Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

שימוש בתאי גזע של האדם המושרה Pluriפוטנטי עבור הדור של אנטיגן גידולים-תאים T ספציפיים

Published: October 24, 2019 doi: 10.3791/59997
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2, 1,2, 1, 3, 1,2
1Surgery Branch, National Cancer Institute, NIH, 2Center for Cell-Based Therapy, National Cancer Institute, NIH, 3Laboratory of Immunology, Institute for Frontier Life and Medical Sciences, Kyoto University
* These authors contributed equally

Summary

מאמר זה מתאר שיטה ליצירת אנטיגן גידול פונקציונלי-ספציפי המושרה pluripotent תא גזע בודד באמצעות OP9/DLL1 מערכת התרבות המשותף.

Abstract

הדור והתרחבות של תאי T פונקציונליים בתחום החוץ יכולים להוביל למגוון רחב של יישומים קליניים. שימוש אחד כזה הוא לטיפול בחולים עם סרטן מתקדם. המאמצת העברת תא T (ACT) של הגידול מועשר ביותר אנטיגן סרטניים ספציפיים הוכח לגרום רגרסיה עמיד של סרטן גרורתי אצל חלק מהחולים. עם זאת, במהלך ההתרחבות, תאים אלה עלולים להיות מותשים או מותלי, ולהגביל את תפקוד האפקטור שלהם והתמדה ב-vivo. בהשפעת תא גזע pluriפוטנטי (iPSC) הטכנולוגיה עשויה להתגבר על מכשולים אלה על ידי המוביל לדור מחוץ לתחום של מספרים גדולים של תאי T הבדיל הגידול פחות מובחנת. IPSC האדם (היפנוט) יש את היכולת להבדיל לכל סוג של תא הסומטיים, כולל לימפוציטים, אשר לשמור את המקורי קולטן תא T (TCR) גנומית מחדש כאשר תא T משמש תא התחלה. לכן, תכנות מחדש של תאי הגידול האנושי אנטיגן ספציפי T כדי היפנוסק ואחריו בידול לשושלת היוחסין של T יש את הפוטנציאל לייצר את הגידול הייחודי אנטיגן בגידולים של תאים T. מתוארים כאן היא שיטה ליצירת אנטיגן הגידול ספציפי CD8αβ+ יחיד חיובי (SP) תאי T מ היפנוsc באמצעות OP9/DLL1 מערכת התרבות המשותף. שיטה זו היא כלי רב עוצמה עבור הדור שושלת היוחסין של התא T ויהיה להקל על פיתוח בתאי T הנגזרים מחוץ לתחום לשימוש ברפואה רגנרטיבית וטיפולים מבוססי תאים.

Introduction

בנוסף ליתרונות פיסיולוגיים, לתאי T יש הרבה יישומים טיפוליים פוטנציאליים. הדור והתרחבות של תאי T בתחום החוץ ניתן להשתמש עבור מידול מחלות ואימות טיפולית, כמו גם מקור הטיפול עבור מצבי הכשל החיסוני תורשתי ונרכש (כלומר, חיסוני נגיפי ו lymphodepletion משני כדי כימותרפיה או השתלת) ולמיגור הסרטן. איכות זו האחרונה הובילה לפיתוח של העברת תא T המאמצת (ACT) לטיפול בחולים עם סרטן מתקדם1.

ACT מורכב מחדש הגידול של החולה, חילוץ לימפוציטים החדירה לגידולים (TILs), הרחבת TILs ex vivo, לאחר מכן מחדש את התאים המורחבים לתוך החולה2. זה הוכח להיות מודאליות טיפול יעיל עבור חולים מסוימים עם סרטן גרורתי.  למרבה הצער, לא כל המטופלים. מגיבים לטיפול הזה דיווחים קודמים הראו כי מצב הבידול של תאים שהועברו3,4,5,6,7,8,9, שימוש במספרים גדולים של סרטן מועשר במיוחד אנטיגן-ספציפי T תאים לא10, והתמדה של תאים T לאחר העברת11,12 כל מתואם עם תגובות עמיד יותר13,14. לכן, כאשר ACT נכשל לעורר תגובה נגד הגידול, זה עשוי בחלק להיות עקב תשואה נמוכה של סרטן אנטיגן ספציפי תאי T, הרחבת vivo ex יעיל המוביל התשישות ואובדן של שיבוטים תגובתי, או חוסר התמדה לאחר העברת4 . זה כבר היסוד כי מכשולים אלה עשויים להיות להתגבר על ידי הדור של מספרים גדולים של מספר רב אנטיגן סרטן מובחנת פחות בתאי T בתוך מבחנה15,16.

בתאי גזע/מחולל שחור (HSPCs) הם מקור קונבנציונאלי עבור הדור תא T מתורבת, למרות שיטה זו מוגבלת על ידי מספר קטן של תאים יכול להיות התאושש תורם אחד1. תאי גזע עובריים (ESCs) הוכחו גם לייצר תאים T אך עם תשואה נמוכה17, מה שהופך אותו לא יעיל עבור יישומים קליניים. יתר על כן, מאז בתאי השושלת T ניסיון השילוב הגנטי סטוכסטי של קולטני תא T שלהם (TCRs) בשלבים התפתחותיים מוקדם, זה לא אפשרי להשתמש HSPCs או ESCs לייצר אוכלוסייה טהורה של תאי T ספציפיים אנטיגן ללא גנומית נוספת שינויים כגון התמרה גנטית של TCR.

גישה אחת כדי להתגבר על האזהרות האלה היא מתכנת TILs לתאי גזע המושרה האדם pluriפוטנטי (hiPSCs), אשר עשוי לספק מקור באין מוגבל עבור הדור תא T מתורבת. זה הוכח סרטן אנטיגן ספציפי TILs יכול להיות מתוכנת מחדש לתוך hiPSCs ו-re הבדיל אל שושלת היוחסין של התא t, אשר שומר על אותו קולטן התא t (tcr) גן תארגנות כמו תא t המקורי18,19.  פרט זה חשוב עבור ACT כי גידולים החולה הפרט יש פרופילים ייחודיים, ומעטים מאוד אנטיגנים סרטן הוכחו להיות משותפים בין חולים20. לכן, באמצעות אנטיגן סרטן ספציפי TILs כמקור עבור הדור מחוץ לבית מתורבת של תאים הנגזרים היפנוsc עשוי לספק אסטרטגיה חדשה לטיפול מותאם אישית של חולים עם סרטן גרורתי.

מוצג כאן בפירוט הוא פרוטוקול להבדיל תאים שושלת היפנוטי הנגזר לתוך אנטיגן פונקציונלי ספציפי CD8αβ+ יחיד חיובי (SP) תאי T באמצעות OP9/DLL1 מערכת התרבות המשותף. שיטה זו היא כלי רב עוצמה עבור בידול התא T מתורבת של hiPSCs, המטפאות ושלתי, ותאי גזע עובריים, כמו גם יישומים נוספים שלהם ברפואה משובי וטיפולים מבוססי תאים.

Protocol

1. האדם culturing iPSCs (hiPSCs) על עכבר מעובריים פיברותקיעות (MEF)

הערה: שיטות חלופיות עבור culturing hiPSCs יכול לשמש גם, כולל אך לא מוגבל: זריעה על 6 צלחת הבאר מראש עם ג'לטין, תערובת חלבון ז'לטין, רקומביננטי למינציה ב 511, או כל מטריצה אחרת מחפש בשימוש התרחבות היפנוסי, ו תרבותי באמצעות מדיה מוגדר ניסח במיוחד עבור תרבות תא גזע האדם החזק.

  1. מתכון לתפירה
    1. מעיל תרבות תא 10 ס"מ צלחת פטרי עם 4 מ ל של 0.1% ג'לטין ו דגירה עבור 30 דקות ב 37 ° c.
    2. הפשרת בקבוקון של 4 x 106 לקרינה מהירה במהירות לתוך 10 מ ל של 37 ° צ' מדיה MEF (dma + 10% fbs + 1x פניצילין-סטרפטומיצין + 1X L-גלוטמין תוסף). צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. ומשהה את הגלולה הסלולרית. ב -9 מיל של מדיית התנועה
    3. להסיר את הצלחת מצופה ג'לטין מן החממה. הג מרוב ומוסיף 7 מ ל של MEF מדיה. צלחת 3 מ ל של ההשעיה MEF (משלב 1.1.2) על הצלחת מצופה ג'לטין. רוק את התבשיל זה לצד זה ומלפנים אל גב כדי להבטיח אפילו הפצה של MEF על הצלחת. מודטה ב 37 ° c עבור 8-36 h.
  2. היפרגיול על MEF
    הערה:     הנתונים נוצר באמצעות מארט-1 iPSC נגזר לטווח ארוך מלנומה תרבותית TIL, אשר במיוחד לזהות מארט 1 פפטיד בהקשר של HLA-A * 02:01, כפי שתוארה בעבר18.
    1. מעבר hiPSCs כאשר המושבות הן בין 0.8-1.2 מ"מ בקוטר. לפני passaging, בדוק המושבות היפאנט במיקרוסקופ סטריאו ולהסיר כל האזורים של בידול מן התרבות באמצעות קצה הפלסטיק של קצה 200 μL.
    2. מנושף מדיה ולהוסיף 10 mL היפנוsc מדיה (האדםהתרבות ES מדיה [טבלה של חומרים] + 10 Ng/ml האדם בסיסי הצמיחה פיברופיצוץ גורם [hbFGF]) שיושלם עם 10 ΜM סלע מעכב.
    3. להחזיק את הצלחת תרבות התא ביד אחת ולגלגל את הכלי תא חד פעמי על פני המנה כולה בכיוון אחד. הפעילו מספיק לחץ כדי שכל להב הרולר ייגע בצלחת התרבות וישמור על לחץ אחיד במהלך פעולת הגלגול.
    4. סובב את תבשיל התרבות 90 ° וחזור על שלב 1.2.3. הצג את הצלחת במיקרוסקופ כדי חזותית לאשר חיתוך הנכון של המושבות, אשר אמור להיראות משובץ. ניתוק מושבות לחתוך על ידי שטיפה מכנית עדינה באמצעות 200 μL צנרת.
      הערה: התנתקות של מושבות לחתוך על ידי שטיפה מכנית חייב להיעשות מיד לאחר חיתוך המושבות עם רולר, כי אחרי 3 דקות מושבות לחתוך יתחיל לחבר את המנה, וזה יהיה קשה לנתק מושבות של גודל הומוגנית על ידי שטיפה.
    5. העברה 350-600 גושים של מושבות לחתוך אל המנה החדשה 10 ס מ של MEF (מצופה 8-36 h לפני היפנוסק passaging) עם 10 מ ל של מדיה חדשה היפנוט בתוספת עם 10 μM סלע מעכב. מודטה ב 37 ° c.
      הערה: 600 גושים מייצג כ 1.0 x 106 מארט -1 ipsc ותניב 0.5-1.0 x 106 תאים DP ביום 35. עם זאת, המספרים הצפויים ישתנו בהתאם לעוצמת קו התאים ותנאי התרבות המתחילים.
    6. ביום שלמחרת, מנושף את אמצעי התקשורת ומוסיפים 10 מ ל של מדיית היפנוסק טרייה. לשנות מדיה היפנוsc כל 1-2 ימים בהתאם לקצב הצמיחה היפנוסי.

