Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

I vivo Surface-elektrokardiografi for voksne sebrafisk

Published: August 1, 2019 doi: 10.3791/60011
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Medicine, Division of Cardiology, the Cardiovascular Research Laboratory, David Geffen School of Medicine at UCLA

Summary

Her presenterer vi en pålitelig, minimalt invasiv og kostnadseffektiv metode for å registrere og tolke elektrokardiogrammer i live anesthetized voksen sebrafisk.

Abstract

Elektro bølgeformer av voksne sebrafisk og de av mennesker er bemerkelsesverdig lik. Disse elektro likheter øke verdien av sebrafisk ikke bare som en forsknings modell for menneskelig CARDIAC elektrofysiologi og myopatier men også som et surrogat modell i høy gjennomstrømning farmasøytiske screening for potensielle cardiotoxicities til mennesker, slik som QT-forlengelse. Som sådan, in vivo elektrokardiografi for voksen sebrafisk er et elektrisk bestemmelse av fenotype verktøy som er nødvendig, om ikke uunnværlig, for tverrsnitt eller langsgående in vivo elektrofysiologisk characterizations. Men for ofte er mangelen på en pålitelig, praktisk og kostnadseffektiv opptaks metode fortsatt en stor utfordring å hindre at dette in vivo diagnostisk verktøy blir lettere tilgjengelig. Her beskriver vi en praktisk, grei tilnærming til in vivo elektrokardiografi for voksne sebrafisk ved hjelp av et lite vedlikehold, kostnadseffektivt og omfattende system som gir konsistente, pålitelige innspillinger. Vi illustrerer vår protokoll ved hjelp av sunne voksne mannlige sebrafisk av 12-18 måneders alder. Vi introduserer også en rask tolknings strategi i sanntid for kvalitets validering for å sikre data nøyaktighet og robusthet tidlig i elektro opptaksprosessen.

Introduction

Sebrafisk (Danio rerio) hjerte ligger anteroventrally til bryst hulen mellom Operculum og pectoral hofteholdere. Hjertet er vedlagt ganske løst i en sølv-farget perikard SAC. Anatomisk er sebrafisk hjerte forskjellig fra de fire-kamret menneske og andre pattedyr hjerter på grunn av sin lille skala (100-fold mindre enn menneskets hjerte) og dens to-kamret struktur bestående av bare ett Atrium og en ventrikkel. Likevel, elektro (EKG) bølgeformer og varigheten av QT-intervallet av begge artene er bemerkelsesverdig lik (figur 1). Følgelig har sebrafisk dukket opp som en populær modell for å studere menneskelig arvet arytmi1,2,3 og for høy gjennomstrømming narkotika screening av potensielle menneskelige cardiotoxicities4,5 , for eksempel QT-forlengelse.

I rutinemessig evaluering av menneskelige hjertesykdommer, har kroppen-overflaten EKG blitt den mest utbredte brukte første-linjen ikke-invasiv diagnostisk verktøy siden oppfinnelsen av Einthoven i 1903. I kontrast, siden den første tilpasningen av kroppen-overflaten EKG-opptak metode for voksne sebrafisk i 20066 og flere modifikasjoner deretter7, denne teknikken har vært stort sett utilgjengelige for mange forskere i feltet til tross populariteten til denne dyre modellen. For andre forskere som utførte in vivo ECG-avhør for voksne sebrafisk, førte store variasjoner blant operatørene til inkonsekvens i EKG-funn fra ulike studier. Vanlige årsaker inkluderer tungvint og dyre spesialiserte enheter og programvare, lav signal-til-støy-forhold, og forvirring om elektrodeplassering, alle ytterligere forverret av en ufullstendig forståelse av den voksne sebrafisk EKG-funksjoner og underliggende vevs mekanismer. Gitt at in vivo ECG er det eneste diagnostiske verktøyet for elektrisk fenotype av levende sebrafisk, er det et klart behov for en standardisert metode for å forbedre følsomhet og spesifisitet, reproduserbarhet og tilgjengelighet.

Her presenterer vi en praktisk, pålitelig og validert tilnærming for å registrere og tolke sebrafisk in vivo-elektrokardiogrammer (figur 2). Ved hjelp av en enkelt bipolar bly i frontal flyet, undersøkte vi endringene i EKG bølgeformer og intervall varighet av levende anesthetized sunn vill-type AB voksen sebrafisk.

Protocol

Alle eksperimenter i denne studien ble gjennomført i samsvar med US National Institutes of Health guide for omsorg og bruk av Laboratoriedyr. Alle dyr protokoller i denne studien ble godkjent av UCLA institusjonelle Animal Care og use Committee.

1. utarbeidelse av eksperimentell oppsett

  1. Oppretthold sebrafisk i system for å strømme gjennom akvarium på en 14 h lys, 10 h mørk photoperiod ved 28 ° c ± 0,5 ° c. Fôr med flak mat daglig og levende saltlake reker (Artemia nauplii) to ganger daglig. Sebrafisk i denne studien ble vedlikeholdt og matet av UCLA sebrafisk Core.
  2. På dagen for eksperimentet, transport sebrafisk fra akvariet til laboratoriet.
  3. Sett opp i vivo EKG opptakssystem ved å koble de essensielle delene av utstyret og sette inn de tre fargekodede rustfrie stål elektrodene i de tre farge samsvarende tilgangs portalene til forsterkeren (Figur 3). Start systemet ved starten av et EKG-opptak og/eller en analyse økt.
  4. Anskaffe nødvendige verktøy, for eksempel en tidtaker/stoppeklokke, en våt svamp med et slit å holde fisk, pinsett, saks, Pasteur Pipetter og kultur retter (100 mm x 20 mm).

2. anestesi induksjon

  1. Forbered nedsenking anestesi for smerte kontroll og fisk immobilisering å unngå bevegelse gjenstander under EKG datainnsamling. De fleste laboratorier bruker nedsenking tricaine (etanol 3-aminobenzoate methanesulfonate, MS-222).
    1. For å gjøre tricaine 0,4% lagerløsning, kombinere følgende elementer i en skrue-avkortet mørk glass flaske: 400 mg tricaine pulver, 98 mL av dobbelt destillert vann, og 2 mL 1 M Tris (pH 9). Juster til pH 7,0 ved hjelp av 1 N NaOH eller 1 N HCl etter behov8.
    2. For å gjøre tricaine endelige nedsenking løsning, bestemme minimum konsentrasjon som passer for sebrafisk alder9, størrelse, metabolske tilstand, belastning, sykdom modell, vitenskapelige mål og prosessuelle varighet.
    3. Utfør en tricaine konsentrasjon-respons studie, titrating opp eller ned fra den anbefalte konsentrasjonen av 168 mg/L (eller 0,0168%)9 om nødvendig, for å oppnå nivå 4 av anestesi innen 3 min med færrest mulig cardiorespiratory toksisitet. I denne studien vil for eksempel nedsenking av ville-type AB-sebrafisk på 12-18 måneders alder til en 0.02-0.04% tricaine løsning indusere nivå 4 av anestesi innen 3 min.
      Merk: på nivå 4 av anestesi, likevekt og muskel tone er helt tapt og opercular bevegelse rate er redusert8.
    4. Om nødvendig, konsultere veterinær i institusjonelle Animal Care og use Committee (IACUC) for ytterligere veiledning om egnethet for valg av bedøvelse (er) og administrasjonsvei.
  2. Fordyp en voksen sebrafisk i en tallerken som inneholder tricaine løsning av lavest forhåndsbestemt og IACUC-godkjent konsentrasjon (for eksempel 0.02-0.04% i denne studien) for å indusere nivå 4 av anestesi innen 3 min (figur 2).
    1. For å overleve EKG-protokollen, må du holde EKG-opptaket så kort som mulig (under 10 min). For korte EKG-opptak økter som varer mindre enn 15 min, er anestesi vedlikehold ikke nødvendig.
    2. Bruk en lang-fungerende intramuskulær paralytisk og et oral system for lange EKG-opptak som varer i timevis, for å gi rikelig med hydrering og oksygenering6.

3. plassering av EKG-bly

  1. Når sebrafisk opprettholder nivå 4 av anestesi for 3 s, bruk et par Butt tang for å overføre fisken umiddelbart på den fuktige svamp slit med sin ventrale overflate øverste for plassering av EKG-bly elektroder (Figur 4).
  2. Sett forsiktig de tre EKG bly elektrodene i fisken muskulaturen til ca 1 mm i dybden for å etablere en bipolar bly i frontal flyet som paralleller venstre caudal-høyre skallen orientering av CARDIAC viktigste aksen.
  3. Plasser den positive (røde) elektroden i ventrale midtlinjen på nivå med bulbus arteriosus, det vil si, ved 1-2 mm over en innbilt linje som forbinder de to nedre kantene av operculums (figur 4a).
  4. Plasser den negative (svart) elektrode caudally og 0,5-1,0 mm venstre sideveis til den positive elektroden, i en avstand som er større enn maksimal apicobasal lengde på den voksne sebrafisk ventrikkel (figur 4a).
  5. Plasser referanse (grønn) elektrode caudally, nær anal regionen.
    Merk: siden den primære aksen varierer noe fra fisk til fisk, for å maksimere R og T bølge amplituder, justere lederposisjoner ved å gjøre bare små, systematiske endringer gjennom prøving og feiling. Du kan for eksempel endre én elektrode (positiv eller negativ), i stedet for begge elektrodene, om gangen og foreta gradvise endringer i én bestemt retning før du bytter til en annen retning i stedet for å gjøre ujevne endringer i tilfeldige retninger.

4. EKG-opptak

  1. Åpne datainnsamlings programmet for EKG. Velg ønsket innstilling fra rullegardinmenyene for rekkevidde, lavt pass og høy pass. For eksempel gir følgende innstilling i in vivo EKG opptaks systemet som brukes i dette eksperimentet konsistent, tilfredsstillende signal-til-støy-forhold for en normal voksen sebrafisk: Range "2 mV", low pass "120 Hz", og høy pass "0,03 s".
  2. Trykk på Start for å starte kontinuerlig fri EKG-opptak med en samplingsfrekvens på 1 kHz.
  3. For å optimalisere bly posisjonering for maksimalt signal-til-støy-forhold, trykk på Stopp for å stoppe EKG-opptaket og gjennomgå EKG-sporingen like etter det første opptaks forsøket for hvert hjerte.  For å diagnostisere at en voksen sebrafisk EKG er normalt, må du bekrefte at alle de følgende fire valideringskriteriene er oppfylt (figur 1):
    1. Kriterium 1: Sørg for at alle EKG-kurver (P, QRS og T) er tydelige og lett synlige.
    2. Kriterium 2: Kontroller at P-bølgen er positiv.
    3. Kriterium 3: Kontroller at netto QRS-komplekset er positivt (dvs. amplituden til R-bølgen er større enn summen av Q-og S-amplituder).
    4. Kriterium 4: Kontroller at T-bølgen er positiv.
  4. Hvis det forventes et vanlig EKG, flytter du elektrodene (prøv den negative elektroden først) om nødvendig, inntil alle fire valideringskriteriene er oppfylt.
  5. Hvis en normal T bølge er forventet, men T bølgen er for liten, omplassere elektrodene for å maksimere T bølge amplitude.
  6. Gjenoppta EKG-opptaket etter optimalisering av bly posisjonering. Lagre EKG-feier for påfølgende analyse.

5. gjenvinning fra anestesi

  1. På slutten av EKG opptaks økten, forsiktig fjerne elektrodene uten skadet fisken. Forflytning fisken å frisk, oksygenrikt fisken vann ledig av tricaine.
  2. For å lette utvinningen fra anestesi, sprute vann over gjellene kraftig med en Pasteur pipette til fisken fortsetter regelmessig Gill bevegelse eller svømming.
  3. Monitor fisken for full utvinning fra anestesi (vanligvis 1-2 min), som indikert av fisken evne til å svømme oppreist i minst 5 s.

6. EKG-tolkning

  1. Definer analyse innstillingene.
    1. Kjenn programvaregrensesnittet (tabell over materialer) ved å lese bruksanvisningen for programvaren for EKG-dataanalyse.
      Merk: selv om retningene nedenfor er spesifikke for den kommersielle programvaren som brukes i laboratoriet vårt, er de grunnleggende oppgavene i hovedsak de samme i enhver programvarepakke for EKG-analyse.
    2. Åpne dataanalyse programmet for EKG. Fra fil- menyen velger du Åpne for å åpne EKG-filen av interesse og vise hele EKG-sporingen. Bruk musen til å dra ut en del av interesse i EKG-sporingen for å analysere.
    3. Fra EKG-analyse -menyen velger du EKG-innstillinger for å åpne en dialogboks for å forhånds definere ulike parameterinnstillinger for programvare automatisk analyse (figur 5a).
  2. Analysere hjerterytme og hastighet.
    Merk: hjertefrekvensen avhenger av flere faktorer, inkludert sebrafisk alder og belastning, anestesimidler (f. eks, tricaine, isoflurane, etc.) og konsentrasjon, anestesi bruk (enkelt middel5,7 vs. kombinerte agenter5) og eksponeringstid5. For eksempel, i denne studien hjertefrekvensen på 12-18 måneder gamle vill-type AB sebrafisk etter 3-5 min av nedsenking i 0.02-0.04% tricaine løsning var 116 ± 17 slag per minutt (n = 9), i samsvar med litteratur rapporter av hjertefrekvens for denne aldersgruppen og bedøvelse5,7.
    1. Bestem om hjerterytmen er sinus eller ikke, vanlig eller uregelmessig.
      Merk: tilstedeværelsen (eller fraværet) av sinus rytme er basert på tilstedeværelsen (eller fraværet) av en oppreist P-bølge forut for hver QRS med et vanlig PR-intervall (for eksempel 60-65 MS for Liu et al. ' s 10-12 mnd-gammel7 og 12-18 måned gamle Wild-type AB sebrafisk i denne studien). Regularitet og ventrikkel rytme (eller uregelmessig) er basert på regularitet (eller uregelmessig) av etterfølgende PP eller RR intervaller, henholdsvis.
    2. For å fastslå pulsen, må du sørge for at programvaren identifiserer alle P-og R-bølgene på riktig måte. Basert på disse automatiske IDene (eller manuelle korrigeringer) av P-og R-bølgene, måler programvaren automatisk alle PP-og RR-intervallene i EKG-valget, beregner intervall gjennomsnittet for å generere atrieflimmer og ventrikkel rate.
      Merk: atrieflimmer er gjennomsnittlig PP-intervall, mens ventrikkel raten er gjennomsnittlig RR-intervall. For å bestemme hjertefrekvensen, er korrekt identifisering av P-og R-bølgene avgjørende.
    3. Korriger eventuelle feil ved automatisk identifisering ved å flytte de feilplassert markørene til de riktige P-og R-bølgene (figur 5B).
      Merk: Hvis hjertet er i sinus rytme, den atrieflimmer rate og ventrikkel rate er de samme på grunn av en-til-en korrespondanse mellom Sinus P bølgene og QRS komplekser. Men i tilfelle av atrioventrikulær dissosiasjon (f. eks, i ventrikkel takykardi eller tredje-graders atrioventrikulær blokk), er dette en-til-en korrespondanse mellom P bølgene og QRS komplekser tapt; Derfor er det to hjerte frekvenser fordi atrieflimmer er forskjellig fra ventrikkel raten.
    4. Bestem pulsen basert på minst fem påfølgende komplett CARDIAC sykluser hvis hjerterytmen er vanlig, eller en stripe på minst seks sekunder hvis hjerterytmen er uregelmessig.
  3. Beregne intervaller og bølge varigheter.
    1. Gå til EKG-analyse ≫ snitt visning for å sammenkoble n (f.eks. 5) påfølgende hjerte sykluser til ett gjennomsnittlig signal (figur 5c).
      Merk: Hvis EKG-bølgeformene til en individuell hjerte syklus avviker vesentlig fra det gjennomsnittlige signalet, bør du studere denne hjerte syklusen separat uten sammenkobling.
    2. Forsikre deg om at programvaren identifiserer starten og slutten på P-bølgen, QRS-komplekset og T-bølgen som vises i snitt visningsvinduet (figur 5c). Basert på disse automatiske IDene (eller manuelle korrigeringer) av disse bølgene og intervallene, måler programvaren automatisk varighetene som definert konvensjonelt.
      Merk: PR-intervallet strekker seg fra starten av P-bølgen til starten av QRS-komplekset (eller RS-komplekset hvis Q-bølgen ikke er synlig). QRS-varigheten strekker seg fra starten av Q-bølgen (eller R-bølgen hvis Q-bølgen ikke er synlig) til slutten av S-bølgen (dvs. J-punktet; Figur 1). QT-intervallet strekker seg fra starten av Q-bølgen (eller R-bølgen hvis Q-bølgen ikke er synlig) til slutten av T-bølgen. For å beregne intervaller og varigheter er det derfor avgjørende å identifisere starten og slutten på P-bølgen, QRS-komplekset og R-bølgen.
    3. Korriger eventuelle feil ved automatisk identifisering ved å flytte de feilplassert markørene til de riktige plasseringene.
    4. Velg den negative toppen av S bølgen som slutten av QRS-komplekset7 fordi sebrafisk J punkt som signaliserer slutten av s-bølgen kan være spesielt vanskelig å identifisere nøyaktig. Dette vil føre til en liten undervurderer den sanne QRS-varigheten.
      Merk: EKG-analyseprogramvaren korrigerer automatisk QT-intervallet til ventrikkel raten (eller RR-intervall) for å generere det korrigerte QT-intervallet QTc ved hjelp av metoden som er forhånds valgt av brukeren i trinn 6.1.3, for eksempel Bazett (figur 5a). Den Bazett ' s formel (1920) QTc = QT/√ RR er den mest populære og den første av flere metoder foreslått for å korrigere den menneskelige QT-intervallet for hjertefrekvens. Fordi nøyaktigheten av Bazett formel har blitt avhørt, se andre metoder foreslått for mennesker10,11 og sebrafisk6 (figur 5D).
  4. Tolke EKG-unormalt ved å gjenkjenne unntak for de fire valideringskriteriene i trinn 4,3.
    1. Gjenkjenn unntak for kriterium 1. I fravær av noen P bølger (som indikerer fravær av sinus rytme), stole på RR intervaller og QRS varighet å diagnostisere hjerterytmen. For eksempel, hvis RR intervallene er uregelmessig uregelmessig, diagnostisere atrieflimmer; Hvis RR intervallene er regelmessige og QRS er normalt smal, diagnostisere junctional flukt rytme; på den annen side, hvis RR intervallene er regelmessige og QRS er unormalt forlenget, diagnostisere ventrikkel flukt rytme.
    2. Gjenkjenn unntak for kriterium 2. Når P bølgen er negativ (eller invertert), diagnostisere retrograd av atrieflimmer fra et utenfor livmoren (for eksempel et atrieflimmer området nedstrøms av sinus node, atrioventrikulær node, eller ventrikkel).
    3. Gjenkjenn unntak for kriterium 3. Når høye og smale Q bølger til stede med negative P og negative T bølger, diagnostisere bly reversering på grunn av en feilaktig bryter av den positive og negative elektroden posisjoner fordi de høye og smale Q bølgene var sanne R bølger feilaktig invertert (figur 6D ). I kontrast, når brede Q bølger stede med positive P bølger etter betydelig hjertes Kader, diagnostisere hjerteinfarkt fordi de brede Q bølgene er sanne patologisk Q bølger.
    4. Gjenkjenn unntak for kriterium 4. Når T-bølgen er invertert, inspisere ventrikkel aktivisering å identifisere om ventrikkel repolarisasjon unormalt er primær eller sekundær. Stole på klinisk scenario å innskrenke riktig diagnose fra en differensial liste over primære ventrikkel repolarisasjon unormalt (fra narkotika effekter eller hjerteinfarkt iskemi; Figur 6C) VS. sekundær ventrikkel repolarisasjon unormalt (på grunn av avvikende ventrikkel aktivering fra pre-eksitasjon, ventrikkel ektopi, eller ventrikkel pacing).
  5. Eksport av EKG-funn.
    1. Velg Tabell visning for å se gjennom alle EKG-målingene. Velg mål for interesse å kopiere og lime inn i ønsket dokument (for eksempel Excel-regneark).
    2. Hvis du vil eksportere en EKG-sporing, merker du en del av interesse for EKG-sveip ved hjelp av forstørrelsesikonet. Kopier og lim inn i ønsket dokument (for eksempel Word eller PowerPoint).

Representative Results

Figur 1 illustrerer den kliniske relevansen av metoden som presenteres her. In vivo overflate elektrokardiografi for voksen sebrafisk er et essensielt elektrisk bestemmelse av fenotype verktøy på grunn av de bemerkelsesverdige likheter mellom sebrafisk og menneskelige EKG til tross for sine enorme anatomiske forskjeller. Det sebrafisk hjertet har bare ett Atrium og en ventrikkel i motsetning til menneskets hjerte med to Atria og to ventriklene (øverste rad; henholdsvis høyre og venstre). Men til tross for sin åpenbare anatomiske enkelhet, sebrafisk hjertet deler flere EKG-funksjoner med menneskets hjerte (nederste rad; henholdsvis høyre og venstre) derfor har sebrafisk hjerte dukket opp som en surrogat modell for menneskelig CARDIAC elektrofysiologi5,12,13. Figur 1 illustrerer en liten, men distinkt Q-bølge fra en levende, sunn 14 måneder gammel sebrafisk. Men i sebrafisk EKG er ikke bly posisjonering vanligvis optimalisert for å demonstrere Q-bølgen. Derfor er Q-bølgen vanligvis usynlig, og et RS-kompleks er mer allment sett enn hele QRS-komplekset i sebrafisk EKG.

Figur 2 oppsummerer de fire viktige handlingstrinn for å gjennomføre minimalt invasiv in vivo elektrokardiografi for voksne sebrafisk. Etter anestesi induksjon (trinn 1) og elektrodeplassering (trinn 2), registrerte vi Baseline EKG-signaler (trinn 3) fra en sunn vill-type AB-sebrafisk på 12 til 18 måneders alder (n = 9). Vår elektrode innsetting teknikk var bare minimalt invasiv fordi vi ikke trenger å skrelle fisk skalaer eller utføre pericardiotomy. Etter datainnhenting, vi manuelt gjennomgått og bekreftet hvert EKG-opptak (trinn 4) for å unngå potensielle feil tolkning av programvare automatisk analyse.

Figur 3 viser de tre uunnværlige komponentene i et typisk EKG datainnsamlings-og behandlingssystem: en datainnsamlings maskin med høy ytelse, en høy gain differensial forsterker og en datamaskin som er lastet opp med programvare for EKG-data oppkjøp og analyse. I laboratoriet vårt har vi tilpasset et eksisterende kommersielt in vivo EKG opptakssystem som opprinnelig ble utviklet for små pattedyr modeller (som mus, rotter og kaniner) for å imøtekomme den voksne sebrafisk modellen.

Figur 4 viser at riktig føre plassering krever samkjøre ledelsen med antatt CARDIAC primære aksen. I sebrafisk in vivo EKG-opptak, fordi bare ett enkelt bly er brukt, er riktig bly posisjonering for å maksimere samtidig både R og T bølge amplituder kritisk. For å maksimere R og T bølge amplituder, justerte vi den positive og negative bly elektroder med CARDIAC viktigste aksen, antagelig i venstre caudal til høyre skallen orientering. Etter toraktomi og pericardiotomy å åpne perikard SAC og utsette hjertet, blir CARDIAC viktigste aksen tydelig (figur 4b hvit stiplet linje). Faktisk, pericardiotomy å avsløre hjertet er en vanligvis anvendt strategi å forhøye signalet-å-bråk forhold7 for prisen av OMDANNER det EKG innspillingen fra en minimal invasjonen i en høylig invasjonen fremgangsmåte.

Figur 5 illustrerer kritiske trinn i EKG-analyse. Først forhåndsdefinerte vi de ulike parameterinnstillingene for programvare automatisk analyse ved hjelp av dialogboksen EKG-innstillinger (figur 5a). Fordi vi gjenbruke et eksisterende EKG opptaksutstyr designet for pattedyr modeller for å imøtekomme voksen sebrafisk, er gjenkjennings-og analyse innstillingen for sebrafisk ikke tilgjengelig. Vi valgte Human Preset i stedet, gitt den bemerkelsesverdige likheten av sebrafisk EKG til humant EKG (figur 5a). For det andre, vi manuelt bekreftet programvaren automatisk EKG-identifisering (i svart) av R Wave topper og korrekt (i rødt) noen R Wave Auto-identifisering feil før kommanderende programvaren for å beregne den gjennomsnittlige ventrikkel rate. For eksempel, i figur 5B, en stor P bølge i forhold til r bølgen lurt programvaren til feilaktig identifiserer r bølgene, som fører til den påfølgende automatiske feil beregning av RR intervall eller ventrikkel rate. Derfor er menneskelig verifisering og nødvendige rettelser etter behov avgjørende for EKG-analyse. For det tredje, vi raskt vurderte rytme regularitet og beregnet den gjennomsnittlige varigheten av bølger og intervaller ved hjelp av gjennomsnittlig visning (figur 5c) for å sammenkoble flere påfølgende CARDIAC sykluser (grønn) i ett enkelt gjennomsnittlig signal (svart). Her i figur 5c, den ubetydelige avviket mellom hver av de ni CARDIAC sykluser og gjennomsnittlig signal argumenterer for den utmerkede rytme regularitet av denne sebrafisk hjertet. Til slutt, vi aktivert programvaren for å automatisk korrigere QT-intervallet for hjertefrekvens ved hjelp av Bazett, en av de syv ulike metoder tilgjengelig (figur 5D).

Figur 6a -C demonstrerer hvordan dybden på elektrode plasseringen påvirker AMPLITUDER til EKG-signalene. Når vi feil satt inn elektrodene for overfladisk i dermis (figur 6a), var ledelsen "indirekte"-lignende (mer enn to CARDIAC diametere fra hjertet, lik den indirekte standard menneskelige EKG lem fører I, II og III) og spenningen signalene var små. Når vi hensiktsmessig satt inn elektrodene 1 mm dypere inn i pectoralis muskulaturen (figur 6b), ble ledningen "semidirect" (i umiddelbar nærhet, men ikke i direkte kontakt med hjertet) og spennings signalene økt. EKG-kurvene ble lett synlige. Men når vi feil satt inn elektrodene enda dypere inn i ventrikkel (figur 6C), ble ledelsen "direkte" (i direkte kontakt med hjertet) og spennings signalene økt ytterligere. R-bølgen amplitude i figur 6C økt med åtte ganger i forhold til figur 6a og med fire ganger i forhold til figur 6b. Men EKG-spor i figur 6C avdekket nye tegn på skade på ventrikkel myokard, slik som nye St depresjon og nye T bølge inversjon.

Figur 6D demonstrerer hvordan den uvanlige inversions av alle EKG bølgeformer (P, Q, R, S, og T) bør signalisere en føre reversering feil, der de positive og negative elektroder byttet plass. Merk at per definisjon Q og S er alltid negative, mens R er alltid positiv.

Figur 6e -F viser hvordan upassende anestesi dybde kan svekke kvaliteten på in vivo EKG Recording. I figur 6e, utilstrekkelig anestesi (0,017% tricaine) førte til unnlatelse av å nakkens sebrafisk helt. Den resulterende bevegelse artefakter senket signal-til-støy-forhold ved både forurensende signalet (stjerne) og øke støyen (piler). Til sammenligning, i figur 6F, overdose anestesi (0,08% tricaine) indusert alvorlig sinus bradyarrhythmia samt endringer av St-segmentet og T-bølgen.

Figure 1
Figur 1: kontrasterende anatomi og EKG av menneskelige og sebrafisk hjerter. I motsetning til det menneskelige hjertet med to Atria og to ventriklene, sebrafisk hjertet har bare ett Atrium og en ventrikkel (øverste rad). Forkortelser: RA, rett Atrium; LA, venstre Atrium; RV, høyre ventrikkel; LV: venstre ventrikkel. Det sebrafisk hjertet deler flere vanlige EKG-funksjoner med det menneskelige hjertet (nederste rad). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: minimalt invasiv i vivo EKG opptaks protokoll. Et skjematisk flytskjema illustrerer fire kritiske handlingstrinn for å gjennomføre et in vivo EKG-avhør: indusere anestesi, plasser EKG-bly elektroder, ta opp EKG, og analyser EKG-opptakene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Datainnsamlings-og behandlingssystem for EKG. De tre nøkkelkomponentene i et integrert i vivo EKG opptakssystem inkluderer en maskinvare for innhenting av data, en forsterker og dataprogramvare for datainnsamling og analyse. Forsterkeren kommer med tre klar-til-bruk 29-gauge rustfritt stål microelectrodes. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Plassering av EKG-kundeemner. 3 29-gauge fargekodet rustfritt stål elektroder er satt inn sikkert i fisken muskulaturen til ca 1 mm i dybden. Plassering av den negative (svart) elektroden og den positive (rød) elektroden etablerer en bipolar bly i frontal planet, langs en venstre caudal til høyre skallen orientering. Forkortelse: REF, referanse elektrode Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: C ritical trinn i EKG-analyse. (A) pre-definere de ulike parameterinnstillingene for programvare automatisk analyse. (B) manuelt korrigere (rød) to automatisk misidentifications av programvaren (svart) av P og R bølgene å rette programvarefeil beregning av atrieflimmer og ventrikkel rate. (C) sammenkoble ni påfølgende CARDIAC sykluser (grønn) i en enkelt gjennomsnittlig signal (svart) for å raskt vurdere rytme regelmessigheter/uregelmessigheter og beregne gjennomsnittlig varighet av bølger og intervaller. (D) korrigere QT-intervallet for hjertefrekvens ved hjelp av en av de forskjellige metodene, for eksempel Bazett. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: effekter av bly plassering og anestesi dybde på EKG-signaler. To mest kritiske trinn som avgjør hvor vellykket in vivo EKG-opptak er, er plassering (A-D) og anestesi dybde (E-F). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Når du registrerer in vivo ECG for voksen sebrafisk ved hjelp av et enkelt bly som vi har vist i denne studien, er det en rekke advarsler om kvaliteten og gyldigheten av resultatene av EKG-opptaket. Først i valg av riktige anestesi og bestemme minimal nødvendig anestesi konsentrasjon, dybde og varighet, balansere bedøvelse cardiotoxicities mot kritiske behovet for å undertrykke bevegelse gjenstander og a priori bestemmelse for en overlevelse g. Terminal eksperimentell design. Utnytte synergi styrken av en kombinasjon av flere bedøvelse fra ulike legemiddel klasser5,14 og paralytics for å senke dosen av individuelle agenter5 eller administrere en lav vedlikeholdsdose etter en høyere induksjon dose er typiske strategier. Men til tross for sin velkjente potensielle cardiorespiratory toksisitet, inkludert død8, er tricaine fortsatt den mest brukte, den beste tilgjengelige, og den eneste anestesi godkjent av US Food and Drug ADMINISTRATION (FDA) for sebrafisk Anestesi. Tricaine har blitt populært brukt i EKG-opptak av voksne sebrafisk enten som en enkelt agent eller i kombinasjon med andre anestesi eller paralytics.

Sekund, bly plassering nøyaktighet kan sikres minst for sunn normal sebrafisk bruke våre fire validere kriterier for en normal voksen sebrafisk EKG. Av de fire validere kriteriene som vi foreslår her, de to siste kriteriene sammen bekrefter de grunnleggende samsvarskravene mellom polariteten til R-bølgen og T-bølgen i en normal EKG5,7,15. Denne R og T Wave-kon kor sen er en tilfeldig, men likevel kritisk, likhet mellom sebrafisk og humant16,17 normal EKG som bidrar til den kliniske relevansen av sebrafisk hjerte modell som et surrogat for menneskers hjerte elektrofysiologi. Imidlertid kan flere godartet eller ondartede tilstander oppheve noen av de fire valideringskriteriene. For eksempel er R og T Wave konkordans tapt i hjerteinfarkt iskemi7,15. Dette tapet av R og T bølge kon kor sen i hjerteinfarkt iskemi er en annen slående likhet mellom sebrafisk og menneskelige EKG som bidrar til klinisk relevans av sebrafisk hjerteinfarkt modellen.

Til slutt anbefaler vi en standard praksis i EKG-analyse. Med bruk av teknologi kan EKG-analyseprogramvare generere automatisk EKG-tolkning. Vi anbefaler imidlertid på det sterkeste at utdannede mennesker alltid skal tolke og verifisere alle EKG basert på det respektive kliniske scenarioet som fører til EKG-opptak. Rutinemessig selvhjulpenhet utelukkende på automatisk tolkning av en EKG analyseprogramvare er utilrådelig, spesielt i nærvær av vanlige normale EKG-varianter, CARDIAC patologi, eller suboptimal bly plassering.

Denne studien fokuserer på den minimalt invasiv metode for korte EKG-opptak økter. Men skulle behovet oppstå for Terminal langvarig EKG-opptak økter varige timer, modifikasjoner er nødvendig for å gi tilstrekkelig oksygenering, hydrering og anestesi ved kontinuerlig å få6.

I tillegg forsterke signal-til-støy-forhold med en av minst tre måter. Velge en kraftigere forsterker er ofte en kostbar, om ikke upraktisk, alternativ. Åpning av perikard SAC å redusere volumet dirigent er en rimelig, men invasiv, tilnærming som har blitt vedtatt7. Strategisk bly plassering for å justere ledelsen aksen i en retning parallelt med de viktigste CARDIAC aksen (figur 4b) vil maksimere EKG spennings signaler, men kan kreve prøving og feiling, spesielt i fravær av pericardiotomy.

The in vivo EKG avhør metode for voksne sebrafisk som vi presenterte her tilbyr fire viktigste fordelene. Først, vår minimalt invasiv tilnærming krever bare elektrode innsetting, men ingen fisk skala fjerning eller toraktomi-pericardiotomy. Derfor, ved å minimere smerte for fisken, muliggjør vår tilnærming gjentatte EKG-avhør i langsgående overlevelses studier. For det andre, når anestesi tilstrekkelig undertrykke fisken bevegelse, i vivo EKG innspillingen system i vår studie gir konsekvent et tilfredsstillende signal-til-støy-forhold med støy frie rå signaler. For det tredje sørger den fire-kriteriet kvalitets godkjenningen som vi foreslår her, data nøyaktighet og robusthet tidlig i EKG datainnsamlingen og minimerer operatør avhengige variasjoner. Endelig, i særdeleshet, vår siste validering kriterium (normal T-bølgen er oppreist) omslutter kon kor ringen av R-bølgen og T-bølgen, en viktig menneske-lignende funksjon i sebrafisk normal EKG (figur 1).

Det finnes imidlertid fortsatt fire store begrensninger for gjeldende in vivo ECG-metodikk for voksne som er sebrafisk av vår gruppe og andre.

For det første nødvendiggjør mangelen på samarbeid behovet for anestesi med sine begrensende cardiorespiratory toksisitet konsekvenser. For in vivo EKG avhør, mens menneskelige pasienter aldri trenger sedasjon, sebrafisk alltid krever anestesi eller paralytics, som alle forårsake variable cardiorespiratory toksisitet.

For det andre, behovet for å feste det vedlagte EKG fører litt løfter invasiveness av en ellers ikke-invasiv prosedyre. Mens bly plassering i kroppen-overflaten EKG-opptak av mennesker er helt ikke-invasiv fordi elektroder holder seg til den menneskelige epidermis, bly plassering for in vivo EKG-opptak av sebrafisk er mer invasiv fordi, på minimum, stål elektroder må punktering av fisken huden for sikker innsetting i fisken muskulaturen.

De to siste begrensningene stammer fra de anatomiske begrensningene i sebrafisk bryst og hjerte. For det tredje nødvendiggjør den ørsmå størrelsen på det voksne sebrafisk hjertet en drastisk reduksjon i antall EKG-avledninger. Mens mennesker lett imøtekomme tolv fører i et standard EKG-opptak, voksen sebrafisk kan vanligvis romme bare en enkelt Unipolare eller bipolar bly. Forgreninger av et enkelt EKG-bly er utfordringen å optimalisere samtidig amplituder av alle tre P, R, og T bølger. Betydningen av optimal og nøyaktig plassering av bly i sebrafisk EKG-avhør kan derfor ikke være overdrevet. I sebrafisk, den T bølgen presenterer en unik oppdagelse utfordring fordi det er ofte den minste av disse tre bølgene. Derfor bør den sebrafisk T-bølgen amplitude få optimaliserings prioritet over de vanligvis større P-og R-bølgene.

Fjerde, bestemme sebrafisk viktigste CARDIAC aksen for å maksimere R bølge amplitude kan være utfordrende. Årsaken er at sebrafisk hjertet har mer bevegelsesfrihet innenfor sin løs perikard sac i forhold til menneskets hjerte innenfor sin form-montering hanske-lignende pericardium.

Overall, disse begrensningene vil stimulere fremtidig metode innovasjon. Med bruk av 3D-utskrift og deformerbare elektronikk18, det er håp for direkte bly implantation en dag i våken, våken, svømming sebrafisk ved hjelp av en "CARDIAC sokk" av trådløse elektrode sensorer.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health R01 HL141452 til TPN. ADInstruments vennlige gitt generøse midler til å dekke kostnadene ved åpen tilgang publisering, men hadde ingen rolle i enten eksperimentell design, datainnsamling, dataanalyse av denne studien eller tilgang til manuskriptet før publisering.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Culture dishes Fisher Scientific FB087571 100 mm x 20 mm
Dumont Forceps Fine Sciense Tools 11253-20 0.1 x 0.06 mm
FE136 Animal Bio Amp  AD Instruments FE231
Iris Forceps Fine Sciense Tools 11064-07 0.6 x 0.5 mm
LabChart 8 Pro AD Instruments Software with ECG Module
Needle electrodes for Animal Bio Amp  AD Instruments MLA1213 29 gauge
Plastic Disposable Transfer Pipets Fisher Scientific 13-669-12 6 in., 1.2 mL
PowerLab 4/35 AD Instruments 4//35
Scissors Fine Sciense Tools 15000-08 2.5 mm, 0.075 mm
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) Sigma E10521-10G MS-222

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Arnaout, R., et al. Zebrafish model for human long QT syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (27), 11316-11321 (2007).
  2. Hassel, D., et al. Deficient zebrafish ether-a-go-go-related gene channel gating causes short-QT syndrome in zebrafish reggae mutants. Circulation. 117 (7), 866-875 (2008).
  3. Meder, B., et al. Reconstitution of defective protein trafficking rescues Long-QT syndrome in zebrafish. Biochemical and Biophysical Research Communication. 408 (2), 218-224 (2011).
  4. Sieber, S., et al. Zebrafish as a preclinical in vivo screening model for nanomedicines. Advanced Drug Delivery Reviews. , (2019).
  5. Lin, M. H., et al. Development of a rapid and economic in vivo electrocardiogram platform for cardiovascular drug assay and electrophysiology research in adult zebrafish. Science Reports. 8 (1), 15986 (2018).
  6. Milan, D. J., Jones, I. L., Ellinor, P. T., MacRae, C. A. In vivo recording of adult zebrafish electrocardiogram and assessment of drug-induced QT prolongation. American Journal of Physiology-Heart and Circulation Physiology. 291 (1), H269-H273 (2006).
  7. Liu, C. C., Li, L., Lam, Y. W., Siu, C. W., Cheng, S. H. Improvement of surface ECG recording in adult zebrafish reveals that the value of this model exceeds our expectation. Science Reports. 6, 25073 (2016).
  8. Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. Ilar Journal. 53 (2), 192-204 (2012).
  9. Westerfield, M. The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 5th edn, University of Oregon Press. (2007).
  10. Sagie, A., Larson, M. G., Goldberg, R. J., Bengtson, J. R., Levy, D. An improved method for adjusting the QT interval for heart rate (the Framingham Heart Study). American Journal of Cardiology. 70 (7), 797-801 (1992).
  11. Luo, S., Michler, K., Johnston, P., Macfarlane, P. W. A comparison of commonly used QT correction formulae: the effect of heart rate on the QTc of normal ECGs. Journal of Electrocardiology. 37 Suppl, 81-90 (2004).
  12. Vornanen, M., Hassinen, M. Zebrafish heart as a model for human cardiac electrophysiology. Channels (Austin). 10 (2), 101-110 (2016).
  13. Tsai, C. T., et al. In-vitro recording of adult zebrafish heart electrocardiogram - a platform for pharmacological testing). Clinica Chimica Acta. 412 (21-22), 1963-1967 (2011).
  14. Collymore, C., Tolwani, A., Lieggi, C., Rasmussen, S. Efficacy and safety of 5 anesthetics in adult zebrafish (Danio rerio). Journal of American Association of Lab Animal Sciences. 53 (2), 198-203 (2014).
  15. Sun, Y., et al. Activation of the Nkx2.5-Calr-p53 signaling pathway by hyperglycemia induces cardiac remodeling and dysfunction in adult zebrafish. Disease Model and Mechanism. 10 (10), 1217-1227 (2017).
  16. Franz, M. R., Bargheer, K., Rafflenbeul, W., Haverich, A., Lichtlen, P. R. Monophasic action potential mapping in human subjects with normal electrocardiograms: direct evidence for the genesis of the T wave. Circulation. 75 (2), 379-386 (1987).
  17. Chiale, P. A., et al. The multiple electrocardiographic manifestations of ventricular repolarization memory. Current Cardiology Reviews. 10 (3), 190-201 (2014).
  18. Xu, L., et al. 3D multifunctional integumentary membranes for spatiotemporal cardiac measurements and stimulation across the entire epicardium. Nature Communications. 5, 3329 (2014).

Tags

Biologi elektrokardiografi elektro EKG EKG sebrafisk Danio rerio hjerteinfarkt iskemi hjerteinfarkt
I vivo Surface-elektrokardiografi for voksne sebrafisk
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhao, Y., Yun, M., Nguyen, S. A.,… More

Zhao, Y., Yun, M., Nguyen, S. A., Tran, M., Nguyen, T. P. In Vivo Surface Electrocardiography for Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (150), e60011, doi:10.3791/60011 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter