgjørende for suksessen til T celle differensiering. Siden OP9/DLL1 celler er ikke en udødeliggjort homogen cellelinje, kvaliteten på FBS og kultur forhold er avgjørende for å opprettholde sin ekspansjon uten å miste evnen til å støtte hiPSC differensiering. Derfor er det anbefalt å pre-evaluere mye FBS og passasje konsekvent når celle-til-celle cytoplasmatiske kontakt begynner å oppstå, for å hindre celle differensiering og senescence. Ett poeng å ta hensyn til er at celle-til-celle-kontakt kan vises skille fra bakgrunnen avhengig av fase kontrast og forstørrelse av mikroskopet. I vår erfaring, de fleste OP9/DLL1 retter vil synes å være 80% confluent når klar til passering.
Det har blitt vist at redifferentiated t slekts celler generert fra t-iPSCs av OP9/DLL1 co-kultur kan produsere CD8+ SP T celler ved stimulering18,19. Men, fornyet CD8+ SP T celler erverve medfødt-lignende CD8αα homodimer22,28, som er en ineffektiv co-reseptor for TCR signalering29. I tillegg har disse generert CD8+ SP T Cells vist sterke TCR-uavhengige cytotoksisitet, noe som gjør disse cellene ugunstige for klinisk bruk30. Denne protokollen beskriver en fersk metode som involverer stimulering av renset CD4+CD8+ DP celler til å generere CD8αβ+ SP T celler med en mer konvensjonell fenotype og forbedret antigen-spesifikke cytotoksisitet22. Selv om tap av antigen spesifisitet på grunn av sekundær TCRα allel omorganisering oppstår i DP scenen etter langvarig langsiktig kultur, kan dette overvinnes ved Genova redigering i T-iPSCs31. I vår erfaring, hiPSC-avledet DP celler begynner å vises på dag 30-35 av kultur, og disse nylig genererte DP-celler har ennå ikke gjennomgått sekundære TCRα omorganisering. Derfor, de fleste DP celler på dag 35 beholde antigen spesifisitet og kan brukes til å generere antigen-spesifikke CD8αβ+ SP T Cells.
Før menneskelige anti-CD3 og anti-CD28 stimulering på dag 35, CD4–CD8– DN celler må fjernes fra kulturen, da disse har vist å forårsake direkte drap av CD4+CD8+ DP celler etter stimulering22. Bruke CD4 magnetisk perle berikelse (trinn 3,10) vil berike for både DP og CD4+CD8– INTERMEDIATE single positive (ISP) celler1, som vi har vist å ha noen negative effekter22. Alternativt kan fluorescens-aktivert celle sortering av Flow-flowcytometri utføres for å isolere DP-celler. Imidlertid er magnetisk perle separasjon foretrukket som det unngår mekanisk stress indusert av Flow flowcytometri.
Den generasjonen av CD8αβ+ SP T Cells fra humant Pluripotent stamceller uten aktivering-mediert Agonistiske utvalg har senere blitt demonstrert ved bruk av 3D murine stromal cellekultur32. Men fysiologiske positivt valg er avhengig av samspillet av TCR med Self-peptid-MHC komplekser, som er unikt behandlet og presentert av tymusatrofi kortikale epitelceller33. Videre har TCR affinitet for utvalgs peptider vist å bestemme de påfølgende funksjonelle evnene til modne CD8αβ+ SP T Cells34. Foreløpig er det ingen bevis som tyder på at en notch stromal celle-basert co-kultur systemet kan gi den definerte utvalg peptid og MHC kompleks som kreves for fysiologiske positivt valg.
Det har vært tidligere rapportert i en murine modell som T avstamning celler generert fra tumor antigen-spesifikke T celle-avledet hiPSCs bruker OP9/DLL1 alene unnlater å oppleve konvensjonell modning. Men IPSC-avledet umodne T celler generert av OP9/DLL1 systemet kan modnes i naiv-lignende T celler ved videre fysiologiske tymusatrofi utdanning i et 3D-kultur system 28,35. Derfor protokollen som presenteres her for å produsere iPSC-avledet umodne T-celler generert av OP9/DLL1 systemet er avgjørende for ytterligere forsøk på å generere ekte menneskelig tumor antigen-spesifikke post-tymusatrofi T-celler i stand til langsiktig utholdenhet in vivo med effektivitet til å behandle etablerte vascularized svulster.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Alan B. Hoofring og Erina H. Han for grafisk assistanse. Denne forskningen ble støttet av intramural Research program ved National Cancer Institute (ZIA BC010763) og intramural NCI Cancer Moonshot Initiative for Cell-baserte Cancer immunterapi.
10 cm dish | Corning, Inc. | 353003 | |
Anti-CD3, human | BD Biosciences | Cat# 561812, RRID:AB_1089628 | |
Anti-CD34, human | BD Biosciences | Cat# 348791, RRID:AB_400381 | |
Anti-CD4, human | Biolegend | Cat# 344612, RRID:AB_2028479 | |
Anti-CD43, human | BD Biosciences | Cat# 560198, RRID:AB_1645460 | |
Anti-CD7, human | BD Biosciences | Cat# 555361, RRID:AB_395764 | |
Anti-CD8a, human | BD Biosciences | Cat# 555369, RRID:AB_398595 | |
Anti-CD8b, human | BD Biosciences | Cat# 641057, RRID:AB_1645747 | |
Anti-TCRb, human | BD Biosciences | Cat# 555548, RRID:AB_395932 | |
CD28 human monoclonal antibody (15E8), pure functional grade | Miltenyl Biotec | 130-093-375 | |
CD3 human monoclonal antibody (OKT3), pure functional grade | Miltenyl Biotec | 130-093-387 | |
CD4 Microbeads, human | Miltenyl Biotec | 130-045-101 | |
Cell strainer 100 um | Fisher Scientific | 22-363-549 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini | 100-500 | |
Flt-3 ligand | R&D Systems | 427-FL | |
Gelatin Solution 2% | SIGMA-Aldritch | G1393-100ML | |
GlutaMAX (100X) | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | L-Glutamine supplement |
HBSS Mg+Ca+ Phenol-Red Free | Gibco | 14025-092 | |
Interleukin-2 | R&D Systems | 202-IL | |
Interleukin-7 | R&D Systems | 407-ML | |
iTAG MHC Tetramer HLA-A*0201 Mart1 Tetramer -ELAGIGILTV | MBL | Cat#TB-0009-2 | |
Mart1-hiPSC | Vizcardo et al., Cell Stem Cell 2013 | RIKEN-IMS | |
Melan-A, MART 1 (26-35) | InnoPep | 3146-0100 | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140050 | |
αMEM powder | Gibco | 61100061 | |
Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF) | Thermo Fisher Scientific | C57BL/6 MEF MITC-TREATED 4M EACH; A34962 | |
OP9/N-DLL1 | Riken Bioresource center | Cat# RCB2927; RRID:CVCL_B220 | OP9/DLL1 |
Penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
Phosphate buffered saline pH 7.4 (1x) | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
Primate ES Cell Medium | Reprocell | RCHEMD001 | Human ESC Culture Media |
Rhok inhibitor (Y-27632 dihydrochloride) | Tocris | 1254 | |
RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | |
Stem Cell Factor (SCF) | R&D Systems | 455-MC | |
StemPro | EZPassage | 23181-010 | |
T2-tumor | ATCC | T2 (174 x CEM.T2) (ATCC® CRL-1992™) | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300-062 | |
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200-072 | |
U Bottom 96 well plate | Corning, Inc. | 3799 |