2. הכנת תאים OP9/DLL1 לשיתוף תרבות עם hiPSCs

  1. תרבות OP9/DLL1 תאים ב OP9 מדיה [α-בינוני חיוני מינימלי (α-מזכור) + 20% סרום בפרה העובר (FBS) + 1x פניצילין-סטרפטומיצין] ב 37 ° c. כאשר OP9/DLL1 התאים להגיע שליטה, מחית מדיה ולשטוף פעם אחת עם 5 מ ל של 1x מגנזיום, סידן, ו פנול אדום נטול פוספט באגירה מלוחים (PBS).
  2. מחלק את הערוץ ומוסיף 2 מ ל 0.05% טריפסין-EDTA.  דגירה עבור 5 דקות ב 37 ° c. לאחר מכן, להוסיף 4 מ ל של OP9 מדיה מכנית לנתק את שכבת התא על ידי ליטוף כדי ליצור השעיה תא יחיד.
  3. להעביר את ההשעיה התא לתוך שפופרת 50 mL באמצעות מסננת תא 100 יקרומטר כדי למנוע גושי תאים. צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. ומשהה מחדש ב -12 מ ל. של OP9 מדיה
  4. הוסיפו 8 מ ל של OP9 מדיה לכל אחד מ -6 מנות מהמטבח החדש של התאים פטרי. צלחת 2 מ ל של OP9/DLL1 תא הבולם משלב 2.3 אל כל חדש 10 ס מ צלחת. לנדנד את התבשיל זה לצד זה מלפנים אל גב כדי להבטיח אפילו הפצה של OP9/DLL1 על הצלחת.
  5. מודטה ב 37 ° c. חזרו על מעבר כל 2-3 ימים כאשר התאים מגיעים לשטף.
    הערה: חשוב לעשות מספיק מלאי קפוא של OP9/DLL1 תאים ולהפשיר מלאי חדש כל 4-6 שבועות.

3. בבידול חוץ גופית של hiPSCs לתוך CD8αβ+ יחיד חיובי (SP) T תאים

  1. הכינו מנות gelatinized OP9/DLL1 שבוע לפני התרבות המשותף עם hiPSCs. כדי להכין 0.1% הפתרון ג'לטין, להוסיף 5 מ ל של טמפרטורת החדר (RT) מלאי רקמות בכיתה פתרון ג'לטין כדי 500 mL של PBS.
    1. מעיל 3 חדש 10 ס מ תרבות התא מנות פטרי על ידי הוספת 4 מ ל לכל מנה של 0.1% ג'לטין.  דגירה 30 דקות ב 37 ° c.
    2. לאכול ג'לטין ולהוסיף 8 מ ל של OP9 מדיה לכל מנה. מעבר מאכל אחד שוטף של OP9/DLL1 (כפי שנעשה בסעיף 2 לעיל) כדי שלושה מצופים מראש ג'לטין.
  2. לאחר 4 ימים, להוסיף 10 מ ל של OP9 מדיה לכל 10 ס מ צלחת של OP9/DLL1 על ג'לטין, עבור סך של 20 מ ל של מדיה לכל מנה.
  3. לאחר 7-8 ימים, התחילו את התרבות הOP9/DLL1 מנות confluent (בידול יום 0).
    1. מנושף מדיה מתוך הצלחת 10 ס מ של hiPSCs על MEF. הוסף 10 מ ל של OP9 מדיה. גזור ונתק מושבות היפנוsc באמצעות כלי תא חד פעמי הדרך כפי שנעשה בשלבים 1.2.3 ו 1.2.4.
    2. העבר 350-600 גושים של מושבות לחתוך על 10 ס מ pre-gelatinized OP9/DLL1 תבשיל (שלב 3.1) עם 10 מ ל של מדיה חדשה OP9 באמצעות מעבר 200 μL. רוק את התבשיל תרבות מצד לצד ולאחר מכן מלפנים אל גב כדי להבטיח אפילו הפצה של מושבות.
      הערה: לחילופין, הוקמה מראש הembryoid גופים היפנוסי (בס) או השעיית הגוש הקטן עשוי לשמש.  עם זאת, השימוש בכלי תא חד פעמי או מערכת היווצרות EB מעדיפים לייצר גושים היפנוסים של גודל אחיד.
  4. ביום 1, מרוב מדיה בילה ולהחליף עם 20 מ ל של OP9 מדיה טריים. בשנת OP9/DLL1 ליום אחד יופיע מושבות מונאולאר עגולות (איור 1).
  5. ביום 5, לאכול 10 מ ל של מדיה בילו ולהוסיף 10 מ ל של OP9 מדיה טריים. מושבות היאנט יתחילו להבדיל לתוך מזועור פרימיטיבי, המאופיין במרכז כהה רב שכבתי.
  6. ביום 9, מוחלק 10 מ ל של מדיה בילו ולהוסיף 10 מ ל של OP9 מדיה טריים. בשלב זה, מבנים מרכז רב שכבתית יתפתחו לצורות כמו כיפה, ואזור היקפי הרשת יתחיל להיות ברור.
  7. ביום 13, הקציר המטופאות המטטיים (המחשבים האישיים) (איור 1). היפנוטית-נגזר מבנים ביום 13 מאופיינים על ידי אורגאיד מרכזית כהה מוקף רשת של אזורים כמו כיפה, נציג של אזורי המטפאות (HZs) דיווחו בעבר להקיף את תא גזע האדם העובריים הנגזר ושלתי . עשריםואחד
    הערה:     נוכחותם של מבנים כמו הכיפה מצביעה על תהליך מוצלח גם בהיעדר מרכזים אפלים. חוסר היכולת לייצר HPCs עשוי להיות בשל האיכות הירודה של OP9/DLL1, איכות של FBS הרבה, שליטה של הגושים iPSC הנזרע על OP9/DLL1 (350-600 הגושים הוא אופטימלי), ו/או וריאציות בעוצמה של קווי iPSC כדי לייצר המטפאות precursors.
    1. שטפי מדיה בילה ולשטוף 1x עם 5 מ ל של 1x פנול אדום חינם הנקס מאוזנת פתרון מאוזן שונה עם סידן ומגנזיום (HBSS).
    2. משף HBSS ולהוסיף 250 μL של 5000 יחידות/mL הקולגן הרביעי ב 10 מ ל של HBSS. מודקון ב 37 ° צ' צלזיוס עבור 45 דקות. מרוב HBSS עם קולגן הרביעי ולשטוף פעם עם 5 מ ל של PBS.
    3. מחלק את הערוץ ומוסיף 5 מ ל 0.25% טריפסין-EDTA. מודקון ב 37 ° c עבור 20 דקות. לאחר מכן, הוסף 4 מ ל של OP9 מדיה והנתק את שכבת התא על ידי ליטוף כדי ליצור השעיה תא יחיד.
    4. להעביר את ההשעיה התא לתוך שפופרת 50 mL באמצעות מסננת תא 100 יקרומטר.  צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. ומשהה את מחדש ב -10 מ ל. של OP9 מדיה
    5. תא הצלחת מושעה על gelatinized 10 ס מ החדש החברה לצלחת פטרי (ראה שלבים 3.1.1 ו 3.1.2). מודטה ב 37 ° c עבור 45 דקות. לאחר מכן, לאסוף תאים שאינם מחסיד על ידי ליטוף עדין.
    6. העברת השעיית תאים שנאספו לתוך שפופרת 50 mL באמצעות מסננת תא 100 יקרומטר.  צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. מנושף את סופרנטאנט ומשהה מחדש ב -10 מ ל של בידול מדיה [OP9 media עם 5 ng/ml הגורם האנושי תא הגזע (hscf), 5 ng/ml אדם Flt3 ליגנד (hFLT3L), ו 5 ng/ml האדם אינטרלויקין 7 (היל -7)].
    7. צלחת התא ההשעיה על OP9 חדש 10 ס מ לתוך התבשיל DLL1 שוטפת.
  8. . ביום 16, מעבר לתאים
    1. ניתוק מכני תאים לא מחסיד על ידי ליטוף עדין ומסנן דרך מסננת תא 100 יקרומטר. צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. ומשהה את הסופר-מחדש. בתקשורת בעלת 10 מ ל
    2. צלחת התא ההשעיה על OP9 חדש 10 ס מ לתוך התבשיל DLL1 שוטפת.
  9. המשך הזדקנות תאים לא מחסיד כל 5-7 ימים לאחר מכן על-ידי צעד חוזר 3.8.
  10. ביום 35, העשרת CD4+CD8+ כפול חיובי (DP) האוכלוסייה ולעורר לייצר CD8αβ+ SP T תאים (איור 2).
    1. ניתוק מכני תאים לא מחסיד על ידי ליטוף עדין ומסנן דרך מסננת תא 100 יקרומטר כדי להסיר את הגושים תאים. העשרת CD4+ האוכלוסייה תאים על ידי בידוד חרוזים CD4 מגנטי לפי פרוטוקול של היצרן.
      הערה: הרציונל לשימוש בחרוזים CD4 מגנטיים הוא להסיר תאים CD4-CD8- DN מן התרבות, כמו אלה הוכחו לגרום להרג ישיר של CD4+CD8+ העקורים תאים לאחר גירוי22.
    2. הרוזן חי CD4 תאים מועשרים באמצעות הומוציטומטר של ניובאואר ו טריקון צבע כחול.  להשעות OP9 מדיה בריכוז סה כ 0.5 x 106 תאים/mL. מספר 1 mL של ההשעיה התא (0.5 x 106 תאים) לתוך כל טוב של תרבות רקמה תחתונה שטוחה 24 צלחת של CONFLUENT OP9/DLL1.
    3. הוסף 100 IU האדם אינטרלויקין 2 (היל -2), 5 ng/ml היל -7, 500 ng/ml אנטי אדם נוגדן CD3, ו 2 μg/ml אנטי אדם נוגדן CD28, אז תרבות ב 37 ° c.
    4. ביום 4-7 לאחר הגירוי, לאסוף תאים עבור ניתוח מולקולרי (איור 3) או שיתוף תרבות עם אנטיגן פעמו הצגת תאים (apcs).

4. מדידת אנטיגן ספציפיות של היפנוsc הנגזרת CD8αβ+ SP T תאים

הערה: סוג ה-APCs שיש להשתמש בו לצורך ניסיון זה תלוי בהגבלת ה-MHC של תאי T שנגזרו על המסך. כאן, קו התא T2 משמש, שהוא היברידית של קווי תא lymphoblastoid T ו-B. תאים T2 express HLA-A * 02:0123, אשר מזוהה על ידי JKF6 תאים ממנו MART1-ipsc נגזר18. קו תא T2 זה ניתן להרחיב ב-RPMI 1640 + 20% FBS + 1x פניצילין-סטרפטומיצין והוא החוצה כאשר התאים מגיעים לצפיפות של 5 x 105 תאים/mL.

  1. הרוזן חי HLA-A * 02:01+ T-B היברידית lymphoblastoid T2 תאים באמצעות הומוציטוטומיטר neucytom, וצבע כחול של טריבאואר. דגירה APCs ב 24 הטוב התרבות רקמה צלחת עם 1 μg/mL מארט 1 פפטיד עבור 2 h ב 37 ° c.
    הערה: ריכוז פפטיד אופטימלי הוא משתנה, בהתאם לקו התא וספציפיות אנטיגן.
  2. לאסוף APCs ולשטוף 2x עם 10 מ ל של PBS כדי להסיר כל פפטיד נוסף.
  3. הרוזן APCs ולהשעות ב 2 – 5 x 105 תאים/ML ב OP9 מדיה עם 100 IU il-2 ו-5 Ng/mL il-7. Aliquot 100 μL של השעיית תא (2-5 x 104 תאים) לתוך כל באר של מצורף אולטרה נמוכה U התחתון 96 הצלחת או ישירות לתוך צלחת מצופה מראש elispot.
  4. מיין היפאנט-נגזר CD8αβ+ SP T תאים (שבוע אחרי אנטי אדם CD3/CD28 גירוי הנוגדן) באמצעות סדרן התא להשעות ב 1 x 106 תאים/ml ב OP9 מדיה עם 100 IU IL-2 ו-5 ng/mL IL-7. Aliquot 100 μL של השעיית תא (1 x 105 תאים) לתוך כל באר של apcs ותרבות עבור 16-20 h ב 37 ° c.
  5. לאחר 16-20 h, יש לנתח את פרופיל הפרשת הציטוקין על ידי שיטת ELISpot לפי פרוטוקול היצרן (איור 4).

Representative Results

לאחר 13 ימים hiPSCs co-culturing עם OP9/DLL1, CD34+CD43+ תאים מעשה המטפאות הופיעו (איור 1). לאחר 22 ימים נוספים של תרבות על non-gelatinized OP9/DLL1 בנוכחות hscf, hFLT3L, ו-היל -7, המטפאות ושלתי מובחנים CD3+CD7+CD4+CD8+ כפול חיובי (DP) היוחסין התאים, ה מרביתם הביעו את ה-TCR במפורש לאפיטואים מארט -1 (איור 2).

בעבר הוכח כי תאים CD8+ SP יכול להיגרם מתאי CD4+CD8+ DP t באמצעות איתות tcr באמצעות פפטיד, או גירוי tcrמונחהנוגדנים24,25. לכן, ביום 35 של התרבות, הCD4 הנגזרות+CD8+ DP T התאים היו מגורה עם CD3 אנטי אנושיים ואנטי אדם נוגדנים CD28 בנוכחות היל -7 ו-היל -2.  ארבעה ימים לאחר גירוי, מספר התאים CD3+CD8αβ+ SP גדל באופן דרמטי ונשאר ספציפי עבור מארט-1 אפירופה, המאשרת את שימור אנטיגן בירושה שלהם-ספציפיות (איור 3).

כדי לקבוע את המאפיינים הפונקציונליים של CD8αβ+ SP T תאים, הפעלה תלוית אנטיגן והפרשה של אינטרפרון גמא (ifn-γ) נותחו. לאחר גירוי עם אנטי אדם CD3 ואנטי אדם נוגדנים CD28 במשך 1 שבוע, היפנוט-נגזר CD8αβ+ SP T תאים היו מבודדים באמצעות סדרן התא ושיתוף תרבותי עם קו התא T2 המבטא hla-a * 02:01 עם או בלי קנצוני MART1 פפטיד עבור 16-20 h. שיטת ELISpot גילתה כי התקן CD8αβ+ SP t תאים מפרישות כמויות גבוהות יותר של ifn-γ לעומת CD8αα+ sp T תאים, כאשר מתורבתים בנוכחות של פפטיד מארט 1. הביטוי IFN-γ היה null עבור תאי T ו-APCs בלבד, הוכחת כי התאים האנושיים T-iPSC הנגזרים הם אנטיגן ספציפי פונקציונלי (איור 4).

Figure 1
איור 1: הדור של התאים מחולל המטפה . (א) הבחנה סכמטית של הבידול hiPSCs לשושלת המטפאות באמצעות OP9/DLL1 שיתוף התרבות. (ב) הופעה של מבנים נגזרים בימים 1 (למעלה משמאל), 3 (למעלה מימין), 7 (למטה משמאל) ו -13 (מימין למטה). קנה מידה ברים = 100 μm. (C) הזרימה הניתוח cyCD34 הנגזרת של היפנוטית הנגזרים+CD43+ המטפאות בתאי קדמון ביום 13. הנתונים מייצגים שישה ניסויים עצמאיים (n = 1 עד 2). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: היפסק בידול לתוך Mart1+ CD4+CD8αβ+ DP T תאים. (א) תרשים סכימטי של הבידול של השושלת המטטית הנגזרת לתאי T בוגרים באמצעות OP9/DLL1 שיתוף התרבות. (ב) הזרמת האנליזה של CD4 vs CD8Α, CD3 Vs. CD8β, ו מארט -1 ביטוי הטטרמר בתאי T הנגזרים ביום 35. , מגודרת על לימפוציטים. תאים בודדים, פאי שלילי נתונים מייצגים שלושה ניסויים עצמאיים (n = 3-8). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: אינדוקציה של CD8αβ+ SP T cell פנוטיפ. הניתוח הסייטומטט זרימה של CD4- היפנואס בתאי T 4 ימים לאחר האדם ANTI-CD3 ו אנטי-CD28 נוגדן האדם גירוי מונחה. מגודרת על לימפוציטים, תאים בודדים, PI שלילי (n = 4).   אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: אנטיגן ספציפיות של היפנוסק- CD8αβ+ SP T תאים. IFN-γ הפרשה על ידי שיטת ELISpot של CD8αβ+ Sp, CD8αα+ Sp, ותאי T בתפזורת לאחר 20 h שיתוף תרבות עם או בלי תאים T2 פעמו (או לא) עם מארט -1 פפטיד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

שיתוף התרבות של תאים סטרומה OP9 murine היא מערכת מבוססת היטב עבור דור מבחנה של לימפוציטים (כלומר, NK, B, ו-T תאים) מ HSPCs ותאי גזע pluriפוטנטי. איתות החריץ נדרש כדי לגרום T מחויבות השושלת והוא יכול להתבצע על ידי ביטוי חוץ רחמי של חריץ DLL1 או DLL4, אשר יש יעילות דומה עבור דור תא T1. לכן, מערכת OP9/DLL1 שיתוף תרבות הפכה שיטה נפוצה להפקת תאי T בתוך מבחנה.  יתר על כן, שיטה זו ישימה לשימוש עם מספר סוגים ומקורות של תאים אנושיים, כולל דם טבורי, מח עצם HSPCs ו ESCs.  עם זאת, הדור של תאי T ממקורות אלה הוא מוגבל או על ידי האיחזור מספיק של תאי המקור או על ידי בידול יעיל T תאים1. בנוסף, לא ניתן ליצור מוצר תא T עם שילוב מחדש של TCR בודד ממקורות רפרטואר פתוחים אלה. באמצעות טכניקות הרפואה משובי, כלומר תא גזע המושרה pluripotent זה יכול להיות אפשרי לייצר מספרים מסיבית של תאי T ספציפי אנטיגן לשימוש בתא מבוסס therapeutics15.

הhiPSCs דומים לescs החזקים ביותר ביכולתם להתחדשות עצמית, התרחבות ללא גבולות, ופוטנציאל להבדיל לכל סוג של תאים סומטיים בגוף; עם זאת, אין להם חששות אתית סביב השימוש של מוצרים ממוצא עובריים עבור יישומים קליניים. יתר על כן, hiPSCs ניתן להפיק מכל תא הסומטיים, המאפשר פיתוח של מוצרי תאים לרפואה אישית. בדוחות הקודמים, hiPSCs יוצרו מתאי T אנושיים באמצעות תאים היקפיים כולו היקפי, CD3+ תאים, או לימפוציטים מבודדים T ציטוטוקסיים (ctls) כמקור18,19,22, 26. כאשר hiPSCs נוצרות ממקור תא t (t-iPSCs), הסידור המקורי של גן TCR הוא בירושה. לכן, החולה T-iPSC הנגזר תאים T עשוי לספק מודל לטיפול מותאם אישית לפעול על ידי פילוח של המטופל אנטיגנים סרטניים בנפרד.

הבידול של האדם בתאי גזע רב עוצמה לתוך תאים השושלת T מחולק לשני שלבים: הדור של התאים מחולל קדמון (HPCs)27 ואת שלהם בידול נוסף לתוך תאים השושלת T21. את שני השלבים ניתן להשיג באמצעות מערכת OP9/DLL1 התרבות המשותף. חשוב מכך, האיכות של תאי המזין OP9/DLL1 היא קריטית להצלחת בידול התא T. מאז OP9/DLL1 תאים אינם קו הומוגנית מונצח התא, האיכות של FBS ותנאי התרבות הם קריטיים כדי לשמור על התרחבות שלהם מבלי לאבד את היכולת לתמוך בידול היפנוסי. לכן, מומלץ להעריך מראש את הרבה של FBS ומעבר בעקביות כאשר המגע התאים cytoplasmic תא מתחיל להתרחש, על מנת למנוע בידול התא והזדקנות. נקודה אחת שיש לקחת בחשבון היא שאיש קשר מתאים לתאים יכול להיראות בניגוד לרקע בהתאם לניגודיות הפאזה ולהגדלה של המיקרוסקופ. בניסיון שלנו, רוב OP9/DLL1 מנות יופיעו להיות 80% שוטפת כאשר מוכן למעבר.

הוכח כי התאים מחדש השושלת t שנוצר מ-t-iPSCs על ידי OP9/DLL1 שיתוף תרבות יכול לייצר CD8+ SP T תאים על גירוי18,19. עם זאת, שנוצר מחדש CD8+ SP T תאים לרכוש את מולד כמו CD8αα הומודימר22,28, שהוא קולטן שיתוף יעיל עבור tcr איתות29.  בנוסף, אלה מחדש CD8+ SP T תאים הראו רעילות חזקה tcr עצמאית, מה שהופך את התאים האלה שלילי לשימוש קליני30. פרוטוקול זה מתאר שיטה לאחרונה מעורבים גירוישל CD4 +CD8+ התאים DP כדי לייצר CD8αβ+ SP T תאים עם הרבה יותר פנוטיפ קונבנציונאלי ומשופר אנטיגן משופרת של הרעלת ציטוזה22. למרות ההפסד של אנטיגן ספציפיות בשל tcrα allelic תארגנות משני מתרחש בשלב העקורים לאחר תרבות ארוכת טווח ממושכת, זה יכול להיות להתגבר על ידי עריכת הגנום T-iPSCs31.  בניסיון שלנו, תאי העקורים הנגזרים מתחילים להופיע ביום 30-35 של התרבות, ואלה תאי העקורים שנוצר לאחרונה עדיין לא עברו משני TCRα מחדש. לכן, רוב תאי DP ביום 35 לשמור ספציפיות אנטיגן והוא יכול לשמש להפקת אנטיגן ספציפי CD8αβ+ SP T תאים.

לפני CD3 האדם anti-CD28 גירוי ביום 35, CD4-CD8- DN תאים יש להסיר מן התרבות, כמו אלה הוכחו לגרום להרג ישיר של CD4+CD8+ DP תאים לאחר גירוי22. באמצעות CD4 מגנטי חרוז העשרה (שלב 3.10) יהיה להעשיר עבור DP וגם CD4+CD8 ביניים חיובי יחיד (ISP) תאים1, אשר אנו הוכחו אין אפקטים שליליים22. לחילופין, מיון מופעל על ידי קרינה פלואורסצנטית על ידי הזרימה cy, ניתן לבצע כדי לבודד תאים DP. עם זאת, הפרדה מגנטית חרוז הוא המועדף כפי שהוא מונע את הלחץ המכני הנגרמת על ידי שהזרים cy, לנסות.

הדור של CD8αβ+ SP T תאים מתאי גזע האדם pluriפוטנטי ללא הפעלה-מתווכת בחירת אגוניסט הפגינו לאחר מכן על ידי שימוש של 3d מורטין התרבות התא סטרומה32. עם זאת, הבחירה הפיסיולוגית תלויה באינטראקציה של TCR עם self-פפטיד-MHC תסביכים, אשר מעובדים באופן ייחודי ומוצג על ידי תאים אפיתל הרתיה33. יתר על כן, אהדה TCR עבור פפטידים בחירה הוכח כדי לקבוע את היכולות הפונקציונליות הבאות של CD8αβ+ SP T תאים34.  כיום, אין הוכחות שמציעים מערכת משותפת לתרבות שיתוף-הפנים המבוססת על תאים שיכולים לספק את פפטיד הבחירה המוגדרת ואת מתחם MHC הדרוש לבחירה הפיסיולוגית.

זה כבר דווח במודל murine כי תאי השושלת T שנוצר מן אנטיגן הגידול ספציפי T-hiPSCs הנגזר באמצעות OP9/DLL1 לבד להיכשל לחוות התבגרות קונבנציונאלי. עם זאת, ipsc-נגזר תאים t בוגרים שנוצר על ידי מערכת OP9/DLL1 יכול בוגרת לתוך תאים תמימים כמו T על ידי השכלה נוספת פיזיולוגית הרתי במערכת תרבות תלת-ממד 28,35. לכן, הפרוטוקול המוצג כאן כדי לייצר iPSC הנגזרות תאים T בוגרים שנוצר על ידי OP9/DLL1 מערכת חיונית עבור ניסיונות נוספים כדי ליצור האמיתי אנטיגן הגידול האנושי לאחר הרתי T תאים מסוגל התמדה ארוכת טווח ב vivo עם יעילות לטיפול בגידולים הוקמה ואצלב.

Disclosures

למחברים אין כל גילוי.

Acknowledgments

אנחנו מודים לאלן ב. הולפרינג וארנה ה . הוא לסיוע גרפי מחקר זה היה נתמך על ידי תוכנית מחקר הפנים של המכון לסרטן הלאומי (ZIA BC010763) ואת הארגון הפנימי NCI סרטן מונשוט עבור מבוסס תאים חיסוני סרטן.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 cm dish Corning, Inc.  353003
Anti-CD3, human BD Biosciences Cat# 561812, RRID:AB_1089628
Anti-CD34, human BD Biosciences Cat# 348791, RRID:AB_400381
Anti-CD4, human Biolegend Cat# 344612, RRID:AB_2028479
Anti-CD43, human BD Biosciences Cat# 560198, RRID:AB_1645460
Anti-CD7, human BD Biosciences Cat# 555361, RRID:AB_395764
Anti-CD8a, human BD Biosciences Cat# 555369, RRID:AB_398595
Anti-CD8b, human BD Biosciences Cat# 641057, RRID:AB_1645747
Anti-TCRb, human BD Biosciences Cat# 555548, RRID:AB_395932
CD28 human monoclonal antibody (15E8), pure functional grade Miltenyl Biotec 130-093-375
CD3 human monoclonal antibody (OKT3), pure functional grade Miltenyl Biotec 130-093-387
CD4 Microbeads, human Miltenyl Biotec 130-045-101
Cell strainer 100 um Fisher Scientific 22-363-549
Fetal Bovine Serum (FBS) Gemini 100-500
Flt-3 ligand R&D Systems 427-FL
Gelatin Solution 2%  SIGMA-Aldritch G1393-100ML
GlutaMAX (100X) Thermo Fisher Scientific 35050-061 L-Glutamine supplement
HBSS Mg+Ca+ Phenol-Red Free Gibco 14025-092
Interleukin-2 R&D Systems 202-IL
Interleukin-7 R&D Systems 407-ML
iTAG MHC Tetramer HLA-A*0201 Mart1 Tetramer -ELAGIGILTV MBL Cat#TB-0009-2
Mart1-hiPSC Vizcardo et al., Cell Stem Cell 2013 RIKEN-IMS
Melan-A, MART 1 (26-35) InnoPep 3146-0100
MEM Non-Essential Amino Acids Solution Gibco 11140050
αMEM powder Gibco 61100061
Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF) Thermo Fisher Scientific C57BL/6 MEF MITC-TREATED 4M EACH; A34962
OP9/N-DLL1 Riken Bioresource center Cat# RCB2927; RRID:CVCL_B220 OP9/DLL1
Penicillin/streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140-122
Phosphate buffered saline pH 7.4 (1x) Thermo Fisher Scientific 10010-023
Primate ES Cell Medium Reprocell RCHEMD001 Human ESC Culture Media
Rhok inhibitor (Y-27632 dihydrochloride) Tocris 1254
RPMI 1640 Gibco 11875093
Stem Cell Factor (SCF) R&D Systems 455-MC
StemPro EZPassage 23181-010
T2-tumor ATCC T2 (174 x CEM.T2) (ATCC® CRL-1992™) 
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red  Thermo Fisher Scientific 25300-062
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red  Thermo Fisher Scientific 25200-072
U Bottom 96 well plate Corning, Inc.  3799

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brauer, P. M., Singh, J., Xhiku, S., Zuniga-Pflucker, J. C. T Cell Genesis: In Vitro Veritas Est. Trends in Immunology. 37 (12), 889-901 (2016).
  2. Rosenberg, S. A., Restifo, N. P. Adoptive cell transfer as personalized immunotherapy for human cancer. Science. 348 (6230), 62-68 (2015).
  3. Gattinoni, L., et al. Acquisition of full effector function in vitro paradoxically impairs the in vivo antitumor efficacy of adoptively transferred CD8+ T cells. Journal of Clinical Investigation. 115 (6), 1616-1626 (2005).
  4. Rosenberg, S. A., et al. Durable complete responses in heavily pretreated patients with metastatic melanoma using T-cell transfer immunotherapy. Clinical Cancer Research. 17 (13), 4550-4557 (2011).
  5. Crompton, J. G., et al. Lineage relationship of CD8(+) T cell subsets is revealed by progressive changes in the epigenetic landscape. Cellular and Molecular Immunology. 13 (4), 502-513 (2016).
  6. Henning, A. N., Klebanoff, C. A., Restifo, N. P. Silencing stemness in T cell differentiation. Science. 359 (6372), 163-164 (2018).
  7. Henning, A. N., Roychoudhuri, R., Restifo, N. P. Epigenetic control of CD8(+) T cell differentiation. Nature Reviews Immunology. 18 (5), 340-356 (2018).
  8. Vodnala, S. K., et al. T cell stemness and dysfunction in tumors are triggered by a common mechanism. Science. 363 (6434), (2019).
  9. Restifo, N. P., Gattinoni, L. Lineage relationship of effector and memory T cells. Current Opinion in Immunology. 25 (5), 556-563 (2013).
  10. Tran, E., et al. Cancer immunotherapy based on mutation-specific CD4+ T cells in a patient with epithelial cancer. Science. 344 (6184), 641-645 (2014).
  11. Gattinoni, L., et al. Wnt signaling arrests effector T cell differentiation and generates CD8+ memory stem cells. Nature Medicine. 15 (7), 808-813 (2009).
  12. Gautam, S., et al. The transcription factor c-Myb regulates CD8(+) T cell stemness and antitumor immunity. Nature Immunology. 20 (3), 337-349 (2019).
  13. Klebanoff, C. A., et al. Determinants of successful CD8+ T-cell adoptive immunotherapy for large established tumors in mice. Clinical Cancer Research. 17 (16), 5343-5352 (2011).
  14. Klebanoff, C. A., Gattinoni, L., Restifo, N. P. Sorting through subsets: which T-cell populations mediate highly effective adoptive immunotherapy. Journal of Immunotherapy. 35 (9), 651-660 (2012).
  15. Crompton, J. G., Clever, D., Vizcardo, R., Rao, M., Restifo, N. P. Reprogramming antitumor immunity. Trends in Immunology. 35 (4), 178-185 (2014).
  16. Crompton, J. G., Rao, M., Restifo, N. P. Memoirs of a reincarnated T cell. Cell Stem Cell. 12 (1), 6-8 (2013).
  17. Kennedy, M., et al. T lymphocyte potential marks the emergence of definitive hematopoietic progenitors in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Reports. 2 (6), 1722-1735 (2012).
  18. Vizcardo, R., et al. Regeneration of human tumor antigen-specific T cells from iPSCs derived from mature CD8(+) T cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 31-36 (2013).
  19. Nishimura, T., et al. Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation. Cell Stem Cell. 12 (1), 114-126 (2013).
  20. Lo, W., et al. Immunologic recognition of a shared p53 mutated neoantigen in a patient with metastatic colorectal cancer. Cancer Immunology Research. , (2019).
  21. Timmermans, F., et al. Generation of T cells from human embryonic stem cell-derived hematopoietic zones. Journal of Immunology. 182 (11), 6879-6888 (2009).
  22. Maeda, T., et al. Regeneration of CD8alphabeta T Cells from T-cell-Derived iPSC Imparts Potent Tumor Antigen-Specific Cytotoxicity. Cancer Research. 76 (23), 6839-6850 (2016).
  23. Salter, R. D., Howell, D. N., Cresswell, P. Genes regulating HLA class I antigen expression in T-B lymphoblast hybrids. Immunogenetics. 21 (3), 235-246 (1985).
  24. Snauwaert, S., et al. In vitro generation of mature, naive antigen-specific CD8(+) T cells with a single T-cell receptor by agonist selection. Leukemia. 28 (4), 830-841 (2014).
  25. Takahama, Y., Suzuki, H., Katz, K. S., Grusby, M. J., Singer, A. Positive selection of CD4+ T cells by TCR ligation without aggregation even in the absence of MHC. Nature. 371 (6492), 67-70 (1994).
  26. Seki, T., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells. Cell Stem Cell. 7 (1), 11-14 (2010).
  27. Vodyanik, M. A., Slukvin, I. I. Hematoendothelial differentiation of human embryonic stem cells. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 23, Unit 23, 26 (2007).
  28. Vizcardo, R., et al. Generation of Tumor Antigen-Specific iPSC-Derived Thymic Emigrants Using a 3D Thymic Culture System. Cell Reports. 22 (12), 3175-3190 (2018).
  29. McNicol, A. M., et al. CD8alpha/alpha homodimers fail to function as co-receptor for a CD8-dependent TCR. European Journal of Immunology. 37 (6), 1634-1641 (2007).
  30. Themeli, M., Riviere, I., Sadelain, M. New cell sources for T cell engineering and adoptive immunotherapy. Cell Stem Cell. 16 (4), 357-366 (2015).
  31. Minagawa, A., et al. Enhancing T Cell Receptor Stability in Rejuvenated iPSC-Derived T Cells Improves Their Use in Cancer Immunotherapy. Cell Stem Cell. 23 (6), 850-858 (2018).
  32. Montel-Hagen, A., et al. Organoid-Induced Differentiation of Conventional T Cells from Human Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 24 (3), 376-389 (2019).
  33. Takada, K., Kondo, K., Takahama, Y. Generation of Peptides That Promote Positive Selection in the Thymus. Journal of Immunology. 198 (6), 2215-2222 (2017).
  34. Takada, K., et al. TCR affinity for thymoproteasome-dependent positively selecting peptides conditions antigen responsiveness in CD8(+) T cells. Nature Immunology. 16 (10), 1069-1076 (2015).
  35. Vizcardo, R., et al. A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants. JoVE. , https://www.jove.com/video/58672/a-three-dimensional-thymic-culture-system-to-generate-murine-induced e58672 (2019).

Tags

סרטן מחקר סוגיה 152 תא גזע pluriפוטנטי תא גזע מושרה pluripotent אימונולוגיה העברת התא המאמצת בידול התא T הגידול אנטיגן ספציפיות
שימוש בתאי גזע של האדם המושרה Pluriפוטנטי עבור הדור של אנטיגן גידולים-תאים T ספציפיים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Good, M. L., Vizcardo, R., Maeda,… More

Good, M. L., Vizcardo, R., Maeda, T., Tamaoki, N., Malekzadeh, P., Kawamoto, H., Restifo, N. P. Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells. J. Vis. Exp. (152), e59997, doi:10.3791/59997 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter